ĐỊNH DANH PYTHIUM VÀ PHYTOPHTHORA GÂY BỆNH THỐI RỄ CHẾT CÂY HOA LÀI (Jasminum spp.) TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

2009 2.2.3 Đặc điểm của Pytium và Phytophthora Chu kỳ sống của Pythium và Phytophthora có nhiều dạng bào tử, chúng được hình thành qua 2 quá trình sinh sản đó là vô tính và hữu tính..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH PYTHIUM VÀ PHYTOPHTHORA GÂY BỆNH THỐI RỄ CHẾT CÂY HOA LÀI (Jasminum spp.)

TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGÀNH : BẢO VỆ THỰC VẬT NIÊN KHÓA : 2008 - 2012

SINH VIÊN THỰC HIỆN: ĐÀO UYÊN TRÂN ĐA

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 07/2012

ĐỊNH DANH Pythium VÀ Phytophthora GÂY BỆNH THỐI RỄ CHẾT

CÂY HOA LÀI (Jasminium spp.) TẠI THÀNH PHỐ

HỒ CHÍ MINH

Tác giả

ĐÀO UYÊN TRÂN ĐA

K hóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư

LỜI CẢM ƠN

* Chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu và quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; quý thầy cô khoa Nông Học đã tận tình truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em theo học tại trường

Cảm ơn ban lãnh đạo cùng với các anh chị em trong Trung Tâm Kiểm Dịch Thực Vật Sau Nhập Khẩu II đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cảm ơn anh Đàn Nguyên Lưu Vy Vi, em Nguyễn Thị Thu Hà, em Nguyễn Thị Thanh Hòa cùng với tất cả các bạn đã động viên, giúp đỡ và góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tại trường, đặc biệt trong thời gian thực hiện đề tài

* Lời cảm ơn sâu sắc:

Thầy Lê Đình Đôn, chị Phan Thị Thu Hiền và chị Đinh Thị Ánh Tuyết (Trung Tâm Kiểm Dịch Sau Nhập Khẩu II) đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tôt nghiệp

* Luông ghi nhớ công ơn:

Con cảm ơn cha mẹ đã sinh và nuôi dạy con khôn lớn như ngày hôm nay, gia đình luôn là điểm tựa vững chắc, là hành trang con mang theo đi suốt cuộc đời này

Xin chân thành cảm ơn

Tp Hồ Chí Minh, 07/2012

Đào Uyên Trân Đa

TÓM TĂT

Đào Uyên Trân Đa, Khoa Nông Học – Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh,

tháng 07/2012 Đề tài “ Định danh Pythium và Phytophthora gây bệnh thối rễ chết cây hoa lài (Jasminium spp.) tại Tp Hồ Chí Minh”

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Lê Đình Đôn

KS Phan Thị Thu Hiền

Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 07/2012, tại phòng Điều Tra Giám Sát – Trung Tâm Kiểm Dịch Thực Vật Sau Nhập Khẩu II và trại thực nghiệm thuộc bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguồn nấm

đã được thu thập tại các địa điểm: xã Nhị Bình – huyện Hóc Môn, xã Bình Mỹ - huyện Củ Chi và phường Thạnh Lộc - Quận 12, Tp Hồ Chí Minh Khi đã có nguồn nấm của 2 chi

là Pythium và Phytophthora, tiến hành lây nhiễm nhân tạo để đánh giá khả năng gây hại của chúng trên cây hoa lài, đồng thời tiến hành phân lập để xác định lại tác nhân gây hại sau khi chủng Mục tiêu cuối cùng của đề tài là định danh đến loài của các mẫu nấm thuộc

chi Pythium và Phytophthora gây bệnh thối rễ chết cây hoa lài tại Tp Hồ Chí Minh Các

mẫu nấm sẽ được khảo sát trên 2 loại môi trường là CMA và CRA nhằm tìm ra môi trường thích hợp để có được các đặc điểm đặc trưng của từng loại nấm và dựa vào khóa phân loại Pythium của Vander Plaats – Niterink A J., 1981 và Phytophthora của

Ho,1995 để định danh đến loài Đánh giá khả năng gây hại của các mẫu Pythium và

mẫu PyTL05 thuộc chi Pythium và mẫu PhBM10 thuộc chi Phytophthora có khả năng gây hại nặng nhất Tần suất xuất hiện của các tác nhân gây hại được phân lập trở lại sau khi chủng bệnh chiếm tỷ lệ rất thấp ở 10 NSC, 20 NSC, 30 NSC, 40 NSC và 50 NSC Trong 12 mẫu bệnh thuộc nhóm Pythium thì chỉ định danh được 1 mẫu là Pythium

định được tên loài của mẫu PhNB03 là Phytophthora cactorum

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặc vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Giới hạn đề tài 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây hoa lài 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Đặc tính thực vật 4

2.1.3 Điều kiện sinh thái 4

2.1.4 Giá trị kinh tế của cây hoa lài 5

2.1.5 Tình hình nghiên cứu sâu bệnh hại trên cây hoa lài 5

2.1.5.1 Nghiên cứu trong nước về bệnh hại trên cây hoa lài 5

21.5.2 Nghiên cứu ngoài nước về bệnh hại trên cây hoa lài 6

2.2 Sơ lược về Pythium và Phytophthora 7

2.2.1 Đặc điểm của lớp Oomycetes 7

2.2.2 Vị trí phân loại 8

2.2.3 Đặc điểm của Pythium và Phytophthora 8

2.2.3.1 Sơ lược về Pythium 10

2.2.3.2 Sơ lược về Phytophthora 11

2.2.4 Những điểm khác biệt giữa Pythium và Phytophthora 13

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian nghiên cứu 14

3.2 Địa điểm nghiên cứu 14

3.3 Nội dung nghiên cứu 14

3.4 Phương pháp nghiên cứu 14

3.4.1 Nguồn nấm 14

3.4.2 Phương pháp xác định khả năng gây hại của Pythium và Phytophthora đối với cây hoa lài 16

3.4.2.1 Phương pháp nhân sinh khối nấm 16

3.4.2.2 Vật liệu chủng 16

3.4.2.3 Phương pháp chủng bệnh 17

3.4.2.4 Phân lập lại tác nhân gây bệnh sau khi chủng 18

3.4.3 Định danh Pythium bằng cách dựa vào các đặc điểm hình thái học 19

3.4.3.1 Khảo sát sự phát triển của Pythium trên môi trường CRA 19

3.4.3.2 Định danh Pythium 20

3.4.4 Định danh Phytophthora bằng cách dựa vào các đặc điểm hình thái học 21

3.4.4.1 Khảo sát sự phát triển của Phytophthora trên môi trường CRA 21

3.4.4.2 Xác định dạng lai của Phytophthora 22

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả khả năng gây hại của Pythium và Phytophthora đối với cây lài 23

4.2 Kết quả phân lập lại tác nhân gây bệnh của các mẫu nấm sau khi chủng 28

4.3 Kết quả định danh Pythium bằng cách dựa vào các đặt điểm hình thái học 39

4.3.1 Kết quả khảo sát sự phát triển của Pythium trên môi trường CRA 39

4.3.2 Định danh Pythium 31

4.3.2.1 Mẫu PyTL04 33

4.3.2.3 Mẫu PyNB02 38

4.4 Định danh Phytophthora bằng cách dựa vào các đặc điểm hình thái học 40

4.4.1 Mẫu PhNB03 40

4.4.2 Mẫu PhBM10 41

4.4.3 Mẫu PhNB04 43

4.4.4 Mẫu PhBM03 44

4.5 Thảo luận kết quả 46

4.5.1 Kết quả lây nhiễm nhân tạo và phân lập lại tác nhân gây hại trên rễ hoa lài 46

4.5.2 Kết quả định danh 46

4.5.2.1 Các mẫu nấm thuộc nhóm Pythium 46

4.5.2.2 Các mẫu nấm thuộc nhóm Phytophthora 47

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Đề nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

WA Thạch nước cất (Water Agar)

TSXH Tấn suất xuất hiện

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Địa điểm thu thậplấy mẫu và số mẫu phân lập được thuộc Pythium và

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Tỷ lệ bệnh (%) sau khi chủng của Pythium và Phytophthora 24

Hình 4.2 Cấp độ nhiễm bệnh trên rễ 27

Hình 4.3 Rễ lài sau khi chủng của mẫu PyTL04 27

Hình 4.4 Rễ lài sau khi chủng của mẫu PhBM10 28

Hình 4.5 Đặc điểm của nhóm A (Pythium) trên môi trường CRA 31

Hình 4.6 Hình nấm Pythium chamaehyphon 35

Hình 4.7 Đặc điểm của mẫu PyTL07 trên môi trường CMA 37

Hình 4.8 Đặc điểm của mẫu PyTL09 trên môi trường CMA 38

Hình 4.9 Đặc điểm của mẫu PyNB02 trên môi trường CMA 39

Hình 4.10 Đặc điểm của nấm Phytophthora cactorum trên môi trường CRA 41

Hình 4.11 Đặc điểm của mẫu PhBM10 trên môi trường CRA 42

Hình 4.12 Đặc điểm của mẫu PhNB04 trên môi trường CRA 44

Hình 4.13 Đặc điểm của mẫu PhBM03 trên môi trường CRA 45

Độ, được dùng trong các nghi lễ, đám cưới và tô điểm cho hình ảnh tôn giáo Ở một số nước, hoa lài được xem như là quốc hoa với các tên gọi khác nhau như “Melati Putih” ở Indonesia, “Sampaguita” ở Philippin, “Pikake” ở Hawaii Tại Thái Lan, hoa lài được sử

dụng như một biểu tượng của người mẹ Ngoài ra hoa lài còn được dùng làm nước hoa,

và theo y học cổ truyền hoa lài còn là vị thuốc hay trong việc chữa bệnh

Nhờ các đặc tính trên mà hoa lài đem lại giá trị cả vật chất lẫn tinh thần cho nhiều

quốc gia trong đó có Việt Nam Ở miền Nam nước ta hoa lài được trồng nhiều tại thành phố Hồ Chí Minh ở huyện Hóc Môn, huyện Củ Chi và Quận 12 Tuy nhiên, trong những năm gần đây diện tích trồng lài đã giảm mạnh, theo Chi cục Bảo vệ thực vật Tp Hồ Chí Minh thì năm 2001 diện tích là 700 hecta nhưng tới năm 2010 chỉ còn lại 104,5 hecta và được trồng tập trung ở Quận 12 và huyện Hóc Môn (Chi cục Bảo Vệ Thực Vật Tp.Hồ Chí Minh, 2010) Nguyên nhân chính làm diện tích trồng lài giảm là do sâu bệnh gây hại

đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến giá trị kinh tế trên hoa lài Theo nghiên cứu một số bệnh

ở cây hoa lài hiện nay vẫn còn ít cả trên thế giới lẫn Việt Nam Bệnh thối rễ chết cây hoa lài là một trong số các bệnh quan trọng đã gây ảnh hưởng đến sinh trưởng, năng suất và

phẩm chất hoa lài, một khi cây bị bệnh vàđã thể hiện triệu chứng thì rất khó phục hồi, hầu như là bị chết hoàn toàn Do đó việc xác định tác nhân gây bệnh là rất cần thiết, trong số

các tác nhân đã nghiên cứu, bước đầu đã xác định có hai loại nấm là Phytophthora và

danhPythiumvà Phytophthora gây b ệnh thối rễ chết cây hoa lài (Jasminum spp.) tại

Tp Hồ Chí Minh”đã được thực hiện

1.2 Mục tiêu và yêu cầu đề tài

1.2.1 M ục tiêu

Định danh được tên loài của 2 chiPhytophthora và Pythium có khả năng gây hại

trên cây hoa lài

1.2.2 Yêu c ầu

Xác định tính độc của các mẫu nấm thuộc chi Pythium và Phytophthora trên cây

hoa lài bằng lây nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch

Phân lập lại tác nhân gây bệnh sau khi chủng và xác định lại tác nhân gây bệnh Nuôi cấy Pythiumvà Phytophtora trên môi trường chọn lọc, quan sát cácđặc điểm sinh học, các đặc điểm hình thái và từ đó làm cơ sở cho việc định danh tên loài của

nấm

1.3 Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ được thực hiện trên những nguồnnấm đã được phân lập từ trước

Chương 2

T ỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Gi ới thiệu về cây hoa lài

2.1.1 Nguồn gốc

Hoa lài có tên tiếng anh là Jasmine (tên khoa học Jasminum) bắt nguồn từ tiếng Ả

Rập là Yasameen nghĩa như “món quà từ thiên chúa” Là một chi trong họ Oleaceae với khoảng 200 loài có nguồn gốc nhiệt đới và vùng ôn đới ẩm

Chi (Genus) Jasminum

Có 4 loài phổ biến trong chi Nhài hay chi Lài (Jasminum):

Trong 4 loài thì loài Jasminum sambac (L.) Ait Còn có tên gọi khác là lài Ả Rập (Arabian jasmine) được trồng phổ biến nhất

2.1.2 Đặc tính thực vật

Cây lài thuộc loại rễ chùm, phát triển nhiều và lan rộng Thân gỗ nhỏ, mọc thành bụi, thường cao từ 0,5 – 3 m, có nhiều cành nhánh nhỏ vươn dài Lá xanh đậm, bóng cả hai mặt, mọc đối, hình oval, dài từ 3 – 12,5 cm, rộng từ 2 – 7,5 cm, ở kẻ lá có những gân

phụ, gân con hình mạng lưới Hoa màu trắng nở từ 7 – 8 giờ tối, có hương thơm ngát, hoa thường mọc thành phát ở nách lá hay ngọn cây, có từ 3 – 12 hoa trên mỗi phát, hoa có từ

8 – 10 cánh xếp thành hai lớp Quả màu đen hình cầu có hai ngăn, đường kính 6 mm, được bao bọc bởi đài hoa (Trần Hợp, 1998; Nguyễn Hữu Đảng, 2003; Phạm Hoàng Hộ, 1999)

2.1 3 Điều kiện sinh thái

Cây lài có nguồn gốc Nam Á, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng tốt từ 22 - 33°C và từ 8 - 10°C thì cây sinh trưởng kém Lài là cây ưa sáng do đó cần trồng nơi thoáng mát, không bị che bóng cây mới cho năng suất cao và có hương thơm Hoa lài sống được trên nhiều loại đất từ đất đồng bằng trung tính (pH từ 6,5 – 7) đến đất đồi núi hơi chua (pH từ 3,5 – 4), rồi từ đất thịt nặng đến đất thịt pha cát, đất đồi núi nghèo dinh dưỡng, và cả ở đất bạc màu nếu được chăm sóc tốt, bón phân, tưới nước đầy đủ vẫn cho năng suất cao Lài cần nước sinh trưởng để ra hoa liên tục nhưng không chịu được úng,

do đó cần trồng nơi cao ráo, có hệ thống tưới tiêu hợp lý

Thời tiết nóng, ngày dài thuận lợi cho việc ra hoa và kích thước hoa Ở những vùng khô và lượng ánh sáng đầy đủ cây lài sẽ cho lượng hoa dồi dào Nhiệt độ tốt nhất là ban ngày từ 27 - 32°C và ban đêm từ 21 - 27°C, nếu nhiệt độ ban đêm dưới 21°C thì năng suất và kích thước hoa giảm Ngoài ra, cây hoa lài là cây chịu mặn và không chịu được gió mạnh

2.1.4 Giá tr ị kinh tế của cây hoa lài

Trong nhiều năm qua, nhiều địa phương đã áp dụng chương trình chuyển đổi cơ

cấu cây trồng rất thành công, đặc biệt đối với cây hoa màu đã đem lại hiệu quả kinh tế cao trong nông nghiệp Không chỉ có Tp.Hồ Chí Minh mà 1 số tỉnh miền Tây Nam Bộ như Tiền Giang, Bến Tre và Trà Vinh đã đưa cây hoa lài vào sản xuất và đang có triển

vọng cao

Hoa lài được người dân thu hoạch quanh năm, mặc dù năng suất và phẩm chất hoa

có khác nhau giữa mùa mưa và mùa nắng, vì thế giá bán trên thị trường cũng có phần khác nhau, có thời điểm giá bán lên 130 ngàn đồng cho 1 kg hoa tươi nhưng cũng có khi

chỉ bán với 20 ngàn đồng/kg Tuy nhiên, do hoa lài ra hoa quanh năm và ngày nào cũng thu hoạch nên đây vẫn được cho là cây có giá trị kinh tế cao Hầu hết các nhà vườn trồng lài có thu hoạch từ 15 – 20 triệu đồng cho 1 năm

Hiện nay tại tỉnh Trà Vinh có 200 hộ dân trồng hoa lài với diện tích trên 43 hecta,

có 37 hecta đang trong thời kỳ thu hoạch và sản lượng đạt 2,7 tấn/ha

2.1.5 Tình hình nghiên c ứu bệnh hại trên cây hoa lài

2.1.5.1 Nghiên cứu trong nước về bệnh trên cây hoa lài

Tính đến nay thì bệnh trên cây hoa lài vẫn chưa được quan tâm và nghiên cứu nhiều, nếu có cũng chỉ dừng lại ở việc điều tra, khảo sát và đánh giá những thiệt hại trên đồng ruộng Trong khi đó tình hình sâu bệnh trên cây hoa lài ngày một phức tạp và phát triển mạnh, đây cũng chính là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến diện tích canh tác cây hoa lài

giảm đáng kể tại Tp.Hồ Chí Minh Quận 12 tại Tp.Hồ Chí Minh được biết là nơi trồng lại nhiều nhất nhưng qua điều tra cho thấy năm 2001 tổng diện tích của huyện là 600 hecta, đến năm 2007 còn lại 163 hecta và đến năm 2010 diện tích chỉ còn 74,5 hecta (Chi cục

Bảo Vệ Thực Vật Tp Hồ Chí Minh, 2010)

Trong các bệnh gây hại trên cây hoa lài thì có bệnh thối rễlàm chết cây hoa lài vẫn chưa có nghiên cứu về tác nhân cũng như về biện pháp phòng trừ hiệu quả Điều đặc biệt nghiêm trọng đối với bệnh này là rất khó phát hiện, triệu chứnggần giống với triệu chứng thiếu dinh dưỡng của cây Tuy nhiên cây bắt đầu rụng lá thì bộ rễ của cây hầu như không còn khả năng phục hồi được nữa

Theo Nguyễn Văn Kế và Trần Văn Lâu (2002) sâu bệnh hại chính trên hoa lài làm

thất thu nghiêm trọng về năng suất gồm có: bệnh tím bông gây hại nặng vào trời ẩm ướt

do nấm Colletotrichum gloeosporioides và nấm Colletotrichum capsici thuộc bộ Melanconuales, lớp Coelomycetes; bệnh chết bụi do nấm Sclerotium rolfsii thuộc bộ Agonomycetes; sâu đục bông Palpita nigropunctalis Bremer thuộc họ Pyralidae, bộ

Lepidoptera (Vũ Khắc Chung, 2010)

2.1.5.2 Nghiên c ứu ngoài nước về bệnh trên cây hoa lài

Trên thế giới tài liệu nghiên cứu về cây hoa lài vẫn còn ít.Theo Lin, Chen, Chang (2004) thì triệu chứng bệnh là những đốm vàng hoặc vàng toàn bộ lá được xác định do virus thuộc nhóm Potyvirus phát hiện năm 1995 tại Kaohsiung và Pingtung của Đài Loan Tên Jasmine virus T (JaVT) được đề nghị đặt tên cho virus gây hại, điểm nhiệt không

hoạt động của virus từ 50 - 55°C, ngưỡng pha loãng là 10¯3 đến 10¯4

và tuổi thọ trong điều kiện invitro từ 2 – 3 ngày ở 24°C và trên 10 tháng ở nhiệt độ - 70°C Ngoài ra bệnh đốm lá có hình dạng là vết bệnh không đều, có màu nâu tại trung tâm vết bệnh, viền có màu vàng nhạt nếu nặng có màu đen và bệnh xuất hiện tại chóp lá Tác giả Alfieri (1983) cho rằng tác nhân gây bệnh đốm lá là nấm Pseudocercospora jasminicola (Muller và

Chupp)

Trên cây lài có một số sâu bệnh chính gồm:

 Bọ trĩ hại hoa: Thrips hawaiiensis

Muỗi vằn hại hoa: Contariniamaculipennis

 Nhện có phổ ký chủ rộng: Polyphagotarsonemus latus

 Nhện đỏ: Tetranychus cinnabarinus

 Bọ phấn trắng: Aleuroclava jasmine, Dialeurodes kirkaldyi

Rệp sáp: Pseudococcus longispinus

Sâu ăn lá: Psilogramma menephron

Bệnh thối rễ: Pythium, Rhizoctonia, Sclerotium rolfii

Bệnh đốm vàng: Vi rút

Trên Jasminum sambac (L.) Ait triệu chứng đa chồi trên ngọn ghi nhận tại Oman và

tác nhân Phytophthora được tìm thấy dựa vào cấu trúc trình tự vùng 16SrRNA Kết quả cho thấy có thể sử dụng PCR với các primer chuyên biệt để phát hiện Phytophthora trên

cây lài hiện nay Trên cây lài nói chung bệnh rất ít có tài liệu nghiên cứu Trong đó nấm

bệnh rĩ sắt do nấm Uromyces hobsoni tấn công trên hoa và trên mặt lá

2.2 Sơ lược về nấm Phythiumvà Phytophthora

2.2.1 Đặc điểm của lớp Oomycetes

Lớp Oomycetes gồm 4 bộ, một trong số đó có bộ Peronosporales là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng Đặc biệt trong bộ này có hai loài nghiêm trọng gồm Pythium và

Lớp Oomycetes so với nấm thật có nhiều đặc điểm về hình thái và chu kỳ sống tương tự nhau, tuy nhiên riêng vềdi truyền học và cơ chế sinh sản thì khác nhau rõ ràng (Erwin và Ribero, 1996) Ngoài ra lớp Oomycetes còn sinh ra các sợi nấm không có vách ngăn, thêm một đặc điểm chính để phân biệt chúng với nấm thực Việc xếp chúng vào giới Chromista (Cavalieve và Smith, 1986) đã được chứng minh bằng rất nhiều đặc trưng,

gồm có sự biến đổi trong con đường tiến hóa (Elliott, 1983; Hendrix, 1973; Wang,

Bartnicki và Garcia, 1973), hình thành động bào tử có lông roi không đều (Dejardins và ctv, 1989), sự chiếm ưu thế của giai đoạn lưỡng bội trong chu kỳ sống (Erwin và Riberio, 1996) và sự hiện diện của β_glucans tốt hơn chitin trong vách tế bào (Bartnicki, 1973) Ngoài ra ở lớp Oomycetes còn có các du động bào tử với các lông roi được sinh ra từ bọc bào tử qua sinh sản vô tính và sinh bào tử trứng qua sinh sản hữu tính (Võ Thị Thu Oanh, 2007)

2.2.2 Vị trí phân loại

Vị trí phân loại dựa theo Burgess và ctv (2009)

2.2.3 Đặc điểm của Pytium và Phytophthora

Chu kỳ sống của Pythium và Phytophthora có nhiều dạng bào tử, chúng được hình

thành qua 2 quá trình sinh sản đó là vô tính và hữu tính

Sinh sản vô tính: gồm các du động bào tử di chuyển được và có vai trò quan trọng trong chu kỳ bệnh Chúng giúp bệnh lây lan nhanh chóng từ cây này sang cây khác bằng

việc lan truyền nhanh trên mặt đất và trên bề mặt cây trồng Các du động bào tử được giải

ừ bọc bào tử động, một cấu trúc tạo thành bằng sinh sản vô tính

Sinh sản hữu tính: có sự hình thành túi tinh và túi noãn Túi noãn chứa noãn cầu và mỗi noãn cầu chứa một nhân Túi tinh chứa đầy nội chất và nhiều nhân Túi tinh và túi noãn được hình thành từ cùng một sợi nấm hay trên các sợi nấm khác nhau, chúng ngăn cách với phần còn lại bởi một vách ngăn Túi tinh hình trụ và túi noãn hình cầu Từ túi tinh mọc ra những mấu nhỏ nối với túi noãn, từ đó dồn nội nhũ vào túi noãn để thụ tinh và hình thành hợp tử noãn (Oospore) Oospore nghỉ trong một thời gian, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm cho ra sợi nấm ngắn và sau đó phát triển thành bào tử vô tính (Võ Thị Thu Oanh, 2007)

Bào tử noãn: là bào tử hữu tính, hình thành từ sự kết hợp của các túi giao tử được gọi là túi đực và túi cái Tỷ lệ giữa C/N 94:1 thúc đẩy sự hình thành các bào tử noãn và sterol cũng là thành thành phần thiết yếu cho việc hình thành các bào tử noãn Nhiệt độ cần thiết cho sự hình thành bào tử noãn thấp hơn so với sự phát triển của túi noãn Bào tử noãn cũng bị ức chế bởi điều kiện ánh sáng Khi điều kiện không thích hợp bào tử noãn sẽ

đi vào giai đoạn ngủ nghỉ, vì vậy chúng được xem như là một cấu trúc nghỉ Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử noãn sẽ hình thành sợi nấm, rồi sau đó hình thành túi bào tử và động bào tử

Bào tử hậu (Chlamydospore): là một dạng cấu trúc nghỉ vô tính Bào tử hậu được hình thành bên trong sợi nấm hay tại các đầu chóp của sợi nấm nên chúng là những tế bào sinh dưỡng Chúng phát triển vách dày, có thể tồn tại trong môi trường khắc nghiệt, tuy nhiên ở nhiệt độ khoảng 15°C cộng với sự hiện diện của sterol trong môi trường nuôi cấy

và một tỷ lệ cao của C (30:1) là điều kiện tối thích cho bào tử vách dày hình thành Sự

nảy mầm có thể xảy ra khi nồng độ dinh dưỡng cao, đặc biệt là glucose và aspargine Túi bào tử: là một cấu trúc sinh sản nhưng đôi khi cũng được xem như là bào tử vô tính Túi bào tử nảy mầm trực tiếp trong điều kiện lượng nước tự do thấp, môi trường giàu dinh dưỡng và nhiệt độ cao Trong môi trường pH cao (>7) túi bào tử sẽ không hình thành Sự hiện diện của nước và sterol là những yếu tố hình thành túi bào tử, và O2 cũng

rất quan trọng cho việc hình thành túi bào tử Ngược lại, sự hiện diện của Cu2+

sẽ hạn chế

sự hình thành túi bào tử

Động bào tử: được hình thành như điều kiện hình thành túi bào tử, đòi hỏi có nhiều nước tự do và nhiệt độ thấp hơn, khoảng từ 15 - 18°C Động bào tử có dạng hình bầu dục, vách mỏng, vô tính và có khả năng bơi bằng hai lông roi Độ lớn đường bơi của động bào

tử khoảng từ 26 – 70 µm, chúng bơi theo đường xoắn ốc Chúng trở nên mất phương hướng và giảm phạm vi hoạt động khi va chạm với bề mặt xung quanh Động bào tử trở nên ít di động khi nhiệt độ môi trường tăng, pH thấp, tiếp xúc với bề mặt và nồng độ bào

tử thấp Chúng được sinh ra từ túi bào tử và thoát ra ngoài qua một lỗ nhỏ ở đầu túi khi túi trưởng thành Động bào tử bơi trong khoảng thời gian vài phút đến một giờ và hầu như không có phương hướng, nhưng lại bị hấp dẫn trực tiếp bởi dịch tiết ra từ rễ cây Động bào tử sẽ biến đổi thành hình tròn, hai lông roi biến mất khi tiếp xúc với một bề mặt thích

hợp, sau đó nhanh chóng hình thành ống nấm để xâm nhiễm vào cây và bắt đầu sinh trưởng sợi nấm Khi tiến hành xâm nhiễm thì động bào tử xuyên thẳng vào cây ký chủ qua rễ hoặc qua khí khổng và hình thành các giác mút Chỗ vết thương hay những phần mọng nước và chồi ngọn là những vùng thích hợp nhất cho sự lây nhiễm

2.2.3.1 Sơ lược về Pythium

hoa màu bị mất trắng Chúng xuất hiện nhiều trong vùng đất được cày xới, gần vùng rễ ở

lớp đất bề mặt, ngược lại ở những vùng không được cày xới và đất chua thì Pythium rất ít

phổ biến Các loại Pythium có thể sống ký sinh hoặc hoại sinh, tuy nhiên khi sống ký sinh

thường phụ thuộc vào nhiều yếu tố Những phần mô mọng nước và còn non sẽ bị tấn công

trước, đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi cho Pythium và bất lợi cho ký chủ Có nhiều

nhân tố ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm của nấm bệnh vào cây trồng như mật độ Pythium,

nước trong đất, pH, nhiệt độ, cường độ ánh sáng, cation và các vi sinh vật trong đất

tấn công trên một loại ký chủ như Pythium buismaniae (Vander Plaats – Niterink A J.,

1981)

Các sợi nấm của Pythium trong suốt, sợi nấm chính rộng từ 5 – 7 µm có đôi lúc lên

tới 10 µm Những sợi già hay những nơi hình thành cơ quan sinh sản có vách ngăn, các sợi non hầu như không có

Quá trình sinh sản vô tính diễn ra nhờ túi động bào tử và động bào tử Tuy nhiên, động bào tử không phải phóng thích trực tiếp mà thông qua một bao giả (vesicle) được nối với túi bào tử bằng một ống tháo Từ túi bào tử, hàm lượng chất chưa biệt hóa di chuyển qua ống tháo vào bao giả, động bào tử được hình thành và phóng ra bên ngoài tại đây Sinh sản hữu tính diễn ra bởi túi noãn và túi đực Túi noãn hình cầu như quả chanh, thành trơn hoặc có gai Khi tiếp xúc với túi noãn, túi đực hình thành ống thụ tinh để đâm qua túi noãn Túi đực được xem là đơn nghiêng (monoclinous) nếu chúng có cùng cuống với túi noãn và được xem là đôi nghiêng (diclinous) nếu hình thành từ sợi nấm khác, và

phần ở gần cuống túi noãn hình thành túi đực thì gọi là dưới bầu (hypogynous)

Sau khi noãn bào tử trưởng thành thì pha ngủ đông rất cần thiết trước khi diễn ra sự nảy mầm Noãn bào tử biến đổi thành cấu trúc vách mỏng, sản xuất ống phôi hoặc có vai trò như túi bào tử để hình thành nên động bào tử khi nảy mầm Noãn là cấu trúc quan

trọng giúp các loài Pythium tồn tại, phát triển, và có thể lưu tồn trong đất sau 8 đến 12

tháng

2.2.3.2 Sơ lược về Phytophthora

đặt bởi Bary (1887) Phytophthora là một loại nấm quan trọng trên thế giới, và gây hại

nhiều loại cây trồng có giá tị kinh tế cao như: cao su (Hevea brasiliensis), ca cao (

comosus), tiêu (Piper nigrum), khoai tây (Solanum tuberosum), cây có múi (Citrus) và

cây rừng

Phytophthora được mệnh danh là kẻ tàn phá cây trồng và có khoảng 60 loài đã được

mô tả (Erwin và Riberio, 1996) Chúng gây hại cả trong điều kiện khí hậu ôn đới và nhiệt đới Từ những năm 1845 – 1847, khi có dịch bệnh móc sương trên khoai tây đã gây ra nạn

đói ở Châu Âu thì Phytophthora được nghiên cứu nhiều (Bourke, 1964) Phytophthora

tấn công trên nhiều loại cây trồng nên phạm vi ký chủ rất rộng, có những loài chuyên tính

chỉ tấn công ở một loại ký chủ như P fragariae var rubi và có những loài tấn công trên

nhiều loại ký chủ như P cinnamomi có thể tấn công hơn 1000 loại cây trông khác nhau

(Erwin và Riberio, 1960)

Tất cả các mẫu phân lập của Phytophthora đều có khả năng sinh sản cả ở bộ phận

sinh dục đực và cái hoặc túi giao tử (Gallegly, 1960) Ở Phytophthora, một nữa số loài là

đồng tản có thể sinh bào tử noãn nhanh và nhiều trong môi trường nuôi cấy, những loài còn lại là dị tản và sản sinh túi bào tử chỉ khi có sự kích thích hóa học từ các mẫu sinh sản đối ngược nhau (Brasies, 1992; Ko, 1978) Tính dị tản liên quan tới kiểu sinh sản A1 và

bào tử có chóp đầu, hơi chóp hay không có chóp đầu; tính rụng của túi bào tử và kiểu tiếp xúc của túi tinh và túi noãn

Ở chi Phytophthora dễ gây bệnh cho cây trồng hơn các chi nấm thực nhờ có các đặc

điểm sau:

Hình thành nhiều túi bào tử và động bào tử làm nhiệm vụ phát tán và xâm nhiễm

bệnh trong thời gian ngắn, còn bào tử hậu và bào tử noãn làm nhiệm vụ lưu tồn trong thời gian dài Ngoài ra, bào tử noãn có thể sống qua bộ máy tiêu hóa của ốc sên

Động bào tử được hình thành trong mỗi túi bào tử, điều này cho phép Phytophthora

sản xuất một khối lượng lớn nguồn lây nhiễm hơn là một túi bào tử đơn độc cũng như làm tăng khả năng lây nhiễm đến cây ký chủ Ngoài ra, chúng tấn công đầu rễ bằng cách tiết

ra chất kích thích giúp việc xâm nhiễm được dễ dàng hơn, cộng với tính di động ở hai lông roi của động bào tử làm cho việc lây lan càng nhanh chóng

Túi bào tử có thể sống trong không khí sau đó di chuyển đến các khu vực bện cạnh Chúng có thể lây nhiễm trực tiếp vào mô ký chủ hoặc từ túi bào tử này hình thành khoảng

4 – 32 động bào tử làm cho khả năng lây nhiễm của chúng rộng hơn

Vì chi Phytophthora có những đặc điểm khác với nấm thực nên đối với một số thuốc trừ nấm ít có hiệu lực, ngoài ra chúng phát triển ở điều kiện ẩm ướt nên thuốc hóa học cũng khó phát huy tác dụng

2.2.4 Những điểm khác biệt giữa Pythium và Phytophthora

Điểm khác biệt giữa Pythium và Phytophthora là quá trình hình thành và phóng

thích bào tử động Đối với Pythium, các động bào tử nằm ở đỉnh hay đoạn giữa các sợi

nấm có hình tròn (hình cầu) hay hình sợi Từ bọc bào tử của Pythium hình thành một ống

tháo và ở cuối ống này có một bọc giả (vesicle) có thành rất mỏng, tế bào chất di chuyển

từ ống tháo qua bọc giả Nhiệm vụ của bọc giả là chứa các du động bào tử và chúng được tung ra khi màng bọc giả vỡ Ngược lại, Phytophthora thì tạo các túi bào tử có hình dạng

nhất định, rõ rệt trên cành mang bào tử Các du dộng bào tử được hình thành và phóng thích từ bọc bào tử

Khi nhìn bằng mắt thường trên môi trường nuôi cấy ở cùng điều kiện thì Pythium phát triển nhanh hơn Phytophthora, sợi nấm tỏa đều, sinh trưởng mạnh và lan ra mép

ngoài của đĩa petri Đối với Phytophthora thì phát triển chậm hơn, mọc co cụm lại tạo

thành hình dáng nhất định trên môi trường nuôi cấy (Ho H H và ctv., 1995; Burgess và ctv., 2009)

Khi quan sát dưới kính hiển vi, các sợi nấm của Pythium luôn tạo góc bé hơn 90° so

với sợi chính và nhỏ hơn sợi chính, các sợi nấm thì suông mảnh Ở Phytophthora thì sợi nhánh và sợi chính có kích thước bằng nhau, sợi nấm suông mảnh hay trương phồng thành nhiều dạng khác nhau, đặc biệt các sợi chính và sợi nhánh tạo thành góc 90°

Chương 3

N ỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Th ời gian nghiên cứu

Đề tài đã được thực hiện từ tháng 1/2012 đến 7/2012

3.2 Địa điểm nghiên cứu

Định danh nấm bệnh tại phòng Điều tra giám sát – Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II

Thí nghiệm xác định khả năng gây hại của Pythium và Phytophthorađược thực hiện

tại trại thực nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học – Trường Đại Học Nông Lâm

3.3 Nội dung nghiên cứu

Xác định khả năng gây hại của Pythium và Phytophthorabằng phương pháp lây

nhiễm nhân tạo trong điều kiện nhà lưới

Phân lập tác nhân gây bệnh sau khi chủng, xác định lại tác nhân gây bệnh

Định danh tên loài các mẫu nấm của 2 chiPythiumvà Phytopthora bằng cách dựa

vào các đặc điểm hình thái học

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Ngu ồn nấm

Vì thực hiện tiếp theo đề tài “ Nghiên cứu tác nhân Phytophthora và Pythium gây

hại trên cây hoa lài (Jasminum spp.) tại Tp Hồ Chí Minh” của Đinh Thị Ánh Tuyết

(2011) nên nguồn nấm đã được thu thập tại các địa điểm: xã Nhị Bình – huyện Hóc Môn,

xã Bình Mỹ - huyện Củ Chi và phường Thạnh Lộc - Quận 12, Tp Hồ Chí Minh

Bảng 3.1 Địa điểm thu thập mẫu và số mẫu phân lập được thuộc Pythium và

Phytophthora

STT Mã Mẫu Địa điểm thu thập mẫu Tên giống mẫu được xác định

1 PhNB03 Xã Nhị Bình – huyện Hoóc Môn Phytophtora

2 PhNB04 Xã Nhị Bình – huyện Hoóc Môn Phytophtora

3 PhBM03 Xã Bình Mỹ - huyện Củ Chi Phytophtora

4 PhBM10 Xã Bình Mỹ - huyện Củ Chi Phytophtora

5 PyNB02 Xã Nhị Bình – huyện Hoóc Môn Pythium

6 PyBM05 Xã Bình Mỹ - huyện Củ Chi Pythium

7 PyBM06 Xã Bình Mỹ - huyện Củ Chi Pythium

8 PyBM08 Xã Bình Mỹ - huyện Củ Chi Pythium

9 PyTL02 Phường Thạnh Lộc – Quận 12 Pythium

10 PyTL04 Phường Thạnh Lộc – Quận 12 Pythium

11 PyTL05 Phường Thạnh Lộc – Quận 12 Pythium

12 PyTL06 Phường Thạnh Lộc – Quận 12 Pythium

13 PyTL07 Phường Thạnh Lộc – Quận 12 Pythium

14 PyTL08 Phường Thạnh Lộc – Quận 12 Pythium

15 PyTL09 Phường Thạnh Lộc – Quận 12 Pythium

16 PyTL10 Phường Thạnh Lộc – Quận 12 Pythium

(Nguồn: Đinh Thị Ánh Tuyết, 2011)

Trong 16 mẫu đã được phân lập và chia làm 2 nhóm là Pythium và Phytophthora;

mẫu nào thuộc nhóm Pythium sẽ được ký hiệu là Py và mẫu nào thuộc nhóm

3.4.2 Phương pháp xác định khả năng gây hại của Pythiumvà Phytophthorađối với

cây hoa lài

3.4.2.1 Phương pháp nhân sinh khối nấm

Mẫu nấm được nuôi cấy trên môi trường WA ở nhiệt độ phòng Khi đường kính tản nấm được 40 – 50 mm thì lấy 5 khoanh nấm có đường kính 4 mm cấy vào bình tam giác ( 250 ml) đã có sẵn 150ml dung dịch CR 20%

Chuẩn bị môi trường WA (môi trường thạch nước cất): Đun sôi 500ml nước cất, thêm vào 15 gram agar, nấu tan agar và cho thêm nước cất vào cho đủ 1000ml Hấp khử trùng trong 20 phút ở 121°C, 1 atm, sau đó đỗ ra đĩa petri (15ml/đĩa)

Chuẩn bị môi trường CR: 600g cà rốt rửa sạch, gọt vỏ, bào mỏng, xay nhuyễn cùng với 700 ml nước cất, hấp khử trùng ở 100°C trong 20 phút Để nguội lọc qua rây, sau đó tiếp tục lọc qua bốn lớp vải muslin, và lấy dung dịch trong Thêm nước tiệt trùng cho đủ 1000 ml, canh pH tới 6,5 Môi trường được hấp khử trùng trong 20 phút ở 121°C,

Tiến hành chủng bệnh khi giâm cành lài được 3tháng tuổi

Vật liệu: túi nilon có kích thước 25 x 12 cm, tro trấu, xơ dừa và đất trộn đều với tỷ lệ 1: 1: 1

Thí nghiệm được bố trí theo mỗi dòng nấm tương ứng với 9 chậu cây Tổng cộng có

16 dòng nấm đã được phân lập sẽ tương đương với 144 chậu cây lài và cộng với 9 chậu đối chứng

chủng bệnh từ 1 đến 2 ngày thì tưới nước cho cây và phải tưới từ từ

Chỉ tiêu theo dõi

Thời gian theo dõi được chia làm 5 lần ở thời điểm 10 NSC, 20NSC, 30NSC, 40 NSC và 50 NSC.Do thí nghiệm được tiến hành trên 9 cây lài cho 1 mẫu nấm nên trong 4

lần đầu (10 NSC, 20 NSC, 30 NSC và 40 NSC) chỉ tiêu theo dõi sẽ tính ở 2 cây cho 1

mẫu nấm, lần cuối cùng (50NSC) chỉ còn 1 cây cho 1 mẫu nấm Tỷ lệ bệnh được tính theo tổng số rễ bị bệnh trên tổng số rễ điều tra Cấp bệnh được tính ở từng rễ riêng lẻ và được đánh giá dựa theo thang phân cấp

Tính tỷ lệ bệnh tính theo công thức: TLB (%) = m/n * 100

Trong đó: m: số rễ bị bệnh

n: số rễ điều tra Tính chỉ số bệnh theo công thức: CSB (%) = ∑(a*n)/N*5

Trong đó: a: cấp bệnh

n: số rễ ở cấp bệnh tương ứng

N: tổng số rễ điều tra 5: cấp bệnh cao nhất

Cấp bệnh được phân theo thang phân cấp như sau:Cấp 0: rễ không có vết thâm nâu; cấp 1: từ 1– 10% rễ có vết thâm nâu; cấp 2: 11 – 25% rễ có vết thâm nâu; cấp 3: 26 – 50%

rễ có vết thâm nâu; cấp 4: 51 – 75% rễ có vết thâm nâu; cấp 5: > 75% rễ có vết thâm nâu

3.4.2.4 Phân l ập lại tác nhân gây bệnh sau khi chủng

Sau khi chủng mẫu rễ bệnh được tiến hành phân lập lại sau 10NSC, 20 NSC, 30 NSC, 40 NSC và 50 NSC

Áp dụng theo phương pháp của Burgess và ctv (2009) cho việc phân lập nấmgây

khử trùng trong 20 phút ở 121°C, 1 atm, sau đó đổ ra đĩa petri (15 ml/đĩa)

Phương pháp phân lập: Sau khi nhổ cây ra khỏi bầu đất, rễ được rửa dưới vòi nước

để loại bỏ đất và các vi sinh vật hoại sinh bám ngoài rễ Cắt rễ thành từng đoạn 2cm, tiến hành khử trùng mẫu rễ bằng dung dịch NaOCl 1% trong 2 – 3 phút, sau đó khử trùng tiếp bằng cồn ethanol 70% trong 1 phút và cuối cùng rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng

Mẫu bệnh được cắt lại thành từng mảnh dài từ 4 – 5 mm, đặt trên giấy thấm vô trùng, sấy khô bằng bằng quạt trong tủ cấy Cấy mẫu lên môi trường WA, khi có sợi nấm phát triển

ra từ các mẫu cấy ta tiến hành cấy truyền đỉnh sợi nấm trên môi trường CRA.Tiến hành quan sát các đặc điểm hình thái của các mẫu nấm để xác định sự hiện diện của Pythium và

Chỉ tiêu theo dõi: Tần suất xuất hiện các mẫu nấm sau khi chủng được tính theo công thức: TSXH (%)= tổng số mảnh cấy có sự xuất hiệnPythium hay Phytophthora/tổng

số mảnh cấy

3.4.3 Định danh Pythium bằng cách dựa vào các đặc điểm hình thái học

3.4.3.1 Khảo sát sự phát triển của Pythium trên môi trường CRA

Thành phần môi trường CRA được chuẩn bị tương tự như mục 3.4.2.4 Riêng môi trường CRA có CaCO3 thì thêm vào 15g CaCO3

Phương pháp tiến hành: cấy khoanh nấm có đường kính 4 mm có cùng độ tuổi lên trung tâm đĩa petri đã có sẵn môi trường ( đĩa petri có đường kính 90 mm) Ủ trong điều

kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng:0 giờ sáng/24 giờ tối, sau 5 – 7 ngày tiến hành quan sát các

chỉ tiêu

Chỉ tiêu theo dõi:

- Quan sát bằng mắt thường và mô tả hình dạng tản nấm trên môi trường nuôi cấy, sau đó dựa vào thuật ngữ mô tả của khóa phân loại để nhận dạng mẫu nấm thuộc kiểu nào

- Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X để mô tả đặc điểm hệ sợi nấm, và xác định tuổi nấm xuất hiện túi bào tử

- Quan sát sự hình thành túi noãn, túi đực trên môi trường nuôi cấy, nếu có thì tiến hành xác định và đo kích thước túi đực, túi noãn, bào tử noãn, mỗi chỉ tiêu đo 30 túi đực

– Niterink A J., 1981 Quan sát hình dạng và màu sắc tản nấm, túi đực và túi noãn, các kiểu tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn; hình dạng và kích thước túi bào tử; sợi nấm trương

phồng; điều kiện nhiệt độ phát triển; cấu trúc kích thước sợi nấm trương phồng; lỗ phóng

thích

Phương pháp: Cấy nấm có đường kính 4 mm ở cùng độ tuổi (3NSC) vào giữa đĩa petri đã có sẵn môi trường CMA Ủ tối ở điều kiện nhiệt độ phòng từ 7 – 10 ngày Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X

Chuẩn bị môi trường CMA (môi trường thạch bột bắp): Đun sôi 30 gram bột bắp

với 500 ml nước cất trong 1 giờ, thêm vào 15 gram agar, nấu tan agar và thêm nước cất vào cho đủ 1000 ml Hấp khử trùng trong 20 phút ở 121°C, 1 atm, sau đó đổ ra đĩa petri (15 ml/đĩa) Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X

Chỉ tiêu theo dõi:

- Túi bào tử: quan sát hình dạng và đo ngẫu nhiên 30 túi bào tử đã thành thục sau đó

dựa vào khóa phân loại để xác định dạng túi bào tử

- Túi đực và túi noãn: quan sát các dạng tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn, đo ngẫu nhiên kích thước của 30 túi đực và 30 túi noãn

- Lỗ phóng thích: xác định hình dạng và đo ngẫu nhiên 30 lỗ phóng thích ở vật kính 40X

- Bào tử hậu: quan sát và xác định sự hiện diện của bào tử hậu, nếu có tiến hành đo kích thước

- Sợi nấm trương phồng: xác định sự hiện diện và hình dạng của sợi nấm trương phồng trên mẫu nấm, đo ngẫu nhiên kích thước của 30 vị trí trương phồng ở vật kính 40X

3.4.4Định danh Phytophthora bằng cách dựa vào các đặc điểm hình thái học

3.4.4.1 Khảo sát sự phát triển của Phytophthora trên môi trường CRA

Việc định danh tác nhân Phytophthora được dựa trên cơ sở phương pháp của Ho

(1995) bao gồm các nguyên tắc sau: Quan sát hình dạng và màu sắc tản nấm, cấu trúc sợi

nấm, hình dạng và kích thước túi bào tử, chiều sâu núm, kích thước túi trương phồng, lỗ phóng thích, kích thước túi rụng, cấu trúc hữu tính của nấm bệnh

Phương pháp nghiên cứu: Cấy nấm có đường kính 4 mm ở cùng độ tuổi (3 NSC) vào giữa đĩa petri đã có môi trường CRA Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng: 0 giờ sáng/24 giờ tốivà tiến hành quan sát trên kính hiển vi ở vật kính 40X

Thành phần môi trường CRA (môi trường thạch cà rốt) tương tự như môi trường CR (môi trường dung dịch cà rốt) và có thêm 15 gram agar, hấp khử trùng trong 20 phút ở 121°C, 1 atm, sau đó đổ ra đĩa petri (15 ml/đĩa)

Riêng môi trường CRA có CaCO3 thì thêm vào 15g CaCO3

Chuẩn bị môi trường CR: 600g cà rốt rửa sạch, gọt vỏ, bào mỏng, xay nhuyễn cùng với 700 ml nước cất, hấp khử trùng ở 100°C trong 20 phút Để nguội lọc qua rây, sau đó

tiếp tục lọc qua bốn lớp vải muslin, và lấy dung dịch trong Thêm nước tiệt trùng cho đủ

1000 ml, canh chỉnh pH tới 6,5 Môi trường được hấp khử trùng trong 20 phút ở 121°C, 1atm

Chỉ tiêu theo dõi:

- Túi bào tử: đo chiều dài và chiều rộng ngẫu nhiên của 30 túi bào tử đã thành thục, tính tỷ lệ D/R (dài/rộng), sau đó dựa vào khóa phân loại để xác định hình dạng của túi bào

tử

- Bào tử hậu (Clamydospore): xác định sự hiện diện của bào tử hậu (chlamydospore) trên

mẫu nấm, nếu có đo kích thước của 30 túi ngẫu nhiên cùng với độ dày vách và xác định

vị trí của bào tử hậu là ở đầu sợi nấm hay xen giữa sợi nấm

- Đo chiều ngang lỗ phóng thích: khi túi bào tử già sẽ vỡ ở chóp đầu và phóng thích động bào tử, khi đó đo ngẫu nhiên 30 lỗ phóng thích ở vật kính 40X

- Sợi nấm trương phồng: xác định sự hiện diện của sợi nấm trương phồng trên mẫu nấm, nếu có đo ngẫu nhiên kích thước của 30 vị trí trương phồng và xác định vị trí của nó trên sợi nấm

3.4.4.2 Xác định dạng lai của Phytophthora

Xác định dạng lai của các mẫu nấm dựa trên phương pháp (Brasier, 1992)

Phương pháp: cấy từng khoanh nấm có đường kính 4 mm có cùng độ tuổi (3 NSC) vào giữa đĩa petri có môi trường CRA cùng mẫu tester chuẩn A1 và A2 của nấm P

môi trường CRA, khoảng cách giữa 2 mẫu là 20 mm và ủ tối ở nhiệt độ 25°C Sau 10 –

14 ngày cấu trúc hữu tính sẽ hình thành trên đường tiếp giáp của mẫu, ghi nhận kiểu lai với dạng tester thích hợp

Đánh giá kết quả: nếu nấm lai với tester A1 thì cho kiểu lai A2, và ngược lại nếu nấm lai với tester A2 sẽ cho kiểu lai A1, còn nấm không tạo được bào tử hửu tính (oospores) thì cho kiểu lai A0

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quảkhả năng gây hại của Pythium và Phytophthorađối với cây lài

Thí nghiệm chủng bệnh bằng sợi nấmđể đánh giá khả năng gây bệnh và tính độc

của các mẫu nấm trên cây hoa lài cho tất cả 16 dòng, trong đó có 12 mẫuthuộc Pythium và

4 mẫu thuộc Phytophthora Sau các ngày chủng bệnh,rễ có biểu hiện vết thâm nâu so với

đối chứng, vết thâm nâu này ngày một ăn sâu vào bên trong của rễ và khi phân lập lại thấy

đúng tác nhân là do các mẫu bệnh thuộc chi Pythium và chi Phytophthora gây ra.Kết quả

cho thấy đều có biểu hiện bệnh trên rễ với các mức độ khác nhau và được thể hiện ở bảng 4.1 và 4.2

Hình 4.1 Tỷ lệ bệnh (%) sau khi chủng của Pythium và Phytophthora (số liệu từ bảng 4

Bảng 4.1Tỷ lệ bệnh (%) trên rễ hoa lài sau các ngày chủng bệnh.

NSC: Ngày sau chủng ĐC: Đối chứng (-): không bị bệnh

Qua bảng ở 4.1 cho thấy càng về sau thì tỷ lệ bệnh của các mẫu nấm tấn công vào

rễ cây càng tăng Trong đó, mẫu bệnh cho tỷ lệ rễ bị bệnh cao nhất đạt 75% ở mẫu PyTL07 còn mẫu thấp nhất là mẫu PyBM08 ở 47,05% Riêng mẫu PyTL06 thì tỷ lệ bệnh

giữa 40 NSC và 50 NSC là như nhau đạt 70% Ngoài ra, độ chênh lệch của tỷ lệ bệnh

giữa 40 NSC và 50 NSC cao nhất ở mẫu PyBM05 với 14,81% và thấp nhất ở mẫu PyTL09 với 0,65%

Nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt như trên là do thí nghiệm chủng bệnh được tiến hành trên những cây riêng lẻ nên tính xâm nhiễm, thể hiện tính độc của mỗi mẫu nấm ở các cây khác nhau là khác nhau Ngoài ra, số liệu thu thập được cũng ở những thời điểm khác nhau cụ thể ở 10 NSC, 20 NSC,30 NSC, 40 NSC và 50 NSC, mặc dù nấm bệnh có tấn công gây hại nhưng sự phát triển của bộ rễ vẫn diễn ra, có thể mức độ sẽ chậm lại

B ảng 4.2 Chỉ số bệnh (%) trên rễ hoa lài sau các ngày chủng bệnh

Qua bảng 4.2 cho thấy ở thời điểm 30 NSC đối với chiPythium thì mẫu PyTL05

gây bệnh nặng nhất còn đối với chiPhytophthora thì mẫu PhBM10 gây bệnh nặng nhất

Hầu hết các mẫu nấm của 2 chiPythium và Pythophthora đều gây hại nặng trong thời gian

từ 20 NSC đến 40 NSC Riêng mẫu PyBM05 thuộc dòng Pythium lại thể hiện tính độc

nặng nhất ở 50 NSC.Ở lần nhổ cây cuối cùng (50 NSC), so với các dòng nấm thì PyTL07

đã thể hiện tính xâm nhiễm, tính độc của nấm bệnh ở tỷ lệ cao nhất và mẫu PyBM08 lại

thể hiện tính độc thấp nhất Ngoài ra, giữa 40 NSC và 50 NSC tính độc của nấm bệnh là tương đương nhau ở các mẫu PyBM06 và PyTL06

Cũng như tỷ lệ rễ bệnh sự khác biệt về chỉ số bệnh ở các mẫu nấm là do sự phát triển của mỗi bộ rễ ở các cây là khác nhau nên khả năng tấn công của nấm bệnh vào mỗi cây hoàn toàn khác nhau Ngoài ra, số liệu thu thập được cũng ở những thời điểm khác nhau cụ thể ở 10 NSC, 20 NSC,30 NSC, 40 NSC và 50 NSC Đó là nguyên nhân giải thích tại sao tính độc và khả năng xâm nhiễm ở các mẫu nấm ban đầu thì ít sau lại tăng và cuối cùng lại giảm

Hình 4.2 Cấp độ nhiễm bệnh trên rễ A: Cấp 0 (0%) B: Cấp 1 (1- 10%)

C: Cấp 2 (11 – 25%) D: Cấp 3 (26 – 35%) E: Cấp 4 (36 – 75%) F: Cấp 5 (> 75%)

Hình 4.3Triệu chứng rễ lài bị bệnh sau khi chủng của mẫu PyTL04 A: 10 NSC B: 20 NSC C: 30 NSC D: 40 NSC E: 50 NSC F, G: 30 NSC H: 40 NSC

Hình 4.4Triệu chứng rễ lài bị bệnh sau khi chủng của mẫu PhBM10 A: 10 NSC B: 20 NSC C: 30 NSC D: 40 NSC E: 50 NSC.F: 20 NSC G, H: 30 NSC

4.2 Kết quả phân lập lại tác nhân gây bệnh của các mẫu nấm sau khi chủng bệnh

Để xác định tác chính nhân gây bệnh thối rễ chết cây hoa lài thì việc phân lập lại

mẫu rễ sau khi chủng là điều rất cần thiết Nó thể hiện khả năng phục hồi và tính độc được tăng mạnh sau khi chủng.Các mẫu nấm sau khi chủng sẽ được phân lập lại và được tính theo tỷ lệ các mẫu rễ có nấm Pythium hay Phytophthora trên tổng số mẫu được cấy ở

10 NSC, 20 NSC, 30 NSC, 40 NSC và 50 NSC Kết quả phân lập thể hiện qua bảng sau

Bảng 4.3 Tần suất xuất hiện (%) của Pythium và Phytophthora sau các ngày chủng bệnh

Qua bảng 4.3 cho thấy tần suất xuất hiện của các mẫu nấm ở các thời điểm phân

lập là không cao Cụ thể ở 10 NSC, TSXH của các mẫu nấm là thấp nhất với 5,73% Ở 20

NSC, tỷ lệ có tăng ở các mẫu nấm và cao nhất ở mẫu PyTL09 với 25%, riêng có 2 mẫu nấm mà tỷ lệ TSXH có giảm so với 10 NSC là PyBM06 và PyTL06 (4,2%) Đối với 30 NSC tính độc và khả năng xâm nhiễm của hầu hết mẫu bệnh đạt cao nhất nên TSXH trung bình của chúng cũng đạt cao nhất với 13,55% Trong đó có 3 mẫu nấm có tỷ lệ cao nhất là PyTL09, PyTL02 và PhNB03 (25%) So với 30 NSC thì ở 40 NSC, TSXH có

giảm ở 9 mẫu nấm, trong đó mẫu có độ chênh lệch cao nhất là PhNB03 (21,8%) và đây cũng là thời gian phân lập có TSXH trung bình cao thứ 2 sau 30 NSC (11,73%) Tới 50 NSC thì tỷ lệ xuất hiệncủa các mẫu nấm đã giảm nhiều so với 40 NSC (12 mẫu nấm) Trong đó mẫu có tỷ lệ cao nhất là PhBM10 đạt 25 %

Điều này cho thấy khả năng thiết lập của ký chủ và ký sinh ở 2 nhóm nấm này trong điều kiện chủng bệnh chưa được ổn định Nguyên nhân có thể là do ảnh hưởng của các yếu tố khách quan như pH trong đất, điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm đã tác động lên khả năng phát triển của nấm bệnh sau khi chủng

4.3 Định danh Pythium bằng cách dựa vào các đặc điểm hình thái học

4.3.1 Kết quả khảo sát sự phát triển của Pythium trên môi trường CRA

Theo Đinh Thị Ánh Tuyết, 2011 thì tốc độ phát triển trên môi trường CRA của

nhóm Pythium là khá nhanh so v ới nhóm Phytophthoravới tốc độ sinh trưởng là 5,96 cm

ngày -1 và đường kính trung bình tản nấm của 1 NSC là 5,96 cmđến 2 NSC đã chạm vào thành đĩa Ngoài ra các đặc điểm hình thái của một số mẫu nấm cũng được thấy rõ trên môi trường CRA và được thể hiện ở bảng 4.4

Qua bảng 4.4 ta có thể dễ dàng thấy sự khác biệt giữa các mẫu nấm của chi Pythiumtrên

môi trường để từ đó có thể phân chúng ra 3 nhóm riêng và tạm đặt tên là A, B và C gồm các đặt điểm sau:

- Nhóm A: với đặc điểm là tạo được sợi nấm trương phồng trên môi trường nuôi

cấy CRA gồm 7 mẫu nấm là: PyBM06, PyTL07, PyTL09, PyTL02, PyBM08, PyBM05

và PyTL08

- Nhóm B: Dù không có sự hình thành sợi nấm trương phồng nhưng đã có sự hiện diện của túi bào tử, đặc biệt là bọc giả (vesicle) và các đặc điểm khác (sẽ được trình bày trong phần định danh Pythium) giúp cho việc định danh đến loài được dễ dàng hơn Đây

chính là đặt điểm của mẫu PyTL04

- Nhóm C: Đây được xem là nhóm mà các mẫu nấm không hình thành bất kỳ 1 đặc

điểm nào trên môi trường nuôi cấy CRA Gồm có 4 mẫu còn lại trong nhóm Pythium là:

PyTL10, PyTL05, PyNB02 và PyTL06

Bảng 4.4Đường kính sợi nấm trương phồng, túi bào tử của Pythium trên môi trường CRA