nghiên cứu tận dụng bã đậu nành bằng phương pháp lên men xopps bởi nấm sợi linh chi ( ganoderma lucidum ) và bào ngư(pleurotus florida) dùng trong chế biến thực phẩm

Trang 1

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HO CHi MINH

BAO CAO TONG KET DE TAI

” Nghiên cứu tận dụng bã đậu nành bằng

phương pháp lên men xốp bởi nấm sợi: Linh

chi (Ganoderma lucidum) và Bào ngư (Pleurotus florida) dimg trong chế biến thực

phẩm”

Cơ quan chủ trì : Viện Sinh Học Nhiệt đới

Chủ nhiệm để tài: Vũ Văn Ðộ, cán bộ nghiên cứu Viện SHNĐ

Cộng tác viên

Trang 2

Tên để tài” Nghiên cứu tận dụng bã đậu nành bằng phương pháp lên men xốp bởi

nam sgi: Nam linh chi (Ganoderma lucidum) va n&m bao ngu (Pleurotus florida) ding

chế biến thực phẩm”

Thời gian thực hiện: 12 tháng (từ tháng 01/2003 đến tháng 01/2004)

Cơ quan quản lý: Sở KH & CN TP.HCM Cơ quan chủ trì: Viện Sinh học Nhiệt đới

- Dia chi: 01 Mac Dinh Chi, Q.1, TP.HCM - Diénthoai: 8293007 — 8241346

Chủ nhiệm đề tài:

-_ Vũ Văn Độ, Thạc sỹ Sinh học Ngành chuyên mơn: Hố Sinh

- Địa chỉ: 180/3 Xô Viết Nghệ Tĩnh, P.21, Q.Bình Thạnh, TP.HCM -_ Điện thoại nhà: 8991113 DTDD: 098407758

NOLDUNG DANG KY

1: Chế biến và sử,dụng bã đậu nành để nuôi cấy nấm sợi (linh chỉ và bào ngư)

2 Phân tích các thành phân dinh dưỡng (như: đường, đạm, khoáng ) và hoạt

chất sinh học của nấm (các enzym, saponin — triterpen, aflatoxin) trong cơ chất trồng nấm, HHSKSNL & CC và nấm quả thể tương ứng

3 Bằng kĩ thuật biến đối sinh học tạo cho HHSKSNL & CC mùi và một số tính

chất tự nhiên khác gần giống của nấm quả thể

4 Chế biến từ HHSKSNL & CC một số sản phẩm thực phẩm (Bột giải khát, trà, bánh biscuire)

NỘI DUNG ĐÃ THƯC HIỆN

1 Chế biến và sử dụng bã đậu nành để nuôi cấy nấm sợi (linh chỉ và bào ngư)

2 Phân tích các thành phân dinh dưỡng (như: đường, đạm, béo, acid amin) và

hoạt chất sinh học của nấm (các enzym, saponin — triterpen, aflatoxin) trong

cơ chất trồng nấm, HHSKSNL & CC và nấm quả thể tương ứng

Trang 3

Mục tiêu của để tài

1 Sử dụng hai loài nấm lớn là: linh chi (Ganoderma lucidum) va bao ngu (Pleurotus

florida) để làm tác nhân phân hủy bã đậu nành sau công nghiệp sữa, phục vụ cho quá trình chế biến thực phẩm

2 Nghiên cứu sử dụng sinh khối sợi nấm lớn (SKSNL) như nguồn nguyên liệu mới

thay thế quá thể nấm trong việc chế biến các thực phẩm có chứa hoạt tính sinh học

của nấm hay còn gọi là thực phẩm chức năng

Tóm tắt nội dung đề tài

1 Xử lý ba đậu nành thành cơ chất thích hợp cho việc nuôi cấy từng loài nấm (linh chỉ và bào ngư), như pH, độ ẩm, độ xốp, đường, đạm

2 Theo đổi sự biến đổi thành phần hoá học của bã đầu nành trong qua Itrình nuôi

nấm sợi để có được sản phẩm đáp ứng yêu câu thực phẩm cho người, đồng thời có

được thông số thích ứng cho công nghệ sản xuất sau này

3 Khảo sát một vài hoạt tính của nấm làm chỉ tiêu so sánh chất lượng giữa SKSNL và quả thể để đánh giá kết quả của phương pháp để ra

4 Thử nghiệm phương pháp biến đổi sinh học để tạo cho HHSKSNL & CC có được mùi nấm và thúc đẩy quá trình tạo một số hoạt chất sinh học của nấm trong một thời gian ngắn

5 Xây dựng mô hình xử lý bã đậu nành bằng SKSNL ở qui mô pilot

6 Thử nghiệm chế biến một vài sản phẩm từ nguyên liệu đã qua xử lý, như bột giải

Trang 4

MỤC LỤC

1.LỜI MỞ ĐẦU

II TONG QUAN

1 Dau nanh va okara

2 Nấm và các hoạt chất sinh học từ nấm

3 Nấm Linh chỉ (Ganoderma lucidum)

4 Nấm Bào ngư (Pleurotus florida)

II VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu

2 Phương pháp

IV KẾT QUÁ VÀ BIỆN LUẬN

Phần I: Xử lý okara làm cơ chất nuôi trồng nấm linh chỉ và bào ngư

1 Xác định độ ẩm cơ chất 2 Xác định pH

3 Cái thiện độ nở

4 Cải thiện độ kết dính

5 Trọng lượng cơ chất bã đậu nành

6 Thời gian khử trùng cơ chất

Phần 2: Khảo sát đặc tính chủng giống nấm sử dụng 1 Ảnh hưởng các điều kiện lên enzym thủy giải của nấm 2 Khảo sát họat tính enzym thủy giải của nấm

Phần 3: Khảo sát sự biến đổi của okara sau khi nuôi cấy nấm 1 Biến đổi về thành phần dinh dưỡng

2 Biến đổi chất khó tiêu

._3 Thành phân acid amin

4 Sự thay đổi thành phần dinh dưỡng của HHSK SN & CC do xử lý Phần 4: Kiểm tra họat tính của sinh khối sợi nấm

1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn

2 Kiểm tra các chất có họat tính của tơ nấm linh chi

Phân 5: Thử nghiệm chế biến một vài sản phẩm từ HHSKSN & CC

I Chuẩn bị HHSKSN Linh chi va cơ chất

2 Biến đổi sinh học HHSKSN Linh chỉ và cơ chất

3 Chế biến thử nghiệm một vài sản phẩm

4 Một vài chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm

Trang 7

Đậu nành là một loại ngũ cốc quí, vừa là lương thực và vừa là thực phẩm, đây cũng

là nguyên liệu đặc biệt có thể tạo ra sữa cho con người Từ đậu nành, người Trung Quốc

đã làm ra hơn 200 sản phẩm khác nhau, góp phần rất lớn trong việc giải quyết nạn đói

kém ở một nước đông dân nhất thế giới này Ở Việt Nam, đậu nành được đưa vào trong

công nghiệp chế biến sữa, ngoài việc tách lấy sữa thì hàng năm thải ra lượng xác bã rất

lớn Xác bã này vẫn còn chứa nhiều đinh dưỡng, nhưng không thể làm thực phẩm cho con người, do có nhiều chất khó tiêu như cellulose Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp khả

đĩ có thể tận dụng được phế phẩm này để phục vụ lại con người là rất quan trọng Một

trong những giải pháp là sử dụng nhân tố vi sinh vật, trong đó có hệ sợi nấm lớn

Nấm lớn chủ yếu là nấm hoại sinh, thường được sử dụng như thực phẩm, thí dụ:

nấm rơm, nấm bào ngư, hoặc dược phẩm, như nấm linh chỉ, nấm vân chi So với nấm

mốc thì sinh khối sợi nấm lớn (SKSNL) thường ít tạo độc tố trong cơ chất, nhưng lại có

nhiễu hoạt chất sinh học (HCSH) Hệ men ngoại bào của nấm lớn, đặc biệt ở nấm phá gỗ, như cellulase, laccase, pectinase , giúp phân rã cơ chất rất nhanh Theo tác giả Geng-

Tao-Liu, Viện nghiên,cứu Khoa Y học Trung Quốc, SKSNL của linh chỉ (G lucidum va G capense), thu từ phương pháp lên men xốp và lên men chìm, đều có hoạt tính rất tốt

lên hệ thần kinh, tìm mạch, khả năng miễn dịch và chống oxit hoá (anti-oxydanÐ /1/ Các nghiên cứu của nhóm W.K.Liu và S.T.Chang, Đại học Tổng Hợp Trung Quốc ở Hồng Kông, cũng cho rằng SKSNL nuôi cấy lỏng có khả năng tăng tính miễn dịch và kháng ung

thư rất rõ Trong đó SKSNL của nấm thông (Tricholoma) tốt hơn hẳn nấm vân chỉ

(Coriolus) và linh chỉ (Ganoderma) /2/ Do đó, nhiều trường hợp, để có các HCSH của

nấm lớn người ta phải nuôi cấy SKSNL trong môi trường dịch thể với các nổi lên men kín

chịu áp Thời gian nuôi cấy tối thiểu từ 7-14 ngày Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều hạn chế, vì thiết bị đắt tiền, đễ bị nhiễm tạp do thời gian kéo dài /11/ Vì vậy công nghệ này đến nay chưa tiến hành được ở nước ta

Ở nhiều vùng trong nước, SKSNL được nuôi trồng trong bịch mạt cưa để thu quả

thể Thời gian nuôi tơ thường kéo dài khoảng 20 — 30 ngày Thời gian thu hoạch quả thể kéo đài khoảng 30 — 45 ngày Hoặc đặc biệt như nấm linh chỉ là một nấm dược liệu, thì

thời gian để một tai nấm hoàn chỉnh còn dài hơn (50 - 60 ngày) Như vậy, quá trình từ đầu

tới lúc thu hoạch hết nấm tối thiểu phải từ 60 - 75 ngày Bã thải có cả SKSNL còn lại được ủ làm phân hoặc bỏ đi

Để tài đặt ra là kết hợp xử lý bã đậu nành sau công nghiệp sữa với SKSNL nhằm

thu được “hiệu quả kép”, tạo được một dạng nguyên liệu mới cho công nghiệp chế biến

Trang 9

I DAU NANH VA OKARA

Đậu nành còn gọi là đậu tương, tên khoa hoe 1a Glycine soja Sieb et Zucc hay

Glycine Max (L.) Merill., thudc ho dau Leguminosae Hạt đậu nành có ba thành phần:

- Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt - Phôi hạt chiếm 2%

- Tử diệp chiếm 90%

Hạt thường chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, protein trung bình khoảng 38 — 40%, lipid ti 18 — 20% và rất giàu chất khoáng Hạt đậu nành còn có nhiều vitamin, trừ C và D, như các vitamin nhóm B hay các vitamin H, A, E, K

Trong công nghiệp chế biến sữa, xác bã đậu nành được thải ra sau khi tách sữa vẫn còn chứa nhiều dinh dưỡng, nên từ lâu được tái sử dụng cho chăn nuôi Tuy nhiên, nếu không sơ chế thì khó có thể bảo quản lâu và sản phẩm sau khi xử lý gọi là OKARA

Qui trình sơ chế OKARA (do Cty Vinamilk thực hiện) như sau:

Trang 10

OKARA qua phân tích có hàm lượng dinh dưỡng cao, bao gồm: đạm 39,8%; lipid 19,8%; đường 5,17%; khoáng 3,77%, nhưng hàm lượng các chất khó tiêu cũng khá cao, như cellulose 10,7 % Vì vậy không thể dùng làm thực phẩm cho người được, mà phải cần tiếp tục xử lý

II NAM VA CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ NẤM

Nấm là nguồn thực phẩm quí cho con người, ngoài khả năng cung cấp dinh dưỡng cần thiết, như đạm, đường, khoáng, vitamin, nhiều loài nấm còn giúp cải thiện sức khỏe,

ngăn ngừa và điều trị một số bệnh nan y, như tim mạch, ung thư Vì vậy những nước phát

triển cũng là nước tiêu thụ nhiều nấm nhất

Theo GS Kevelen (Đại học Tokyo, Nhật) tất cả các nấm ăn dùng thí nghiệm đều có khả năng ngăn cần sự phát triển của bệnh ung thư, thí nghiệm trên 230 chuột bị ung

thư kết quá có 84 con khỏi hòan tòan và 146 con khối u không còn tăng trưởng nữa

Theo Alhert Szent Gyoryi (Anh), retin và _promin trong cơ thể có xu hướng cân bằng, nếu lượng promin ting lên thì khả năng mắc bệnh ung thư cao hơn Ở nấm có rất nhiễu retin, vì vậy šá nấm sẽ ngăn được sự mất cân bằng này ở cơ thể

Theo Stephan Vove và các aha khoa hoc dai hoc Michigan (Hoa ky) cho rằng dịch

chiết từ bào tứ nấm giúp cho sự hình thành họat chất interferon có khả năng chống virus

và ung thư

Nam 1994, Lin Zhibin và Lei Lin sheng đã xác định được trọng lượng phân tử của

Polysaccharides tit G lucidum khodng 7.100 — 9.300 Những tổng kết về vai trò sinh-

được học của nhóm polysaccharides ở các loài nấm Linh chỉ đã được giới thiệu tại Hội

thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa Kỳ:

©_ He,Y.etal (1992) đã khảo cứu các BN3B — gdm 4 polysaccharide đồng nhất có

hoạt tính tăng miễn dịch Trong đó BN3B1 đựoc xác định là glucan ( chỉ chứa

glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside

nhiều polysaccharide Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư Đó là

các ganoderan B có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, làm giảm sinh tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan; đây chính là cơ SỞ trị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đường

e Các phức hợp polysacchrige — protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn dịch Người ta đã tiến hành lai hệ sợi bang pli ong pháp duag hợp Protoplast

gitta ching G lucidum véi G applanatum, thậm chí với cả nấm đông cô ( Lenfinus

edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các Ente hop polysaccharide — protein lén ding ké

Trang 11

e Gần đây tác dụng tăng sinh tổng hợp IL-2 ( Interleukine-2) va hoat tinh DNA

polymerase 6 chudt gid bdi polysaccharides đã soi sáng thêm khả năng trẻ hóa,

tăng tuổi thọ của các nấm linh chỉ

e Những nghiên cứu về polysaccharides không tan trong nước cũng chúng tỏ hiệu lực chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u vdi ty 16 %4 6 cdc loai G lucidum

va G applanatum

Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine —

triterpenoide — các acid ganoderic Vai trò cửa các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng

histamine, ttc chế Angiotensine Conversion enzym (ACE), tte ché sinh tổng hợp

Cholesterol và hạ huyết áp

Tóm lại, các họat chất có ở nấm có thể thuộc nhóm acid béo hay protein hoặc polysaccharid thậm chí các nucleotid Nhiêu nhóm protein chống dị ứng phổ rộng, điều hòa miễn dịch Nhóm polysaccharid chống ung thư tăng tính miễn dịch, tăng tổng hợp

protein, tăng chuyển hóa acid nucleic và trợ tìm Nhóm alcaloid trợ tìm Nhóm acid béo

có khả năng ức chế giãi phóng histamin Nhóm steroid giải độc gan, ức chế sinh tổng hợp cholesterol Nhóm triperpen hạ huyết áp do ức chế ACE (Angiotension Coversion

Enzym), bảo vệ gan, chống khối u

I NAM LINH CHI (Ganoderma lucidum)

III.1 Khái quát chung

Nấm linh chỉ còn có nhiễu tên gọi khác nhau như bất lão thảo, vạn niên nhung,

thân tiên thảo, mộc linh chỉ, trường thọ nhưng tên linh chỉ có lẽ là tiêu biểu và được gọi

phổ biến hơn Trong “ Thần nông bản thảo kinh” cách đây hơn 2000 năm, tên này đã được sử dụng Nấm Linh chi thuộc: Giới Mycota (Nấm) Lớp Basidiomycetes ( nấm đầm) Bộ Polyporales ( nấm lỗ) Họ Ganodermataceae Donk 'Về hình thái, nấm gồm 2 phần, mũ nấm và cuống nấm

Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xòe hình quạt Trên mặt mũ có vân gợn

đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, mầu sắc từ vàng nâu - vàng cam — đồ cam — đồ nâu —

nau tim ~ nâu đen Bề mặt mũ nhấn bóng, láng như vecni Kích thước tán biến động từ 2

— 30 cm, dày 0.8 — 2.5 cm

Cuống dài từ 2.5 — 25 cm, tròn mập hoặc mảnh Cuống thường đính một bên hoặc

lõm sâu vào giữa tâm, phần đính cuống có thể gỗ lên hoặc lõm xuống

Trang 12

Cơ quan sinh sản nằm ở mặt dưới của tai nấm bao gôm các ống nhỏ, thẳng, miệng tròn, đảm mang 4 đầm bào tử hình trứng Bào tử đảm có cấu trúc vỏ kép, lõm ở đầu, màu

vàng mật ong sáng

Nấm Linh chỉ phân bố khắp nơi trên thế giới, thích nghỉ với nhiều loại cây kể cả

tre trúc, dừa, cau, và nhiều điều kiện khí hậu khác nhau Dựa trên các yếu tố sinh thái và khí hậu, các nhà khoa học Trung Quốc đã chia linh chỉ thành 4 nhóm sau :

Nhóm nhiệt đới và cận nhiệt đới: là nhóm tương đối đông, phát triển ở nhiệt độ và

độ Ẩm cao như G hainanense, G atrum, và tất cả các loài Amawroderma * Nhóm sống trong vùng nhiệt độ trung bình, ít mua: G sinense, G lucidum

Y Nh6m ua thich vùng nhiệt độ thấp và mưa rất it: G tsugae

* Nhóm thích nghỉ với khoảng nhiệt độ và độ ẩm rộng như G applanatum [15 ] Ở Việt Nam, nấm linh chỉ thường mọc trên các cây, như: phượng vĩ ( Delonix

regia), so dita, ( Sesbania grandiflora), One hay lim ( Samanea saman), Ngoai ra con

gap nhiéu trên các cây khác đã chết, gỗ mục kể cả cây còn sống Căn cứ trên hiện tượng, gây mục trắng, mục nâu cây gỗ, người ta coi các nấm linh chỉ là nấm phá gỗ mạnh

Chu trình sống của nấm linh chỉ gồm 3 giai đoạn:

*_ Các bào tử đơn bội khi gặp điểu kiện thuận lợi sẽ nẩy mâm tạo ra hệ sợi sơ cấp

(primary hyphae) Hệ sợi sơ cấp đơn nhân đơn bội mau chóng phát triển, phối hợp với nhau tạo ra hệ sợi thứ cấp hay còn gọi là hệ sợi song hạch (dicaryon hyphae) Khi hệ sợi thứ cấp phát triển, thường có sự hình thành bào tử vô tính màng dày hoặc rất dày Chúng

Trang 13

* Giai đoạn phân hóa hệ sợi : có sự bện kết hệ sợi để chuẩn bị cho sự hình thành

mầm mống quả thể

II2 Nuôi trông nấm linh chỉ

Qui trình trồng nấm linh chỉ phổ biến tóm tắt theo sơ đồ sau: Mùn cưa Tai nấm tươi Cây gỗ mềm Tr6n co Ỷ Cưa khúc, chất, đóng Giống sốc đục lỗ túi 2 oe:

Cấy giống Cấy giống

Sơ đồ 2 : Oui trình nuôi trồng nấm linh chi

Hiện nay có hai công nghệ nuôi trồng nấm linh chỉ: trồng trên gỗ khúc và trồng trên cơ chất hỗp hợp Các loại mùn cưa, vồ bào, rơm rạ, bã mía, đều có thể trở thành nguyên liệu tốt

Qui trình nuôi trồng linh chỉ thu quả thể thường phải kéo dài nhiều tháng và thời gian để tai nấm linh chỉ hòan chỉnh mất hơn 60 ngày

II.3 Dược tính của nấm linh chỉ

Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm nay ở Trung Quốc

và người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính của linh chỉ Đa số các loài linh chỉ đều

có vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng tim, chữa trị tức ngực

+ Đối với các bệnh tim mạch: Hàng loạt các hoạt chất của linh chỉ được chứng tổ có

tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cholesterol, kùm hãm quá trình kết tụ tiểu cầu Các nghiên cứu này đã củng cố cho kết quả trị liệu các bệnh nhân cao huyết áp, nhiễm mỡ xơ mạch, bệnh mạch vành tim, Hầu hết các bệnh nhân có chuyển biến tốt sau

Trang 14

một vài tuân, huyết áp ổn định dan, không xảy ra tác dụng phụ như các loại thuốc

tân dược

Nhiễu nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng vết hiếm

Vanadium (V) có tác dụng ức chế enzym ACE và chống tích đọng cholesterol trên thành mạch, Germanium (Ge) giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô Hiện nay, chỉ số Ge trong các được phẩm linh chỉ được xem như là một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị bệnh tim mạch và trong trị liệu ung thư, {4} + Hiệu quả chống ung thư : Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hóa trị, giải

phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thu da day có thể kéo dài thời gian sống cho người bệnh, tỷ lệ những người sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm

Nhiều thông tin ở Đài Loan coo biết nếu dùng nấm linh chi trồng trên gỗ long não diéu trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết gủa rất tốt - khối u tiêu biến hồn tồn Cơng trình của G§ Zhibin Lin et al (1994) đã chỉ ra nguyên lý hiệu dụng là tăng khôi phục hệ miễn dịch, nhờ đó các phác đồ trị liệu: xạ trị, hóa trị, giải phẫu đạt kết quả

cao hon [1]

+ Kha nang khang HIV : Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong nấm linh chỉ (Ganoderma lucidum), người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virus HIV-I trên các tế bào Iympho T ở người Sự nhân lên của virus được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bể mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV-1 Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virus này

Do đó, nhiều quốc gia đã đưa linh chỉ vào phác đổ điều trị tạm thời, nhằm tăng

cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI,

DDC còn hiếm và rất đắt [14]

“ Kha năng kháng oxit hóa (antioxydant): Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine — triterpenoids, ma trong d6 ganoderic acid dude coi 1a hiệu quả nhất

Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo In làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh — vào nấm linh chỉ

+ Ngoài ra, việc trị liệu đối với các bệnh nhược cơ, bệnh gan, bệnh tiết niệu cho kết quả khả quan Năm 1998, tại Nhật Bản có khoảng 300 bệnh nhân bị nhược cơ được điều trị thành công bằng linh chỉ và không gây bất kì tác dụng phụ nào

Trang 15

Iv NAMBAONGU (Pleurotus florida)

IV.1 Khai quat chung

Nấm bào ngư là tên dùng chung cho các loài thuộc giống Pleurotus Theo Singer

(1975) có tất cả 39 loài khác nhau và chia làm 4 nhóm Trong đó có hai nhóm lớn:

e Nh6m “va nhiệt trung bình” ( ôn hòa) kết quả thể ở nhiệt độ từ 10 — 20°C

e Nhóm “ ưa nhiệt” tạo quả thể ở nhiệt độ 20 - 30C Đây là nấm có nhiều lồi được

ni trồng nhất ở Pháp, có 7 loài ( P cornucopiae, P ostreatus, P sapidus, P florida, P du Quebec, P columbinus, P pulmonarius)

Ở các nước Châu Á còn thấy có loài P ƒlabellatus, P abalonus, P sajor — caju, P corticatus,

Ở Việt Nam, nấm bào ngư trước đây chủ yếu mọc hoang dại và có nhiều tên gọi khác nhau: nấm sò, nấm hương trắng, nấm chân ngắn ( miễn Bắc), nấm dai ( miền Nam) Việc ni trồng lồi nấm này bắt đầu từ khoảng 20 năm trở lại đây với nhiều chủng loại:

P florida, P ostreatus, P pulmonarius, [2]

Đặc điểm chung của nấm bào ngư là tai nấm dạng phễu lệnh, phiến mang bào tử kéo dài xuống đến chân, cuống nấm gần gốc có lớp lông nhỏ mịn Tai nấm bào ngư còn

non có màu sắc sậm hoặc tối nhưng khi trưởng thành màu trở nên sáng hơn

Trang 16

Nấm bào ngư thuộc nhóm phá gỗ, sống chủ yếu hoại sinh, một số loài còn có đời

sống ký sinh như P ostreatus, P eryngii Phần lớn cơ chất trồng nấm đều chứa nguồn cellulose Tuy nhiên, đa số trường hợp cellulose bao giờ cũng thấp hơn 50% còn lại là lignin, hemicellulose va khodng

Nấm bào ngư có khẩ năng sử dụng tốt mọi nguén hydratcarbon nhờ vào hệ thống

enzym thủy giải mạnh, như: cellulase thủy giải cellulose, hemicellulase thủy giải

hemicellulose, laccase thủy giải lignin, Tỷ lệ nguồn carbon đối với đạm ( C/Ñ) tốt nhất ở

khoảng 20 — 30 và khơng q 50

Ngồi các chất dinh dưỡng, sự tăng trưởng và phát triển của nấm còn liên quan đến nhiều yếu tố khác như : nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, pH, oxy

TV.2 Nuôi trồng nấm bào ngư

Trong tự nhiên, nấm bào ngư mọc phổ biến trong các khu rừng, trên các cành cây gẫy, gốc cây chết hoặc các khúc.cây bị đốn, hình thành dam dạng quạt, hơi trắng Khi thu hoạch, chóp quả thể có đường kính từ 5 — 15 cm ( có thể lên đến 20cm) [16]

Nấm bào ngư đã được nuôi trồng ở nước ta cách đây hơn 20 năm và là loài có thể

trồng trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau nhất Ngoài cách trồng cổ điển trên gỗ khúc, trên mạt cưa, nấm bào ngư còn cho năng suất cao ngay cả trên những loại nguyên liệu xốp như rơm rạ, bã mía, cùi bắp, thân vỏ cây đậu, bông phế thải Nói chung, nấm có khả

năng sử dụng tốt mọi nguồn hydratcarbon, nhất là cellulose Hoạt động này là nhờ vào hệ thống enzym thủy giải mạnh như : cellulase, hemicellulase, xylanase, laccase

Qui trình trồng nấm bào ngư được tóm tắt như sau : Nguyên liệu

(Ram bi mia chi ban.)

Phơi khô, làm ẩm với nước vôi :

0.5%, bổ sung ure 3%e h0 Túi cơ chất

Trộn giống, vào túi, Khử trùng, cấy giống,

nuôi ủ 15-25 ngầy nuôi ủ 15-25 ngày

Túi phôi Túi phôi

Trang 17

IV.3 Giá trị đỉnh đưỡng và được tính của nấm bào ngư

Ở châu Âu, nấm bào ngư xếp thứ hai trong các loài nấm ăn (chỉ sau nấm mỡ — Agaricus bisporus) Nấm không những ăn ngon mà còn có nhiều tính chất quý và quá trình sản xuất không dùng phân bón hay hóa chất Do đó, nấm bào ngư được coi là loại

rau an toàn cho người tiêu dùng

Nấm bào ngư có rất nhiều đường, hơn cả nấm rơm, nấm mỡ, nấm hương Về đạm và khống khơng thua gì các loài nấm kể trên Protein ở nấm bào ngư là 4.6%, trong khi ở

nấm rơm chỉ có 3.6%, nấm mèo là 1.06% Hàm lượng lipid cia ném bao ngu 1a 0.8%,

nấm rơm 0.3%, nấm mèo 0.2% [6]

Xét về năng lượng, nấm bào ngư cung cấp năng lượng ở mức tối thiểu và thích hợp

cho những người ăn kiêng

Chỉ số acid amin không thay thế EAI ( essential aminoacid index) được xác định

bằng cách so sánh với acid amin không thay thế của trứng gà Chỉ số EAI của một số loài nấm bào ngư như sau :

P sajor — caju 65.24 P cornucopiae 48.08 P ostreatus 4733

Nấm bào ngư có giá trị dược liệu tuyệt vời Người ta đã phát hiện được chất kháng

sinh, gọi là pleurotin Chất này ức chế hoạt động của vỉ khuẩn Gram dương ( Robins và

cộng sự, 1947) Bên cạnh đó, Yoshioka và cộng sự (1975) cũng tìm thấy hai

polysaccharide có tính kháng ung bướu Cả bai đều có nguồn gốc là glucose Trong đó, chất được biết nhiều nhất bao gdm 69% B (1-3) glucan, 13% galactose, 6% mannose, 13% uronic acid Pleuran được thu nhận từ nấm bào ngư là một B 1-3/1-6-glucan, chất này có

hoạt tính kháng ung thư ở liễu lượng rất thấp 0.1 mg/kg [17]

Thử nghiệm về ung thư trên chuột bạch cho thấy dùng nước nóng chiết xuất nấm

bao ngu P ostreatus c6 thể làm tiêu hoàn toàn khối u với ty lệ 50% chuột

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc thì nếu ăn nấm bào ngư với

lượng 2.5g/kg sau 40 ngày lượng cholesterol trong máu giảm xuống chỉ còn 193.12mg

Nếu đùng với lượng cao hơn gấp đôi thì sau 40 ngày lượng cholesterol trong máu chỉ còn

128.57mg

Nhiều loài nấm bào ngư có tác dụng ức chế sự phát triển của khơng ít lồi vi khuẩn

nhu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium phlei, Bacillus subtilis, Klebsiella

pneumoniae, Escherichia coli, [6]

Trang 18

VẬT LIỆU VÀ

Trang 19

1 VAT LIEU

1.1 Đối tượng

- Bã đậu nành: sản phẩm sau công nghiệp sữa do Vinamilk cung cấp

- Chủng nấm: bào ngư (Plewrofus florida) va linh chi (Ganoderma lucidum) do Bộ môn Vi sinh Đại học KHTN TP HCM cung cấp

1.2 Môi trường dinh đưỡng

1.2.1 Môi trường nhân giống: PGA và PG Môi trường PGA Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g Nước đủ 1.000 ml PH =6,5 Khử trùng ở 121°C/40°

Môi trường PG, giống với PGA chỉ không có agar

1.2.2 Mỗi trường thí nghiệm

Bã đậu nành bổ sung nước để có độ ẩm thích hop

II PHƯƠNG PHÁP

TI.1 Nội dung nghiên cứu

1 Chế biến và sử dụng bã đậu nành để nuôi cấy nấm sợi (linh chỉ và bào ngữ) 2 Phân tích các thành phần đinh dưỡng (như: đường, đạm, béo, acid amin) và hoạt

chất sinh-học của nấm (các enzym, saponin, triterpen ) trong cơ chất trồng nấm, HHSKSNL & CC và nấm quả thể tương ứng

3 Bằng kĩ thuật biến đổi sinh học tạo cho HHSKSNL & CC mùi gần giống của nấm

quả thể và một số tính chất tự nhiên khác

`4 Chế biến từ HHSKSNL & CC một số sản phẩm thực phẩm (Bột giải khát hay trà,

bánh biscuire)

TI.2 Phương pháp tiến hành 1.2.1 Đối với bã đậu nành

1I2.1:1 Xử lý bã đệu nành

Để có nguyên liệu thích hợp cho nuôi cấy hai lọai nấm (bào ngư và linh chỉ)

- Về độ ẩm: thay đổi độ ẩm trong nguyên liệu từ 40, 50, 60, 70% bằng cách bổ

sung nước và đo bằng máy đo độ ẩm tự động hiệu Denver của Mỹ Nguyên liệu cho vào các túi PP, mỗi túi chứa 150g, khử trùng ở 1219C/ 90°C Sau khi để nguội, cấy giống và

theo đổi khả năng lan tơ của tơ nấm

Trang 20

- Về độ nở: bã đậu nành được chuẩn bị độ ẩm thích hợp và thực hiện ba cách khác nhau:

Bã đậu nành + nước lạnh Bã đậu nành + nước nóng Bã đậu nành hấp chín

TU ng liệu cho vào ống nghiệm và túi nylon, mỗi ống chứa 15- 20g bã đậu nành đã xử lý và mỗi túi chứa 150g Khử trùng ở 121°C/ 90” Sau khi để nguội, cấy giống và

theo đổi tốc độ ăn lan của tơ nấm

- Về độ xốp: bã đậu nành được hấp bằng xửng và áo bằng bột mì từ 0, 1, 3, 5, 10, 15 đến 20% Phân vào ống nghiệm và túi nylon, mỗi ống 15- 20g cơ chất và mỗi túi 150g Khử trùng ở 121°C/ 90” Sau khi để nguội, cấy giống và theo đổi tốc độ lan tơ nấm

II.2.1.2 Xác định | tỉ lệ CN

- Xác định C tổng số bằng phương pháp Eulop, Grinden (1967), Xưlencop (1963) Oxid hóa carbon bằng Kalibicromat, định lượng Kalibicromat để biết được lượng carbon tổng số có trong cơ chất

- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldahl Chất đạm có trong cơ chất được vô cơ hóa dưới dạng ammonium sulfat, khi cho tác dụng với chất kiểm mạnh như NaOH

sẽ phóng thích ra ammoniac Sau đó lượng ammoniac được hơi nước lôi cuốn bằng dụng

cụ máy Parnas-Wargner và được dẫn tới một bình tam giác có chứa lượng thừa H;SO¿ Từ đây cho phép chúng ta xác định được lượng ammoniac được phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu

% N = 100 14 AV x 10%/a

AV: Vo~— VI (hiệu số thử không và thử thật)

x: hệ số chỉnh lý NaOH N/100 bằng acid oxalic a: khối lượng nguyên liệu

H.2.1.3 Xác định hàm lượng đường tổng số hòa tan

Chiết rút đường bằng cồn nóng, nồng độ 96”, sau đó là 80° Dun nhe cho bay hoi

hết cổn Thực hiện phẩn ứng thử màu vời thuốc antron Sau đó làm lạnh trong nổi nước đá, để nguội và đo mật độ quang ( ở bước sóng 630 nm Dựa vào đường chuẩn, suy ra nồng độ x trong ống, từ đó tính được nông độ đường trong mẫu

1.2.1.4 Phuong pháp xác định đường khử J8]

Trong môi trường kiểm, đường khử kết hợp với kalifericyanur tạo thành kaliferocyanur Với sự c6 mat ctia gelatine, kaliferocyanur kết hợp với sắt sulfat tạo hành phức chất màu xanh bền

Trang 21

Phần ứng như sau: H OH | | K;Fe(CN)+C=O ————* K#e(CNx + CH=O (CHOH); (CHOH), CH;OH CH;OH

KyFe(CN), + 2FeSO¿s; ———> Feu[Fe(CN)]s + 6 K2SO4

Cường độ màu được xác định trên máy so mầu và đường chuẩn Phương pháp này

cho phép xác định khối lượng đường rất thấp trong dung dịch

H.2.1.5 Phương pháp xác định hàm lượng lipid thô (pÐ 'TAPPI- 1931)

Mẫu được nghiên nhỏ và sấy 6 105°C đến trọng lượng không đổi, sau đó trích ly

lipid ra khổi nguyên liệu bằng cther dầu boả hoặc cther ethylic trên máy soxhlet và xác

định khối lượng chất béo Công thức tính hàm lượng lipid

— (a-b).100

x= c

Trong đó:

X : Hàm lượng lipid (%)

a : Trọng lượng giấy lọc và mẫu trước khi chiết (g) b : Trọng lượng giấy lọc và mẫu sau khi chiết (ø) c : Lượng mẫu dùng để phan tich lipid (g)

11.2.1.6 Phương pháp xác định cellulose [9] theo TCVN 4329 — 1993

Hoà tan mẫu trong H;SO¿ 1,25% và sau đó đem hoà tan tiếp các chất tan trong KOH 1,25% Lọc qua giấy lọc và rữa bằng nước cất nóng Rửa sạch chất béo bằng côn 96° va eter etylic (1 : 1) Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 105°C đến trọng lượng không đổi Hàm lượng xơ thô trong mẫu thức ăn tính bằng phân trăm theo công thức: % xơ thô = (m¡ - m;) x100/m Khối lượng cốc lọc và mẫu trước khi nung (g) my,

mạ : Khối lượng cốc lọc và mẫu sau khi nung (g) m : Khối lượng mẫu(g)

Trang 22

IL2.2 Phương pháp nuôi cấy sợi nấm linh chỉ và bào ngư trên bã đậu nành Bã đậu nành Tạo ẩm Ỳ Cơ chất trồng nấm Vào túi, thanh trùng ở Ỷ 121°C/ 90 phút Tui cơ chất ( 150g, 300g, 500g) Cấy giống, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng v To ném moc kin bich Sơ đô 6 : Qui trình nuôi cấy sợi nấm linh chỉ và bào ngữ trên okara 11.2.3 Hoat tính enzym

1.2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tinh cia enzym protease [17]

Phương pháp Anson: dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của cnzym protcase trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phan ting bằng phản

ứng màu với thuốc thử folin Lắc đêu đo mật độ quang ở bước sóng 660nm Dựa vào đồ thỉ chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sắn phẩm thủy phân dưới tác dụng

của enzym protease

Một đơn vị hoạt tinh (dvht) enzym protease được xác định là lượng enzym để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 ug tyrosine trong 1ml địch lọc dưới điều kiện thí nghiệm

Hoat tinh enzym protease (dvht/ g) = (A — Ao) * F * 1/100 *n

A : Độ hấp thụ của mẫu

Ajo : Độ hấp thụ của mẫu đối chứng

F :ˆ Lượng tyosine từ đường chuẩn (Hg) n : Hệ số pha loãng của enzym

1/100 : Hệ số chuyển đổi

Trang 23

1I2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tinh enzym amylase [11]

Hoạt tính enzym amylase xác định theo phương pháp Smith và Roe (1996) Hoạt

tính biểu thị bằng khả năng enzym amylase xtic tac thủy phân tỉnh bột đến cdc dextrin trong 1 phút ở 50°C và được thể hiện bằng số đơn vị cửa enzym đó trong | gam mẫu Khi

phần ứng thủy phân tỉnh bột xây ra, lượng tỉnh bột còn lại chưa được phân huỷ sẽ có phần ứng màu với iod và được đo bằng máy so màu quang học bước sóng 595 nm

Đơn vị hoạt tính được tính theo công thức: (Bạ- E,) x Cx L Ul = Eaxt Mật độ quang học của ống chuẩn Mật độ quang học của ống thử Lượng tỉnh bột ban đầu tham gia phần ứng ( 10 mg) Thời gian phần ứng (30 phút ) Hệ số pha loãng m“omm HE

II.2.3.3 Phương pháp xác định hoại tính của hệ ensym cellulase [L1]

Phương pháp Schinner-von Mersi: hoạt tính enzym cellulase được tính bằng khả năng sử dụng CMC ( carboxyl methyl ccllulose) như cơ chất, phóng thích các phân tử

glucose Dựa vào hàm lượng glucose, xác định hoạt tính ctia enzym cellulase

Don vị hoạt tính (đvht) của enzym cellulase được xác định như sau: 1 đvht tương ứng với lụg glucose trong thời gian thuỷ phân cơ chất CMC trong l phút ở nhiệt độ phòng ` ; A(ug/ ml) * 7 * 40 *n*V Đvht /g MT/ phút = m*y*24 * 60 A Ham luong glucose (g/ml) trong dich thi nghiém da pha loang N Hệ số pha loãng 7: Thể tích của hỗn hợp phản ứng 40 : Hệ số pha loãng dịch lọc

Thể tích dich enzym thi nghiém (ml) Thể tích dich enzym ban đầu (ml)

m_ : Khối lượng chế phẩm cnzym sử dụng (8)

mt : Môi trường

<<

Trang 24

1I.2.3.4 Phương pháp định tính enzym laccase

Phần ứng với œ - napthol cho thấy sự có mặt của laccase Một giọt dung dịch rượu — nước của œ - napthol ( 2.5 g œ - napthol, 50ml etylic 95%, 50ml nước cất) nhỏ trên rìa

đang phát triển của khuẩn lạc nấm Phần ứng dương tính (+ ) khi sợi nấm nhuộm màu tím hay đỏ tối

II.2.3.5 Phương pháp định tinh enzym tyrosinase

Phần ứng với B - cresol cho thấy sự tổn tại của tyrosinase Một giọt dung dịch 1% B - cresol trong nước cất nhỏ lên rìa khuẩn lạc đang phát triển và lên tâm khuẩn lạc Phản

ứng (+) khi sợi nấm nhuộm màu dé — nau (gạch) hay cam — nâu

112.4 Phương pháp tăng mùi nấm

Trong quá trình nuôi trồng nấm ăn, khi tơ nấm đã mọc kín cơ chất, người ta tiến hành rạch bịch để cho tơ nấm tiếp xúc với không khí, nước, ánh sáng, và hình thành nên quả thể có mùi nấm đặc trưng Tương tự; bằng một số tác động về mặt cơ học và hóa học

lên SKSNL nhằm kích thích hoạt động của các cnzym và phần ứng hóa học làm tăng mùi nấm của sợi nấm Nguyên liệu : Hén hop sinh khối sợi nấm và cơ chất (HHSKSN & CC) Xử lý cơ học : + Cắt hỗn hợp tơ nấm và cơ chất thành sợi nhỏ, mảnh để làm tăng diện tích tiếp xúc

+ Nghiễn nát hỗn hợp SKSNL và CC giúp cho quá trình tự phân xây ra tốt hơn, nhanh hơn và cũng làm tăng bể mặt tiếp xúc hơn

Xử lý hóa học : Sứ dụng các tác nhân như không khí, oxy, NaCl, Na2CO3 Sau khi

được xử lý bằng các tác nhân trên, trong SKSNÑ xẩy ra các quá trình biến đổi mùi theo chiều hướng làm tăng mùi nấm `

Bảng 5 : Các phương thức xử lý HHSKSN & CC để tăng mùi nấm Mẫu Cách xử lý Mẫu Cách xử lý

1 Đối chứng cắt 6 Xay + O¿

2 | Đối chứng xay 7 |Xay+2% NaCl

3 Cắt + không khí 8 | Xay + 2% NaCl + Oz

4 Xay + không khí 9 Xay + 1% Na;CO› + O¿

5 Cat +O» 10 Xay + 1% Na,CO3+ Oz

Các mẫu trên được cho vào bịch nilon, mỗi bịch 100g Theo dõi sự biến đổi hang ngày về mùi vị, màu sắc,

Trang 25

11.2.5 Thử nghiệm chế biến một số sản phẩm từ HHSKSN & CC

1I.2.5.1 Chế biến bánh biscuit [7]

4% Nguyên liệu :

- 1 qua tritng ga - 220g sữa đặc có đường

- 150g đường nhuyễn -_ 1 muỗng cà phê bột nổi

- 1 chút va-ni - _ 1 muỗng cà phê thuốc tiêu mặn - 60g bd dé mém - 300g bét mi + 80g bột bắp

Bổ sung HHSKSN & CC đã được sấy khô ở 45° C và xay thành dạng bột mịn màu

nâu, có vị đắng, tỷ lệ 5% và 10% so với nguyên liệu làm bánh

+ Cáchlàm :

-_ Trứng gà đánh nổi với đường, cho bơ và sữa đặc vào

-_ Rây bột mì và bột bắp xuống bàn, cho thuốc tiêu mặn, bột nổi, va-ni và bột SKSNL & CC vào, trộn đều

- Khoét một lỗ ở giữa, cho trứng gà đã đánh nổi với đường, bơ, sữa vào, trộn đều

tay, nhồi lại bột cho đều và mịn là được Day lại bằng khăn ẩm, ủ 1 giờ

- Cán bộtcho mỏng khoảng 3 ly, dùng khuôn bánh biscuit, ấn ra từng bánh, đem nướng lửa trung bình Bánh chín vàng và đều là được

Trang 26

Từng hỗn hợp được trộn đều, đóng thành túi ( 10g/ túi)

+% Cách dùng : Pha 10g hỗn hợp trong 75ml nước đun sôi để lạnh hoặc nguội

11.2.5.3` Thử nghiệm chế biến trè túi lọc: Mỗi túi chứa 3 g bột sinh khối nấm linh chỉ

Cách dùng: pha trà bằng nước nóng Mỗi gói dùng cho một tách trà 11.2.6 Khảo sát khả năng kháng khuẩn

s* Đối tượng :

-_ Vi khuẩn Gram dương : Bacillus subtilis

- Vi khuẩn Gram âm : E coli, Coliforms - Môi trường : Nutrient agar

+» Cách tiến hành :

- Đổ môi trường lên đĩa petrị vô trùng

- Dùng que cấy vòng cấy chuyển một ít sinh khối vi khuẩn từ ống giống qua các ống nghiệm chứa nước muối sinh lý vô trùng

-_ Dùng pipetman hút 0.1ml dịch vi khuẩn ở trên vào các đĩa môi trường

-_ Trải đều bằng que gạt thủy tinh

- ˆ Đặt lên mỗi đĩa 5 miếng HHSKSN & CC đã được nuôi cấy trong bịch ( đường kính

mỗi miếng khoảng 1cm)

-_ Ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng

- _ Quan sát kết quả thu được

1I2.7 Phương pháp xác định các chất có hoạt chất sinh học

II.2.7.1 Phương pháp định tính Alcaloid

Chuẩn bị mẫu

Ngâm bột nguyên liệu trong dung địch acid H;SOu loãng 1%, sau đó cho lên nổi

đun cách thủy trong 15 phút

Lọc nước chiết, từ đây có thể định tính được alkaloid

Cách tiến hành

Dùng các loại thuốc thử sau:

Thuốc thử Mayer: 1.35g HgCl; hòa tan trong 100ml dung dich KI 5% Cac alkaloid

sẽ tủa vô định hình màu trắng vàng

Thuốc thử Dragendorƒƒ (xác định theo Munier va Macheboeuf)

Dung dich A: 850mg bismutnitrate baz hòa tan trong 40 ml nuéc va 10 ml acid

acetic bang

Trang 27

Trộn 2 thể tích bằng nhau của 2 dung dich A va B để làm thuốc thử Các alkaloid

cho tủa màu vàng cam đến đỏ

Thuốc thử Wagner: hòa tan 5g l› trong 100 ml dung dịch KI 10% Các alkaloid cho tủa màu nâu sáng đến nâu đen (phân lớn ở dạng tủa bông hoặc bột, đôi khi tạo thành giọt

dầu có màu nâu đen)

1I.2.7.2 Phương pháp định tính Saponin

Chuẩn bị mẫu

Cho vào ống nghiệm 0.5g bột dược liệu, thêm vào 5ml cồn etylic 70”, đun cách

thủy 5 phút rồi lọc Cô bốc hơi dịch lọc cho đến cặn khô Dùng cặn để làm các phần ứng định tính Cách tiến hành Phản ứng tạo bọt: Cho cặn khô vào ống nghiệm, thêm 2 mÌ nước Lắc mạnh doc theo thành ống, nếu có bọt bền (1 giờ) là có saponin ˆ

Phân ứng Liebermann — Burchard:

Cho vào cặn 1ml alhydric acetic khuấy kỹ cho tan, 1ml CHC1 để lạnh O°C, 1 giọt

H;SO¿ rồi quan sát Phản ứng dương tính là cho màu vàng lục tới lục 1.2.7.3 Phương pháp dinh tinh Triterpenoid

Chuẩn bị mẫu

Ngâm bột dược liệu trong cồn 96” / 24h, sau thu dung dịch và ngâm tiếp ba trong côn 70° 24h, tiếp tục làm như vậy với cồn 45”, gộp 3 dung dịch lại và cô quay ở 50°C để đuổi dung môi, ta có dịch cồ đặc chứa triterpenoid để làm phản ứng định tính

Thuốc thử vanilin — acid phosphoric:

Hòa tan 1g vanilin trong dung dịch nước acid orto-phosphoric 50% (100ml) cho

vài giọt thuốc thử, sản phẩm cho mau dé hay tim xanh dưới ánh sáng thường

Phân ứng Liebermann — Burchard: phương pháp sắc ký lớp mỏng Cho hấp phụ trên bản mồng là SiO; G

Dùng hệ dung môi CHC]; — MeOH- H;O tỷ lệ (61 : 32 : 7)

Dung dịch phun xịt bản: trộn cẩn thận alhydric acetic (5ml) và H;SOx (5ml) để nguội, rót methảnol (50m]) vào hỗn hợp trên

Phun xịt lên bảng mỏng sau khi đã chạy sắc ký Say 6 110°C Néu có mầu hồng kết

luận có triterpenoid

Trang 28

1I.2.7.4 Phương pháp định tính Steroid Phần ứng Salkowki:

Hòa tan 1-2 mg mẫu trong CHC]; và nhỏ vào 1ml H;SO¿ đậm đặc Phần ứng dương tính là cho màu đồ sẫm; xanh; xanh tím

IL2.8 Phương pháp xác định hàm luợng acid amin bằng sắc ký lồng cao áp

(HPLC) theo phương pháp PICOTAG

(do Trường Đại học Nông Lâm TP HCM phân tích)

Trang 29

KẾT QUÁ

Trang 30

PHAN1

XU LY OKARA LAM CO CHAT NUOI NAM LINH CHI VA BAO NGU L XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM CƠ CHẤT

OKARA được làm ẩm bằng nước với độ ẩm khác nhau 30, 40, 50, 60, 70 (%) So sánh tốc độ ăn sâu của tơ nấm Linh chỉ và Bào ngư cho bởi đồ thị I và ảnh 1 và 2 ElLinh chỉ RNHBäo ngư & we 'Độ ăn sâu (mm/ ngày) * ° Đó ẩm (%)

Đồ thị 1: So sánh độ ăn sâu của tơ nấm LC và BN theo các độ ẩm cơ chất khác nhau

Kết quả cho thấy độ ẩm quan trọng đến việc tăng trưởng của hệ sợi nấm Độ ẩm thấp

làm sự hấp thu dinh dưỡng của nấm chậm lại, dẫn đến sự tăng trưởng của hệ sợi cũng bị

ảnh hưởng theo, ngược lại ở độ ấm 70% tốc độ ăn sâu của tơ nấm Linh chỉ và Bào ngư đều tốt nhất Tuy nhiên, ở những độ ẩm trên 70%, nguyên liệu bị úng nước, sau khi hấp nó bệch ra, không thể dùng nuôi cấy nấm được

Ganoderma lucidum Pleurotus florida

Ảnh 1: Tốc độ ăn sâu của tơ nấm Linh chi Ảnh 2: Tốc độ ăn sâu của tơ nấm Bào ngư

Trang 31

Il XAC DINH PH

Trang 32

Kết quá cho thấy pH có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tơ nấm Linh chỉ cũng như tơ Bào ngư Tuy nhiên ở pH 4 hoặc từ 7 trở lên đều làm tơ nấm phát triển chậm lại Tơ nấm mọc tốt nhất ở pH 5 - 6

II CẢI THIỆN ĐỘ NỞ

Thực hiện thí nghiệm với ba nghiệm thức sau:

` NTI: Bã đậu nành + nước lạnh NT2: Bã đậu nành + nước nóng NT3: Bã đậu nành + hấp bằng xửng Bắng 6: So sánh tốc độ lan tơ của nấm linh chỉ và bào ngư trên ba nghiệm thức Nghiệm thức ị NTI ị NT2 | N3 |

Nấm linh chỉ (Ganoderma lucidum)

Tốc độ lan tơ (mm/ ngày) 43+027 | 503041 63+ 0/24

Nấm bào ngư ( Pleurotus florida)

| Tốc độ lan tơ (mm/ ngày) | 3,3+0,15 4,3 + 0,23 5,6+ 0,49 % 5 E = s 2 3 $ 8 “ NT1 NT2 NT3 Đồ thị 3: So sánh tốc độ lan tơ của nấm linh chí và bào ngư trên ba nghiệm thức Nhận xét:

Bã đậu nành qua hấp cho kết quả tốt hơn so với các nghiệm thức còn lại, lý do khi hấp các hạt nở đều hơn, đồng thời quá trình hấp chín tạo cơ chất dễ tiêu cho nấm

IV CẢI THIỆN ĐỘ KẾT DÍNH

Bã đậu nành dạng hạt, khi hấp thường nở ra và dễ dính vào nhau, việc áo bột mì

giầm độ kết dính để tăng độ xốp cho cơ chất Kết quả thay đổi lượng bột mì áo thu được ở bang 2 va dé thi 4

Trang 33

Bảng 7: So sánh khả năng lan tơ của nấm LC và BN trên cơ chất bã đậu nành có áo bột mì 'Tỉ lệ bột mì 0 1 3 5 10 15 20 25 30 (%) Nam linh chi (Ganoderma lucidum) Tốc độ lan tơ | 5,75+| 6,55+| 7,25 + | 7.00 + 54I+| 5,10+| 4,80+| 4,60 +| 4,50 + (mm/ngày) 0,19 0,21 0,24 | 0,22 | 0,18 | 0,24 | 0,16 0,19 | 0,15 Nam bao ngw ( Pleurotus florida) Tốc độ lan tơ| 4,75 +| 5,75 +| 7,83 + 7,10+ | 5,41 + | 5,30 + | 5,16 + 4,50 +| 4,10 + | (mm/ngay) 0,18 0,19 | 0,26 | 0,15 | 0,18 0,26 | 031 | 0,29 | 0,15 10 64 : BiNấm linh chỉ | Nấm bào ngư 'Tốc độ ăn lan (mm/ ngày) 0+4 0 1 3 5 10 lễ 20 25 30 'Tỉ lệ bột mì (%)

Đô thị 4: : So sánh khả năng lan tơ của nấm LC và BN trên bã đậu nành có áo bột mì Dựa vào kết quả nhận được cho thấy bột mì bổ sung có ảnh hưởng nhất định đến độ ăn lan của tơ nấm linh chỉ cũng như của nấm bào ngư Ở nồng độ bột mì bổ sung từ 3- 5% dùng để áo bã đậu nành, cho tốc độ ăn lan tốt nhất Tuy nhiên, khi tăng lượng bột lên

cao (> 20%) thi tac dung cd chiều hướng ngược lại, tốc độ lan tơ có xu hướng còn chậm lại

thậm chí thấp hơn so với đối chứng Lý đo khi tăng độ ẩm bột mì nhão, dính bệch vào

nhau, khi giảm ẩm bột lại khô và bời rời, tơ nấm khó mọc tốt

Ngoài ra, phân tích tỉ lệ CN của cơ chất (với bột mì bổ sung là 3%) là 21 (C= 95,25% và N= 4,55%) là tỉ lệ có thể chấp nhận cho việc nuôi cấy nấm linh chí và nấm

bào ngư

V.TRỌNG LƯỢNG BỊCH CƠ CHẤT BÃ ĐẬU NÀNH

Quá trình khảo sát về trọng lượng bịch, điều kiện khử trùng, thời gian lan tơ trên cơ

chất okara cho kết quá sau :

Trang 34

Bảng 8: Thời gian lan tơ kín bịch của nấm linh chỉ và bào ngư Linh chỉ Bào ngư Trọng lượng bịch 150g | 300g | 500g | 150g 300g | 500g Thời gian tơ lan kín bịch 15 21 >25 21 30 525 co chat (ngay) A B

“&nhS: A-To nm bao ngu lan kin co chat trong bich

Trang 35

Nhận xét :

-_ Thời gian lan tơ kín bịch của nấm linh chỉ nhanh hơn nấm bào ngư khoảng l tuần

-_ Có thể nuôi cấy bịch với trọng lượng từ 150g đến 300g, tốt nhất là 150g VI THỜI GIAN KHỦ TRÙNG CƠ CHẤT

Cơ chất cần khử trùng trước khi nuôi cấy nấm để tránh tạp nhiễm Mỗi lô thí

nghiệm thực hiện 10 bịch, mỗi bịch 150g cơ chất bã đậu nành Nhiệt độ khử trùng là

121°C Kết quả nhận được theo bảng 4

Khi giữ ở nhiệt độ 121°C từ 40 đến 60 phút, tỷ lệ bịch nhiễm rất cao, chiếm từ 30 đến 50% Khi thời gian khử trùng kéo dài:90 phút, thì gần như không còn bịch nhiễm,

màu của nguyên liệu lúc này hơi chuyễn sang vàng sậm, nhưng không qué sam mau Do đó, có thể dùng nhiệt độ 121°C với thời gian khử trùng là 90 phút

Ngoài ra, kết quả thực nghiệm cũng cho thấy độ chiếu sáng không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của cả hai loại sợi tơ nấm

Tóm lại, bã đậu nành (okara) cần làm ẩm từ 50% trở lên, nhưng không quá 70%,

pH trong khỏang 5-6 Nguyên liệu sau đó nên hấp trước và áo bột mì 3% Sau đó cho

vào túi, khối lượng là 150g, khử trùng ở 121°C trong 90 phút

35

Trang 36

PHẨN2 :

KHAO SAT DAC TINH CHUNG GIỐNG NẤM SỬ DỤNG L ANH HUGNG CAC DIEU KIRN LEN ENZYM THUY GIAI CỦA NẤM

1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Thử nghiệm với các môi trường có tỉnh bột, CMC (carboxyl metyl cellulose) hoặc

casein để tìm hiểu hoạt tính các enzym amylase, cellulase va protease của hai loài nấm:

Linh chi (Ganoderma lucidum) va Bao ngư (Pleurotus florida), trong cdc diéu kién nhiét

độ khác nhau: 20°C, 25°C, 30°C, 35°C Kết quả được tính dựa trên tốc độ lan tơ của từng loài nấm (mm/ ngày) và bán kính vòng phân giải (mm) trên các môi trường kiểm tra sau

10 ngày nuôi cấy (bảng 10)

Bang 10: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính các enzym ở nấm Linh chi và Bào ngư | Loài nấm Tốc độ lan tơ Amylase Cellulase Protease Nấm Linh chỉ ‘ 30 - 35°C 30°C 30°C 35°C (Ganoderma lucidum) Nấm Bào ngư 25 - 30°C 25°C 30°C 30°C (Pleurotus florida)

Qua kết quả nhận được cho thấy:

- Nấm Linh chỉ có tốc độ lan tơ tốt nhất 30-35°C, trong khi nấm Bào ngư là 25-30°C

-_ Nấm Linh chỉ nuôi ở nhiệt độ 30°C cho hoạt tính enzym amylase và cellulase tốt nhất, trong khi protease là 35°C Nấm Bào ngư nuôi ở 30°C cho hoạt tính enzym cellulase và

protease tốt nhất, trong khi amylase 1 25°C

1.2 Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau

Nuôi cấy hai loại tơ nấm Linh chỉ và Bào ngư trên các nguồn cơ chất khác nhau (ba

đậu nành, bột mì, bột khoai mì và bột gạo) Xác định hoạt tính enzym của từng lọai nấm

Trang 37

Các kết quả định tính và định lượng cho thấy nấm Linh chỉ và Bào ngư có hoạt tính

enzym phân giải cellulose là cao nhất Tuy nhiên hoạt tính rõ nhất trên bã đậu nành, còn trên các cơ chất khác (bột mì, bột khoai mì, bột gạo) hoạt tính các enzym hầu hết đều

-

yếu hơn

IL KHAO SAT HOAT TINH ENZYM THỦY GIẢI CỦA NAM

Khảo sát họat tính enzym của nấm sau khi nuôi cấy trên bã đậu nành qua ba giai

đoan: trước khi biến đổi, sau khi xử lý cơ học và hóa học

IL1 HOAT TINH CUA PROTEASE

Bang 12 : Hoạt tính protease clla HHSKSN nấm và CC trước và sau khi xử lý STT Mẫu Linh chỉ Bào ngư (đvhtg MT/phúÐ) (dvht/g MT/phit) 1 |Okaratrướcbiếnđổi ` 171 19,5

2 Okara + xay +O 16,2 17,8

3 | Okara + xay +2% NaCl+ O¿; 15,4 17,5: 19,5 17 19 a 16.5 18.5 2 16 2 18 F 15.5 _ 11,5 15 17 14.5 = 16.5 1 2 3 + A B

Đô thị 5 : Hoạt tính protease của

A- HHSKSN Linh chỉ & CC trước và sau khi xử lý cơ học và hóa học

B- HHSKSN Bào ngư & CC trước và sau khi xử lý cơ học và hóa học

Nhận xét : Hoạt tính enzym protease sau khi biến đổi ở cả hai loại nấm giảm

xuống so với trước biến đổi Đây là vấn để cần được nghiên cứu thêm

Trang 38

1.2 Hoạt tính enzym amylase

Bang 13: Hoạt tính amylase của HHSKSN nấm & CC trước và sau khi xử lý STT Mẫu Linh chi Bao ngư (đvht/g MT/phút) (đvh/ø MT/phú) 1 | Okara trước biến đổi 8,22 8,74 2 Okara + xay +O 8,65 9,94 3 Okara + xay + 2% NaCl +O» 10,86 12 10 10 9.8 | 9,6 ¬ 8 9.4 oF t 8.8 + 8.6 a 8.4 8.2 0 8 1 2 3 2 A

Đồ thị 6: Hoạt tính amylase của

A- HHSKSN Linh chỉ & CC trước và sau khi xử lý cơ học và hóa học B- HHSKSN Bào ngư & CC trước và sau khi xử lý cơ học và hóa học

Nhận xét: Hoat tinh enzym amylase tang lên có thể được ghi nhận:

LC ~ Okara + xay + 2% NaC] + O; tăng BN-— Okara + xay + Ò¿ tăng

so với trước khi biến đổi

1I.3 Hoạt tính cellulase 32,1% 13,7% Bảng 14: Hoạt tính cellulase của HHSKSN LC & CC trước và sau khi xử lý STT Mẫu Linh chỉ Bàong ˆ| (đvhưg MT/phú) (đvhưg MT/phú0) 1 | Okara trước biến đổi 29,42 34,65

2 | Okara + xay +O2 35,45 45,64

3: Okara + xay + 2% NaCl +O 43,93

Trang 39

50 50 45 40 40 a = 35 2 30 & 30 2 3 25 = 20 § 20 = 7 15 10 10 5 6 0 1 ? 1 2 3 A B

Đồ thị 7: Hoat tinh cellulase cia

A- HHSKSN Linh chi & CC trước và sau khi xử lý cơ học và hóa học

B- HHSKSN Bào ngư & CC trước và sau khi xử lý cơ học và hóa học

Nhận xét : Hoạt tính enzym cellulase ở các mẫu sau khi biến đổi đều cao hơn so với mẫu chưa biến đổi và được ghi nhận như sau :

LC — okara + xay + Ò¿ tăng 20,5% LC — okara + xay + 2% NaCl + O; tăng 49,3% BN - okara + xay + Ở; tăng 31,7%

114 Kết quả khảo sát sự có mặt của các enzym oxydase

quả dương tính Tuy nhiên, dựa vào cường độ mầu ta có thể thấy hoạt tính của enzym laccase (d-naptol) ở nấm linh chỉ mạnh hơn nhiều so với nấm bào ngư

e_ Đối với enzym tyrosinase : cả hai loài nấm linh chi, bào ngư đều cho kết quả âm tính (B-cresol)

Ảnh 7: Định tính enzym laccase và tyrosinase ở nấm linh chi

Trang 40

Anh 8: Dinh tinh enzym laccase va tyrosinase ở nấm bào ngư

Định dạng
Số trang	72
Dung lượng	11,49 MB