PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA COLI TRONG PHÂN HEO SƠ SINH VÀ CAI SỮA TIÊU CHẢY BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y **************** HUỲNH THỊ THANH THANH PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA COLI TR

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA COLI TRONG PHÂN HEO SƠ SINH VÀ CAI SỮA

TIÊU CHẢY BẰNG KỸ THUẬT PCR

Sinh viên thực hiện: HUỲNH THỊ THANH THANH

Lớp: DH07DY Ngành: Thú Y chuyên ngành Dược Niên khóa: 2007 – 2012

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

****************

HUỲNH THỊ THANH THANH

PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA COLI TRONG PHÂN HEO SƠ SINH VÀ CAI SỮA

TIÊU CHẢY BẰNG KỸ THUẬT PCR

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y

PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên : HUỲNH THỊ THANH THANH

Lớp : DH07DY

Tên đề tài : “Phát hiện các yếu tố độc lực của E coli trong phân heo sơ sinh và cai

sữa tiêu chảy bằng kỹ thuật PCR”

Khóa luận đã được thực hiện theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến, đóng góp của hội đồng chấm luận văn

Ngày… tháng… năm 2012

Giáo viên hướng dẫn

PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN

Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn:

- Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

- Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi – Thú y

- Quý thầy cô khoa Chăn nuôi – Thú y luôn tận tình, hết lòng vì học trò

Chân thành cảm ơn thầy Lê Hữu Ngọc, cô Văn Ngọc Dung, anh chị và các

em phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường Sức khỏe Vật nuôi, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài

Tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè đã động viên, chia sẻ những buồn vui trong quãng đời sinh viên của tôi

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Trần Thị Mỹ Phúc tận tình chỉ bảo

và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian thực tập

Và lời cuối cùng, xin kính chúc toàn thể Quý thầy cô trong Khoa Chăn nuôi – thú y luôn dồi dào sức khỏe và gặt hái được nhiều thành công trong sự nghiệp giáo dục và hoạt động nghiên cứu của mình

Xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 1 tháng 8 năm 2012

TÓM TẮT

Đề tài “Phát hiện các yếu tố độc lực của Escherichia coli trong phân heo sơ

sinh và cai sữa tiêu chảy bằng kỹ thuật PCR” được thực hiện tại trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, từ tháng 12/2011 đến tháng 6/2012 Quá trình nghiên cứu bao gồm thu thập và xử lý 48 mẫu phân heo sơ sinh và cai sữa, xác định tổng số vi

khuẩn E coli, dùng kỹ thuật PCR để phát hiện gen độc lực Kết quả thu được:

Số lượng vi khuẩn E coli trong phân heo sơ sinh tiêu chảy giai đoạn 1 – 21

ngày tuổi là 1,58*108 MPN/g, cao hơn heo con giai đoạn 22 – 45 và 46 – 90 ngày tuổi

Tỉ lệ phát hiện các gen độc lực của E coli trong phân heo sơ sinh và heo cai

sữa tiêu chảy là 43,75 %

Tỉ lệ phát hiện gen astA cao (37,5 %), cho thấy rằng gen astA sản sinh yếu

tố độc lực EAST1, có thể là yếu tố độc lực quan trọng của dòng E coli gây bệnh

trong phân heo con tiêu chảy từ 1 – 21 ngày tuổi, và là yếu tố hiệp lực trong sự phát

sinh bệnh tiêu chảy do E coli trên heo giai đoạn 22 – 90 ngày tuổi (heo sau cai sữa

đến 3 tháng)

Chưa phát hiện được gen lt-I và gen stx1 của E coli trong 48 mẫu phân heo

sơ sinh và cai sữa

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Vi khuẩn Escherichia coli 3

2.1.1 Định nghĩa 3

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 3

2.1.3 Yếu tố kháng nguyên 4

2.1.4 Phân loại E coli gây bệnh 5

2.2 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC 7

2.2.1 Độc tố Shiga (Shiga toxin) 7

2.2.2 Yếu tố kết bám intimin 7

2.2.3 Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1: 8

2.3 NHÓM ETEC (Enterotoxigenic E coli) 8

2.3.1 Yếu tố độc lực 8

2.3.2 Tiêu chảy do nhóm ETEC 10

2.4 NHÓM EPEC (Enteropathogenic E coli) 11

2.5 Kỹ thuật PCR 12

2.5.1 PCR là gì? 12

2.5.2 Nguyên tắc của PCR 13

2.5.4 Phân tích kết quả PCR 15

2.6 Những công trình nghiên cứu liên quan 16

2.6.1 Trong nước 16

2.6.2 Thế giới 16

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 17

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 17

3.1.1 Thời gian thực hiện 17

3.1.2 Địa điểm thực hiện 17

3.2 Nội dung thực hiện 17

3.3 Phương pháp thực hiện 17

3.3.1 Thu thập mẫu 17

3.3.2 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 18

3.3.3 Ly trích DNA 19

3.3.4 Xác định gen liên quan đến yếu tố độc lực của E coli 19

3.4 Chỉ tiêu khảo sát 20

Chương 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 22

4.1 Tổng số E coli từ phân heo sơ sinh và cai sữa tiêu chảy theo ngày tuổi 22

4.2 Tỷ lệ mang gen liên quan đến yếu tố độc lực của các gốc E.coli đã phân lập 23 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27

5.1 Kết luận 27

5.2 Tồn tại 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

PHỤ LỤC 34

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A/E: Attaching - and - Effacing

AMP: Adenosine 5’ monophosphate

cAMP: cyclic Adenosine 5’ monophosphate

DAEC: Diffusely adherent E coli

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

Eae: E coli attaching and effacing

EAEC: Enteroaggregative E coli

EAST1: Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable toxin

EHEC: Enterohaemorrhagic E coli

EIEC: Enteroinvasive E coli

EPEC: Enteropathogenic E coli

ETEC: Enterotoxigenic E coli

FAO: Food and Agriculture Organization

GMP: Guanosine 5’ monophosphate

HUS: Haemolytic Uraemic Syndrome

IMViC: Indol, Methyl red, Voges Proskauer, Citrate

MR: Methyl Red

SLTEC: Shiga Like Toxin producing E coli

TSI: Triple Sugar Iron

DANH SÁCH CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ

Bảng 2.1 Các type của ETEC gây tiêu chảy hoặc phù thũng trên heo sau cai sữa 11

Bảng 2.2 Tóm tắt nhóm E coli quan trọng gây bệnh trên heo từ sơ sinh đến cai sữa

12

Sơ đồ 3.1 Qui trình phân lập, định lượng vi khuẩn E coli 18 Bảng 4.1 Tổng số E coli trong phân heo tiêu chảy theo ngày tuổi 22 Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen độc lực của E coli từ phân heo 1 – 21 ngày tuổi 23

Bảng 4.3 Kết quả phát hiện gen độc lực của E coli từ phân heo 22 – 45 ngày tuổi 24

Bảng 4.4 Kết quả phát hiện gen độc lực của E coli từ phân heo 46 – 90 ngày tuổi 24 Bảng 4.5 Tổng kết kết quả phát hiện gen độc lực của E coli đã phân lập 25

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cách xâm nhập và tấn công của vi khuẩn E coli 6

Hình 2.2 Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR 14

Hình 3.1 E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim trên môi trường thạch EMB 19

Hình 3.2 E coli cho phản ứng IMViC 19

Hình 3.3 Kết quả điện di đối chứng dương 20

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR 21

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành chăn nuôi ở nước ta đóng vai trò quan trọng trong đời sống kinh tế

xã hội, đặc biệt là chăn nuôi heo Ngành chăn nuôi heo đã không ngừng phát triển

và tiến bộ, từ quy mô nhỏ trong phạm vi hộ nuôi gia đình đến hình thức chăn nuôi công nghiệp với quy mô lớn và mật độ tập trung của đàn heo khá cao Tuy nhiên, đây cũng là điều kiện thuận lợi cho sự tồn tại, phát triển và lây lan của nhiều mầm bệnh, trong đó đáng chú ý là bệnh tiêu chảy

Tiêu chảy là hội chứng bệnh lý ở đường tiêu hóa, bệnh xảy ra cho các lứa tuổi heo, đặc biệt thời kỳ heo con theo mẹ, và tỷ lệ chết cao Bệnh thường xảy ra với triệu chứng chung là tiêu chảy, mất nước – chất điện giải, suy kiệt, trụy tim mạch,

có thể dẫn đến tử vong Có nhiều nguyên nhân gây bệnh, trong đó có vai trò của vi

khuẩn Escherichia coli (E coli) E coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế,

tồn tại tự nhiên trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật Khi có điều

kiện thích hợp, một số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân

gây tiêu chảy, đặc biệt là gia súc non (tiêu chảy trên bê nghé, tiêu chảy phân trắng ở heo con theo mẹ, tiêu chảy phù thũng trên heo cai sữa) Dựa trên đặc điểm gây

bệnh, E coli được chia thành nhiều nhóm Mỗi nhóm đều có những yếu tố độc lực

khác nhau được qui định bởi những gen độc lực

Việc phân lập được vi khuẩn E coli trong phân để tìm nguyên nhân gây

bệnh hay xác định được số lượng vi khuẩn hoàn toàn không phản ánh được khả

năng gây độc của chúng Do vậy việc xác định các gen độc lực của E coli là một

bước rất cần thiết phục vụ cho việc đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con người Các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR thường được áp

dụng để phát hiện các gen độc lực này Với mục tiêu xác định tổng số E coli, phát hiện một số gen mã hóa protein gây độc của E coli phân lập được từ phân heo sơ sinh và cai sữa, đề tài “Phát hiện các yếu tố độc lực của E coli trong phân heo sơ

sinh và cai sữa tiêu chảy bằng kỹ thuật PCR” được tiến hành dưới sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Ngọc Tuân và cô Văn Ngọc Dung

Ly trích DNA từ vi khuẩn E coli phân lập được

Phát hiện một số gen độc lực (eae, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I, astA) của

E coli phân lập được bằng kỹ thuật PCR.

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Vi khuẩn Escherichia coli

2.1.1 Định nghĩa

Vi khuẩn E coli được phân lập và mô tả đầu tiên vào năm 1885 bởi bác sĩ

nhi khoa người Đức Theodor Escherich Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi

khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia E coli là trực khuẩn

Gram âm, di động, kích thước khoảng 1,5 x 1 – 3 μm, không hình thành bào tử và

có giáp mô, có lông quanh tế bào (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

E coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi Có thể sinh trưởng ở

nhiệt độ 15 – 400C, nhiệt độ tối hảo là 370C, pH thích hợp 6,4 - 7,5 (tối ưu 7,2 -

7,4) Trong môi trường lỏng, sau 4 - 5 giờ E coli làm đục nhẹ môi trường, càng để

lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi

trường Trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ E coli hình thành những

khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước

khoảng 2 - 3 mm Trên môi trường thạch chuyên biệt EMB, E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim Trên môi trường thạch Mac Conkey, E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng Trên môi trường thạch nghiêng TSI, E coli tạo acid/acid (vàng/vàng)

Để phân biệt E coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng thử nghiệm IMViC E coli cho kết quả IMViC là +/-, +, -, -

2.1.3 Yếu tố kháng nguyên

E coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Trước kia, kỹ thuật xác định

kháng nguyên bề mặt là phương tiện chính để phân biệt các dòng E coli gây bệnh

Năm 1947, Kauffmann đưa ra hệ thống phân nhóm serotype mà vẫn còn được sử dụng đến ngày nay Hệ thống phân nhóm này dựa vào việc xác định kháng nguyên

bề mặt O, H, K

* Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharid của

thành tế bào, bền với nhiệt và cồn Khi đun nóng ở 1000C trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên Kháng nguyên O có thể được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ, tạo nền tảng cho việc phân

loại serogroup của E coli Hiện nay đã phát hiện được 174 type kháng nguyên O

(Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Trong mỗi serogroup có 1 hay nhiều serotype được phân loại dựa vào kháng nguyên lông H

* Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, tạo khả năng

di động của E coli, kém chịu nhiệt Có khoảng 56 type kháng nguyên H (Nguyễn

Ngọc Hải, 2007)

* Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): Kháng nguyên K lúc đầu được

xác định bằng phản ứng ngưng kết Người ta xác định sự hiện diện của kháng nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bị đun nóng Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành 3 type

là A, L và B Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành phần hóa học của chúng và đã có hơn 80 type kháng nguyên K đã được xác định (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

* Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): Tiêm mao (fimbriae) dài khoảng

4 μm, đường kính 2,1 - 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn Tiêm mao không tham gia

vào tế bào niêm mao ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn (Lê Thị Mai Khanh, 2004)

2.1.4 Phân loại E coli gây bệnh

Dựa trên đặc điểm gây bệnh, các dòng E coli gây bệnh đường ruột có thể

được chia thành 6 nhóm (Kaper và cs, 2004)

(1) EPEC (Enteropathogenic E coli): E coli thuộc nhóm EPEC sẽ bám chặt vào

tế bào ruột non, phá hủy cấu trúc bình thường của vi nhung mao, tấn công và làm tổn thương bằng cách bào mòn nhung mao ruột Kết quả là làm biến đổi cấu trúc khung bên trong tế bào vật chủ, đồng thời kèm theo đáp ứng viêm và tiêu chảy

(2) STEC (Shiga-toxin producing E coli) hoặc VTEC (Verotoxigenic E coli) hoặc EHEC (Enterohaemorrhagic E coli): E coli thuộc nhóm này sẽ tấn công và

phá hủy niêm mạc kết tràng Đặc trưng của EHEC là tiết độc tố giống như độc tố của Shigella (Stx) Độc tố Stx được hấp thu vào máu dẫn đến nhiều phản ứng phức tạp xảy ra, gây nguy hiểm cho tính mạng của vật chủ như viêm ruột kết xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) hoặc hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) hoặc bệnh phù thũng sau cai sữa (ED: edema disease)

(3) ETEC (Enterotoxigenic E coli): E coli nhóm ETEC bám vào tế bào ruột non

nhờ yếu tố bám Kháng nguyên lông bám liên kết với ETEC của heo được đặt tên K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), và F41 (Runnel và Moon, 1984) Vi khuẩn tiết độc

tố ruột kém chịu nhiệt (LT: heat-labile) và / hoặc độc tố chịu nhiệt (ST: heat-stable, bao gồm STa và STb) LT sẽ liên kết với các thụ thể GM1 hay GM1b để thâm nhập vào bên trong tế bào ruột, hoạt hóa enzyme adenylyl cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào, kích thích tế bào nhung mao ruột tiết Cl-, ngăn cản hấp thu NaCl từ lòng ruột, dẫn đến hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng, nước được vận chuyển thụ động từ tế bào vào lòng ruột, và gây tiêu chảy nhiều nước Trong khi đó, ST lại liên kết với enzyme xuyên nửa màng guanylyl cylase để vào bên trong tế bào Tại đó, nếu là STa sẽ làm gia tăng GMP vòng trong tế bào, kích thích tiết Cl-, ngăn cản hấp thu NaCl và gây tiêu chảy tương tự LT; trong khi STb không

làm gia tăng AMP vòng hay GMP vòng mà kích thích tiết bicarbonat vào lòng ruột

và gây tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998; Hitotsubashi và cs, 1992)

(4) EAEC (Enteroaggregative E coli): bám dính biểu mô ruột non lẫn ruột già,

hình thành màng biofilm dày, bài tiết độc tố ruột và độc tố tế bào

(5) EIEC (Enteroinvasive E coli): xâm lấn tế bào biểu mô ruột kết, phân giải thể

thực bào (phagosome), sau đó di chuyển xuyên qua tế bào nhờ vào việc hình thành sợi actin giống như cái đuôi để giúp vi khuẩn di cư sang tế bào khác Vi khuẩn có thể di chuyển trực tiếp từ tế bào biểu mô này sang tế bào biểu mô khác, cũng có thể thoát ra và xâm nhập trở lại màng tương của tế bào kế cận EIEC bao gồm các serogroup như sau: O28, O29, O124, O136, O143, O144, O147, O152, O164, và O167 (Taylor và cs, 1988)

(6) DAEC (Diffusely adherent E coli): thường làm cho tế bào biểu mô ruột non

biến dạng thành hình giống như ngón tay bao quanh vi khuẩn

2.2 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC

Tên gọi STEC (Shiga toxin-producing E coli, trước đây gọi là Shiga like toxin producing E coli: SLTEC) chỉ rõ khả năng sản sinh độc tố gây độc tế bào

giống như độc tố Shiga (Calderwood và cs, 1996) Nhóm STEC còn có những tên

gọi khác như VTEC (Verotoxigenic E coli hoặc Vero cytotoxin producing E coli)

được Konowalchuk và cs (1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện chúng sản xuất

độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero, EHEC (Enterohaemorrhagic E coli) bắt

nguồn từ triệu chứng gây viêm ruột kết xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998) Ở thú, VTEC liên kết với bệnh phù thũng ở heo, một bệnh thường xảy ra ở heo cai sữa

STEC có các yếu tố độc lực như độc tố shiga (Stx), yếu tố bám (Eae), độc

tố xuất huyết ruột (enterohemolysin = Ehly) Trong thực tế chỉ cần 1 – 1000 CFU / liều gây nhiễm là có thể gây bệnh (Paton and Paton, 1998)

2.2.1 Độc tố Shiga (Shiga toxin)

STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), hay còn gọi là Shiga toxin (Stx) hoặc Verotoxin (VT) Độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2, chúng giống nhau khoảng 55% trình tự acid amin, được

mã hóa bởi gen stx1 và gen stx2 STEC có thể chỉ sản xuất độc tố Stx1 hoặc Stx2,

hoặc cả hai, hoặc nhiều dạng Stx2 Ba loại Stx2 được xác định là Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và cs, 1998) Có thể thay thế thuật ngữ Stx và VT với nhau (Calderwood và cs, 1996)

2.2.2 Yếu tố kết bám intimin

Yếu tố bám dính của nhóm STEC đóng vai trò rất quan trọng trong việc giúp vi khuẩn bám chặt vào tế bào nhung mao ruột Cho nên yếu tố bám dính còn được xem là yếu tố độc lực của vi khuẩn Intimin, một loại protein màng ngoài,

được mã hóa bởi gen eae (E coli attaching và effacing) nằm trên nhiễm sắc thể

ruột do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và cs, 1993) Gen eae

cũng có thể được tìm thấy ở nhóm EPEC, tồn tại ở hầu hết các dòng STEC, nhưng

không phải tất cả các dòng STEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998) Sandhu

và cs (1996) cho biết có sự liên quan chặt chẽ giữa gen eae của nhóm STEC với

những ca viêm kết tràng xuất huyết và hội chứng huyết niệu

2.2.3 Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1:

Lần đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC, do gen astA mã hóa, cũng được tìm

thấy ở nhiều dòng STEC Tầm quan trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh của STEC vẫn chưa được biết tường tận Có thể phát hiện gen này ở một vài trường hợp tiêu chảy không có máu của những ca nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998)

2.3 NHÓM ETEC (Enterotoxigenic E coli)

2.3.1 Yếu tố độc lực

* Độc tố ruột enterotoxin

Nhóm ETEC gồm những E coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố

đường ruột là độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT) ETEC được xem là nhóm đại diện cho cơ chế gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch

Nhóm này gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường ruột ST và LT E coli

nhóm này có thể chỉ tiết 1 loại độc tố LT hoặc ST, hoặc có thể tiết cả hai LT và ST

(1) Độc tố kém chịu nhiệt (Heat-labile toxin, LT)

Độc tố LT của E coli là oligopeptid có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin - CT) do Vibrio cholerae

tiết ra LT có 2 serogroup chính là LT-I và LT-II Chúng không có phản ứng chéo

về mặt miễn dịch

- LT-I: Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, LT-I thâm nhập qua màng trong tế bào, kích thích enzyme adenylyl cyclase hoạt động dẫn đến

bào ruột tiết ra Cl- một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl của những

tế bào nhung mao Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998)

- LT-II: có cấu trúc giống với LT-I và CT, LT-II cũng làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không có liên quan đến bệnh trên người và thú

(2) Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST)

Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfit của

nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này ST được chia thành STa và STb, hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động Gen mã hóa cho cả 2 nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do

ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và

V cholerae không phải O1 ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt

EAST1 của EAEC Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1 Trong khi đó STb chỉ được tìm thấy ở ETEC

- STa: STa được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa) từ E coli phân lập được trong phân heo và STh (ST human hay STIb) của E coli phân lập

trên người Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên nửa màng guanylyl cyclase C (GC-C) STa kết hợp với thụ thể GC-C làm hoạt hóa enzyme này, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl- và/ hoặc ngăn cản sự hấp thụ NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy (Hitotsubashi, 1992)

- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo, vài chủng ETEC được phân lập từ người Không giống như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất hoặc teo một phần

tế bào nhung mao của biểu mô ruột Thụ thể của STb chưa được biết rõ, mặc dù gần

vào bên trong tế bào Không gây ra sự tiết Cl- nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào STb còn kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi, 1992)

*Yếu tố bám (colonization factor - CF): Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết

bám vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, có tính kháng nguyên mạnh, gọi là yếu tố bám (CF) CF có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái Có 3 loại chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng

bó, lông có cấu trúc mảnh mềm Yếu tố F bám vào thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào biểu mô ruột Nhóm ETEC với yếu tố bám F5, F6, F41 hầu như định vị ở phía sau không tràng và hồi tràng trái lại F4 định vị theo chiều dài không tràng và hồi tràng

2.3.2 Tiêu chảy do nhóm ETEC

Tiêu chảy là một bệnh quan trọng đối với heo con, được phân làm ba loại: tiêu chảy ở heo sơ sinh (ở vài ngày đầu tiên khi sinh), tiêu chảy ở heo con (từ tuần đầu tiên khi sinh đến cai sữa), và tiêu chảy ở heo con cai sữa

Tiêu chảy ở heo sơ sinh: thường gặp từ 0 đến 6 ngày tuổi ETEC gây tiêu chảy ở

heo sơ sinh chỉ sản sinh độc tố ruột STa Các ETEC này bám vào niêm mạc ruột non bằng một hoặc nhiều yếu tố bám như F4 (K88), F5 (K99), F6 (987) và F41 Hầu hết các dòng ETEC gây bệnh trên heo sơ sinh thuộc serogroup O8, O9, O64 và O101 với F5, F6 và hoặc F41 dương tính

Tiêu chảy ở heo con sau cai sữa do ETEC: ETEC gây tiêu chảy trên heo sau cai

sữa hoặc heo con bú mẹ từ 7 ngày tuổi trở lên, chúng sản sinh một hoặc nhiều loại độc tố ruột, bao gồm STa, STb và LT, gần đây người ta còn thừa nhận độc tố EAST1 Những dòng ETEC này thường có yếu tố bám F4 lẫn F18 Tuy nhiên cũng

chảy sau cai sữa, còn F18ab gây bệnh phù thũng trên heo sau cai sữa Hiện nay, tiêu chảy trên heo sau cai sữa phân lập được chủ yếu là O149 mà hầu hết có F4 Trong khi đó, gây phù thũng trên heo sau cai sữa chủ yếu là O138, O139, O141, O147 và O157 với F18 dương tính Các type của ETEC gây tiêu chảy hoặc phù thũng trên heo sau cai sữa được trình bày trong bảng 2.1

Vài dòng ETEC sản sinh độc tố ruột lẫn độc tố Stx2e, chúng đều có yếu tố bám F18 Khuynh hướng sau này xếp chúng vào nhóm ETEC hơn là STEC vì gây

ra các triệu chứng tiêu chảy sau cai sữa hơn là gây phù thũng Nếu nhiễm hỗn hợp STEC có F18 và ETEC dương tính với F4 thì triệu chứng trội hẳn là tiêu chảy do F4, mặc dù bệnh lý mô học của bệnh phù thũng

Bảng 2.1Các type của ETEC gây tiêu chảy hoặc phù thũng trên heo sau cai sữa

Yếu tố bám Chủng huyết thanh (Serovirotype)

F4 (K88)

O149: LT:STb:EAST-1O149:LT:STa:STb:EAST-1O149:LT:STb

F18

O149:LT:STb:EAST-1O138:STa:STb

O139:LT:STb:EAST1:Stx2eO139: Stx2e:(AIDA)

O147:STa:STb:AIDAO?:STa:STb

O?:STa:STb:Stx2e

(Nguồn: Fairbrother, 2012)

2.4 NHÓM EPEC (Enteropathogenic E coli)

Nhóm EPEC có đặc điểm gây những thương tổn “gắn kết và gây hư hại” (“attaching and effacing” – A/E) ở biểu mô ruột, có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm bệnh và trong nuôi cấy tế bào (dẫn liệu Nataro và Kaper, 1998) Đặc điểm đặc trưng của thương tổn A/E cho biết vi khuẩn gắn vào bề mặt biểu mô ruột, gây hư hại vi nhung mao (Afset và cs, 2006) EPEC không sản xuất Stx và không liên kết với HUS Gen cần thiết cho việc tạo ra

tổn thương A/E là gen eae mã hóa protein intimin Protein này là yếu tố độc lực cần

diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei; nhưng không hiện diện ở những dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông

thường

Ở heo, EPEC liên quan đến trường hợp tiêu chảy sau cai sữa do độc tố intimin Nhóm EPEC không chiếm hữu các yếu tố độc lực như STEC gây bệnh phù thũng và ETEC gây tiêu chảy trên heo sau cai sữa

Bên cạnh đó, việc phát hiện các gen độc lực của E coli thường được thực

hiện dựa trên những kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR

Bảng 2.2 Tóm tắt nhóm E coli quan trọng gây bệnh trên heo từ sơ sinh đến cai sữa

-hemolysin O149, O157 Tiêu chảy heo

sau cai sữa F4, AIDA STa, STb, LT,

O8, O138, O139, O141, O147,

O149, O157

STEC F18, AIDA Stx2e, EAST-1 O138, O139, O141,