PHÁT HIỆN BORDETELLA PERTUSSIS BẰNG Ỹ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH H LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN BORDETELLA PERTUSSIS BẰNG Ỹ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Họ tên sinh viên: PHẠM NGỌC THẢO Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2007 - 2011 Th ng PHÁT HIỆN BORDETELLA PERTUSSIS BẰNG Ỹ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) T c giả PHẠM NG C THẢO Khóa luận đƣợc đệ trình để đ p ứng yêu cầu cấp Kỹ sƣ ngành Bảo quản Chế biến Nông sản Vi sinh Thực phẩm Gi o viên hƣớng dẫn: BS Nguyễn Thị Kim Hồng Ths ng Nguyễn Đức Ninh Tháng 7/2011 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn BS Nguyễn Thị Kim Hồng, anh ng Nguyễn Đức Ninh chị Võ Thị Trang Đài Những ngƣời tận tâm dìu dắt, hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm thực tế giúp đỡ tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp tạo điều kiện để tơi có hội học tập thêm kiến thức thực tế, nắm bắt c c phƣơng ph p nghiên cứu khoa học Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giảng viên Trƣờng Đại học Nông Lâm, đặc biệt q thầy Khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý b u suốt thời gian em học tập trƣờng Xin chân thành cảm ơn quý c n bộ, c c anh chị phụ tr ch c c phòng thí nghiệm tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Cuối xin cảm ơn tất bạn bè ngƣời thân, ngƣời giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập thực đề tài Thành phố H Chí Minh, th ng năm Phạm Ngọc Thảo iii T M TẮT Đề tài “Phát Bordetella pertussis kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)” đƣợc tiến hành phòng Vi Khuẩn Hơ Hấp, khoa Vi Sinh Miễn Dịch, viện Pasteur thành phố H Chí Minh từ ngày th ng 03 đến ngày 30 th ng 07 năm Đề tài thực với mục đích để xây dựng qui trình chuẩn ph t B.pertussis (bệnh ho gà) kĩ thuật PCR nhằm đƣa phƣơng ph p chẩn đo n bệnh nhanh để rút ngắn thời gian xét nghiệm giúp cho việc điều trị đạt hiệu cao Kết tối ƣu hóa c c thành phần phản ứng PCR nhƣ sau: n ng độ MgCl2 2,5 mM, n ng độ m i Pip -Pip2 0,3 µM loại để phản ứng đƣợc biểu tốt Đ ng thời x c định độ đặc hiệu, độ nhạy phản ứng PCR t c nhân gây bệnh ho gà Với cặp m i Pip1-Pip khuếch đại phần đoạn gen IS48 cho sản phẩm PCR đặc hiệu ho gà bp Và ứng dụng thành công mẫu ngoại kiểm bệnh ho gà Học viện hoàng gia Úc Mặt kh c, so s nh chất lƣợng ADN hai phƣơng ph p t ch: t ch ADN Kit thƣơng mại (Roche) t ch ADN nhanh (sốc nhiệt) Từ rút phƣơng ph p t ch phù hợp cho mục đích sử dụng iv MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix CHƢƠNG I MỞ Đ U Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu .2 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG II T NG QUAN TÀI LI U Sơ lƣợc tình hình bệnh ho gà 2.1.1 Trên giới .3 2.1.2 Tại Việt Nam Sơ lƣợc bệnh ho gà 2.2.1 Hình thể tính chất ni cấy 2.2.2 Dịch tễ học .5 2.2.3 Bệnh học 2.2.4 Vi sinh lâm sàng Kh ng sinh điều trị dự phòng 2.2.6 Phòng ngừa bệnh ho gà Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .10 2.2.1 Khái niệm .10 2.2.2 Các tiêu ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 12 2.2.3 Nguyên tắc PCR 13 Ƣu nhƣợc điểm kỹ thuật PCR 13 CHƢƠNG III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N C U 16 Địa điểm thời gian thực 16 Địa điểm .16 3.1.2 Thời gian thực 16 3.2 Vật liệu 16 3.2.1 Thiết bị 16 3.2.2 Dụng cụ 17 3.3 Phƣơng ph p định danh ho gà 17 3.3.1 Nhận diện khuẩn lạc nhuộm soi 17 3.3.2 Các phản ứng sinh hóa định danh sơ 17 3.3.3 Phƣơng ph p PCR 18 3.3.4 Xây dựng qui trình chuẩn phát B pertussis kỹ thuật PCR 23 3.3.5 Kiểm tra độ đặc hiệu 24 3.3.6 X c định độ nhạy 25 v 3.3.7 So sánh chất lƣợng ADN .25 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N .27 4.1 Kết nhuộm soi phản ứng sinh hóa 27 4.2 Kết thay đổi n ng độ MgCl2 27 4.3 Kết n ng độ m i tối ƣu 28 4.4 Kết độ đặc hiệu phản ứng 29 4.5 Kết độ nhạy 30 4.6 Kết ứng dụng chạy PCR với mẫu ngoại kiểm .32 CHƢƠNG V KẾT LU N VÀ ĐỀ NGH .33 5.1 Kết luận .33 Đề nghị 33 TÀI LI U THAM KHẢO .34 PHỤ LỤC 37 vi D NH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AC Adenylate Cyclase ADN Acid Deoxyribo Nucleic ATCC American Type Culture Collection BHI Brain Heart Infusion BG Bordet-Gengou CFU Colony Forming Units dATPs C c Deoxyadenosine triphosphate dCTPs C c Deoxycytidine triphosphate dNTPs Các Deoxynucleoside triphosphate dGTPs C c Deoxyguanosine triphosphate dTTPs C c Deoxythymidine triphosphate FHA Filamentous Hemagglutinin LPS Lipopolysaccharide MC MacConKey PCR Polymerase Chain Reaction PT Pertussis Toxin TBE Tris Borate Edta Tm Nhiệt độ nóng chảy m i vii D NH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Số liệu tổng kết từ năm 993 đến Bảng : C c chủng thuộc họ Bordetella Bảng 3: C c tính chất định danh c c chủng Bordetella Bảng 3.1: Danh mục chủng vi sinh vật thử nghiệm Bảng : Thành phần n ng độ MgCl2 thay đổi phản ứng PCR Bảng 3.3: N ng độ m i thay đổi phản ứng PCR Bảng 3.4: Hàm lƣợng ADN tƣơng ứng với bậc pha lỗng viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình : Lấy bệnh phẩm c ch phết mũi họng Hình : Vi khuẩn B pertussis mơi trƣờng BG Hình 3: Phản ứng PCR Hình 3.1: B pertussis dƣới kinh hiển vi Hình : Sơ đ thực PCR Hình 3.3: Bộ kit thƣơng mại Roche Hình 3.4: Sơ đ Qui trình T ch ADN Roche Hình 3.5: Máy li tâm (Hermle labortechnik) Hình 3.6: Máy PCR (ABI-applied biosystem) Hình : Kết vi khuẩn B pertussis dƣới kính hiển vi Hình 4.2: Kết tăng dần n ng độ MgCl2 Hình 4.3: Kết hàm lƣợng n ng độ m i tối ƣu Hình 4.4: Kết độ đặc hiệu phản ứng PCR Hình 4.5: Kết độ nhạy PCR t ch ADN kit thƣơng mại Hình 4.6: Kết độ nhạy PCR ADN t ch nhanh Hình 4.7: Kết mẫu bệnh phẩm ix CHƢƠNG I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi sinh vật học ngành khoa học có tốc độ ph t triển mạnh mẽ, cơng trình nghiên cứu đối tƣợng vi sinh đạt đƣợc nhiều thành tựu vĩ đại Riêng nhà khoa học ngƣời Ph p Louis Pasteur có khối lƣợng nghiên cứu ph t đ sộ cống hiến cho nhân loại, bậc nhƣ nghiên cứu vắc xin chống bệnh dại, ngày 6-7885 em bé tuổi Joiseph Meister ngƣời đƣợc cứu sống nhờ vắc xin Girolamo Fracastoro (1546) cho c c thể nhỏ bé t c nhân gây bệnh tật, Edward Jenner ( 798) nghiên cứu phƣơng ph p chủng mủ đậu bò để phòng ngừa bệnh đậu mùa, CharlesLouisAlphonseLaveran (1880) ph t ký sinh trùng Plasmodium gây bệnh sốt rét Cho đến nhiều nghiên cứu giới vi sinh vật nhỏ bé Vi sinh vật sinh vật vô nhỏ bé nhƣng có t c dụng lớn đời sống ngày từ xa xƣa, từ thời Hùng Vƣơng dựng nƣớc biết “làm mắm cầm thú, làm rƣợu cốt gạo” Song song lợi ích mà vi sinh vật mang lại t c hại mà gây khơng phần nghiêm trọng Điển hình vi khuẩn Bordetella pertussis tiết độc tố Pertussis Toxin gây bệnh ho gà Bệnh xảy lứa tuổi, t c nhân gây tử vong cao trẻ sơ sinh Theo Pittman M (1984), ho gà bệnh nhiễm trùng cấp tính đƣờng hơ hấp vi khuẩn B pertussis gây Vi khuẩn có hạt nƣớc bọt bắn từ mũi, miệng bệnh nhân ho, hắt trực tiếp sang ngƣời lành Vì ho gà lây từ ngƣời sang ngƣời c ch dễ dàng nên có nhiều khả bùng ph t thành dịch Do đó, ho gà nằm danh s ch bệnh chủng ngừa bắt buộc Tuy vấn đề chủng ngừa đƣợc quan tâm nhƣng tỉ lệ mắc tử vong trẻ sơ sinh đƣợc b o c o năm cao Chỉ tính th ng 6- 7, Khoa Nhiễm bệnh viện Nhi Đ ng I thành phố H Chí Minh có tới trẻ mắc bệnh ho gà phải nhập viện điều trị có biến chứng viêm phổi (theo vấn vietbao.vn, B c sĩ Trƣơng Hữu Khanh, Trƣởng độ MgCl2 kh c Để góp phần tối ƣu phản ứng PCR ph t B pertussis chúng tơi tiến hành thí nghiệm thay đổi n ng độ MgCl2 từ 1,5 mM đến 5,0 mM * C ch thực hiện: Thực phản ứng PCR tủ an tồn sinh học riêng (khơng có ADN), lấy micropipette hút lần lƣợt c c thành phần đệm PCR, Taq polymerase, dNTPs, m i Pip1-Pip2 n ng độ MgCl2 thay đổi theo bảng 3.2 vào eppendorf 0,2 ml Tiếp theo hút µl sản phẩm ADN B pertussis cho vào c c eppendorf tủ an toàn sinh học kh c, trừ eppendorf (không cho ADN) làm chứng âm để kiểm so t ngoại nhiễm thao t c thêm H2O-Rnase free để tổng thể tích phản ứng đạt µl Sau chạy PCR theo mục 3.3.3.2 Bảng 3.2: Thành phần n ng độ MgCl2 thay đổi phản ứng PCR N ng độ MgCl (mM): 1,5 2,0 3.3.4.2 Thay đổi nồng độ mồi Pip1-Pip2 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 M i tiêu quan trọng để đạt đƣợc khuếch đại đặc trƣng có hiệu cao (H Huỳnh Thùy Dƣơng, 998) M i hóa chất đắt tiền để thực phản ứng PCR Vì vậy, chúng tơi tiến hành thí nghiệm thay đổi n ng độ m i từ , - 0,5 µM tổng thể tích µl * C ch thực hiện: Thực phản ứng PCR tủ an tồn sinh học riêng (khơng lẫn ADN), lấy micropipette hút lần lƣợt c c thành phần Taq polymerase, dNTPs, đệm PCR, MgCl2 n ng độ m i Pip -Pip2 thay đổi theo bảng 3.3 vào eppendorf , ml Hút µl sản phẩm ADN B pertussis cho vào c c eppendorf tủ an toàn sinh học kh c thêm H2O-Rnase free để tổng thể tích phản ứng đạt µl Tiếp theo chạy PCR theo mục 3.3.3.2 Bảng 3.3: N ng độ m i thay đổi phản ứng PCR Pip1 (µM) Pip2 (µM) 3.3.5 0,1 0,1 0,2 0,2 0,3 0,3 0,4 0,4 0,5 0,5 iểm tra độ đặc hiệu Để xác định độ đặc hiệu cặp m i Pip1-Pip2 việc phát B pertussis, thực phản ứng PCR sản phẩm ADN vi khuẩn B 24 pertussis với sản phẩm ADN c c chủng vi khuẩn thƣờng cƣ trú đƣờng hô hấp ngƣời * C ch thực hiện: Thực phản ứng PCR theo qui trình chuẩn đƣợc rút mục 3.3.4 Cuối hút µl sản phẩm ADN B pertussis c c chủng vi khuẩn thử nghiệm nêu bảng 3.1 3.3.6 Xác định độ nhạy * Phƣơng pháp đo hàm lƣợng DN Hàm lƣợng ADN mẫu cần phân tích đƣợc x c định m y so màu quang phổ bƣớc sóng nm Đầu tiên, sử dụng μl nƣớc cất để tạo mẫu blank, đo mẫu nƣớc cất lần r i tiến hành đo sản phẩm ADN Trƣớc tiến hành đo hàm lƣợng sản phẩm ADN cần phải pha loãng n ng độ sản phẩm AND bậc (3 μl sản phẩm ADN μl nƣớc cất) làm bậc Sau đó, sử dụng μl dung dịch pha loãng bậc cho vào m y để đo Ghi nhận kết bƣớc sóng nm, hàm lƣợng sản phẩm ADN bảng 3.4 Bảng 3.4: Hàm lƣợng ADN tƣơng ứng với bậc pha loãng Độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Hàm lƣợng ADN (μg ml) 514,8 134,3 92,1 85,8 77,2 70,7 * Xác định độ nhạy: Mục đích thí nghiệm tìm lƣợng ADN B pertussis thấp mà kĩ thuật PCR có khả ph t đƣợc Bằng c ch tiến hành chạy PCR cho bậc pha loãng đo đƣợc hàm lƣợng ADN bảng 3.5 C ch tiến hành: Thực phản ứng PCR theo qui trình chuẩn đƣợc rút mục 3.3.4 Cuối hút n ng độ ADN B pertussis pha loãng bậc r i tiến hành chạy PCR nhƣ mục 3.3.3.2 3.3.6 So sánh chất lƣợng DN - Tách DN nhanh (sốc nhiệt): B pertussis vi khuẩn Gram âm nên dễ dàng thực t ch ADN nhanh c ch sốc nhiệt Ở nhiệt độ gần C ph vỡ thành tế bào để thu nhận ADN mà khơng cần enzyme hay hóa chất * Chuẩn bị : tủ ủ đƣợc chuẩn bị trƣớc, điều chỉnh nhiệt độ C 25 * C ch thực : Hút huyền dịch vi khuẩn B .pertussis (0,5 McFarland) cho vào eppendorf 1,5 ml, sau ủ C/10 phút bể ủ nhiệt, r i li tâm phút Cuối thu lấy dịch (có ADN cần t ch) Xác định độ nhạy: ADN sau đƣợc t ch nhanh tiếp tục thao t c nhƣ x c định độ nhạy PCR cho sản phẩm ADN t ch Roche để so s nh chất lƣợng ADN Cách thực Pha loãng n ng độ ADN t ch nhanh bậc (5 μl sản phẩm ADN 45 μl nƣớc cất) làm bậc Thực phản ứng PCR theo qui trình chuẩn đƣợc rút mục 3.3.4 Cuối hút n ng độ ADN B pertussis pha loãng bậc r i tiến hành chạy PCR nhƣ mục 3.3.3.2 3.3.7 Ứng dụng chạy PCR với mẫu ngoại kiểm C ch thực hiện: mẫu bệnh phẩm đƣợc đ nh dấu lần lƣợt A, B, C, D, E, F tiến hành t ch ADN kit thƣơng mại Roche, chạy PCR mẫu bệnh phẩm với qui trình chuẩn rút mục 3.3.4 26 CHƢƠNG IV ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1  ết nhuộm soi phản ứng sinh hóa Kết nhuộm soi Hình 4.1: Kết vi khuẩn B pertussis dƣới kính hiển vi  Phản ứng oxydase : (+)  Phản ứng urease: (-)  Môi trƣờng thƣờng BHI: (-)  Môi trƣờng MC: (-) Thực nhuộm soi c c phản ứng sinh hóa nhƣ: oxydase, urease, BHI, MC để kh ng định chủng B pertussis trƣớc tiến hành thực để đảm bảo kết qui trình phản ứng PCR 4.2 ết thay đổi nồng độ MgCl2 Hình 4.2 Kết tăng dần n ng độ MgCl2 27 M: marker 100 bp 1: 1,5 mM 5: 3,5 mM 2: mM 6: mM 3: 2,5mM 7: 4,5 mM 4: mM 8: mM Kết thử nghiệm hình 4.2 cho thấy n ng độ MgCl2 ảnh hƣởng rõ rệt đến phản ứng N ng độ qu cao 4,5 mM; mM giếng 7; băng lên mờ Từ giếng đến giếng c c băng lên s ng, giếng mM băng qu to không x c cho kích thƣớc với n ng độ ,5 bp ADN B.pertussis Băng giếng 3, giếng n ng độ lần lƣợt ,5; 3,5 băng lên rõ, s ng, mỏng đạt yêu cầu Tuy nhiên so giếng giếng kết tƣơng đ ng mà n ng độ sử dụng giếng cao hơn, giảm chi phí ta nên chọn n ng độ ,5 mM giếng Vậy n ng độ MgCl2 thích hợp cho phản ứng ,5 mM Kết phù hợp nghiên cứu S Nelson (1996) sử dụng n ng độ MgCl2 2,5 mM phản ứng PCR với cặp m i BP -BP2 4.3 ết nồng độ mồi tối ƣu Hình 4.3: Kết thay đổi n ng độ m i tối ƣu 1: 0,5 µM 4: 0,2 µM 2: 0,4 µM 5: 0,1 µM 3: 0,3 µM M: : marker 100 bp Kết thử nghiệm hình 4.3 cho thấy n ng độ m i giếng cho băng lên mỏng, rõ ràng đạt yêu cầu Giếng , , cho kết dƣơng tính 28 nhƣng băng lên mờ Giếng băng không lên, nhận thấy lƣợng m i không đủ để khuếch đại đoạn ADN B pertussis Vậy n ng độ m i ,3 µM thích hợp cho phản ứng PCR Kết phù hợp với nghiên cứu S K Poddar and C T Le (2000) sử dụng n ng độ m i ,3 µM loại cho phản ứng PCR kết hợp đèn hiệu thăm dò phát B pertussis 4.4 ết độ đặc hiệu phản ứng Hình 4.4: Kết độ đặc hiệu PCR M: marker 100 bp Klebsiella pneumoniae Bordetella pertussis Pseudomonas aeruginosa Heamophilus influenzae Streptococcus pneumoniae E.coli Streptococcus pyogenes Sta.aureus 10 Sta.epidermidis Moraxella catarrhalis Chứng âm 29 Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy có giếng có tín hiệu băng bp, c c giếng lại âm tính Nhƣ vậy, cặp m i Pip -Pip có khả ph t đặc hiệu B pertussis kết phù hợp với nghiên cứu Lena Lind-Brandberg ( 983) sử dụng cặp m i đặc hiệu 98% 4.5 ết độ nhạy Hình 4.5: Kết độ nhạy PCR ADN t ch kit thƣơng mại M: marker 100 bp 100: sản phẩm ADN trƣớc pha loãng 100 đến -7 : dung dịch ADN pha lỗng làm bậc 30 Hình 4.6: Kết độ nhạy PCR ADN t ch nhanh M: marker 100 bp 100: sản phẩm ADN trƣớc pha loãng 100 đến -7 : dung dịch ADN pha loãng làm bậc Thực song song t ch ADN phƣơng ph p r i chạy PCR Kết PCR cho ADN t ch kit thƣơng mại hình 4.5, độ pha lỗng -1 đến dƣơng tính Vậy độ nhạy trƣờng hợp tƣơng ứng độ pha loãng -7 cho kết -6 đo đƣợc ,7 μg ml hàm lƣợng ADN Hình 4.6 kết cho thấy độ pha lỗng có độ nhạy tƣơng đƣơng t ch ADN nhanh so với t ch kit thƣơng mại Nhƣng ADN t ch kit thƣơng mại tốn nhiều hóa chất, sinh phẩm, nhiều thời gian, chi phí cao nhiều so với tách ADN nhanh (chỉ qua bƣớc xử lí nhiệt, khơng hóa chất nào) Tuy nhiên c c băng thể phƣơng ph p t ch kit thƣơng mại rõ, s ng Do tùy mục đích sử dụng mà ta lựa chọn phƣơng ph p t ch Nếu xét nghiệm bệnh phẩm bắt buộc ta phải sử dụng kit thƣơng mại để đảm bảo kết Còn t ch nhanh thực c c công việc kh c nhƣ thử chứng dƣơng c c chủng B pertussis, kiểm tra chất lƣợng m i 31 4.6 ết ứng dụng chạy PCR với mẫu ngoại kiểm Hình 4.7: Kết mẫu bệnh phẩm ng dụng mẫu ho gà ngoại kiểm Học viện hoàng gia ÚC (RCPA Quality Asurance program pty limited) Kết cho thấy mẫu A, B có kết dƣơng tính, c c mẫu lại âm tính Trùng với kết chƣơng trình ngoại kiểm mẫu A, B lần lƣợt 30; 300 CFU/ml 32 CHƢƠNG V ẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 ết luận  Xây dựng qui trình chuẩn ph t B pertussis với đệm PCR 1X, Taq polymerase 2,5 IU, n ng độ m i Pip -Pip ,3 µM cho loại, n ng độ MgCl2 0,25 mM, dNTPs 200 µM  Độ nhạy PCR B .pertussis tƣơng ứng ,7 µg ml  Độ đặc hiệu gần % B pertussis so với c c chủng vi khuẩn kh c thƣơng trú đƣờng hô hấp  Ph t mẫu bệnh phẩm bệnh ho gà với hàm lƣợng vi khuẩn thấp (30 CFU/ml) 5.2 Đề nghị - Thí nghiệm tiến hành x c định thêm n ng độ dNTPs, hàm lƣợng Taq polymerase để tối ƣu hóa điều kiện phản ứng PCR - Kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng PCR dùng m i Pip -Pip với nhiều chủng thƣờng gặp đƣờng hô hấp ngƣời để tăng mức độ đặc hiệu, độ tin cậy phản ứng PCR - Tiến hành x c định độ nhạy phản ứng PCR pha n ng độ ADN bậc thấp để tìm độ x c cao - Qua kết so s nh chất lƣợng ADN phƣơng ph p t ch đề nghị dùng phƣơng ph p t ch nhanh để t ch ADN từ khuẩn lạc B pertussis - Thí nghiệm tiến hành qui trình PCR chuẩn với nhiều mẫu bệnh phẩm ho gà - Thử nghiệm kết hợp qui trình PCR chuẩn ph t vi khuẩn B pertussis với số m i khuếch đại c c t c nhân gây bệnh kh c để ph t đ ng thời nhiều t c nhân gây bệnh phản ứng PCR 33 TÀI LIỆU TH M HẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Thị Hoàng Oanh, Bài giảng Nguyên lý kỹ thuật chẩn đoán bệnh Khoa thủy sản trƣờng Đại học Cần Thơ Đoàn Thị Nguyện, Vi sinh vật Y học Nhà xuất Hà Nội H Huỳnh Thùy Dƣơng, 998 Sinh học phân tử Nhà xuất gi o dục, trang 4 Khuất Hữu Thanh, Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, trang Lê Duy Thành, 2008 Cơ sở sinh học phân tử Nhà xuất gi o dục, trang 33 Newton Graham trích dẫn Trần Thị Mỹ Duyên, Nguyễn Duy Phong, Bài giảng bệnh ho gà Bộ môn nhiễm Đại học y dƣợc thành phố H Chí Minh Nguyễn Thị Kim Hồng, Lớp tập huấn Kỹ Thuật Xét nghiệm cho cán tuyến huyện Viện Pasteur thành phố H Chí Minh Nguyễn Văn Thanh, Sinh học phân tử Nhà xuất gi o dục, trang 10 Nguyễn Viết Khuê, Chẩn đoán bệnh động vật thủy sản phương pháp PCR Viện Nghiên Cứu Nuôi Tr ng Thủy sản 11 Trịnh Đình Đạt, Cơng nghệ sinh học (IV) Nhà xuất gi o dục, Hải Phòng, trang 172 34 12 Vƣơng Thị Việt Hoa, Thực tập vi sinh đại cương Tủ s ch trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố H Chí Minh Tài liệu tiếng nh 13 Bergey D.H and John G.H, 1994 Bergey’s manual of determinative bacteriology 9th Lippincott William and Wilkins, USA p 544-551 14 Departments of Bacteriology, Mycology and Parasitology and Biostatistics, Statens Serum Institut, Artillerivej , DK-2300, Copenhagen S, Denmark 15 Eric M Glare, James C Paton, Robert R Premier, Andrew J Lawrence, and Ian T Nisbet, 1990 Analysis of a Repetitive DNA Sequence from Bordetella pertussis and Its Application to the Diagnosis of Pertussis Using the Polymerase Chain Reaction Journal Of Clinical Microbiology 28 (9): 1982-1987 16 Harvill, E., Preston, A, Cotter, P., Allen, A., Maskell, D., and J Miller, 2000 “Multiple roles for Bordetella lipopolysaccharide molecules during respiratory tract infection.” Infect Immun 68(12): 6720-8 17 Houard, S., C Hackel, A Herzog, and A Bollen 1989 Specific identification of Bordetella pertussis by the polymerase chain reaction Res Microbiol (140): 477–487 18 Isacson J., B Trollfors, J Taranger, G Zackrisson, Lagergard T.1993 How common is whooping cough in a nonvaccinating country (12): 284-288 19 J.W.Bass – D Brewter, 1989 Pertussis in an infant Journal of Emergency Medicine 345-348 20 J.W.Bass – P Bégue, 1997 Rapid diagnosis of pertussis in young infants: comparison of culture, PCR, and infant's and mother's serology 21 Krantz I., J Taranger, B Trollfors.1989 Estimating incidence of whooping cough over time : a cross-sectional recall study of four swedish birth cohorts Int J Epidemiol (18): 959-963 22 Lena Lind-Brandberg, Christina Welinder-Olsson, Mar, 1998 Evaluation of PCR for Diagnosis of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis Infections Journal Of Clinical Microbiology 36 (3): 679–683 23 M Finegold Ellen Jo Baron, 1986 Diagnostic microbiology p.433 24 Moulton, 1964 The Mirror of Health 35 25 Norman K Fry, Oceanis Tzivra, Y Ting Li, Anthony McNiff, Nivedita Doshi, PAChristopher Maple, Natasha S Crowcroft , Elizabeth Miller, Robert C George and Harrison G Ti-mô-thê, 2004 Laboratory diagnosis of pertussis infections the role of PCR and serology Journal Of Clinical Microbiology 53 (6): 519-525 26 Parton R, 1999 "Review of the biology of Bordetella pertussis" Biologicals 27 (2): 71–6 27 Pittman M, 1984 “The concept of pertussis as a toxin-mediated disease.” Pediatr Infect Dis 3(5): 467-86 28 PubMed Mattoo S, Cherry JD,2005 “Molecular pathogenesis, epidemiology, and clinical manifestations of respiratory infections due to Bordetella pertussis and other Bordetella subspecies” Clin Microbiol Rev 18 (2): 326-82 29 Staff L.R, Brown, D.R and SandStrom R.E, 1983 Cephalecin-supplementted Jones-Kendrick char-cool agar for selective isolation B.p comperision with previously described media Jclin-Microbiol (17): 60 30 Valérie Caro and Elisabeth Njamkepo, 2004 Laboratory manual for the diagnosis pf whooping cough caused by Bordetella pertussis or Bordetells parapertussis Department of Immunization, Vaccines and Biologicals Family and Community Health, WHO 31 S K Poddar and C T Le, 2000 Bordetella pertussis detection by spectrofluorometry using polymerase chain reaction (PCR) and a molecular beacon probe DoD Center for Deployment Health Research, Naval Health Research Center (15): 161–167 32 S Nelson, 1996 Detection of B pertussis in Clinical Specimens by PCR and a Microtiter Plate-Based DNA Hybridization Assay Department of Pediatric Laboratory Medicine, Division of Microbiology, The Hospital for Sick Children, and Department of Microbiology, University of Toronto,Toronto, Ontario, Canada and Biolyne, Inc, Amherst, New York 117-120 Tài liệu từ Internet 31 Biology Lesson 5, Alteration of Genetic Composition Truy cập ngày th ng năm 32 Dr GUISO Nicole, “Molecular Prevention and Therapy of Human Diseases”, Activity Reports 2006 - Institut Pasteur Truy cập ngày th ng năm 36 34 He Q, “Comparison of polymerase chain reaction with culture and enzyme immunoassay for diagnosis of pertussis” Truy cập ngày th ng năm 2011 35 He Q, “Sensitive and specific polymerase chain reaction assays for detection of Bordetella pertussis in nasopharyngeal specimens” Truy cập ngày th ng năm 36 Linh Doan, “Bệnh Ho Gà” Truy cập ngày th ng năm 37 Pv Vệt B o, “Bỏ tiêm ngừa: Coi chừng dịch bệnh trở lại” Truy cập ngày năm 38 “Taq PCR handbook” , t i lần Truy cập ngày th ng năm th ng PHỤ LỤC Phụ lục 1: Vài máy sử dụng thực kĩ thuật PCR Hình: M y điện di Hình: Thiết bị chụp gel 37 Hình: Tủ an tồn sinh học Hình: Tủ giữ chủng iờ 38 ...PHÁT HIỆN BORDETELLA PERTUSSIS BẰNG Ỹ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) T c giả PHẠM NG C THẢO Khóa luận đƣợc đệ trình để đ p ứng yêu cầu cấp Kỹ sƣ ngành Bảo quản Chế... Thành phố H Chí Minh, th ng năm Phạm Ngọc Thảo iii T M TẮT Đề tài Phát Bordetella pertussis kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) đƣợc tiến hành phòng Vi Khuẩn Hơ Hấp, khoa Vi Sinh Miễn Dịch,... chỉnh xét nghiệm B pertussis phƣơng ph p PCR labo Vi Khuẩn Hô Hấp, Khoa Vi Sinh Miễn Dịch, Viện Pasteur Đề tài: “Ph t Bordetella pertussis kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) đƣợc tiến hành