Đang tải... (xem toàn văn)
Hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen) nằm trên nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng nguyên rất phức tạp và đa dạng. Hệ HLA không những là tiêu chí di truyền của mỗi người, mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ tới chức năng điều hòa miễn dịch và các bệnh tật khác. Mời các bạn cùng tham khảo nghiên cứu.
TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 18, 2003 NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA ALLELE HLADQA1 BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION SEQUENCE SPECIFIC PRIMERS (PCRSSP) Ở DÂN TỘC KINH MIỀN TRUNG VIỆT NAM Trần Đình Bình Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế Wang Linlin, Lin Weixiong Trường Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc Hệ kháng ngun bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen) nằm trên nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng ngun rất phức tạp và đa dạng. Hệ HLA khơng những là tiêu chí di truyền của mỗi người, mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ tới chức năng điều hòa miễn dịch và các bệnh tật khác [13]. Những người khơng cùng một loại hình phân bố các allele của HLA thì tính nhạy cảm hay sức đề kháng với một số bệnh khơng giống nhau [13]. Nhiều tác giả nước ngồi đã nghiên cứu sự khác biệt về phân bố allele HLADQA1 trong quần thể người đã phát hiện một số người mang những allele này sẽ có khả năng nhạy cảm hay đề kháng với một số bệnh tật nhất định. Trong thực tế, mỗi dân tộc có mỗi bối cảnh di truyền, yếu tố di truyền khác nhau, cùng một dân tộc nhưng khác nhau về vị trí địa lý thì sụ phân bố các alleles của hệ HLA cũng khác nhau[4 11]. Ở Trung Quốc đã có nhiều nghiên cứu hệ HLA, nhất là sự phân bố của allele HLADQA1 trên nhiều dân tộc như Hán, Choang, Bố Y, Duy Ngơ Nhĩ, Mãn , Thái Lan cũng đã có báo cáo về vấn đề này [11], nhưng cho đến nay chưa có báo cáo nào về phân bố allele HLADQA1 ở Việt Nam Chúng áp dụng kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers (PCRSSP) [12] để nghiên cứu tính đa dạng của sự phân bố 81 allele HLADQA1 ở dân tộc Kinh, miền Trung Việt Nam để góp phần nghiên cứu sự khác biệt về di truyền giữa các dân tộc khác nhau I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu: là 214 thanh thiếu niên khỏe mạnh, tuổi từ 736, dân tộc Kinh, cư trú tại các tỉnh Thừa Thiên Huế, Quảng Trị và Quảng Bình, tỉ lệ nam nữ 1:1. Tuổi bình qn là 14 tuổi 2. Tách DNA: Trên mỗi đối tượng lấy 2ml máu tĩnh mạch, thêm 0,5ml Natri citrate 3,8% chống đơng và dùng phương pháp chiết tách DNA kinh điển có cải tiến là Phenol/ Chloroform. Các bước như sau [13]: Với 2ml máu chống đơng, thêm 5ml dung dịch Gelatine 3%, trộn đều, ủ ở o 37 C/ 10 phút, tách lấy phần dịch phía trên, ly tâm 3500 rpm/5 phút, bỏ phần dịch phía trên, thêm 2 ml dung dịch TES 2mM, trộn đều, thêm 0,5 ml dung dịch 10% SDS, trộn đều, thêm 2ml dung dịch Phenol bão hòa trong TES. Trộn đều, ly tâm 3500rpm?5 phút, tách lấy phần dịch ở trên, (có thể tiến hành bước này thêm một lần nữa), thêm 2ml dung dịch Chloroform/Isoamylic (v/v:24/1), trộn đều, ly tâm 3500rpm/5 phút. Tách lấy phần nước trong trên, thêm 5ml dung dịch cồn Ethylic 95%, nhẹ nhàng quay ống nghiệm để các sợi DNA xoắn lại, dùng ống hút nhỏ nhẹ nhàng hút lấy DNA và bảo quản một ống khác trong dung dịch cồn 75%. Khi sử dụng có thể dùng dung dịch TE hoặc nước cất để hòa tan DNA 3. Kỹ thuật PCR để phân tích allele HLADQA1 3.1. Specific Primers: Căn cứ vào bảng các nucleotides của các alleles của hệ HLA II năm 2002[14] và dựa vào các Primers đặc hiệu của O.Olerup [12], chúng tơi lấy các Primers đặc hiệu từ Trung tâm nghiên cứu Vi sinh vật học và Cơng nghệ Sinh học của Viện Khoa học Trung Quốc (tham khảo bảng 1), bao gồm 9 chuỗi 5’ và 7 chuỗi 3’ hợp thành 12 đơi Primers đặc hiệu để khuếch đại và phân tích exon thứ 2 của HLADQA1 allele 3.2. Primers đối chiếu: Mỗi lần tiến hành PCR đều dùng một đơi Primers đối chiếu là Ctrl 1 (5’ TAT CAT GCC TCT TTG CAC CAT TC 3’, 23 mer, Tm 660C) ? Ctrl 2 (5’ AAT GCA CTG AAC TCC CAC ATT CC 3’, 23 mer, Tm 700C) để kiểm sốt và đối chiếu phản ứng khuếch đại PCR 3.3. Kỹ thuật PCRSSP: Dựa vào phương pháp của O.Olerup để tiến hành, cụ thể là: Mỗi ống tiến hành PCR chứa 10µl gồm có : 75ng tiêu bản DNA , dung dịch đệm 5 x PCR (50mmol KCl;1.5mmol MgCl2;10mmol TrisHCl (pH 8.3); 0.001%(w/v) Gelatin)1% BSA;200àl dNTPs chính là các dATP, dGTP, dCTP và dTTP; 0.25àM các đơi Primers đặc hiệu, 0.05àM đơi Primers đối chiếu và 0.50 IU Taq DNA polymerase. Tiến hành 30 tuần hồn, mỗi tuần hồn như sau: Biến tính 94 oC/30 giây Giảm nhiệt 62oC/30giây N ối dài 72oC/90 giây. Sản phẩm thu được sau PCR được tiến hành điện di ở trong thạch Agarose 1,5% với điện áp 100 V 82 trong 15 phút. Xem và phân tích kết quả đèn cực tím hoặc máy vi tính để chụp ảnh và bảo lưu kết quả 4. Xử lý số liệu thống kê: Dùng cách tính tần suất % theo HardyWeinberg [15] để thống kê và xử lý các kết quả đạt được 83 Bảng 1: Vị trí, kích thước và tên gọi của các Primers đặc hiệu để khuếch đại allele DQA1 Tên gọi các Đôi Primers allele đặc hiệu DQA1*0101/4 A*5’01+A*3’01 DQA1*0101/2/4 A*5’02+A*3’01 10 11 DQA1*0102/3 DQA1*0103 DQA1*0201 DQA1*0301 DQA1*0302 DQA1*0401 DQA1*0501 DQA1*0601 DQA1* “A” A*5’03+A*3’01 A*5’04+A*3’01 A*5’04+A*3’02 A*5’05+A*3’03 A*5’06+A*3’03 A*5’07+A*3’04 A*5’02+A*3’05 A*5’04+A*3’06 A*5’08+A*3’07 149 bp 172 bp 170 bp 183 bp 183 bp 190 bp 186 bp 117 bp 196 bp 12 DQA1*0104 A*5’09+A*3’07 170 bp TT Sản phẩm PCR 149 bp 172 bp Các allele thu hoạch sau PCR DQA1*0101, DQA1*0104 DQA1*0101, DQA1*0102 ? DQA1*0104 DQA1*0102, DQA1*0103 DQA1*0103 DQA1*0201 DQA1*0301 DQA1*0302 DQA1*0401 DQA1*0501 DQA1*0601 all DQA1 alleles except DQA1*0104 DQA1*0104 II. KẾT QUẢ Kết quả phân tích HLADQA1 từ 214 mẫu máu (xem bảng 2). Đã kiểm tra được 10 loại allele DQA1, tần suất tìm thấy cao nhất là allele DQA1*0104 (25,8%), tiếp đó là các allele DQA1*0101 và DQA1*0102 với tần suất tìm thấy lần lượt là 19,4% và 15,7%, các allele DQA1 còn lại đều được tìm thấy dưới 10%. Nhiều alleles là đồng hợp tử nên tổng số các alleles tìm được là 328 trên số người điều tra là 214 (lẽ ra phải là 428 alleles). Để kiểm tra alleles là đồng hợp tử thì cần phải tiếp tục kiểm tra chuỗi DNA. Đề tài này chưa tiến hành xác định các alleles là đồng hợp tử bàng kỹ thuật đọc chuỗi. Hình ảnh dưới đây là kết quả điện di sản phẩm PCR sau khuếch đại được phân tích và lưu ảnh ở máy tính BioRad Gel Doc 2000 TT Bảng 2: Tần suất các allele HLADQA1 của người Kinh Việt Nam Tên gọi các allele Lượt tìm thấy Tần suất kháng Tần suất allele (328) nguyên (%) tìm được(%) DQA1*0101/4 75 0.35 0.194 DQA1*0101/2/4 62 0.29 0.157 DQA1*0102/3 0.04 0.020 DQA1*0103 96 0.45 0.258 DQA1*0201 24 0.11 0.056 DQA1*0301 24 0.11 0.056 DQA1*0302 0.03 0.015 84 10 DQA1*0401 DQA1*0501 DQA1*0601 22 0.10 0.03 0.02 0.051 0.015 0.010 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 1: Hình ảnh kết quả allele dị hợp tử HLADQA1*0102/0103 sau khi điện di trong Agarose sản phẩm của PCRSSP 112 là 12 cột điện di cho đơi Primers đặc hiệu khuếch đại HLADQA1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 2: Hình ảnh kết quả allele dị hợp tử HLADQA1*0101/0104 sau khi điện di trong Agarose sản phẩm của PCRSSP 112 là 12 cột điện di cho đơi Primers đặc hiệu khuếch đại HLADQA1 Bảng 3: So sánh tần suất các allele HLADQA1 của người Kinh miền Trung Việt Nam với các dân tộc khác của Trung Quốc và người Thái Lan hiện đại Tên allele DQA1*0101 Người Ngườ Ngườ Ngườ Người Ngườ Ngườ Ngưồ Ngườ Ngườ Người Ngườ Kinh i Hán i Hán i Hán Choang i Tải i Bố i Duy iMãn i Di Choang i Thái Việt miền miền Vân Quảng n=146 Y Ngô n=50 n=85 Ba mã Lan Nam Bắc Nam Nam Tây n=67 Nhĩ n=142 n=140 n=214 n=34 n=27 n=54 n=140 11.7 9.6 15.2 15.7 19.4 n=18 5.0 27.0 85 20.8 13.6 13.8 15.3 DQA1*0102 15.7 14.3 23.0 15.9 17.8 32.0 33.1 12.0 14.9 15.3 27.8 15.7 DQA1*0103 2.0 12.0 5.9 7.6 5.4 4.6 15.2 8.5 6.7 2.1 5.0 DQA1*0104 25.8 0 17.8 22.1 0 0 19.5 DQA1*0201 5.6 11.7 4.8 0.0 1.0 0.7 19.0 8.6 5.4 14.3 DQA1*0301 5.6 27.8 28.5 22.8 35.0 22.0 14.5 14.7 25.5 23.3 12.8 26.0 DQA1*0302 1.5 0 0.0 0 0 0 DQA1*0401 5.1 0.9 0.7 1.1 0 3.3 1.1 2.8 0.0 DQA1*0501 1.5 18.1 15.2 11.5 14.3 9.0 18.0 20.7 13.8 15.9 19.5 12.8 DQA1*0601 1.0 3.5 12.2 24.9 0.0 8.0 6.2 1.6 12.8 18.1 16.4 III. BÀN LUẬN Cho đến nay, hệ kháng ngun bạch cầu người (HLA) được coi là hệ kháng ngun di truyền phức tạp và đa dạng nhất. Chúng khơng chỉ có sự phân bố khác nhau giữa các cá thể khác nhau, mà còn có sự khác biệt giữa các dân tộc do khác nhau bối cảnh di truyền, yếu tố di truyền và ngay cả cùng một dân tộc nhưng khác nhau về vị trí địa lý. Nghiên cứu tính đa dạng của hệ Kháng ngun bạch cầu người có vị trí rất quan trọng vì nó là một tiêu chí di truyền học vơ cùng chắc chắn, ứng dụng nhiều trong việc xác định con cái, bố mẹ, trong khoa học hình sự để tìm tội pham, trong nghiên cứu nhân chủng học, dân tộc học để tìm hiểu nguồn gốc của một dân tộc [1]. Ngồi ra, nhiều kết quả nghiên cứu gần đây còn khẳng định mối liên hệ mật thiết giữa HLA và một số bệnh tật như: Đái tháo đường khơng phụ thuộc Insulin, Viêm cứng cột sống, Viêm đa khớp dạng thấp, Viêm khớp thiếu niên Vì thế nghiên cứu HLA còn có ý nghĩa quan trọng trong phân loại, chẩn đốn và hỗ trợ chẩn đốn, tiên lượng bệnh, dự phòng và điều trị một số bệnh tật. Theo đà phát triển mạnh mẽ của Sinh học phân tử, việc nghiên cứu hệ HLA ngày càng đơn giản, thuận tiện và chính xác. Tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu về HLA vẫn còn khu trú tại các Viện nghiên cứu, Phòng Khoa học hình sự còn chưa được sử dụng nhiều trong bệnh viện và các phòng thí nghiệm y học. Đây có lẽ là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về HLA, dẫu rằng có tài liệu đề cập đến hệ HLA của người Việt Nam nhưng khơng ghi rõ nơi nghiên cứu [15]. Theo kết quả nghiên cứu trên đây, người dân tộc Kinh Miền Trung Việt Nam có tần suất tìm thấy allele HLADQA1*0104 là cao nhất 25,8%, tiếp đó là các allele DQA1*0101 và DQA1*0102 với tần suất tìm thấy lần lượt là 19,4% và 15,7%, các allele khác được tìm thấy với tần suất rất thấp. So sánh với các dân tộc khác ở Trung Quốc thấy rằng tần suất tìm thấy các allele phân bố khá giống với dân tộc Choang (đã tìm thấy allele HLADQA1*0104 với tần suất 22,1% và allele HLADQA1*0401 là 1,1% ). Dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam có các allele HLADQA1*0301 và 86 HLADQA1*0501 được tìm thấy rất thấp, đều thấp hơn cả 10 dân tộc ở Trung Quốc (xem bảng 3). Như vậy, tần suất allele HLADQA1*0401 cao, HLADQA1*0301 và HLADQA1*0501 thấp có lẽ là đặc trưng phân bố allele HLADQA1 của người Kinh miền Trung Việt Nam So sánh với nghiên cứu người Thái Lan thấy HLA DQA1*0101, HLADQA1*0102 có tần suất tương tự tần suất HLA DQA1*0501 (12,8%) cũng cao hơn nhiều so với người Kinh miền Trung Việt Nam (p