Nghiên cứu tính đa dạng của virus y trên khoai tây trồng tại thái nguyên

Nghiên cứu tính đa dạng của virus y trên khoai tây trồng tại thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -

VŨ THỊ BƯỞI

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên-2009

Công trình được hoàn thành tại:

Khoa Sinh -Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Mậu, Phó Giám đốc Đại học Thái Nguyên, đã rất tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh (trường Đại học Khoa học), các thầy cô giáo, cán bộ khoa sau đại học và khoa Sinh (trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên) đã hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Chu Hoàng Hà, chị Phạm Thị Vân, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật-Viện Công nghệ Sinh học và các cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-Trường Đại học Sư phạm; phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân yêu trong gia đình và bạn bè những lời biết ơn sâu sắc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 9, năm 2009

Tác giả

Vũ Thị Bưởi

PVYNTN Potato virus Y strain (variant) NTN

Hình 1.5 Loài rệp có cánh truyền PVY (Aphis nasturtii)

Hình 1.6 Dấu hiệu so sánh PVY trên Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm)

Hình 1.7 Triệu chứng nhiễm lần 2 với PVY trên cánh đồng khoai tây

Hình 1.8 Triệu chứng của bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD)

Hình 1.9 Vị trí các gen kháng PVY trên genome khoai tây

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Hình 3.1 Một số hình ảnh về khoai tây ở các vùng nghiên cứu

Hình 3.2 Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi nhiễm bệnh

Hình 3.3 Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1%

Hình 3.4 Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên

Hình 3.5 Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình

Hình 3.6 Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP

Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu

Hình 3.8 So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu

Hình 3.9 Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen

CP-13

16 16

17 19

21 22 23 24 29 39

41 43 45 46 46

49

50

52

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Một số virus khoai tây thuộc nhóm 1

Bảng 1.2 Một số virus khoai tây thuộc nhóm 2

Bảng 1.3 Một số virus khoai tây thuộc nhóm 3

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của bệnh virus đến củ khoai tây

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

Bảng 2.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự

Bảng 2.6 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự

Bảng 3.1 Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây nghiên cứu

Bảng 3.2 Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP

Bảng 3.3 Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR

Bảng 3.4 19 trình tự trong ngân hàng gen được sử dụng để đưa ra so sánh

Bảng 3.5 Hệ số giống nhau và khác nhau về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu với các mẫu trên ngân hàng gen NCBI

8 8 9 10 28 32 32 33 35 36

39 40 45

51

54

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây

1.1.3 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam

1.2 Virus gây bệnh trên khoai tây

1.2.1 Các loại virus khoai tây

1.2.2 Đặc điểm chính của bệnh virus trên khoai tây

1.3 Virus Y ở khoai tây

1.3.1 Phân loại

1.3.2 Cây chủ

1.3.3 Hình dạng và cấu trúc phân tử

1.3.4 Quan hệ họ hàng với các potyvirus khác

1.3.5 Lan truyền của PVY

1.3.6 Một số đặc điểm của PVY trên khoai tây

1.4 Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới

1.4.2 Tình hình nghiên cứu PVY ở Việt Nam

1 3 3 3 5 5 6 7 9 14 14 14 16 17 18 20 24 24 27 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.2 Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

2.2.2 Thiết bị

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thống kê

2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 28 28 28 28 28 29 29 29 30

2.3.3 Phương pháp RT-PCR 31

2.3.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

2.3.5 Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng

2.3.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

2.3.7 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

2.3.8 Tách chiết plasmid

2.3.9 Phương pháp xác định trình tự nucleotide

2.3.10 Phương pháp xử lí trình tự gen thu được

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả khảo sát tỉ lệ nhiễm PVY

3.2 Kết quả nhân gen, tách dòng cDNA

3.2.1 Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR

3.2.2 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR

3.2.3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

3.2.4 Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR

3.2.5 Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu

3.3 Kết quả so sánh trình tự gen CP-PVY phân lập từ 2 mẫu nghiên cứu với một số trình tự trong ngân hàng gen

3.3.1 So sánh trình tự nucleotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu

3.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã được công bố trong ngân hàng gen

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 33 34 34 34 35 36 38 38 40 40 42 43 44 46

47

47

50 55 56 57

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây lương thực chủ lực đứng

đầu trong các loại cây lấy củ trên thế giới và đứng thứ 5 trong số các cây lương thực nói chung (chỉ sau lúa mì, gạo, ngô, đậu tương) Củ khoai tây có giá trị dinh dưỡng cao, được chế biến thành hàng trăm món ăn đặc sắc, ngon miệng và có lợi cho sức khoẻ con người Củ khoai tây còn là nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp, chế biến thức ăn cho gia súc Ngoài ra, khoai tây còn là một dược phẩm dùng để chữa trị nhiều bệnh như khó tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, say nắng…Với những lợi ích to lớn đó, khoai tây đã được trồng ở hơn 130 quốc gia và là một nguồn thu lớn cho hàng triệu nông dân [5]

Ở khoai tây, bệnh virus đã trở thành một hiểm họa Người ta thấy có ít nhất 38 loại virus trên khoai tây đã được phát hiện và mô tả, phổ biến là: PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus), PVX (potato virus X), PVA (potato virus A), PVS (potato virus S)…Trong đó, PVY gần đây được xem là virus gây bệnh nghiêm trọng nhất (Kerlan, 2008) [40] Chúng làm giảm kích thước, số lượng cũng như chất lượng củ khoai tây, gây thiệt hại kinh tế tới 80% thậm chí còn hơn (Kerlan và cs, 2008) [41]

Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng như những nghiên cứu về bệnh virus trên khoai tây ở nước ta còn rất hạn chế so với các nước Bắc Mĩ và Châu Âu Do đó, việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đưa ra những biện pháp phòng trừ bệnh thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh virus gây ra là hết sức cần thiết Hơn nữa, những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản sự lan truyền của PVY chỉ mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại được bệnh này, lại tốn nhiều thời gian và công sức

Gần đây, với việc áp dụng những kĩ thuật tiên tiến của sinh học phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh để tạo cây trồng chuyển gen kháng virus đã thu được kết quả đáng khích lệ như cây khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY

Tạo cây khoai tây chuyển gen kháng virus được coi là một biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn và hạn chế tác hại do virus gây ra Nhưng vấn đề đặt ra là phổ kháng bệnh của những cây chuyển gen này phụ thuộc vào độ tương đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên Vì vậy khảo sát tính đa dạng di truyền của gen mã hoá cho protein vỏ virus (coat protein- CP) có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus

Xuất phát từ những lí do trên, tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là:

“Nghiên cứu tính đa dạng của virus Y trên khoai tây trồng tại Thái Nguyên”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định sự đa dạng trong cấu trúc gen mã hoá protein vỏ (CP- coat protein) của PVY phân lập từ các mẫu lá khoai tây thu tại một số địa phương thuộc tỉnh Thái Nguyên

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1 Khảo sát, thống kê và xác định tỉ lệ nhiễm PVY trên khoai tây ở Thái Bình, Thái Nguyên, Hưng Yên, Bắc Giang làm cơ sở cho việc thu mẫu và xác định sự có mặt của virus PVY

3.2 Tách chiết RNA của virus từ các mẫu khoai tây thu thập được

3.3 Nhân gen CP, tách dòng và đọc trình tự gen CP của PVY trong các mẫu khoai tây

3.4 So sánh trình gen CP của PVY phân lập được với một số trình tự đã công bố trong ngân hàng gen NCBI

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY KHOAI TÂY

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây

Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc họ cà (Solanaceae)

Khoai tây có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru Vào thế kỉ XVI, người Tây Ban Nha xâm chiếm Peru và họ đã đem cây khoai tây về nước trồng Đến cuối thế kỉ XVI, khoai tây đã được trồng rộng rãi ở nhiều nước Châu Âu (Vũ Hướng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45]

Khoai tây được du nhập vào nước ta là do một người Pháp là giám đốc vườn bách thảo Hà Nội đem vào trồng thử, và nó nhanh chóng được trồng ở nhiều địa phương Do người Pháp là người đem cây về nước ta và phổ biến cách trồng nên nhân dân ta gọi cây này là “khoai tây” (Vũ Hướng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45]

Khoai tây vừa là cây lương thực vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Củ khoai tây chứa trung bình 19% hydratcacbon (trong đó 15% tinh bột; 2,2% chất xơ); 0,1% chất béo; 2-3% protein và 79% là nước Ngoài ra, trong khoai tây còn chứa nhiều loại vitamin và chất khoáng Người ta đã tính khoảng hơn 200g khoai tây nướng cả vỏ cung cấp 844mg kali; 28% khẩu phần sắt hàng ngày; 43% khẩu phần vitamin C; 35% khẩu phần vitamin B6 và nhiều chất khác như niacin, thiamin, folat… (Vũ Hướng Văn, 2007) [12] Còn theo Bill và Dean (1992), sử dụng 100g khoai tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein; 3% nhu cầu năng lượng; 10% nhu cầu sắt; 19% nhu cầu vitamin B1; 20-50% nhu cầu vitamin C của người trong một ngày (Bill và cs, 1992) [18]

Khoai tây được chế biến thành hàng trăm món ăn ngon phục vụ nhu cầu ẩm thực của con người Không chỉ vậy, khoai tây còn được coi là công cụ làm đẹp hiệu quả và dễ sử dụng nhất Ngoài ra, củ khoai tây cũng còn là nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp, chế biến thức ăn trong chăn nuôi Trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, khoai tây đã được chế biến thành nhiều sản phẩm thơm ngon, có giá trị dinh dưỡng cao Khoai tây cũng được sử dụng trong công nghiệp sản xuất cồn, cao su nhân tạo (Hồ Hữu An và cs, 2005) [1]

Đặc biệt, khoai tây cũng là một dược phẩm Củ khoai tây có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ khí, kiện tỳ, tiêu viêm Nó dùng để chữa chứng khó tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, viêm tuyến nước bọt, say nắng, sốt, bỏng nhẹ, eczema, vết thương…Hoa khoai tây chữa bệnh tăng huyết áp và là nguyên liệu chiết rutin để chữa bệnh Quả và mầm củ khoai tây ít được dùng làm thuốc vì dễ gây độc Trong công nghiệp dược phẩm, chúng được chiết lấy solanin để làm thuốc giảm đau, chữa đau bụng, đau nhức xương khớp, chữa dị ứng, chống hen, viêm phế quản, động kinh (Hương Tú, 2008) [11]

Trong củ khoai tây có nhiều chất chống oxi hoá, nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hoá, hạn chế sự phát triển của ung thư và một số bệnh khác Các nhà nghiên cứu tại trường Đại học Y Harvard-Mỹ đã phát hiện ra rằng: những người thường xuyên ăn khoai tây có khả năng giảm ung thư tuyến tiền liệt (Vũ Hướng Văn, 2007) [12]

Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy củ khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể Có nghiên cứu cho thấy, khoai tây có tác dụng làm chậm sự tấn công của HIV/ AIDS Theo dõi trên một nhóm bệnh nhân HIV thấy những người ăn khoai tây có khả năng sống thêm được ít nhất 2 năm nữa so với những bệnh nhân không ăn (Vũ Hướng Văn, 2007) [12]

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây

Cây khoai tây thuộc loại thân thảo, bao gồm các bộ phận thân, lá, rễ, hoa, quả, hạt Thân và lá khoai tây có nhiều lông, lá kép lông chim không đối xứng Hoa cân đối, cánh hoa có gốc dính liền nhau Nhị đực kết dính thành ống hoặc chóp cụt, nhị cái ở trên và dễ rụng Cây khoai tây chủ yếu là tự thụ, một số trường hợp giao phấn Cánh hoa có các màu: trắng, tím- đỏ, tím xanh, xanh thẫm Quả có hai ô, hạt rất nhỏ có mầm uốn cong Khoai tây thường được nhân giống bằng củ Củ là phần phình to của phần thân cây nằm dưới đất chứa nhiều chất dinh dưỡng (Hồ Hữu An và cs, 2005) [1], (Đường Hồng Dật, 2005) [3], (Trương Quang Vinh, 2007) [14]

Ở nước ta, khoai tây địa phương trồng phổ biến ở phía Bắc là giống Thường Tín, và phía Nam là giống Đà Lạt Các giống nhập nội của Trung Quốc, Đức, Pháp, Hà Lan…hiện đang được trồng ở nhiều nơi (Nguyễn Mạnh Chinh, 2005) [2] Ở đồng bằng sông Hồng, khoai tây chủ yếu trồng ở vụ đông vào tháng 10, 11, thu hoạch tháng 1, 2 năm sau Ở các tỉnh miền núi phía Bắc và Đà Lạt trồng muộn hơn một chút khoảng tháng 1, 2 để tránh sương giá vào tháng

11, 12 (Nguyễn Mạnh Chinh, 2005) [2]

1.1.3 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam

Khoai tây được trồng phổ biến ở 130 nước trên thế giới Do điều kiện sinh thái, mức độ thâm canh và trình độ sản xuất khác nhau nên năng suất khoai tây chênh lệch rất lớn, từ 7 tấn/ha đến 65 tấn/ha Tính đến năn 2005, trên thế giới trồng được 18,57 triệu ha khoai tây, sản lượng đạt 320,15 triệu tấn (bằng 60-70% tổng sản lượng lúa hay mì)

Diện tích khoai tây của thế giới trong những năm gần đây có xu hướng giảm nhẹ Năm 2005, diện tích khoai tây giảm 0,37 triệu ha so với năm 2003; giảm 1,37% triệu ha so với năm 2000 Tuy vậy, năng suất khoai tây trung bình lại có xu hướng tăng Năm 2005, năng suất khoai tây tăng 0,79 tấn/ha so với năm 2000 và tăng 1,32 tấn/ha so với năm 2001 (FAO, 2005) [30]

Trong những năm gần đây, ở nước ta diện tích trồng khoai tây ngày một tăng, nhưng tốc độ tăng không cao Năng suất khoai tây của nước ta chỉ bằng 61,3% năng suất bình quân chung của thế giới, bằng 62,9% năng suất khoai tây của Châu Âu (FAO, 2005) [30]

Như vậy, khoai tây ở nước ta đã và đang phát triển nhưng tốc độ mở rộng diện tích và tăng năng suất hằng năm không cao, không ổn đinh Có thể đưa ra 2 nguyên nhân quan trọng dẫn đến hiện tượng này là:

+ Thiếu giống có chất lượng tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu

+ Chưa có biện pháp phòng trừ bệnh đặc biệt là bệnh virus có hiệu quả (Trương Quang Vinh, 2007) [14]

1.2 VIRUS GÂY BỆNH Ở KHOAI TÂY

Hiện tượng thoái hoá khoai tây, do virus gây ra, đã được mô tả và phát hiện ngay từ thế kỉ XVIII, nhưng tác nhân gây ra nó phải đến tận thế kỉ XX mới được xác định Virus cuốn lá (potato leafroll virus viết tắt là PLRV) là virus được phát hiện đầu tiên vào năm 1916 bởi Quanfer, Vanderlek và O Botfes Những virus chủ yếu gây khảm trên khoai tây (potato virus M, potato virus X, potato virus Y, potato virus A) được xác định trong những năm 1920 và 1930 Những virus quan trọng khác chỉ được phám phá trong những năm 1950 (tobacco rattle virus, potato virus S) hoặc giữa những năm 1960 (potato mop-top virus) (Vũ Triệu Mân, 1986) [6], (Kerlan, 2008) [40] Trong 4 thập kỉ gần đây, người ta đã phát hiện thấy số lượng virus ngày càng gia tăng ở châu Mỹ La Tinh, đặc biệt là trong châu thổ Andean, nơi được xem là khởi nguồn của khoai tây Nhiều virus phổ biến ở các cây chủ khác, đôi khi lại nhiễm vào khoai tây Một số chúng, ví dụ như virus đốm héo cà chua (tomato spotted wilt virus), gây bệnh cho khoai tây và có thể trở nên nghiêm trọng trong tương lai Nhiều tác giả cũng lưu ý rằng, một virus truyền qua con đường tiếp xúc, như pepino mosaic virus, cho đến nay vẫn chưa được phát

hiện trên khoai tây, cũng có khả năng nhiễm vào nhiều cây khoai tây quan trọng và trở thành một hiểm họa trong tương lai

Những người trồng khoai tây ở nhiều quốc gia đã thừa nhận rằng khoai tây giống ảnh hưởng lớn tới hiệu quả sản xuất Chương trình sản xuất khoai tây giống phát triển trong những năm 1940 và 1950 Khoai tây giống được chứng nhận với mức độ nhiễm virus thấp bây giờ đã trở thành nhân tố chính trong cuộc chiến chống virus Nhân giống kháng mạnh với virus cuộn lá (potato leafroll virus) được sử dụng ít nhất là từ những năm 1925 và khả năng kháng virus của nhiều cây dại họ cà đã được khai thác Ba kiểu kháng được mô tả từ những năm 1950 và thông tin di truyền về yếu tố quy định khả năng kháng được xác định từ những năm 1970 Hiện nay, nhiều gen chống chịu đã được xác định vị trí trên genome khoai tây, tạo điều kiện cho công tác nhân giống kháng virus dựa trên các chỉ thị phân tử Hàng loạt những biện pháp mạnh đã được xác lập để tránh sự xâm nhập của các virus kiểm dịch (Kerlan, 2008) [40] Sử dụng vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh để tạo cây chuyển gen kháng virus được xem là biện pháp hữu hiệu và đã thu được kết quả khá khả quan

1.2.1 Các loại virus khoai tây

Ở khoai tây có ít nhất 38 virus đã được mô tả (Kerlan, 2008) [40] Dựa trên mức độ thiệt hại và phạm vi phân bố, virus khoai tây được phân chia thành 3 nhóm:

+ Nhóm 1: Gồm những virus gây thiệt hại đáng kể, phân bố tương đối rộng trên thế giới

Bảng 1.1 Một số virus khoai tây thuộc nhóm 1

Năm đầu tiên đƣợc nói đến

Thiệt hại về kinh

virus (APMoV)

Comovirus 1977 Chƣa biết Chili, Ecuador, Peru, Brazil Arracacha virus B-

oca strain (AVB-O)

Nepovirus 1981 Chƣa biết Bolivia, Peru

Potato deforming mosaic virus (PDMV)

Begomovirus 1985 Cao ở một cây

Bắc Brazil

Potato rough dwart virus (PRDV)

Carlavirus 1995 Rất thấp Argentina, Uruguay Potato virus T (PVT) Trichovirus 1977 Chƣa biết Bolivia, Peru Potato virus U (PVU) Nepovirus 1983 Không có Peru

+ Nhóm 3: Gồm những virus xuất hiện ở những vùng khác nhau trên thế giới, mức độ thiệt hại không đáng kể hay chỉ cục bộ

Bảng 1.3 Một số virus khoai tây thuộc nhóm 3

Năm đầu tiên được nói đến

Thiệt hại

Alfalfa mosaic virus (AMV)

Alfamovirus

1940 Chỉ cục bộ Hiếm thấy Eggplant mottled

Dwarf virus (EMDV)

Nucleorhabdovirus 1987

Rất thấp Iran

Potato aucuba Mosaic Virus

(PAMV)

Potexvirus 1961 Thấp Hiếm thấy

Potato latent virus

(PotLV) Carlavirus

1996

Chưa biết Bắc Mỹ Potato virus V

(PVV) Potyvirus

1986

Thấp Bolivia, Peru, Bắc châu Âu

1.2.2 Đặc điểm chính của bệnh virus trên khoai tây 1.2.2.1 Triệu chứng và thiệt hại

Virus gây ra các triệu chứng chủ yếu là: khảm, đốm hay sự đổi màu, bộ lá bị quăn cuộn hay méo mó, sự rụng lá, còi cọc hay biến dạng của cây (Vũ Triệu Mân, 2007) [7] Các kiểu chết hoại khác nhau có thể xuất hiện trên lá, thân và củ có thể ở cả trong và ngoài Kích thước, số lượng, diện mạo và chất lượng của củ có thể bị ảnh hưởng (Kerlan, 2008) [40] Theo Vũ Triệu Mân, ở Việt Nam, các bệnh virus ảnh hưởng lớn tới năng suất củ khoai tây Trọng lượng củ trên khóm giảm, tỉ lệ củ lớn thấp hoặc không có, tỉ lệ củ nhỏ tăng cao Nhiều củ không sử dụng để làm lương thực hay thực phẩm được mà phải dùng làm thức ăn gia súc hay loại bỏ

Thiệt hại do bệnh virus khoai tây gây ra được chú ý nhiều hơn ở ngoài cánh đồng, nhưng thực ra ngay ở trong kho bảo quản bệnh cũng gây ra thiệt hại Một số điều tra cho thấy, củ khoai tây thuộc giống Ackersegen bị nhiễm virus Y, X, S, M và virus cuốn lá (PLRV) khi đưa vào bảo quản đều tăng lượng củ thối và giảm khả năng nảy mầm (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của bệnh virus đến củ khoai tây (tính bình quân 20 khóm mỗi loại hình bệnh)

(Theo Vũ Triệu Mân, 1973 -1977)

Chỉ tiêu theo dõi

Người ta thấy cả khi ngoại cảnh rất phù hợp cho bệnh phát triển, nhưng năng suất và phẩm chất củ bị ảnh hưởng rất ít Nhiều tác giả nhận thấy các cây ở các dòng lai có thể chống virus Y, X, S, M và virus cuốn lá

Ở cây khoai tây có một hiện tượng đáng chú ý là sự xâm nhiễm hỗn hợp của nhiều virus trên một cây bệnh Trong trường hợp này, cây bệnh thường có hiện tượng thoái hoá rất nặng và thiệt hại về năng suất rất nghiêm trọng (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]

Sự nhiễm virus và một số bệnh hại khác ở khoai tây có mối quan hệ với nhau và cần xem sự nhiễm virus như một chỉ tiêu đánh giá sự nhiễm bệnh nấm của cây khoai tây Bệnh thối trong kho do nấm Fusarium sẽ tăng lên gấp 5 lần khi củ khoai tây bị nhiễm virus X và tăng gấp 6 lần khi củ khoai tây bị nhiễm nhiều virus cùng lúc (X, S, M) (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]

1.2.2.2 Lan truyền của virus khoai tây

Các virus khoai tây được truyền có hiệu quả bởi rệp Rệp có thể định cư ở khoai tây hay di cư từ cây trồng, cỏ dại khác Potato leafroll virus (PLVR) và potato virus Y (PVY) là những virus điển hình cho việc nghiên cứu cơ chế của sự truyền virus qua rệp theo cách bền vững và không bền vững (persistent and nonpersistent) (Vũ Triệu Mân, 2007) [8] Nhiều virus ít gây thiệt hại được truyền qua các côn trùng khác, đáng chú ý là rầy xanh đuôi đen, bộ trĩ, ruồi trắng Potato virus X (PVX) và một số chủng của potato virus S (PVS) được truyền bởi sự tiếp xúc giữa bộ lá, các mầm, giữa các củ khi cắt và cũng thông qua các dụng cụ nông nghiệp Một số virus sinh sản trong đất trồng được truyền bởi giun tròn (tabacco rattle virus) hoặc nấm (potato mop-top virus, tobacco nerosis virus) Nhiều loài virus Andean có thể truyền bởi hạt (true potato seeds) và phấn hoa Trong hầu hết các trường hợp thì nguồn lây nhiễm là bản thân cây khoai tây (Kerlan, 2008) [40]

1.2.2.3 Phương pháp phòng chống bệnh virus khoai tây

* Quản lí khoai tây giống

Mục đích của công việc này là phân loại chất lượng về phạm trù thương mại của khoai tây giống Tiêu chuẩn này phụ thuộc vào từng nước, tuy nhiên mức độ nhiễm không nên quá 10% với tất cả các virus (Kerlan, 2008) [40]

Quá trình sản xuất khoai tây giống đảm bảo chất lượng gồm các bước chính sau:

+ Nhân giống trong điều kiện mức độ nhiễm virus rất thấp Ví dụ như trong ống nghiệm, hay trong nhà kính, ống nhựa ngăn chặn được vector hay trong những cánh đồng cô lập ở vùng mà khả năng nhiễm virus thấp

+ Kiểm tra cánh đồng bao gồm: - Tỉa cây bị bệnh

- Diệt tất cả các nguồn lây nhiễm

- Có biện pháp xử lí chống lại các vector (sinh vật trung gian truyền bệnh), đặc biệt là các côn trùng

+ Sử dụng kĩ thuật trồng đặc biệt tính đến ngăn chặn các vector như tỉa cành khoai tây, trồng cây hàng rào

+ Quản lí vụ thu hoạch: Kiểm tra ở phòng thí nghiệm trên diện rộng, thông thường sử dụng ELISA, đôi khi là các kĩ thuật phân tử

* Nhân giống kháng virus

Có 3 kiểu kháng virus là: Resistance to infection hay field resistance;

hypersensitivity resistance (HR); extrem resistance (ER)

Resistance to infection được di truyền đa gen, được xác định bởi số củ

con cháu bị nhiễm Nó bao gồm cả sự kháng với virus lẫn với tác nhân truyền bệnh Mức độ kháng phụ thuộc mạnh vào điều kiện môi trường, thời gian nhiễm, chất tiêm nhiễm và vector

HRvà ER được quy định bởi các gen trội đơn lần lượt N và R ER là một dạng tăng cường của HR (ER is an enhanced form of HR), kết quả là triệu chứng không rõ ràng và không có sự nhiễm vào cơ thể Ngược lại, HR gây ra những tổn thương chết hoại cục bộ trên các lá được tiêm và trong hầu hết các trường hợp sự chết hoại này mở rộng tới lá thấp hay cao hơn, tới thân và củ Mặc dù virus phân bố không đều nhưng có thể được phát hiện trong tất cả các cơ quan

Hình 1.1 Các gen kháng (màu xanh) với 4 virus chủ yếu (PVY, PLRV, PVX, PVA) ở khoai tây

(Theo: S Marchadour, FNPPPT-INRA, Pháp)

Các chương trình nhân giống khoai tây resistance to infection của các

virus chính đã được tiến hành từ lâu ở nhiều nước trồng khoai tây ER cũng được khai thác cao, đặc biệt là ở các nước mà quy định về khoai tây giống đảm bảo chất lượng không được quản lí thoả đáng Khả năng bảo vệ chống lại một số virus chính (PVX, PVY, PVA, PVM) quy định bởi gen R đã được tìm thấy trong một số loài họ cà dại như: S stolonniferum, S andigena, S chacoense, S acaule Những loài này được sử dụng trong các chương trình nhân giống ngay từ giữa những năm 1940 Gen N có mặt trong nhóm khoai tây cổ bởi vậy nó sát nhập dễ dàng vào cây khoai tây mới Ngoài ra, khoai tây dễ biến đổi bởi các kĩ thuật di truyền

Bên cạnh đó, sự kháng bắt nguồn từ mầm bệnh chống lại một số virus chính (PVY, PVX, PMTV) đã được nghiên cứu tỉ mỉ (Kerlan, 2008) [40]

* Biện pháp kiểm dịch

Các biện pháp kiểm dịch nhằm ngăn chặn nguy cơ xâm nhập của các virus lạ từ một quốc gia hay một lục địa khác Cho đến bây giờ, chưa có một loại virus hay chủng nào trong danh sách kiểm dịch truyền ra ngoài vùng khởi đầu của nó Các kĩ thuật cần thiết cho việc kiểm tra các vật liệu xuất nhập khẩu (củ, cành, hạt, phấn hoa, cây non trong ống nghiệm) đã được thiết lập Các virus được chuẩn đoán bởi các thí nghiệm sinh học trên cây chỉ thị được chọn lựa, phần lớn kiểm tra bởi ELISA Các kĩ thuật sinh học phân tử và kính kiển vi điện tử cũng có thể được sử dụng (Kerlan, 2008) [40]

1.3 POTATO VIRUS Y

1.3.1 Phân loại

Potato virus Y (PVY) thuộc chi potyvirus và họ potyviridae Đây được xem là một họ lớn nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế nhất của virus thực vật (Dimitre và cs, 2004) [28], (Tetsuji Ogawa và cs, 2008) [66]

1.3.2 Cây chủ

Phạm vi cây chủ tự nhiên của PVY gồm những cây thuộc 9 họ Có thể kể đến các cây sau: Khoai tây (S tuberosum ssp.tuberosum); một vài loài khoai tây địa phương ở Andes như A andigena; nhiều cây dại họ cà; hồ tiêu (Capsicum spp.); thuốc lá (Nicotiana spp.); cà chua (Lycopersicon spp.); cà tím (S melongena); các cây cảnh (Petunia spp., Dahlia spp.); các cây lâu năm (Physalis virginiana, P heterophyla); một số cây hàng năm hoặc cây tự nhân giống lâu năm Nhiều cây ở những vùng riêng biệt cũng là cây chủ của PVY như Cotula australis ở New Zealand hoặc Sorbaria tomentosa ở Himalaya

Cỏ dại thuộc họ cà thường là nguồn lây nhiễm PVY cho cà chua, hồ tiêu Chúng gồm:

+ S nigrum và S dulcamara ở nhiều quốc gia + S chacoense và P viscosa ở nam Mỹ

+ S Florida, P gracile, S aculeatissimum, P angulata, P ciliosa và P floridana ở Floria

+ P virginiana và P heterophyla là những cây chủ qua đông ở bắc Mỹ, S dulcamara ở phía tây châu Âu hoặc Datura spp ở các nước địa trung hải là nguồn lây nhiễm PVY cho khoai tây trồng cũng như khoai tây mọc tự nhiên Với thuốc lá ở USA, Canada, Italy, những cây cà chua, hồ tiêu, khoai tây nhiễm virus được xem là nguồn lây nhiễm (Kerlan và cs, 2008) [41]

Khoảng 495 loài cây chủ thuộc 72 chi, 31 họ được sử dụng để làm các thí nghiệm Chúng gồm 287 loài thuộc họ Solanaceae; 28 loài thuộc họ Amaranthaceae; 25 loài thuộc họ Fabaceae ; 20 loài thuộc họ Chenopodiaceae và 11 loài thuộc họ Asteraceae Phần lớn những cây này là những cây chủ tổn thương cục bộ Từ những năm 1980-1990, Datura stramonium được chứng minh là miễn dịch hoàn toàn với tất cả các chủng Một số PVY có thể nhiễm vào cây mô hình Arabidopsis thaliana (Kerlan và cs, 2008) [41]

N tabacum , N benthamiana, N occidentalis nhạy cảm với tất cả các chủng PVY và có thể sử dụng như các loài chuẩn đoán Các cây non N tabacum thường được sử dụng trong các thí nghiệm truyền virus qua rệp Đây cũng là cây chủ thích hợp cho nhân virus Lượng virus thu được dao động từ 10 đến 25mg (có khi lên tới 40mg) trên 1kg lá thuốc lá Ngoài ra, lá của cây này là vật liệu nhiễm virus tốt nhất cho việc tích trữ (Kerlan và cs, 2008) [41]

Hình 1.2 Những đốm (mottle) điển hình trên cây thuốc lá N tabacum cv Xanthi gây ra bởi PVY khoai tây sau 15 ngày tiêm

(Theo: C Lacroix, IVRA, Pháp)

1.3.3 Hình dạng và cấu trúc phân tử

Virion PVY không có vỏ bao, dạng sợi nhỏ, cong queo, dài 730-740nm, đường kính 11-12nm Nó có một ống trục với đường kính 2-3 nm, và cơ thể đối xứng xoắn ốc Quá trình lắp ráp các bộ phận và phá vỡ hạt PVY được

nghiên cứu tỉ mỉ

Hình 1.3 Hình dạng của PVY

Virion chứa khoảng 6% axit nucleic Genome của PVY là phân tử RNA dạng thẳng, sợi đơn, chiều dương, có poly A ở đầu 3‟ và liên kết với protein (VPg) ở đầu 5‟ nhưng không có lipid cũng như các thành phần khác RNA của PVY khối lượng khoảng 3,1-3,2kDa, dài chừng 9,7kb, trừ đuôi poly A Trình tự về toàn bộ hệ gen của PVY ở khoai tây, thuốc lá, hồ tiêu, cà chua, cà đen đã được công bố (Kerlan và cs, 2008) [41]

Cũng như các potyvirus khác, bộ khung đọc mở của nó quy định một polypeptit lớn, khoảng 3061-3063 aa Polypeptit lớn này được cắt thành 10 protein chức năng: P1 (284aa); HC-Pro (456aa); P3 (365aa); 6K1(52aa); CI (634aa); 6K2 (52aa); VPg (188aa); NiaPro (244aa); Nib (521aa); CP (267aa) Có 2 vùng ngoại biên không dịch mã: 5‟ NTR (184aa); 3‟ NTR (326-333aa)

Hình 1.4 Sơ đồ mô tả hệ gen của các chủng PVY0, PVYN và các biến thể PVYNTN

, PVYNW

(Được mô phỏng lại của Glais L,Tribodet M và Kerlan C (2002))

1.3.4 Quan hệ họ hàng với các potyvirus khác

PVY có quan hệ xa về huyết thanh với potato virus A (PVA), potato virus V (PVV) và 17 virus khác thuộc chi potyvirus PVY, pepper mottle virus

(PepMoV), PVV, pepper yellow mosaic virus, pepper severe mosaic virus, wild potato mosaic virus và Peru tomato virus tạo thành một nhánh cây phát sinh phân biệt với các potyvirus khác kể cả PVA (Kerlan và cs, 2008) [41]

1.3.5 Lan truyền của PVY

Trong tự nhiên, PVY được truyền bởi rệp và các cơ quan sinh sản sinh dưỡng của cây như củ hay cành Với các cây thuốc lá và cà chua được trồng ở Bắc Mỹ, PVY được truyền thông qua sự tiếp xúc giữa cây với cây Chúng cũng được truyền bởi sự tiếp xúc giữa các mầm củ khoai tây trong quá trình cất giữ Ngoài ra, phương thức truyền bởi hạt cũng được thông báo ở S nigrum và Nicandra physaloides Sự lan truyền bởi phấn hoa chưa từng được xác định ở bất cứ cây chủ nào

Không giống với các potyvirus khác, PVY có phạm vi rệp truyền bệnh rất lớn 70 loài rệp thuộc họ Aphidinae đều có thể truyền PVY Trong đó,

Mysus persicae là loại rệp có hiệu quả truyền PVY lớn nhất Ở khoai tây, loài

này cùng những loài định cư ở khoai tây trong thời gian dài trên cánh đồng là tác nhân truyền virus chủ yếu Tuy vậy, những loài di cư từ những cánh đồng khác cũng có vai trò đáng kể trong việc truyền PVY Rệp ngũ cốc, rệp đậu hà lan được cho là liên quan tới dịch bệnh xảy ra trên cánh đồng khoai tây ở Châu Âu, Bắc Mỹ (Kerlan và cs, 2008) [41] PVY có phạm vi cây chủ rộng nhưng cho tới tận bây giờ, ngoài khoai tây chưa có cây chủ nào được nhận định như là một nguồn lây nhiễm đáng kể Cũng trên khoai tây, có sự khác nhau về hiệu quả truyền PVY giữa các chủng PVYN

có hiệu quả truyền qua rệp cao hơn các chủng khác do thời gian duy trì của chúng trong rệp dài hơn

(Kerlan, 2008) [40]

Hình 1.5 Loài rệp có cánh truyền PVY (Aphis nasturtii) (Theo: B Chaubet, INRA, Pháp)

Rệp truyền PVY theo cách không bền vững (nonpersistent manner) Giai đoạn thu nhận được và tiêm rất ngắn (vài giây hay vài phút) Vòi của rệp xuyên vào bên trong lớp tế bào biểu bì của cây và đâm thủng màng tế bào chất Virus được giữ trong rệp không quá 1 đến 2 giờ Tuy vậy, ở Aphis nasturtii, thời gian giữ có thể lên tới trên 17 giờ Thời kì đói của rệp làm tăng hiệu quả của việc truyền virus mặc dù nó không ảnh hưởng tới số lượng các lỗ trích trong suốt thời kì thu nhận được (Kerlan và cs, 2008) [41]

Tính chất có thể lan truyền của PVY được quyết định bởi cả hai protein là coat protein (CP) và helper component protein (HC-Pro) Tất cả PVY có thể được truyền bởi rệp đều chứa bộ ba aa: DAG (Asp-Ala-Gly) trong vùng tận cùng đầu N của CP Khác với tobacco vein mottling virus, các virus trình tự DAGE cũng có thể được truyền bởi rệp PVY là virus đầu tiên được chứng minh rằng một thành phần của nó trong nhựa cây cần thiết cho sự vận chuyển của rệp Sự làm mất hoạt tính của HC- Pro liên quan tới việc không giữ được virion trên vòi rệp Các virus được vận chuyển bởi rệp và không được vận chuyển bởi rệp khác nhau ở một hoặc 2 sự thay thế axit amin: Gly35

cho Asp, Lys50 cho Glu hoặc Lys50 cho Asn, Ile225 cho Val, Ser355 cho Gly Lys50 là một

phần của “LITC motif” có tính bảo thủ (Lys–Ile–Thr–Cys) Thay đổi bên trong hay xung quanh motif này có thể làm mất tính chất có thể truyền bởi rệp của PVY

1.3.6 Một số đặc điểm của PVY trên khoai tây 1.3.6.1 Thiệt hại PVY gây ra trên khoai tây

Ở khoai tây, hiện nay PVY đã trở thành virus nghiêm trọng nhất, gây thiệt hại lớn về kinh tế Nó ảnh hưởng tới hầu hết các cây và gây thiệt hại về sản lượng tới 80%, thậm chí còn lớn hơn trong trường hợp bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) Kết quả nghiên cứu những năm trước, Weideman (1979) cho biết, ở Đức khi bị PVY nặng, khoai tây có thể giảm tới gần 60% năng suất dự thu

Thiệt hại do PVY gây ra trên khoai tây phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó hai yếu tố quan trọng nhất là giống khoai tây và chủng virus

1.3.6.2 Các chủng và các biến thể của PVY khoai tây

PVY khoai tây được chia thành 3 chủng (PVYO, PVYN và PVYC), nhiều biến thể PVYO

, PVYN và PVYC được phân biệt dựa trên các phản ứng của chúng trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum và trên khoai tây trồng mang

các „hypersensitivity gene’ Nytbr và Nc (Kerlan, 2008) [40] PVYN khác với PVYO và PVYC trong việc gây ra phản ứng chết hoại gân lá của N tabacum cv Samsun hoặc cv Xanthi 2aa ở vị trí 400 và 419 trong protein HC- Pro liên quan tới sự cảm ứng phản ứng chết hoại này ở cây thuốc lá Ngoài ra, các chủng PVY còn được phân biệt bởi phản ứng trên cây chủ P floridance PVYC gây ra sự suy sụp và chết sớm ở loại cây này (Kerlan và cs, 2008) [41]

Các biến thể PVYNTN

, PVYNW và PVYN:O cũng khá phổ biến PVYNW, PVYN:O và phần lớn PVYNTN là sự tái tổ hợp giữa chủng PVYO và PVYN với từ một đến ba điểm tái tổ hợp PVYNTN

đặc trưng bởi sự gây ra chết hoại củ trên khoai tây Việc phát hiện ra PVYNTN

không có điểm tái tổ hợp đã chỉ ra

rằng cấu trúc tái tổ hợp của genome không phải là điều kiện quyết định cần thiết cho kiểu hình chết hoại củ PVYN W phân biệt với PVYN

ở tính chất gây độc và kiểu huyết thanh là O-C PVYN:O được mô tả trong những năm 2000 cũng mang một phần thuộc tính của PVYN

và PVYO Một số PVYN:O

gây ra sự chết hoại củ (Kerlan, 2008) [40], (Kerlan và cs, 2008) [41], (Tetsuji Ogawa, 2008) [66]

Các chủng PVYO

và PVYN phân bố rộng khắp, nhưng đến nay, PVYNvẫn chưa thuộc danh sách mầm bệnh kiểm dịch ở Canada và USA Chủng PVYC ít gặp hơn (ở Pháp PVYC chiếm ít hơn 5% PVY) Biến thể PVYNTN

được tìm thấy trong hầu hết các nước trồng khoai tây kể cả USA và Peru Còn biến thể PVYNW được thông báo ở một vài quốc gia và phổ biến ở Poland Ở Canada và USA cùng thông báo sự xuất hiện của PVYN:O

Hình 1.6 Dấu hiệu so sánh PVY trên Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm): (a) Thuốc lá nhiễm PVYN; (b) Thuốc lá nhiễm PVYO1.3.6.3 Triệu chứng của bệnh do PVY trên khoai tây

vết đốm hay vết hình khuyên, sau đó chết và treo trên thân, lá cây giòn (Vũ Triệu Mân, 1986) [6] Khi nhiễm lần hai (secondery), triệu chứng điển hình là khảm, quăn, đốm chết hoại của lá và sự còi cọc của cây

+ PVYN gây ra các triệu chứng nhẹ hơn, thường là khảm, đốm trên lá Đôi khi những vết đốm không rõ ở lần nhiễm đầu tiên Khi bệnh nhiễm vào cây chậm, triệu chứng ở tán lá có thể không biểu hiện, nhưng củ thu hoạch ở nhóm cây nhiễm chậm vẫn có thể mang bệnh (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]

+ PVYC gây ra các sọc chấm trên thân và những đốm nâu xung quanh các mắt củ

Bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) do PVYNTN

và một số PVYNW, PVYN:O được đặc trưng bởi những kiểu đặc biệt trên lá và thân (đôi khi là chết hoại lá sồi) sự chết hoại hình vòng và cong trên bề mặt củ Đầu tiên, nó nhô ra không đáng kể trên vỏ củ, rồi trở nên nâu đen cùng một số vết rạn nứt (Kerlan và cs, 2008) [41]

Hình 1.7 Triệu chứng nhiễm lần hai (secondary) với PVY trên cánh đồng khoai tây: quăn, vàng và nhỏ của lá

(Theo: V Le Hingrat, FNPPPT, Pháp)

Hình 1.8 Triệu chứng của bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD): (a)Vàng và chết hoại trên lá cơ bản; (b) Kiểu chết hoại lá sồi trên lá trung gian; (c) Triệu chứng điển hình của PTNRD trên củ ở cv Monalisa; (d) Triệu chứng không điển hình gây

ra bởi PVYO

trên củ ở cv Yukon Gold

(Theo: K Charlet-Ramage, GNIS-INRA, France (a–c) và R P Singh Potato Research Centre, NB, Canada (d)) 1.3.6.4 Biện pháp phòng chống bệnh do PVY gây ra trên khoai tây

Các bệnh do PVY gây ra trên khoai tây đƣợc phòng chống dựa trên các biện pháp quản lí khoai tây giống, gây giống kháng bệnh và các quy định về kiểm dịch, đặc biệt là đối với PVYN Sự sản xuất khoai tây giống an toàn gồm: kiểm tra rệp truyền bệnh, xử lí dầu vô cơ chống lại sự truyền của rệp, trừ cỏ dại, kiểm tra phát hiện virus trong vụ thu hoạch chính bằng sử dụng ELISA trên phạm vi rộng Nhiều các thí nghiệm sinh học phân tử cũng đƣợc phát triển để phát hiện PVY trong lá, củ và rệp nhƣ lai cDNA (cDNA hybridization), các RT-PCR khác nhau, kĩ thuật microarray HR và ER lần lƣợt do các gen trội đơn NyvàRy quy định Gen Ry (Rysto, Ryadg)ở loài họ cà

dại, nằm trên nhiễm sắc thể XI và XII, quy định khả năng kháng rộng Ngược lại, gen Nc, Nytbr nằm trên nhiễm sắc thể thứ IV và Nz lần lượt quy định khả năng kháng PVYC

, PVYO và PVYZ Protein NiaPro của PVY liên quan tới việc hoạt động của Ry Đã tạo được hơn 20 loại cây trồng chứa Ry đem lại khả năng kháng virus khá bền (Kerlan và cs, 2008) [41] Ngoài ra, hướng nghiên cứu sử dụng vật liệu di truyền có nguồn gốc từ virus để tạo cây chuyển gen kháng virus đang được nhiều tác giả quan tâm

Hình 1.9 Vị trí các gen kháng PVY trên genom khoai tây (Theo: S Marchadour, FNPPPT-INRA, Pháp)

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PVY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.4.1 Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới

Năm 1931, Smith lần đầu tiên phát hiện ra PVY trên khoai tây Từ đó đến nay, hàng loạt các công trình nghiên cứu về virus này đã được công bố Các chủng và các biến thể PVY được phát hiện, nghiên cứu tỉ mỉ, thiệt hại của bệnh, các phương pháp chuẩn đoán cũng như các biện pháp phòng chống PVY được đưa ra

Việc chẩn đoán các chủng PVY đầu tiên dựa vào các thí nghiệm sinh học Các chủng khác nhau biểu hiện các triệu chứng khác nhau trên cây chỉ thị Tuy vậy, phương pháp này tốn nhiều thời gian, nhiều khâu phức tạp, không phù hợp với chuẩn đoán nhanh trên quy mô lớn Vì vậy, nhiều nhóm nghiên cứu ở các phòng thí nghiệm quốc tế đã cố gắng phát triển các phương pháp khác để phát hiện, mô tả PVY dựa trên các đặc điểm sinh học, huyết thanh và phân tử của PVY

Từ cuối những năm 1970, những hiểu biết về thuộc tính gây miễn dịch của PVY đã được sử dụng trong việc nhận dạng virus Dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể này, nhiều phương pháp chuẩn đoán lần lượt được

công bố như: DAS-ELISA hoặc TAS-ELISA (double-or triple-antibody

Sandwich-enzyme-linked immunosorbent assays); sử dụng kháng thể đơn

dòng hay đa dòng (Gugerli và Fries, 1983 [33]; Maat và Huttinga, 1987 [44]; Oshima và cs, 1990 [53]; Sanz và cs, 1990 [60]; Singh và cs, 1993 [62]; Ellis

và cs, 1996 [29]); kính hiển vi điện tử hấp thụ miễn dịch immunosorbent

electron microscopy (Walkey và Webb, 1984 [70]); chất kết dính nhựa mủ latex agglutination (Berckx, 1967 [16]; Talley và cs, 1980 [65]) Tuỳ theo sự

đặc trưng của những kháng thể được sử dụng mà sự kiểm tra này có thể có phổ rộng (Health và cs, 1987 [35]; Ellis và cs, 1996 [29]), hay chỉ phân biệt được giữa PVYN

với PVYO hoặc với PVYC (Mc Donald và Singh, 1996 [48]; Boonham và Barker, 1998 [19]; Ounouna và cs, 2002 [54]) Phương pháp huyết thanh nhanh, đáng tin cậy cho việc nhận dạng PVYN

và PVYO và phương pháp này được sử dụng khá phổ biến để phát hiện virus trong lá cây (Clark và Adams, 1977 [26]) hay trong các mô khác như củ khoai tây (Vetten và cs, 1983 [69]) Tuy nhiên, gần đây sự nổi lên của các biến thể như PVYNTN (Le Romancer và cs, 1994 [43]; Kerlan và cs, 1999 [42]) và PVYNW đã cho thấy điểm hạn chế của phương pháp huyết thanh (Chrzanowska, 1991 [25]) Bằng phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng, đa dòng đã xếp PVYN

W vào

nhóm PVYO, mặc dù chúng rõ ràng gây ra triệu chứng chết hoại trên gân thuốc lá Ngoài ra, phương pháp này không phân biệt được PVYNTN

và PVYN

Sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử từ đầu những năm 1980 cho phép nghiên cứu tính đa dạng di truyền của PVY Những nghiên cứu sử dụng bản đồ RFLP của một phần hay toàn bộ genome đã được tiến hành Toàn bộ trình tự của PVYN

(Robaglia và cs, 1989 [56]; Jakab và cs, 1997 [38]; Abdelmaksoud và Gamal Eldin, 2002 [15]; Nie và Singh, 2003 [51]), PVYO, PVYNTN (Thole và cs, 1993; Nie và Singh, 2003 [51]) đã được công bố Hơn nữa, trình tự vùng không dịch mã (NTR) ở đầu 5‟ và đầu 3‟, các gen của PVY đã có sẵn trong ngân hàng gen Những dữ liệu này cho phép so sánh giữa các trình tự, xác định sự tương đồng hay khác biệt về trình tự giữa các virus Những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng:

+ Tính biến đổi cao của PVY (trên 28% khác nhau giữa vùng P1 của PVYN và PVYO (Marie-Jeanne Tordo và cs, 1995 [46]))

+ Sự tương đồng giữa trình tự coat protein (CP) của PVYN

W và PVYO Điều này đã giải thích việc phát hiện PVYNW bởi các kháng thể đơn dòng đặc trưng của PVYO

+ Sự có mặt của 1 (PVYNW) đến 3 (PVYNTN) điểm tái tổ hợp giữa trình tự của PVYN

và PVYO trong các biến thể PVY nổi lên gần đây

Như một sự thay thế cho phương pháp huyết thanh, nhiều thí nghiếm sinh học phân tử đặc hiệu và nhạy cảm được phát triển dựa trên sự biến đổi trong trình tự PVYN

, PVYO hay điểm tái tổ hợp ở bên trong genome nhằm phát hiện đặc hiệu các chủng và biến thể của PVY Có thể kể đến các phương pháp như: gel retardation (Rosner và Maslenin, 2001, 2003 [58] [59]; Matousek và cs, 2000 [47]); RT-PCR-RFLP (Glais và cs, 2002 [31]); single-restriction cleavage of PCR products (Rosner và Maslenin, 1999 [57] ); RT-PCR đơn thành phần (Nie và Singh, 2002 [50]; Boonham và cs, 2002 [20]); RT-PCR đa thành phần

(Nie và Singh, 2002 [50]); AmpliDet RNA; competitive fluorescent RT-PCR (Walsh và cs, 2001 [71]) và PCR 3 mồi (Moravec và cs, 2003 [49])

Sử dụng vật liệu di truyền của virus để tạo cây khoai tây chuyển gen là một hướng đi mới, đã và đang nhận được những kết quả khá khả quan Schubert và cs, 2004 đã tạo thành công khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY

1.4.2 Tình hình nghiên cứu virus PVY ở Việt Nam

Ở nước ta, những nghiên cứu về bệnh virus nói chung và bệnh PVY nói riêng trên khoai tây còn rất ít Việc nghiên cứu mới bắt đầu dừng lại ở phát hiện sự xuất hiện của bệnh, sự phân bố của bệnh trên các cánh đồng khoai tây, tỉ lệ nhiễm, thiệt hại và phản ứng của cây khi bị nhiễm virus Cũng có những nghiên cứu xác định loại và chủng virus, nhưng dựa trên các phương pháp quan sát bằng mắt thường, cây chỉ thị, huyết thanh, kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]

Với sự tiến bộ của công nghệ sinh học đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống khoai tây củ bi sạch bệnh Nguyễn Thị Kim Thanh và cs, 1994) [9], (Trần Thanh Thu và cs, 1988) [10], (Trương Quang Vinh, 2007) [14]

Đến nay, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong phân tích, đánh giá đặc điểm di truyền của PVY khoai tây được công bố (Phạm Thị Vân và cs, 2009) [13]