Xác định tỉ lệ vi khuẩn đường ruột mang gen KPC và NDM 1 tại bệnh viện hữu nghị việt đức từ tháng 12 2016 đến tháng 4 2017

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy đủ tiếng anh Viết giải nghĩa tiếng việt DNA Deoxyribonucleic Acid Phân tử axit nucleic Bp Base pair Đơn vị đo trọng lượng của phân tử DNA C

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI: “XÁC ĐỊNH TỈ LỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT

MANG GEN KPC VÀ NDM-1 TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ VIỆT ĐỨC TỪ THÁNG 12/2016 ĐẾN THÁNG 4/2017”

Người hướng dẫn: Th.s Nguyễn Thị Vân Sinh viên thực hiện: Phan Ngọc Hà

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tôi dã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sau sắc tới những sự giúp đỡ này

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Th.s Nguyễn Thị Vân – Trưởng khoa Vi sinh, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức, người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn KTV Nguyễn Thành Đô và KTV Đoàn Anh Tuấn cùng các cán bộ khoa Vi sinh, đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô của khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo trong suốt quá trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người

đã luôn bênh cạnh động viên, ủng hộ, tạo mọi điều kiện tuận lợi giúp tôi học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Phan Ngọc Hà

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG 1

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH 2

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3

MỞ ĐẦU: 5

PHẦN I: TỔNG QUAN 7

1.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện: 7

1.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 10

1.2.1 Lịch sử phát triển kháng sinh: 10

1.2.2 Sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn: 11

1.2.2.1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn: 11

1.2.2.2 Phân loại đề kháng 11

1.2.3 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 12

1.2.3.1 Thay đổi đích tác động 12

1.2.3.2 Tạo ra các enzym 13

1.2.3.3 Giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất 13

1.3 Carbapenem và cơ chế kháng Carbapenem: 13

1.3.1 Carbapenem: 13

1.3.2 Cơ chế kháng cabapenem: 14

1.4 Tổng quan về KPC và NDM-1: 15

1.4.1 Tên loài và phân loại: 15

1.4.2 Lịch sử và phân bố: 17

1.4.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của một số vi khuẩn mang gen KPC và NDM-1: 18

1.4.4 Đặc điểm dịch tễ học: 23

1.4.5 Đặc điểm lâm sàng: 26

1.4.6 Đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn mang gen KPC và NDM-1 28

1.5 Tình hình nghiên cứu tính đề kháng Carbapenem của vi khuẩn mang gen KPC và NDM-1 30

1.5.1 Tình hình đề kháng Carbapenem của vi khuẩn mang gen KPC

và NDM-1 trên Thế giới 31

1.5.2 Tình hình đề kháng Carbapenem của vi khuẩn mang gen KPC và NDM-1 ở Việt Nam: 32

1.6 Ứng dụng CNSH vào xác định gen kháng kháng sinh Cabapenem: 33 1.6.1 Phương pháp PCR: 33

1.6.2 Phương pháp Realtime PCR: 35

1.6.3 Cách xác định KPC và NDM-1: 36

1.6.4 Quy trình sử dụng hệ thống realtime PCR ABI của Mỹ: 36

PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 40

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 40

2.1.1.Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Hữu nghị Hà Nội Việt Đức làm địa điểm nghiên cứu 40

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu: 40

2.1.3 Lấy mẫu thuận tiện 40

2.2 Vật liệu nghiên cứu: 40

2.3 Phương pháp: 41

2.3.1: Nuôi cấy vi khuẩn ái khí: 41

2.3.2 Thử nghiệm kháng sinh đồ với vi khuẩn ái khí: 41

2.3.3 Xác định gen KPC và NDM-1bằng hệ thống Realtime ABI của Mỹ: 41

2.3.3.1.Chuẩn bị cho phương pháp realtime PCR xác định gen KPC và NDM1 41

2.3.3.3 Tiến hành: 42

2.4 Phân tích và xử lý số liệu: 45

2.4.1 Phân tích và xử lý số liệu: 46

2.4.2 Kiểm soát sai số có thể xảy ra trong quá trình nghiên cứu: 46

PHẦN III: KẾT QUẢ 48

1.Tổng số bệnh nhân: 41 48

2 Phân loại bệnh phẩm theo khoa 48

3.Tỉ lệ bệnh nhân theo chẩn đoán 49

4 Tỉ lệ các loại bệnh phẩm 50

5 Tỉ lệ các chủng vi khuẩn toàn kháng phân lập đƣợc 50

6 Mức độ nhạy cảm kháng sinh 50

6.1 Mức độ nhạy cảm kháng sinh của 41 chủng 50

6.2 K.pneumoniae (26 chủng) 51

6.3 E.coli (6 chủng) 51

7 Tỷ lệ KPC/NDM1 52

8 Phân bố tỉ lệ gen kháng thuốc theo từng loại vi khuẩn 52

9 Phân bố tỉ lệ gen kháng thuốc theo bệnh phẩm 53

10 Phân bố tỉ lệ gen kháng thuốc theo khoa 54

BÀN LUẬN 55

KẾT LUẬN 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC BỆNH NHÂN

DANH MỤC BỆNH NHÂN

BỆNH PHẨM

NGÀY TRẢ KẾT QUẢ

2.1 Trang thiết bị dùng trong thí nghiệm 40

2.2 Trình tự mồi để phát hiện gen KPC và NDM-1 42

3.1 Phân loại bệnh phẩm theo khoa 47

3.2 Tỉ lệ bệnh nhân theo chuẩn đoán 48

3.9 Tỷ lệ phân bố gen kháng thuốc theo từng loại vi khuẩn 51

3.10 Tỷ lệ phân bố gen kháng thuốc theo bệnh phẩm 52

3.11 Tỷ lệ phân bố gen kháng thuốc theo khoa 53

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

1.1 Sơ đồ nhiễm khuẩn bệnh viện 6

1.2 Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện ở các nước có thu nhập

1.4 Cơ chế kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm 11

1.5 Cấu trúc phân tử của Carbapenem 13

1.6 Đặc điểm các vùng mang gen kháng kháng sinh của các

chủng K pneumonia

16

1.7 So sánh trình tự các amino acid của NDM-1 với các trình tự

amino acid của IMP1, IMP2, IMP-8,…

16

1.8 Hình ảnh chụp hiển vi hình thái siêu cấu trúc của K

pneumonia

18

1.9 Hình ảnh vi khuẩn K pneumonia được nuôi trên thạch máu 18

1.10 Hình ảnh k.pneumoniae thử trên canh thang 19

1.11 Một số phản ứng hóa học của K pneumonia 19

1.13 E coli nuôi cấy trên một số môi trường thạch 21

1.14 Hình ảnh 1 số phản ứng hóa học củ E coli 21

1.15 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn mang gen NDM-1 trên thế giới 23

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký

hiệu Viết đầy đủ tiếng anh

Viết giải nghĩa tiếng

việt

DNA Deoxyribonucleic Acid Phân tử axit nucleic

Bp Base pair Đơn vị đo trọng lượng

của phân tử DNA CDC Centers for Disease Control and

Prevention

Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh dịch ESBL Extended-spectrum beta-lactamases Enzym kháng kháng sinh

phổ rộng beta lactam GARP Global Antibiotic Resistance Partnership Hiệp hội kháng kháng

sinh toàn cầu MBLs Metallo-beta-lactamase Enzym kháng kháng sinh

nhóm beta lactam MLST Multilocus Sequence Typing Phân loại dựa trên đa

điểm của trình tự gen

KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase

Enzyme kháng carbapennem phát hiện trên các chủng Klebsiella pneumonia

NDM-1 New Delhi Metallo-beta-lactamase-1

New Delhi lactamase-1 kháng carbapenem

Metallo-beta-PCR Polymerase chain reaction Chuỗi phản ứng trùng

hợp PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Điện di xung trường WHO World Health Orgnization Tổ chức Y tế Thế giới RNA Ribonucleotide acid Phân tử axit nucleic MIC Minimum inhibitory concentration Nồng đọ ức chế tối thiểu kDa Kilo daton Đơn vị đo lượng phân tử

của DNA SIM Seoul imipenemase

Enzyme ly giải imipenem đặt theo tên thủ đô Seoul

AMC Amoxicicllin/ acid clavulanic Một loại kháng sinh TCC Ticarcillin + clavulanate Một loại kháng sinh

TZP Piperacillin + Tazobactam Một loại kháng sinhCAZ Ceftazidime Một loại kháng sinhCMX Cefuroxime Một loại kháng sinhCTX Cefotaxime Một loại kháng sinhETP Ertapenem Một loại kháng sinhCIP Ciprofloxacin Một loại kháng sinh

GM Gentamicin Một loại kháng sinhIPM Imipenem Một loại kháng sinhMEM Meropenem Một loại kháng sinhSXT Co-trimoxazole Một loại kháng sinhTGC Tygecycline Một loại kháng sinh

AK Amikacin Một loại kháng sinh

MỞ ĐẦU:

Cơ chế đề kháng carbapenem phổ biến ở K pneumoniae là tiết enzym

Klebsiella pneumoniae carabapenemase (KPC) Gen mã hóa KPC hiện diện

trên transposon Tn4401, một cấu trúc có khả năng giúp lan truyền tính kháng làm cho gen này không chỉ hiện diện ở K pneumoniae, mà đã chuyển sang

cho các vi khuẩn khác và gây nên nhiều vụ dịch bệnh với tỷ lệ tử vong cao

trên thế giới Thu thập được 26/41 chủng K pneumoniae từ các chủng đề

kháng carbapenem phân lập tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức từ tháng7 đến tháng 9 năm 2016 Khảo sát đặc tính kháng thuốc ở các chủng này cho thấy các chủng đã đề kháng từ 9 đến 15 loại kháng sinh thường được sử dụng trong điều trị nhiễm khuẩn; 88.4 đến 100% số chủng kháng với ampicillin và cephalosporin các thế hệ; 96.2 đến 100% kháng carbapenem, 84.6 đến 100 0% kháng quinolone; 16% kháng amikacin Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác nhận được sự hiện diện của gen mã hóa KPC trong 46.2% và gen mã hóa NDM-1 trong 34.6% số chủng Nghiên cứu đặc điểm phân tử của các chủng mang gen mã hóa KPC cho thấy kiểu gen đề kháng carbapenem là gen mã hóa KPC Gen này được tạo dòng và biểu hiện thành công với cả promoter tự nhiên và promoter T7 thành KPC tái tổ hợp ở dạng vạch protein

có kích thước 29 kDa và có khối lượng phân tử 29,542 Da, tương ứng với kích thước và khối lượng theo tính toán của KPC Protein KPC tái tổ hợp có hoạt tính carabapenemase, và cho thấy có vai trò quan trọng trong hình thành

tính kháng carbapenem ở các chủng này

Trong 2 năm gần đây bệnh viện Hữu nghị Việt Đức đã xuất hiện 1 chủng K peumoniae kháng hầu hết các kháng sinh thử nghiệm: AMC, CFs, Quinolon, AG, Carbapenem Các chủng này được xác định gen KPC và NDM-1 bằng kỹ thuật sinh học phân tử Realtime PCR với độ nhậy và độ đặc hiệu cao

KPC là gen kháng thuốc được gen mã hóa nằm trên plasmid Trình tự gen KPC nằm giữa trình tự transposon Tn 44001 Việc kết hợp KPC với họ gen khác làm tăng kháng thuốc và di truyền ngang nên nguy cơ kháng thuốc càng cao KPC và NDM-1 là các gen mã hóa quy định tính trạng kháng thuốc kháng sinh nhóm Carbapenem: Ertapenem, Imipenem, Meropemnem, Doripenem

Với vũ khí Klebsiella pneumoniae carbapenem (KPC) K.pneumoniae đã gây

ra nhiều đợt dịch trên thế giới với những hậu quả nghiêm trọng

Do khả năng lan truyền gen KPC có tích chất thành dịch nên mức độ nghiêm trọng và cũng là thách thức cho điều trị Việc xác định gen kháng thuốc như KPC và NDM1 cần thiết để phòng dịch tránh lây lan từ người bệnh này sang người bệnh khác từ người bệnh lan ra ngoài cộng đồng Chính vì vậy, cần thiết lập hệ thống giám sát vi khuẩn toàn kháng và siêu kháng, đặc biệt cần xác định rõ ở các chủng vi khuẩn này mang những loại gen kháng thuốc nào

để xây dựng các quy định, hưỡng dẫn dựa trên bằng chứng góp phần làm giảm nhiễm khuẩn bệnh viện, giảm tỉ lệ tử vong và giảm chi phí cho người bệnh

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định tỉ lệ vi khuẩn đường

ruột mang gen KPC và NDM-1 tại bệnh viện Hữu nghị Việt Đức từ tháng 12/2016 đến tháng 4/2017” với mục tiêu là:

- Xác định tỉ lệ vi khuẩn đường ruột mang gen KPC và NDM-1 tại bệnh viện

Hữu nghị Việt Đức

PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện:

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, nhiễm khuẩn bệnh viện (hospital-acquired

infection hay nosocomial infection) là “những nhiễm khuẩn người bệnh mắc

phải trong thời gian điều trị tại bệnh viện mà thời điểm nhập viện không thấy

có yếu tố nhiễm khuẩn hay ủ bệnh nào Nhiễm khuẩn bệnh viện thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện”

Để chẩn đoán nhiễm khuẩn bệnh viện, người ta thường dựa vào định nghĩa và tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng vị trí nhiễm khuẩn bệnh viện Hiện nay, theo hướng dẫn từ Trung tâm Giám sát và Phòng bệnh Hoa Kỳ (CDC) và các hội nghị quốc tế đã mở rộng định nghĩa ca bệnh cho các vị trí nhiễm khuẩn khác nhau và đang được áp dụng để giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện trên toàn cầu Dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học, các nhà khoa học

đã xác địnhcó khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác nhau có thể xảy ra tại bệnh viện

Hiện nay nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nghiêm trọng tác động đến sức khoẻ toàn cầu Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới về nhiễm

Hình 1.1 Sơ đồ nhiễm khuẩn bệnh viện

Thời điểm nhập viện Thời điểm nằm viện Thời điểm ra viện

48 giờ

NKBV

khuẩn bệnh viện từ năm 1995 đến 2010 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện tính chung cho các quốc gia có thu nhập cao nằm trong khoảng từ 5% đến 12% (Hình 1.2) và tỷ lệ chung cho tất cả các quốc gia này vào khoảng 7,6% [40] Theo ước tính của trung tâm phòng chống và kiểm soát bệnh châu

Âu, hàng năm có khoảng 4.100.000 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn bệnh viện và khoảng 37.000 trường hợp tử vong Phần lớn các trường hợp là nhiễm khuẩn tiết niệu tiếp theo là nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm khuẩn sau khi phẫu thuật, nhiễm khuẩn huyết và một số nhiễm khuẩn khác (bao gồm tiêu chảy do

Clostridium difficile) Tại Mỹ năm 2002, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện vào

khoảng 4,5% tương đương với khoảng 1,7 triệu bệnh nhân bị mắc nhiễm khuẩn Nhiễm khuẩn đường tiết niệu chiếm tỷ lệ cao nhất (36%) tiếp theo là

nhiễm khuẩn vết mổ (20%), nhiễm trùng huyết và viêm phổi (11%) [20]

Hình 1.2 Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện ở các nước có thu nhập cao *(nguồn WHO, 2011, Report on the Burden of Endemic Health Care-

Associated Infection Worldwide) [40]

Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện ở các quốc gia có thu nhập trung bình và thấp dao động từ 5,7% đến 19,9% và tỷ lệ tính chung là khoảng 10,1/100 bệnh nhân (Hình 1.3) [40] Trong đó nhiễm khuẩn vết mổ chiếm tỷ lệ cao nhất (29,1%), nhiễm khuẩn tiết niệu (23,9%), nhiễm khuẩn huyết (19,1%), đường hô hấp (14,8%) và các nhiễm khuẩn khác là 13,1% [40]

Hình 1.3 Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện ở các nước có thu nhập thấp và trung bình *(nguồn WHO, 2011, Report on the Burden of Endemic

Health Care-Associated Infection Worldwide) [40]

Có rất nhiều tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và sự tác động của các tác nhân này cũng rất khác nhau giữa các nhóm bệnh nhân, các bệnh viện, khoa điều trị và giữa các quốc gia Đặc biệt trong 10 năm vừa qua các vi

khuẩn Gram âm như Escherichia coli (E coli), Klebsiella pneumoniae (K

pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) và Acinetobacter baumanii (A baumannii) là nguyên nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn nặng

trong các bệnh viện như nhiễm khuẩn vết mổ, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết, đặc biệt khi các vi khuẩn này đã kháng lại các nhóm kháng sinh thế thệ mới đắt tiền được sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện như cephalosporin

và carbapenem là kháng sinh mạnh nhất hiện nay gia tăng một cách nhanh chóng trên toàn thế giới Điều này đe doạ thực sự đến hiệu quả điều trị cho

bệnh nhân tại các bệnh viện trên toàn thế giới [21, 28, 30, 41]

1.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh

Kháng sinh được phát hiện ở thế kỷ 20 và lập tức đóng vai trò quan trọng trong việc khống chế các bệnh nhiễm trùng Cùng với việc cải thiện điều kiện vệ sinh, nhà ở, dinh dưỡng và chương trình tiêm chủng mở rộng đã

góp phần quan trọng làm giảm tỷ lệ tử vong của các bệnh nhiễm trùng và tuổi thọ của con người đã được nâng cao Cho đến nay nhiều thế hệ kháng sinh khác nhau đã được nghiên cứu và chế tạo thành công đáp ứng kịp thời cho công tác điều trị Tuy nhiên hiện nay do sự gia tăng tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trong bệnh viện và cộng đồng là một vấn đề quan trọng hàng đầu trên thế giới cần được nghiên cứu và tìm ra các giải pháp phòng chống một cách hiệu quả

1.2.1 Lịch sử phát triển kháng sinh:

Năm 1929 Alexander Fleming là người đầu tiên nghiên cứu và phát minh ra loại thuốc kháng sinh đầu tiên có tên là Penicillin, trong nghiên cứu

tác giả quan sát thấy ở trên các đĩa thạch bị nhiễm nấm penicillin (mold

Penicillium notatum) có khả năng ức chế sự phát triển của tụ cầu, ở trên các

đĩa thạch này xuất hiện một vòng vô khuẩn xung quanh khóm nấm do tụ cầu không có khả năng mọc xung quanh khóm nấm Tuy nhiên phải đến năm

1939, Ernst Chain và Howard Florey mới tách chiết thành công hoạt chất penicillin và được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trong chiến tranh thế giới lần thứ II Năm 1946, penicillin bắt đầu được sử dụng trong lâm sàng

và có đóng góp to lớn cho y học Những phát minh này đã tạo ra một cuộc cách mạng khoa học trong nền y học hiện đại và làm tiền đề nghiên cứu và phát triển nhiều hợp chất kháng sinh có nguồn gốc từ thiên nhiên [32]

Thập kỷ 50 đến 70 của thế kỷ 20 được coi là thời kỳ hoàng kim của kháng sinh, nhiều loại kháng sinh mới đã được giới thiệu bao gồm: streptomycin, chloramphenicol và tetracycline được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Cho đến nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều nhóm và các thế hệ kháng sinh khác nhau như cephalosporin, fluoroquinolone, macrolide và carbapenem đã được nghiên cứu và sản xuất thành công, góp phần to lớn cho công tác phòng và điều trị các bệnh nhiễm trùng

1.2.2 Sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn:

1.2.2.1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn:

Trong tự nhiên phần lớn các vi khuẩn đều sở hữu riêng các gen kháng

kháng sinh Điều này được quan sát thấy trên một số chủng Staphylococcus

đã đề kháng với penicillin ngay sau khi được đưa vào sử dụng năm 1946 Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên và sự đấu tranh sinh tồn đã giúp các loài vi khuẩn có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, do vậy sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn thường xuất hiện rất nhanh ngay sau khi kháng sinh được đưa vào sử dụng Hiện nay hầu hết các vi khuẩn gây bệnh đã kháng lại một hoặc nhiều loại kháng sinh [35]

Trong thời gian gần đây, khoảng 70% các chủng vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất 1 loại kháng sinh thường dùng trong điều

trị, đặc biệt một số vi khuẩn như E coli, K pneumoniae, P aeruginosa và A

baumannii đã kháng lại tất cả các loại kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh

mạnh nhất hiện nay như cephalosporin và carbapenem Đây là một mối lo ngại và thách thức lớn đối với nền y học hiện đại [5, 21, 25, 41]

1.2.2.2 Phân loại đề kháng

Về nguyên lý của kháng sinh là ức chế sự phát triển của vi khuẩn, nhưng nếu trong môi trường kháng sinh ở nồng độ thường dùng mà vi khuẩn vẫn phát triển được gọi là đề kháng [1] Đề kháng được chia làm hai loại đề kháng giả và đề kháng thật

Đề kháng giả: là hiện tượng có biểu hiện đề kháng nhưng bản chất

không phải do di truyền

Đề kháng thật bao gồm đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được

+ Đề kháng tự nhiên: Là do cấu trúc di truyền của một số loài vi

khuẩn không có vách thì không chịu tác động của các thuốc kháng sinh tác

động vào vách [1]

+ Đề kháng thu được: là hiện tượng do một biến cố di truyền đột biến

hoặc nhận được gen đề kháng mà vi khuẩn đang từ trở nên có gen đề kháng sinh [1]

1.2.3 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

Có rất nhiều cơ chế tham gia vào tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Những cơ chế này có thể thay đổi đích tác động, tạo ra các enzym, ngăn cản khả năng gắn vào tế bào vi khuẩn và làm thay đổi đường chuyển hóa (tạo ra các isoenzym)

Hình 1.4 Cơ chế kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm [11]

1.2.3.1 Thay đổi đích tác động

Vi khuẩn thay đổi đích tác động của kháng sinh do đó kháng sinh không còn vị trí để tác động Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolone là ức chế hoạt động của đoạn gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym GyrA(DNA gyrase subunit A) và ParC (topoisomerase IV) của tế bào vi khuẩn

1.2.3.2 Tạo ra các enzym

Enzym được tạo ra làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của kháng sinh.Sau đó hàng loạt các enzym beta-lactamase có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem được phát hiện Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzym kháng kháng sinh của vi khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và

phần lớn các gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có thể truyền

dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài [9, 28]

1.2.3.3 Giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất

Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong trường hợp kháng tetracycline hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid [28] Việc thâm nhập của các kháng sinh nhóm beta-lactam được thực hiện qua các kênh vận chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác động của nhóm kháng sinh này [28] Cơ chế bơm đẩy (efflux

pump) của các kháng sinh nhóm quinolon của vi khuẩn E coli và P

aeruginosa, thường liên quan đến hệ thống vận chuyển ion qua màng tế bào

Thienamycin, một hợp chất tự nhiên do Streptomyces cattleya ( S cattleya) sống trong đất tiết ra Hoạt chất này có khả năng ức chế quá trình tổng hợp peptidoglycan của tế bào vi khuẩn Năm 1979 Kahan và cộng sự đã tách chiết thành công thienamycin có độ tinh khiết cao >90% Năm 2003, gen mã hóa

quá trình tổng hợp thienamycin của vi khuẩn S cattleya được phát hiện và

giải trình tự, tổng hợp và phát triển thành các kháng sinh thuộc nhóm

trúc đặc biệt của carbapenem tạo ra ba đặc tính giúp cabapenem có phổ tác dụng rộng: (1) những phân tử này rất nhỏ và có khả năng sử dụng những lỗ hổng rất nhỏ của màng ngoài vi khuẩn Gram âm để tiếp xúc với PBP (

penicillin- binding protein); (2) cấu trúc của carbapenem làm cho kháng sinh này khó bị β- lactam của nhiều loại vi khuẩn cắt đứt vòng β- lactam; (3)

carbapenem có ái lực với nhiều PBP khác nhau của nhiều loại vi khuẩn

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của carbapenem 1.3.2 Cơ chế kháng cabapenem:

Tình hình kháng carbapenem chủ yếu do 3 cơ chế:

- Sản xuất vượt mức một loại β- lactamase không phải carbapenem như AmpC cephalosporinase hay ESBL kết hợp với giảm tính thấm màng ngoài

do mất hoặc thay thế kênh porin làm chặn cổng vào của kháng sinh Cơ chế này được nhận thấy ở Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogens, Proteus rettgeri, Citrobacter freundii, Escherichia coli, K pneumonia [35, 36] Ở K pneumoiae, kênh porin màng OmpK35 và OmpK36 giữ vai trò quan trọng, sự thiếu hay thay thế một trong hai protein này đều đóng gớp vào tính kháng carbapenem [19]

- Sản xuất carbapenem có khả năng thủy giải carbapenem nhờ hoạt tính thủy phân cầu amide của vòng β- lactam Đây là cơ chế chủ yếu được thấy ở

K pneumoniae [35,36] Với vũ khí Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), K pneumoniae đã gây ra nhiều đợt dịch trên thế giới với những hậu quả nhiêm trọng

- Sự thay đổi ái lực của các protein gắn penicillin (PBP) đối với

carbapenem làm cho kháng sinh này không tiếp cận được với chuỗi

peptidoglycan đang được tổng hợp của vi khuẩn [35, 36] Cơ chế kháng

carbapenem này trên K pneumoniae ít được nghiên cứu [35, 36]

Ở K pneumonia, vấn đề hệ thống bơm đẩy kháng sinh ra ngoài AcrAB

vó liên quan tính kháng carbapenem hay không vẫn chưa được làm rõ [19], tuy nhiên đã có nghiên cứu chứng minh rằng sự biểu hiện vượt mức hệ thống này có làm cho vật chủ mở rộng phổ kháng kháng sinh, chúng có khả năng kháng chéo với chloramphenicol, quinolone [7]

1.4 Tổng quan về KPC và NDM-1:

1.4.1 Tên loài và phân loại:

- Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC): là một lớp enzyme lần đầu

tiên được tìm thấy trong K pneumonia phân lập, thuộc lớp A, nhóm 2f, bị ức chế bởi clavulanic Tuy nhiên nó có thể được sản xuất bởi các sinh vật khác bao gồm Serratie spp, Enterbacter spp, E coli,

+ KPC do gen mã hóa nằm trên plasmid, plasmid có thể ở dạng dung hợp hay không dung hợp Trình tự gen blaKPC nằm giữa trình tự transposon Tn44001 Việc kết hợp gen blaKPC với các họ gen khác nằm trên plasmid như Fluoroquinolone, aminoglycosides làm tăng cường tính kháng cho vi khuẩn Hơn nữa, plasmid là yếu tố di truyền di động, có thể dễ dàng truyền ngang giữa các loài lân cận nên khả năng truyền tính kháng là rất cao

- EnzymeNewDelhimetallo-beta-lactamase1(NDM-1) kháng

carbapenem nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay, đang là vấn đề lớn đe dọa nghiêm trọng đến sức khóe cộng đồng Vi khuẩn mang gen NDM-1 được phát hiện ở bệnh viện và cả ở cộng đồng Phần lớn gen mã hóa

NDM-1nằm trên plasmid, điều kiện thuận lợi để lây lan gen NDM-1 trong quần thể vi khuẩn gram âm

+New Delhimetallo-betalactamase (NDM-1) là enzyme mới thuộc nhóm B (metallo-beta-lactamase), có trọng lượng phân tử 28kDa, được Yong và cộng sự

phát hiện lần đầu tiên năm 2008 trên chủng K.pneumoniae và E.coli phân lập từ

bệnh nhân người Thụy Ðiển bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu có tiền sử chữa bệnh tại Ấn Ðộ[54] Enzyme NDM-1 được phát hiện có khả năng ly giải tất cả kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam trừ aztreonam và sinh enzyme metallo-betalactamase (MBL) nhưng có kết quả âm tính với các gen mã hóa MBL được phát hiện trước

đó như IMP, VIM.SIP, SPM, KHM và SIM(Hình1.6)

Hình 1.6: Ðặc điểm các vùng mang gen kháng kháng sinh của các chủng

K.pneumoniae.

Ghi chú: (A) đọan 4,3kb mang gen blaNDM-1 được nối với 4,8kb của

classIintergron (int1) mang các gen kháng kháng sinh arr-2(kháng rifampicin),ereC(erythromycin),aadA1(gentamicin),

cmlA7(chloramphenicol)và qacEA(sulphomamide) (B)blaCMY-4 gen mã hóa tính kháng sinh cephalothin, ampicillin và amoxicillin-clavulanic acid[54].

+ Gen mangNDM-1tương đồng rất thấp với trình tự của các enzyme MBL được tìm thấy trước đó và chỉ có 32,4% giống với VIM1 và VIM2(Hình1.7)

Hình 1.7 So sánh trình tự các amino acid của NDM-1 với các trình tự amino acid của IMP1, IMP2, IMP-8, VIM1, VIM2, GIM1, SPM1, SIM1 và KHM1[9]

1.4.2 Lịch sử và phân bố:

- Những thập kỷ qua đã chứng kiến sự gia tăng nhanh chóng của vi khuẩn

gram âm kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem, “ nhóm lựa chọn cuối cùng” [55] Chủng K pneumonia kháng carbapenem mang gen KPC được phát hiện đầu tiên tại Mỹ năm 1996 [46], sau đó lây lan ra toàn thế giới và chủng K pneumonia này là nguyên nhân gây ra dịch trong bệnh viện tại

Mỹ, các quốc gia Châu Âu, Nam Mỹ và Hy Lạp [25][37][38]

- NDM-1 được phát hiện lần đầu tiên năm 2003 vào hiện đã lây lan ra toàn thế giới [35][32][39] Sự xuất hiện của vi khuẩn mang gen siêu kháng thuốc này là dấu hiệu mở đầu cho một giai đoạn mới về tình trạng

vi khuẩn kháng kháng sinh trên thế giới Sự lây lan của vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 không chỉ giới hạn trọng phạm vi loài mà còn có thể lan truyền sang các loại vi khuẩn gam âm khác sống bình thường trong đường tiêu hóa người [34][43]

- Sự lan truyền của các gen kháng kháng sinh như NDM-1 và KPC được tạo điều kiện bằng chuyển ngang gen (HGT) giữa các vi khuẩn [38] Trong số các tác nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, HGT tạo điều kiện kết hợp của các gen kháng kháng sinh hiệu quả nhất từ khu vực địa lý khác nhau vào plasmid kháng đa thuốc lây lan giữa các chủng Tái tổ hợp và chuyển vị đã tạo ra quần thể các plasmid đã liên quan đến kiến trúc nhưng khác nhau trong thành phần của các băng cassette kháng thuốc kháng sinh [39] Gen kháng kháng sinh

cũng có thể lây lan thông qua việc mở rộng dòng vô tính trong các chủng gây

bệnh thành công, ví dụ, KPC trong K loại chuỗi pneumoniae (ST) 258 [32],

và mở rộng phổ β-lactamase CTX-M-15 trong E coli ST131 [33] Cả hai

HGT và mở rộng dòng vô tính đã kích hoạt và KPC NDM-1 để nhanh chóng lan rộng đến các địa điểm xa xôi sau khi xuất hiện của họ [42, 39]

1.4.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của một số vi khuẩn mang gen KPC và NDM-1:

Klebsiella pneumonia:

- Hình thể:

+ Trong bệnh phẩm: trực khuẩn ngắn, Gram âm, bắt màu đậm ở 2 cực

+ Vi khuẩn có nhiều hình thể: Cầu khuẩn, hình dài; có vỏ polysaccharide đặc trưng- lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của tế bào chủ, không di động, không sinh nha bào

Hình 1.8: Hình ảnh chụp hiển vi hình thái siêu cấu trúc của K

Hình 1.10: Hình ảnh K.pneumoniae thử trên canh thang

- Tính chất sinh vật hóa học:

+ Lên men nhiều loại đường sinh acid và hơi: glucoza, lactoza, manit

+ K pneumonia có quan hệ gần nhất với klebsiella oxytoca, chúng phân biệt nhau nhờ phản ứng indole, K pnneumoniae có indole âm và có khả năng tăng trưởng với cả melezitose và 3- hydroxybutyrate

+ một số phản ứng: Đỏ metyl (-), VP (+), Citrat (+), Ureaza (+), H2S (-)

Hình 1.11:Hình ảnh một số phản ứng hóa học của K pneumoniae

- Phân bố:

+ Vi khuẩn này có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên như ở đất, nước, nước tahir, các sản phẩm thực vật, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao + K pneumonia có phổ kí chủ động vật rộng, bao gồm cả côn trùng và nhiều nhóm động vật khác Ở người có thể tìm thấy chúng ở da, ở cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hau vết thương vô trùng

Escherichia coli ( E coli)

+ Là những vi khuẩn kí sinh, bình thường có ruột

+ Là tác nhân gây bệnh khi xâm nhập vào các cơ quan khác như đường tiết niệu, đường máu, đường mật,…

+ Và có một số chủng E.coli có khả năng gây bệnh tiêu chảy như ETEC, EPEC, EIEC…

- Đặc điểm sinh vật học:

 Hình thể:

Hình 1.12: Hình ảnh hình thái của vi khuẩn E coli

+ Trực khuẩn Gram âm, di động ( có lông quanh thân) + Một số chủng E coli có vỏ polysaccarit, không có nha bào

 Tính chất nuôi cấy:

+ Hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc

+ Phát triển dễ dàng ở môi trường nuôi cấy thông thường, một số có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản

+ Nhiệt độ thích hợp 37o

C, pH: 7-7,2

Hình 1.13: Hình ảnh E.coli nuôi cấy trên một số môi trường thạch

 Tính chất sinh vật hóa học:

+ Lên men nhiều loại đường sinh axit và sinh hơi: glucoza, lactoza,

rammoza…

+ Không lên men đường adonit và inozit

+ Phản ứng sinh indol: E.coli có indol (+)

+ Phản ứng đỏ metyl: E.coli có phản ứng đỏ metyl (+)

+ Phản ứng tính khả năng sử dụng cacbon của Citrat: E.coli phản ứng Citrat(-)

+ E.coli không phân giải được ure, không sinh H2S sau 48 giờ

Hình 1.14 Hình ảnh một số phản ứng hóa học của E.coli:

• Sức đề kháng:

+ Đun 55oC trong 1 giờ hoặc 60oC trong 30 phút sẽ bị tiêu diệt

+ Dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường

1.4.4 Đặc điểm dịch tễ học:

* NDM-1:

- Kumarasamy và cộng sự [49] đã phân tích 180 chủng vi khuẩn đường ruột mang gen NDM-1 phân lập tại Ấn Độn, Pakistan và Anh Kết quả cho thấy: (i) Tất cả các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 kháng tất cả kháng sinh ở mức độ cao ngoại trử colistin

(ii) Kháng sinh carbapenem là nhóm kháng sinh được coi là mạnh nhất và hiện chưa có kháng sinh thế hệ mới thay thế

(iii) Hầu hết các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 đều có khả năng truyền qua plasmid trong mô hình phòng thí nghiệm

(iv) Điều tra dịch tễ học 37 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 tại Anh cho thấy nhiều trường hợp có tiền sử đi du lịch, chữa bệnh tại Ấn Độ và Pakistan, do vậy các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 phân lập tại Anh có thể là hậu quả sự lây nhiễm từ Ấn Độ và Pakistan

- Tại Châu Âu từ năm 2008 đến 2010, có 77 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 kháng carbapenem ở 13 quốc gia, nhiều nhất tại Anh với một số ca bệnh tăng dần theo năm: 8 ca (2008); 30 ca (2009) và 39 ca ( 9 tháng đầu năm 2010)[30] Hiện nay, vi khuẩn mang gen NDM-1 đã được phát hiện ở Australia, Canada, Singapore, Trung Quốc, Hoa Kỳ và nhiều nước khác [5][41- 42] (hình 1.15)

Hình 1.15: Tỷ lệ phân bố vi khuẩn mang gen NDM-1 trên thế giới

- Đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu dịch tễ học để đánh giá các yêu tố nguy

cơ liên quan đến nhiễm vi khuẩn gram âm mang gen NDM-1 Tại Châu Âu, điều tra dịch tễ học 77 trường hợp bệnh nhân dương tính vơi NDM-1 cho thấy

51 ca tại Anh có độ tuổi mắc từ 2-87 tuổi và tỷ xuất về giới tính nam/nữ à 0,62 Có 57 chủng vi khuẩn đường ruột khác nhau mang gen NDM-1 bao gồm: K,pneumonia (n=31), E.coli (n=36), Enterobacter spp (n=4), C.freundii (n=3), M morganii (n=2) và Pro- teus mirabilis (n=1) Các quốc gia Anh và Đức đã công bố xuất hiện chủng Aci-netobacter spp mang gen NDM-1 nội địa [40] Tổng số 26 trường hợp dương tính với NDM-1 tại các quốc gia Châu

Âu khác ( ngoài Anh), trong đó 14 trường hợp được xác định mang vi khuẩn NDM-1 nhưng không có triệu chứng lâm sang, 6 nhiễm khuẩn tiết niệu, 3 nhiễm khuẩn phần mềm, 2 nhiễm khuẩn đường tiêu hóa và 1 trường hợp viêm phổi 4/77 ca dương tính tại Châu Âu tiến triển thànhn hiễm khuẩn huyết và 7

- Trong khi đó, tại Ấn Độ và Pakistan, nhiễm khuẩn NDM-1 lại có xu hướng xảy ra ở cộng đồng [43] Các nghiên cứu chỉ ra rằng gen NDM-1 không phải

lan truyền từ một chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 ban đầu mà lan truyền qua các plasmid trong quần thể vi khuẩn có trong hệ tiêu hóa của người

[34][35] Điều này đặc biệt quan trọng đối với các quốc gia đang phát triển, nơi cộng đồng dân cư sống trong điều kiện vệ sinh thấp kém và thiếu nước sạch[34]

* KPC:

-Trước sự bùng phát bệnh viện đầu tiên ở thành phố New York, kháng

carbapenem trong K pneumoniae là hiếm ở Mỹ [36] Các dịch ban đầu gây ra mối quan tâm lớn như những vi khuẩn này đã giảm tính nhạy cảm hoặc kháng với tất cả beta-lactam bao gồm penicillin, cephalosporin, monobactams, và carbapenems Hơn nữa, nghiên cứu in vitro của 95 KPC phân lập từ các bệnh viện Brooklyn năm 2003-2004 cho thấy khoảng một nửa là nhạy cảm với kháng sinh nhóm aminoglycosides và rất ít có dễ bị flouroquinolones [35] -Sau khi dịch lẻ tẻ ban đầu ở thành phố New York, vi khuẩn sản xuất enzyme KPC đã trở thành đại dịch ở nhiều bệnh viện trong khu vực [33] New York và New Jersey Trong thập kỷ tiếp theo, vi khuẩn KPC-sản đã lan truyền khắp nước Mỹ và trên toàn thế giới Dữ liệu liên quan đến nhiễm trùng bệnh viện báo cáo với CDC cho thấy tỷ lệ tổng thể của kháng carbapenem trong K

pneumoniae phân lập được hoa hồng từ ít hơn một phần trăm trong năm 2000 đến tám phần trăm trong năm 2007 [43] Tại một trung tâm y tế học tập tại thành phố New York, tỷ lệ kháng carbapenem K pneumoniae tăng từ 9% năm

2002 lên 18% vào năm 2004, sau đó tiếp tục đến 38% trong năm 2008 [36] Cho đến nay, vi khuẩn KPC-sản xuất đã được phân lập ở ít nhất 33 quốc gia [35] Năm 2005, báo cáo đầu tiên của một chủng lâm sàng sản xuất một bên ngoài KPC của Mỹ xảy ra tại Pháp từ một bệnh nhân gần đây đã được nhập viện ở New York City [31] Các ổ dịch đầu tiên bên ngoài nước Mỹ đã ở Israel [42] và KPCs hiện đang lưu hành ở cả Israel và Hy Lạp KPCs

Enterobacteriaceae sản xuất cũng đã được báo cáo ở Brazil, Trung Quốc,

Colombia, Na Uy, Anh, Ấn Độ, Thụy Điển [37] và gần đây hơn, Ý và Phần Lan

Hình1.16: Tính năng dịch tễ học của Klebsiella pneumonia carbapenem của các nước xuất xứ

1.4.5 Đặc điểm lâm sàng:

* NDM-1:

- Nghiên cứu về triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 cho thấy có các biểu hiện tương tự như các bệnh nhân bị nhiễm khuẩn kháng kháng sinh nhóm carbapenem (KPC, IMP,VIM…) [35][40] Một số trường hợp không có triệu chứng lâm sàng thường là người lành mang

vi khuẩn này Các trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện (nosocomial infections) với vi khuẩn mang gen NDM-1 được chuẩn đoán là nhiễm khuẩn tiết niệu, vết

mổ, máu, phần mềm và viêm phổi liên quan đến đặt ống hỗ trợ hô hấp Nhiều bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 kháng carbapenem có các bệnh mãn tính đi kèm và có tính trạng suy giảm miễn dịch (như đái tháo

đường, ung thư hay suy thận) hoặc đang sử dụng các liệu pháp điều trị suy giảm miễn dịch hoặc có sử dụng các thủ thuật y tế can thiệp [49][50] Một số người trẻ tuổi và người khỏe mạnh trở thành người lành mang vi khuẩn mang gen NDM-1 sau khi điều trị ở các bệnh viện ở Ấn Độ và Parkistan [35][30] Nguyên nhân gây tử vong của các trường hợp nhiễm vi khuẩn mang gen

NDM-1 thường khó xác định do các chuẩn đoán rất phức tạp và bệnh nhân thường có các bệnh khác đi kèm