Xác định vi khuẩn gram âm mang gen mediate colistin resistant 1 (mcr 1) kháng colistin phân lập trong thực phẩm và môi trường chăn nuôi

Mục tiêu nghiên cứu đề tài Xác định được mức độ kháng kháng sinh sử dụng phổ biến, đặc biệt mức độ kháng colistin của các chủng vi khuẩn thuộc các loài E.coli sp., Salmonella sp., Campy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

VŨ THỊ HUYỀN

XÁC ĐịNH VI KHUẩN GRAM ÂM MANG GEN

MEDIATE COLISTIN RESISTANT 1 (MCR-1) KHÁNG COLISTIN PHÂN LậP TRONG THựC PHẩM VÀ MÔI TRƯờNG CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội,10/2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã ngành : 60420201

XÁC ĐịNH VI KHUẩN GRAM ÂM MANG GEN

MEDIATE COLISTIN RESISTANT 1 (MCR-1) KHÁNG COLISTIN PHÂN LậP TRONG THựC PHẩM VÀ MÔI TRƯờNG CHĂN NUÔI

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS PHẠM THỊ TÂM

Hà Nội, 10/2016

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

và sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Tâm, người đã định hướng nghiên cứu đề tài cũng như hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự hỗ trợ của các anh chị cán bộ, giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội Tôi xin cảm ơn tập thể các Thầy/Cô Khoa Sau đại học, Viện đại học Mở Hà Nội đã giúp tôi hoàn thành chương trình đào tạo thạc sỹ ngành công nghệ sinh học Đặc biệt, tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ, đồng nghiệp khoa Xét nghiệm Vi sinh Bệnh viện Nhi Trung ương đã chia sẻ khó khăn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác

Tôi thực sự biết ơn gia đình đã ủng hộ và động viên để tôi hoàn thành khóa học này

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2016

Tác giả

Vũ Thị Huyền

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tôi, tất cả các số liệu kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong đề tài nào khác

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2016

Tác giả

Vũ Thị Huyền

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình kháng thuốc trên thế giới 3

1.2 Tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam 5

1.2.1 Sử dụng kháng sinh trong cộng đồng 5

1.2.2 Sử dụng kháng sinh và tình hình kháng kháng sinh trong bệnh viện 6

1.3 Sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh trong chăn nuôi 9

1.4 Nguyên nhân kháng thuốc 10

1.4.1 Sử dụng thuốc kháng khuẩn không thích hợp 10

1.4.2 Công tác kiểm nghiệm, kiểm tra chất lượng thuốc còn hạn chế 11

1.4.3 Phòng và kiểm soát các bệnh truyền nhiễm chưa hiệu quả 11

1.4.4 Hệ thống giám sát về kháng thuốc chưa được thiết lập 11

1.4.5 Sử dụng thuốc kháng khuẩn trong chăn nuôi chưa được kiểm soát hợp lý 11

1.4.6 Các quy định chuyên môn về khám, chữa bệnh chưa được cập nhật thường xuyên, liên tục 11

1.4.7 Nhận thức của cộng đồng, cán bộ y tế về kháng thuốc còn hạn chế 12

1.5 Kháng sinh Colistin 12

1.5.1 Cơ chế tác dụng của colistin 12

1.5.2 Dạng sử dụng, thải trừ thuốc và phổ kháng khuẩn 13

1.5.3 Tình hình kháng colistin 14

1.5.4 Cơ chế gây kháng colistin 16

1.5.5 Gen kháng kháng sinh colistin 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3 Thiết bị, dụng cụ, môi trường hóa chất 21

2.3.1 Thiết bị: 21

2.3.2 Dụng cụ 21

2.3.3 Môi trường, hóa chất 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu thịt gà, lợn (Theo QCVN 01-04: 2009/ BNNPTNT) 22

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu tăm bông trực tràng gà, lợn 23

2.4.3 Phương pháp lấy mẫu chất thải trong môi trường chăn nuôi 23

2.4.4 Phương pháp xử lý mẫu 23

2.4.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli 23

2.4.6 Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella 24

2.4.7 Phương pháp phân lập vi khuẩn Campylobacter 24

2.4.8 Phương pháp đánh giá độ nhạy cảm kháng sinh (CLSI 2015) 25

2.4.9 Kỹ thuật tách chiết DNA 26

2.4.10 Kỹ thuật PCR phát hiện gen mcr-1 (1,626 bp) 26

2.4.11 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Mức độ nhiễm một số loài vi khuẩn gram âm ở thực phẩm và môi trường chăn nuôi 28

3.2 Mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gram âm phân lập 30 3.2.1 Kết quả xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi

khuẩn E coli phân lập 31

3.2.2 Kết quả xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập 33

3.2.3 Kết quả xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn Campylobacter phân lập 36

3.2.4 Mức độ kháng kháng sinh colistin của các chủng vi khuẩn phân lập 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

1 Kết luận 49

2 Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANSORP Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens

BHI Brain Heart Infusion

BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn

DNA Deoxyribonucleic acid

ECDC European Centre for Disease Prevention and Control

ESBL Extended-spectrum beta-lactamase

KONSAR Korean Nationwide Surveillance of Antimicrobial Resistance LPS Lipopolysaccharide

MCR-1 Mediate colistin resistant 1

MDR Multi Drug Resistance - Đa kháng thuốc

MIC Minimum Inhibitory Concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu

PCR Polymerase Chain Reaction

QCVN Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia

RNA Ribonucleic acid

WHO World Health Organization

XLD Xylose Lysine Deroxycholate

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Campylobacter 25

Bảng 3.1 Mức độ ô nhiễm một số loài vi khuẩn gram âm trong mẫu thí nghiệm 29Bảng 3.2 Quy định đánh giá mức độ mẫn cảm với kháng sinh của CLSI,

2015 30

Bảng 3.3 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập 31 Bảng 3.4 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập 33 Bảng 3.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Campylobacter phân lập 36

Bảng 3.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh colistin của vi khuẩn phân lập 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Tỉ lệ kháng kháng sinh thường dùng của 4 loài vi khuẩn gram âm 8

Hình 1.2 Các nước trên thế giới phát hiện gen mcr-1 trong cơ thể động vật 19 Hình 1.3 Các nước trên thế giới phát hiện gen mcr-1 20

trong thực phẩm và môi trường 20

Hình 1.4 Các nước trên thế giới phát hiện gen mcr-1 ở người 20

Hình 3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập 32

Hình 3.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủngvi khuẩn Salmonella phân lập 35

Hình 3.3 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủngvi khuẩn Campylobacter phân lập 37

Hình 3.4 Tỷ lệ mẫn cảm với colistin của các chủng vi khuẩn phân lập 38

Hình 3.5 Tỷ lệ mẫn cảm với colistin của các chủng vi khuẩn phân lập 41

Hình 3.6 Kết quả điện di đồ sản phẩm PRC phát hiện gen mcr-1 42

Hình 3.7 So sánh trình tự của gen mcr-1 từ mẫu phân lập với trình tự GeneBank mã số KX013539.1 43

Hình 3.8 Mức độ tương đồng của trình tự gen mcr-1 từ mẫu phân lập với các trình tự GeneBank 47

MỞ ĐẦU

Kháng kháng sinh là một mối đe dọa nghiêm trọng, thách thức đối với điều trị trong tương lai Mỗi năm, thế giới có hàng trăm nghìn người chết do kháng thuốc và phải chi hàng trăm tỷ USD Vì thế Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xác định kháng kháng sinh là một mối đe dọa nghiêm trọng, thách thức đối với điều trị trong tương lai [14]

Cũng như các quốc gia đang phát triển, ở Việt Nam, kháng sinh được sử dụng không chỉ trong phạm vi bệnh viện mà còn được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng dân cư và trong chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản Trong chăn nuôi, kháng sinh được dùng cho mục đích điều trị, phòng bệnh và tăng trọng

đã tạo áp lực cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh trong cơ thể vật nuôi Sự gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh trong vật nuôilà nguồn lây lan sang con người thông qua thực phẩm, nước và môi trường ngoại cảnh

Hiện nay, thực trạng cũng như mối liên quan của vi khuẩn kháng kháng sinh nói chung và kháng colistin nói riêng trong trong môi trường, thực phẩm nước và động vật là các nguy cơ quan trọng lây lan sang người chưa được

hiểu một cách đầy đủ Nghiên cứu “Xác định vi khuẩn Gram âm mang gen

Mediate colistin resistant 1 (MCR-1) kháng colistin phân lập trong trong thực phẩm và môi trường chăn nuôi” là cơ sở giúp cho các nhà chuyên môn,

các nhà quản lý hoạch định chính sách sử dụng kháng sinh một cách hiệu quả

1 Mục tiêu nghiên cứu đề tài

Xác định được mức độ kháng kháng sinh sử dụng phổ biến, đặc biệt mức

độ kháng colistin của các chủng vi khuẩn thuộc các loài E.coli sp.,

Salmonella sp., Campylobacter sp phân lập được từ một số loại thực phẩm và môi trường chăn nuôi để làm cơ sở cho việc tuyên truyền, phổ biến tình trạng kháng thuốc kháng sinh cho cộng đồng, đồng thời làm cơ sở cho việc xây dựng kế hoạch hành động ngăn ngừa tình trạng kháng thuốc lan tràn và chiến lược sử dụng kháng sinh cho ngành y tế và thú y

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Việc xác định được gen kháng kháng sinh colistin là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về việc xác định kháng sinh và phác đồ điều trị phù hợp, hiệu quả

Ý nghĩa thực tiễn

Việc xác định được mức độ kháng kháng sinh nói chung và kháng colistin nói riêng của các chủng vi khuẩn gram âm phân lập được từ một số loại thực phẩm và môi trường chăn nuôi để làm cơ sở cho việc tuyên truyền, phổ biến tình trạng kháng thuốc kháng sinh cho cộng đồng, đồng thời làm cơ

sở cho việc xây dựng kế hoạch hành động ngăn ngừa tình trạng kháng thuốc lan tràn và chiến lược sử dụng kháng sinh cho ngành y tế và thú y

CHƯƠNG1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình kháng thuốc trên thế giới

Thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển với các bệnh truyền nhiễm còn chiếm tỷ lệ cao trong cơ cấu bệnh tật như: Nhiễm khuẩn đường tiêu hoá, đường hô hấp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện… đang là gánh nặng thực sự vì sự gia tăng chi phi do phải bắt buộc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới đắt tiền Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Xu hướng kháng lại các thuốc kháng sinh thường dùng làm cho thuốc đó không còn tác dụng trên lâm sàng, không còn tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Ngay cả khi kháng sinh được sử dụng với nồng

độ cao, thời gian kéo dài

Theo báo cáo của trung tâm phòng chống bệnh tật Châu Âu (ECDC), hằng năm ở Châu Âu có trên 25.000 bệnh nhân chết vì nhiễm phải vi khuẩn

đa kháng thuốc Các vi khuẩn kháng thuốc như MRSA, vi khuẩn tiết ESBL… tăng lên rõ rệt hằng năm Cũng theo ECDC, vi khuẩn tiết ESBL đã tăng 6 lần trong vòng 4 năm từ 2005 đến 2009

Trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển, vấn đề kháng thuốc đã trở nên báo động Gánh nặng về chi phí điều trị do các bệnh nhiễm khuẩn gây ra khá lớn do việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền Năm 2011, tình hình lao kháng thuốc đang xảy ra ở hầu hết các quốc gia Toàn cầu có khoảng 640.000 trường hợp lao đa kháng thuốc (MDR - TB), trong số đó khoảng 9% là siêu kháng thuốc (XDR - TB) [17]

Ký sinh trùng sốt rét Falciparum kháng với artemisinin đang nổi lên ở

Đông Nam Á Đề kháng với thuốc chống sốt rét thế hệ trước đó như

chloroquine và sulfadoxine-pyrimethamine là phổ biến ở hầu hết các nước lưu hành sốt rét [18]

Việc tiếp cận toàn cầu đối với các thuốc kháng vi rút để điều trị người bệnh HIV làm tăng nguy cơ kháng thuốc Sự kháng của vi rút đối với các thuốc này đang là mối đe dọa đối với loài người Khoảng 15% người bệnh được điều trị đã phải dùng đến các thuốc phác đồ bậc hai và bậc ba Chi phí các thuốc này gấp 100 lần so với các thuốc phác đồ bậc một Sự kháng thuốc của HIV tăng lên đặt ra một thách thức cần phải duy trì chương trình tiếp cận toàn cầu ở các nước có thu nhập thấp Các nước này cần phải tăng cường các dịch vụ y tế và cải tiến chất lượng chăm sóc người nhiễm HIV để giảm tối thiểu việc lan truyền vi rút kháng

Số liệu nghiên cứu giám sát ANSORP từ tháng 1/2000 đến tháng 6/2011 của 14 trung tâm từ 11 nước Đông Nam Á cho thấy tỷ lệ kháng cao của vi

khuẩn S pneumoniae Trong số 685 chủng vi khuẩn S pneumoniae phân lập

được từ người bệnh, có 483 (52,4%) chủng không còn nhạy cảm với penicillin, 23% ở mức trung gian và 29,4% đã kháng với penicillin (MIC ≥ 2mg/l) Kết quả phân lập vi khuẩn cho thấy tỷ lệ kháng penicillin ở Việt Nam cao nhất (71,4%) tiếp theo là Hàn Quốc (54,8%), Hồng Kông (43,2%) và Đài Loan (38,6%) Tỷ lệ kháng erythromycin cũng rất cao, ở Việt Nam là 92,1%, Đài Loan là 86%, Hàn Quốc là 80,6%, Hồng Kông là 76,8% và Trung Quốc

là 73,9% Số liệu từ nghiên cứu giám sát đa trung tâm đã chứng minh rõ ràng

về tốc độ và tỷ lệ kháng của S pneumoniae tại nhiều nước châu Á, những nơi

có tỷ lệ mắc bệnh nhiều nhất thế giới [19]

Theo số liệu nghiên cứu KONSAR từ 2005-2007 ở các bệnh viện Hàn

Quốc cho thấy S aureus kháng Methicillin (MRSA) 64%; K pneumoniae kháng cephalosporin thế hệ 3 là 29%; E coli kháng fluoroquinolone 27%, P aeruginosa kháng 33%, Acinetobacter spp kháng 48%; P aeruginosa kháng

amikacin 19%, Acinetobacter spp kháng 37% E faecium kháng vancomycin

và Acinetobacter spp kháng imipenem tăng lên dần Tỷ lệ kháng phát hiện tại các phòng xét nghiệm của E coli và K pneumoniae đối với cephalosporin thế

hệ 3 và P aeruginosa đối với imipenem cao hơn trong bệnh viện

Các thuốc kháng sinh điều trị hiệu quả bệnh lỵ do Shigella trước đây đã

bị kháng, vì vậy hiện nay WHO đang khuyến cáo dùng ciprofloxacin Tuy nhiên tỷ lệ kháng ciprofloxacin tăng lên nhanh chóng đã làm giảm cả độ an toàn và hiệu quả điều trị, đặc biệt là đối với trẻ em

AMR đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong điều trị bệnh lậu (gây

ra bởi N gonorrhoeae), thậm chí liên quan đến cả cephalosporin uống

(phương thuốc cuối trong điều trị) và ngày càng gia tăng trên toàn thế giới Nhiễm khuẩn do lậu cầu không thể điều trị được sẽ dẫn đến tăng tỷ lệ bệnh và

tử vong, do đó làm đảo ngược lại các thành tựu đã đạt được trong chương trình kiểm soát các bệnh lây truyền qua đường tình dục Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan rộng của tình trạng kháng thuốc

1.2 Tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam

1.2.1 Sử dụng kháng sinh trong cộng đồng

Theo kết quả khảo sát về việc bán thuốc kháng sinh ở các hiệu thuốc vùng nông thôn và thành thị các tỉnh phía Bắc cho thấy nhận thức về kháng sinh và kháng kháng sinh của người bán thuốc và người dân còn thấp đặc biệt ở vùng nông thôn Trong tổng số 2953 nhà thuốc được điều tra: có 499/2083 hiệu thuốc

ở thành thị (chiếm tỷ lệ 24%) và 257/870 hiệu thuốc ở nông thôn (chiếm tỷ lệ 29,5%) có bán đơn thuốc kê kháng sinh Kháng sinh đóng góp 13,4% (ở thành thị) và 18,7% (ở nông thôn) trong tổng doanh thu của hiệu thuốc Phần lớn kháng sinh được bán mà không có đơn 88% (thành thị) và 91% (nông thôn) Mua kháng sinh để điều trị ho 31,6% (thành thị) và sốt 21,7% (nông thôn) Ba

loại kháng sinh được bán nhiều nhất là ampicillin/amoxicillin (29.1%), cephalexin (12.2%) và azithromycin (7.3%) Người dân thường yêu cầu được bán kháng sinh mà không có đơn 49,7% (thành thị) và 28,2% (nông thôn) [1]

1.2.2 Sử dụng kháng sinh và tình hình kháng kháng sinh trong bệnh viện

Báo cáo tính nhạy cảm của các kháng sinh từ năm 2003-2006 của bộ Y tế

cho thấy tỉ lệ đề kháng của Klebsiella spp đối với các kháng sinh cephalosporins

thế hệ 3, thế hệ 4, fluoroquinolon và aminosid đã tăng nhanh từ >30% trong năm

2003 lên >40% trong năm 2006; đối với Pseudomonas spp từ >40% trong năm

2004 lên >50% trong năm 2006 và đối với Acinetobacter spp từ >50% trong

năm 2004 lên >60% trong năm 2006 Trong khi imipenem/cilastatin, carbapenem được đưa vào thị trường Việt Nam mới gần được 10 năm, cũng đã giảm nhạy cảm đối với các trực khuẩn gram âm không sinh men Tỷ lệ đề kháng

imipenem/cilastatin của Pseudomonas spp tăng dần qua các năm 12,5% (2003),

15,5% (2005) và 18,4% (2006) [1]

Theo số liệu báo cáo của 15 bệnh viện trực thuộc Bộ, bệnh viện đa khoa tỉnh ở Hà Nội, Hải Phòng, Huế, Đà Nẵng, Hồ Chí Minh,… về sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh giai đoạn 2008 - 2009 cho thấy: năm 2009, 30 - 70% vi khuẩn gram âm đã kháng với cephalosporin thế hệ 3 và thế hệ 4, gần 40-60% kháng với aminoglycosid và fluoroquinolon Gần 40% chủng vi

khuẩn Acinetobacter giảm nhạy cảm với imipenem

Sử dụng kháng sinh trung bình là 274,7 DDD/100 ngày-giường Tỷ lệ này cao hơn đáng kể so với báo cáo của Hà Lan cùng kỳ là 58,1 DDD/100 ngày-giường và báo cáo từ 139 bệnh viện của 30 nước châu Âu năm 2001 là 49,6 DDD/100 ngày-giường Sự tương quan giữa việc dùng kháng sinh và kháng kháng sinh thể hiện rõ khi tỷ lệ kháng của vi khuẩn gram âm đối với cephalosporin thế hệ 4 cao ở những nơi việc tiêu thụ kháng sinh lớn [1] Theo kết quả “Tìm hiểu thực trạng sử dụng kháng sinh trong nhiễm khuẩn bệnh viện tại các đơn vị điều trị tích cực ở một số cơ sở khám, chữa

bệnh” cho thấy 4 chủng vi khuẩn phân lập được nhiều nhất là Acinetobacter spp, Pseudomonas spp, E.coli , Klebsiella spp Tần xuất nhiễm Acinetobacter spp hay Pseudomonasspp chiếm tỷ lệ ưu thế (>50%) trong viêm phổi bệnh

viện (thở máy hay không thở máy) 4 chủng này đều là vi khuẩn đa kháng kháng sinh Sự kháng thuốc cao đặc biệt ở nhóm cephalosporin thế hệ 3, 4 (khoảng từ 66-83%) tiếp theo là nhóm aminosid và fluoroquinolon tỷ lệ kháng xấp xỉ trên 60% [Lý Ngọc Kính, Ngô Thị Bích Hà và cộng sự, “Tìm hiểu thực trạng sử dụng kháng sinh trong nhiễm khuẩn bệnh viện tại các đơn vị điều trị tích cực ở một số cơ sở khám, chữa bệnh” năm 2009-2010]

Tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ở mức độ cao Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ kháng penicillin cao nhất (71,4%) và kháng

erythromycin (92,1%) [9] 75% các chủng Pneumococci kháng với 3 loại

kháng sinh trở lên Tình trạng kháng phổ biến ở các vi khuẩn Gram-âm (enterobacteriaceae) Theo kết quả nghiên cứu công bố năm 2009 cho thấy

42% các chủng Enterobacteriaceae kháng với ceftazidime, 63% kháng với

gentamicin và 74% kháng với nalidixic acid Tỉ lệ kháng cao này được ghi nhận ở người khỏe mạnh trong cộng đồng Do tỉ lệ kháng cao, nhiều liệu pháp kháng sinh được khuyến cáo trong các tài liệu hướng dẫn điều trị đã không còn hiệu lực, đang và sẽ gây ra những tác động tiêu cực đối với ngành y tế và kinh tế Việt Nam

Nguyên nhân của tình trạng kháng kháng sinh là do sử dụng kháng sinh không hợp lý trên người và trong nông nghiệp Theo báo cáo của một nghiên cứu dựa trên cộng đồng tiến hành năm 1999, 78% kháng sinh được mua từ các nhà thuốc tư mà không có đơn 67% khách hàng tham khảo tư vấn của nhân viên bán thuốc trong khi 11% tự quyết định về việc sử dụng kháng sinh Chỉ có 27% số nhân viên bán thuốc có kiến thức về sử dụng kháng sinh và kháng

kháng sinh [10] Theo một nghiên cứu khác năm 2006 cho thấy tình trạng sử dụng kháng sinh không cần thiết trong điều trị nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp thể nhẹ ở trẻ dưới năm tuổi tại khu vực nông thôn Việt Nam, 63% trẻ nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp thể nhẹ đã được điều trị với kháng sinh [11]

Năm 2008-2009, Chương trình giám sát về sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh do Cục quản lý Khám chữa bệnh, Bộ Y tế phối hợp với Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Đại học Oxford trong khuôn khổ Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng kháng sinh GARP-Việt Nam được thực hiện trên 15 bệnh viện trên cả nước Đánh giá mức độ kháng kháng sinh được thực hiện trên 5 loài vi

khuẩn thường gặp bao gồm E coli, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, kết quả thể hiện trong hình dưới đây

Hình 1.1 Tỉ lệ kháng kháng sinh thường dùng của 4 loài vi khuẩn gram âm

(Nguồn: Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008-2009 của Bộ Y tế-Việt Nam phối hợp với Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng kháng sinh GARP Việt Nam và Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng ĐH Oxford)

Nhìn chung, khoảng 30-70% vi khuẩn Gram âm kháng các kháng sinh cephalosporin thệ hệ 3 và 4, xấp xỉ 40-60% kháng với các kháng sinh nhóm aminoglycosides và fluoroquinolones Có tới 40% các chủng Acinetobacter

giảm nhậy cảm với imipenem Tỉ lệ kháng cao nhất của các vi khuẩn Gram

âm với kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ 4 tại các bệnh viện khu vực phía Bắc nơi mà có mức độ sử dụng nhóm kháng sinh này cao hơn hai khu vực còn lại, điều này chứng tỏ có sự liên quan giữa mức độ sử dụng kháng sinh và tình trạng kháng kháng sinh

1.3 Sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh trong chăn nuôi

Trong chăn nuôi, để hạn chế rủi ro với các nguy cơ dịch bệnh, người chăn nuôi có thói quen dùng nhiều loại kháng sinh, thuốc kích thích bao gồm

cả các hoạt chất và thuốc thú y ngoài danh mục lưu hành được sử dụng nhằm kích thích tăng trưởng hoặc phòng và điều trị cho vật nuôi Nếu không được kiểm soát tốt, việc sử dụng các loại hoạt chất, thuốc thú y trong chăn nuôi sẽ gây ra một nguy cơ rủi ro lớn cho môi trường và sức khỏe con người như hiện tượng kháng thuốc, kháng kháng sinh ở người, do tồn dư kháng sinh từ phân, nước tiểu sang cây trồng và qua nguồn nước sang con người

Các loại kháng sinh hiện đang sử dụng cho thú ý bao gồm các nhóm: Lactam(Peniciline, Amoxycilline, Cloxaciline, Cephalosporins, ); Aminoglucosides (Apramycin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Spectinomycin, Streptomycin); Macrolides (Erythromycin, Josamycin, Spiramycin, Tylosin); Tetracyclin (Tetracyclin, Oxytetracyclin, Doxycyclin, Chlotetracyclin); (Fluoro)quinolones(Flumequine, Enrofloxacin, Norfloxacin, Oxolinic acid, Marbofloxacin, Danofloxacin, Difloxacin ); Phenicol (Florfenicol, Thiamphenicol); Polymyxins(Colistin); Pleuromutilins (Tiamulin); Lincosamides ( Lincomycin) ; Sulfamid(Sulfachlorpiridazine, Sulfadiazine, Sulfadimethoxine, ); Diaminopyrimidine( Trimethoprim) Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi lợn thịt, gà thịt ở một số trang trại chăn nuôi tập trung trên địa bàn tỉnh Hưng Yên, Hà Tây tại 30 trang trại chăn nuôi lợn thịt và 30 trang trại chăn nuôi gà thịt, kết quả cho thấy: 100% các trang trại chăn nuôi có sử dụng kháng sinh, 63,3% trang trại nuôi lợn thịt, 50% trang trại nuôi gà thịt sử dụng với mục đích trị bệnh; 13,3% trang trại nuôi lợn thịt, 46,7% trang trại nuôi gà thịt sử dụng với mục đích với mục đích

β-phòng bệnh 60,3% mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt, 70,3% mẫu thức ăn chăn nuôi gà thịt phát hiện ít nhất có một trong số các loại kháng sinh thuộc nhóm Tetracycline và Tylosin [12]

Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở 55 trại chăn nuôi lợn tại

2 tỉnh Đồng Nai và Bình Dương cho thấy: 13 loại kháng sinh được sử dụng nhiều nhất là Tylosin (16,39%), Amoxicillin (11,89%), Gentamycin (8,61%), Enrofloxacin (6,56%), Penicillin (6,15%), Lincomycin (5,74%), Tiamulin (5,74%), Colistin (5,33%), Streptomycin (4,51%), Norfloxacin (4,51%), Tetracyclin (4,1%), Ampicillin (4,1%) và Florphenicol (3,28%).44,05% trại chăn nuôi lựa chọn kháng sinh dựa vào triệu chứng bệnh của đàn lợn và kinh nghiệm của người nuôi, 33,33% trại sử dụng thuốc theo chỉ định của thú y viên, 16,67% sử dụng thuốc theo thông tin và khuyến cáo của nhà sản xuất và chỉ có 5,95% trại sử dụng thuốc theo kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ.Tỉ lệ mẫu thức ăn chăn nuôi có sử dụng kháng sinh lần lượt là: Tylosin 31/60 mẫu (51,67%), Tetracycline: 25/60 mẫu (41,16%), Oxytetracyclin: 4/60 mẫu (6,6%)

và Chlotetracycline: 15/60 mẫu (25%) - Số mẫu vượt quá qui định theo 10 TCN 861-2006: Tylosin: 1/60 (1,66%); Tetracycline: 2/60 mẫu (3,3%); Oxytetracyline 1/60 mẫu (1,66%); Chlotetracycline: 9/60 mẫu (15%) [12] Việc sử dụng kháng sinh ở các trang trại chăn nuôi ở các trang trại chưa hợp lý: lựa chọn loại kháng sinh, liều sử dụng, liều trình điều trị, chủ yếu dựa vào kinh nghiệm của người chăn nuôi; chưa chú ý thời gian ngừng sử dụng thuốc trước khi khai thác sản phẩm (thịt, trứng, sữa)

1.4 Nguyên nhân kháng thuốc

1.4.1 Sử dụng thuốc kháng khuẩn không thích hợp

Việc sử dụng quá liều, dưới liều hoặc lạm dụng thuốc kháng khuẩn đều gây ra tình trạng kháng thuốc, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật kháng thuốc xuất hiện, biến đổi và lây lan Thực tế nhiều người bệnh mua kháng sinh tự điều trị khi không có đơn của thầy thuốc, sử dụng kháng sinh để điều trị đối với trường hợp không do bệnh lý nhiễm khuẩn gây ra, sử dụng

kháng sinh, thuốc không phù hợp với loại, chủng vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng gây ra, sử dụng không đúng liều lượng, hàm lượng, thời gian sử dụng

1.4.2.Công tác kiểm nghiệm, kiểm tra chất lượng thuốc còn hạn chế

Hệ thống kiểm tra chất lượng chưa đáp ứng được nhu cầu thực tế do còn thiếu năng lực kiểm nghiệm với nhiều danh mục hoạt chất; chưa bảo đảm kiểm soát được chất lượng của tất cả các lô hàng sản xuất khác nhau của từng loại sản phẩm lưu hành trên thị trường

1.4.3.Phòng và kiểm soát các bệnh truyền nhiễm chưa hiệu quả

Việc phòng và kiểm soát các bệnh truyền nhiễm không hiệu quả làm tăng sự lan truyền của vi khuẩn kháng thuốc Người bệnh được điều trị trong bệnh viện là một nguồn lan truyền chính các vi sinh vật đề kháng từ người này tới những người khác

1.4.4.Hệ thống giám sát về kháng thuốc chưa được thiết lập

Hiện tại, Việt Nam chưa có mạng lưới giám sát quốc gia về kháng thuốc Việc giám sát về kháng thuốc chỉ được thiết lập và triển khai ở một số đơn vị, như bệnh viện Bệnh nhiệt đới trung ương, bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Nhi đồng 1 Tuy nhiên, những hoạt động giám sát chưa được thực hiện thường xuyên Việc thiếu các cơ sở xét nghiệm có thể xác định chính xác vi sinh vật

đề kháng dẫn đến khó khăn trong việc phát hiện các vi sinh vật đề kháng mới nổi, nên không thể có những hành động nhanh chóng để khống chế tình trạng kháng thuốc này

1.4.5.Sử dụng thuốc kháng khuẩn trong chăn nuôi chưa được kiểm soát hợp lý

Kháng sinh ngày càng được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để thúc đẩy tăng trưởng và phòng ngừa bệnh tật Điều này có thể dẫn đến các vi sinh vật đề kháng và gây ra kháng thuốc ở người

1.4.6.Các quy định chuyên môn về khám, chữa bệnh chưa được cập nhật thường xuyên, liên tục

Nhiều bệnh truyền nhiễm chưa có đủ các hướng dẫn chẩn đoán và điều trị hoặc hướng dẫn chưa được cập nhật Bên cạnh đó, việc quy định về sử

dụng kháng sinh, làm kháng sinh đồ, xét nghiệm vi sinh chưa hoàn thiện, đầy đủ; việc kiểm tra, giám sát trong quá trình thực hiện tại các địa phương chưa được thường xuyên

1.4.7.Nhận thức của cộng đồng, cán bộ y tế về kháng thuốc còn hạn chế

Thói quen tự chữa trị và “bắt chước” đơn thuốc của người dân dẫn đến tình trạng sử dụng kháng sinh tùy tiện, góp phần làm gia tăng sự kháng thuốc Bên cạnh đó, trình độ cán bộ y tế, trang thiết bị của một số cơ sở y tế, đặc biệt

ở các tuyến dưới, vùng sâu, vùng xa còn hạn chế, chưa có điều kiện, khả năng làm kháng sinh đồ nên người bệnh không được sử dụng kháng sinh hợp lý Kháng thuốc không phải là một hiện tượng mới, tuy nhiên mức độ ngày càng trầm trọng và tốc độ gia tăng của vấn đề này ảnh hưởng lớn đối với sức khỏe cộng đồng Kết quả là chỉ sau 70 năm kể từ khi giới thiệu thuốc kháng sinh, chúng ta đang phải đối mặt với khả năng của một tương lai không có thuốc kháng sinh điều trị hiệu quả đối với một số bệnh nhiễm khuẩn, nhất là đối với các phẫu thuật và phương pháp điều trị như hóa trị liệu ung thư và cấy ghép mô, bộ phận cơ thể người

Ngoài ra, kháng thuốc gây ra sự khan hiếm, thiếu hụt các thuốc kháng khuẩn mới, đặc biệt ở người bệnh bị nhiễm khuẩn do sinh vật đa kháng (MDR) Các chi phí xã hội và tài chính trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn kháng thuốc đặt gánh nặng đáng kể lên mỗi cá nhân, gia đình và xã hội: do thời gian điều trị kéo dài, tiên lượng xấu và lãng phí nhiều chi phí tiền thuốc

do sử dụng thuốc không phù hợp

1.5 Kháng sinh Colistin

Colistin là kháng sinh thuộc nhóm polymixin (polymyxin E), được phát hiện đầu tiên vào những năm 1940 nhưng mãi đến cuối những năm 1950 mới được đưa vào sử dụng chống lại nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn gram âm khó trị

1.5.1 Cơ chế tác dụng của colistin

Đích tác dụng của colistin là màng tế bào vi khuẩn Sự liên kết đầu tiên của Colistin với màng vi khuẩn xuất hiện thông qua sự tương tác tĩnh điện

giữa polypeptide tích điện dương và phân tử lipopolysaccharide (LPS) tích điện âm ở bên ngoài màng vi khuẩn Gram âm, dẫn đến sự xáo trộn màng tế bào Colistin thay thế Mg2+ và Ca2+ mà bình thường làm ổn định phân tử LPS, từ đó làm cho phân tử LPS chuyển sang tích điện dương dẫn đến sự rối loạn cục bộ của lớp màng bên ngoài Kết quả của tiến trình này gây ra sự gia tăng tính thấm màng tế bào, sự thoát ra của các thành phần tế bào vì vậy gây chết tế bào

Ngoài hoạt động kháng khuẩn trực tiếp, colistin còn có hoạt động kháng nội độc tố rất đáng kể Nội độc tố của vi khuẩn Gram âm là phần lipid A của phân tử LPS và colistin sẽ gắn và trung hòa LPS Ý nghĩa của cơ chế kháng khuẩn là sự ngăn chặn hiệu lực của nội độc tố thông qua sự tiết ra các cytokine, điều này là không rõ ràng, bởi vì nội độc tố trong huyết tương ngay lập tức được gắn bởi protein gắn LPS và phức hợp này nhanh chóng được gắn với CD14 trên bề mặt tế bào

1.5.2 Dạng sử dụng, thải trừ thuốc và phổ kháng khuẩn

Colistin được sử dụng theo hai dạng: colistin sulfate dùng tại chỗ và colistimethate natri dùng toàn thân Cả hai dạng đều có thể dùng đường hít nhưng hai dạng này không thể thay thế lẫn nhau Colistin sulfate tích điện dương và ổn định, trong khi colistimethate natri tích điện âm và không ổn định cả trong thực nghiệm lẫn trong cơ thể [6, 7] Colistimethate natri an toàn hơn, tần suất gây độc thấp hơn, được sử dụng cho đường tĩnh mạch [8] Colistimethate natrilà dạng tiền thuốc, dễ dàng bị thủy phân để tạo nên những dẫn xuất sulfomethylate không hoàn chỉnh như colistin sulfate một dạng hoạt động của thuốc, sự thủyphân colistimethate natri thành colistin này

là một bước quan trọng trong hoạt tính kháng khuẩn của thuốc Trước khi colistin được tạo thành, colistimethate natri có rất ít đến không có hoạt tính kháng khuẩn và được xem là dạng bất hoạt của colistin[8]

Colistimethate natri bị thải trừ chủ yếu tại thận, một phần thuốc sẽ được biến đổi để thành colistin có hoạt tính trong cơ thể [9, 10] Cơ chế diệt khuẩn của colistin tương tự polymyxin B, cụ thể: colistin mang nhiều điện tích dương, vừa ái nước vừa ái mỡ Những điện tích dương này tương tác theo cơ chế cân bằng điện tích với lớp màng ngoài của vi khuẩn gram âm và thế chỗ cho những ion mang hai điện tích dương của lớp màng lipid, đặc biệt là can xi

và magie phá vỡ lớp màng ngoài, thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn gây ly giải tế bào[2-4]

Colistin có phổ kháng khuẩn hẹp, hầu như chỉ nhạy với các vi khuẩn gram

âm thường gặp Đặc biệt nhất là colistin có thể chống lại những vi khuẩn gram

âm đa kháng như A baumannii, P.aeruginosa và K pneumoniae trong điều

kiện thực nghiệm Colistin cũng có hoạt tính chống lại những vi khuẩn khác

như Enterobacteriaceae, Stenotrophomonas maltophilia, Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella sp., Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, và

Legionella pneumophila[2]

Mặc dù colistin cho thấy hiệu quả trong điều trị nhiều loại nhiễm trùng khác nhau[3, 14] nhưng việc sử dụng colistin nhằm điều trị nhiễm trùng gây

ra do ba tác nhân trên bị cản trở bởi sự xuất hiện của tình trạng kháng thuốc

Sự gia tăng kháng thuốc này là một vấn đề rất đáng ngại Bởi vì colistin là lựa chọn điều trị cuối cùng đối với những tác nhân gây bệnh này, việc kháng thuốc có thể rất nguy hiểm nếu không còn lựa chọn điều trị nào khác

1.5.3.Tình hình kháng colistin

Trong một nghiên cứu với 265 chủng Acinetobacter được thu thập từ hai

bệnh viện tại Hàn Quốc[18] có 214 mẫu (81%) được xác định là

A.baumannii Bằng phương pháp pha loãng vi khuẩn trong nước luộc thịt, 27.9% mẫu phân lập được phát hiện kháng với colistin (nồng độ ức chế tối thiểu [MIC] > 16 mg/L) với nồng độ thuốc tối thiểu có thể ức chế được 90%

vi khuẩn (MIC90) là 32 mg/L Những chủng A baumannii này tiếp

tục được xếp vào ba nhóm nhỏ hơn, dựa trên phân nhóm phát sinh loài Ở phân nhóm II và III, hầu hết các mẫu đều kháng colistin (64.8% và 88.9% theo thứ tự) nhưng vẫn nhạy với những kháng sinh truyền thống khác

(như carbapenems, β-lactams, và ciprofloxacin) Trong khi đó, những mẫu A baumannii ở phân nhóm I có tỉ lệ kháng colistin thấp hơn (7%), nhưng lại tăng kháng với những kháng sinh này

Nghiên cứu thứ hai tiến hành so sánh 17 mẫu kháng colistin củaA baumannii phân lập được với 17 chủng nhạy thuốccũng cho những kết quả tương

tự [21] Giống như nghiên cứu trước, nghiên cứu này cũng sử dụng phương pháp pha loãng vi khuẩn trong nước luộc thịt để tìm MICs Nhìn chung, những chủng kháng colistin đã gia tăng độ nhạy với những kháng sinh truyền thống, biểu hiện bằng MICs đã giảm (thấp hơn 16 lần) Những chủng kháng colistin cũng được phát hiện giảm khả năng hình thành biofilm, điều này liên quan đến việc giảm

ngưỡng nhạy cảm với kháng sinh ở các A baumannii này

Nghiên cứu của Yan và cộng sự, 2009trên những chủng P aeruginosa phân

lập ở vùng Tây Thái Bình Dương đã cho thấy có 1/ 30 chủng kháng với colistin (3.3%) và 7 chủng dị kháng colistin (23%) [19] Mặc dù tỉ lệ kháng và dị kháng colistin thấp hơn so với những báo cáo trước đây, nhưng những kết quả này nhấn mạnh rằng không chỉ đòi hỏi sử dụng đủ liều mà còn chú ý đến việc phối hợp kháng sinh nhằm tiệt trừ những nhóm kháng thuốc này

Nghiên cứu của Li và cộng sự, 2001 trên 23 chủng phânlập từ những bệnh nhân mắc bệnh xơ nang cho thấy có 11 chủng kháng vớicolistin với MICs tăng đến 128 mg/L[24] Những trường hợp kháng colistin cũng đã được ghi nhận ở 6 bệnh nhi mắc bệnh xơ nang sau khi được điều trị bằng colistin dạng khí dung trong khoảng thời gian trung bình là 3.1 năm[26] Sự gia tăng tình trạng kháng

colistin của P aeruginosa đã bắt đầu nổi lên trong dân số bệnh nhân mắc xơ

nang, điều này có thể là hậu quả của việc sử dụng tràn lan colistin dạng hít ở những bệnh nhân này Tình trạng kháng thuốc nếu tiếp tục gia tăng sẽ rất nguy

hại bởi P aeruginosa đóng vai trò rất lớn trong sự hủy hoại phổi và tình

trạng suy hô hấp ở những bệnh nhân xơ nang

Nghiên cứu của Antoniadou và cộng sự 2007đã phát hiện 18 chủng K pneumoniaekháng colistin (MIC > 8 mg/L) từ 13 bệnh nhân trong hơn 16 tháng tại một trung tâm chăm sóc đặc biệt ở Hy Lạp [27] Tất cả những bệnh nhân này đều có thời gian sử dụng colistin (trung bình 27 ngày) và nhập viện điều trị (69 ngày) kéo dài, điều này có thể đóng góp vào việc gia tăng kháng thuốc Nghiên cứu của Suh và cộng sự, 2010; Poudyal và cộng sự, 2008 xác định được 6.8% (15 trong số 221 chủng K pneumoniae phân lập và 27.3% (6

trong số 22K pneumoniaechủng phân lập)kháng colistin ởmiền nam Hàn

Quốc và Australia

1.5.4.Cơ chế gây kháng colistin

Vi khuẩn Gram âm có thể hình thành sự đề kháng với colistin thông qua

cơ chế đột biến hoặc thích nghi Sự đột biến là di truyền, ở mức độ thấp và không phụ thuộc vào sự có mặt liên tục của kháng sinh trong khi đó sự thích nghi thì ngược lại Hầu hết có sự đề kháng chéo hoàn toàn giữa colistin và polymycin B Những nghiên cứu sự đề kháng polymycin của chủng

Pseudomonas aeruginosa đã đặt ra giả thuyết rằng sự thay đổi của màng ngoài tế bào vi khuẩn (sự thay đổi trong LPS, thay đổi nồng độ protein đặc hiệu màng ngoài, sự thay đổi thành phần Mg2+ và Ca2+ vỏ tế bào và sự thay đổi lipid) có liên quan đến sự hình thành đề kháng Ngoài ra, một nghiên cứu

gần đây trên loài Yesinia đã chỉ ra rằng một hệ thống bơm Kali ra ngoại bào

có thể có liên quan đến sự đề kháng đối với polymycin B

Sự đa dạng trong biến đổi gen nhằm thay đổi lớp màng ngoài của vi khuẩn gram âm, vốn là vị trí hoạt động của colistin đã dẫn đến sự kháng thuốc

Mặc dù dữ liệu về cơ chế gây kháng thuốc này còn rất ít và dường như còn tùy thuộc từng vi khuẩn nhưng hệ thống điều hòa gen PmrA-PmrB và PhoP-PhoQ đóng vai trò quan trọng trong sự gia tăng kháng colistin [33-49] Những hệ thống điều hòa gồm hai thành phần như PmrA-PmrB và PhoP-PhoQ, cho phép

vi khuẩn đáp ứng với những thay đổi của môi trường bằng cách biến đổi một số gen biểu hiện Khi những hệ thống điều hòa này tương tác lẫn nhau, chúng được cho là gây ra những thay đổi đa dạng hơn [33]

Một cơ chế kháng thuốc khác được cho thấy là liên quan với thay đổi cấu trúc của lớp lipid A và lipopolysaccharides tích điện âm trên bề mặt của

vi khuẩn Sự thay đổi này là kết quả của sự hoạt hóa hệ thống PmrB Hệ thống này được điều hòa bởi hệ thống PhoP-PhoQ, nhưng cũng có thể hoạt động độc lập trong môi trường axit nhẹ hoặc nồng độ sắt cao[34, 35] Hệ thống PmrA-PmrB điều hòa hai điểm PmrE and PmrHFIJKLM, chịu trách nhiệm trong việc thay đổi lipid A và đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng polymyxin[34, 36-40] Khi được hoạt hóa, hệ thống PmrA-PmrB

PmrA-sẽ gắn thêm ethanolamine vào nhóm phosphate của lipopolysaccharides và lipid A, đồng thời cũng chèn thêm aminoarabinose tại vị trí 4' phosphate của lipid A[34, 35, 41, 42] Sự thay đổi này sẽ làm giảm tổng điện tích của lipopolysaccharide và vì vậy sẽ làm giảm ái lực gắn kết với những polymyxin mang điện tích dương[43]

Nồng độ magie và pH của môi trường là hai nhân tố chính cho thấy tác động lên sự biểu hiện gen và sự xuất hiện kháng thuốc của vi khuẩn Nghiên

cứu của Perez và cộng sự, 2007 trênSalmonella enterica trong môi trường bổ

sung 10 mM MgCl2 ở pH 5.8 đã cho thấy kháng polymyxin B tăng lên xấp xỉ 100,000 lần so với tăng sinh ở pH 7.7.[41] Sựgia tăng này được cho là do sự tăng hoạt động của hệ thống PmrA-PmrB ở môi trường pH acid nhẹ và ion

Mg2+ Kết quả này có thể cho phép sử dụng giải pháp điều chỉnh pH và nồng độion Mg2+ đề ngăn chặn sự kháng thuốc

Nồng độ Mg2+ thấp cũng gây gia tăng tình trạng kháng thuốc do sự hoạt hóa PhoP và PmrA Sự hoạt hóa này không chỉ làm thay đổi lipopolysaccharides của vi khuẩn mà còn làm gia tăng biểu hiện của gen OprH, đóng vai trò là yếu

tố chính trong việc phát triển tình trạng kháng thuốc [33, 35, 37, 44] Gen OprH, PhoP và PhoQ tạo thành một “operon” kiểm soát cả PhoP và nồng độ

Mg2+ cũng như góp phần vào sự đề kháng polymyxin[35, 45] Gen OprH nằm ngay dưới hệ thống điều hòa PhoP-PhoQ, mã hóa cho một protein màng ngoài được gọi là OprH, đây là protein gia tăng biểu hiện trong điều kiện nồng độ

Mg2+ thấp[36] Những protein này chiếm giữ những vị trí Mg2+ trên màng tế bào và làm giảm những vị trí gắn kết của colistin gây nên tình trạng kháng thuốc [35, 45-47]

Hình thái học và cấu trúc tế bào của những vi khuẩn kháng colistin được phát hiện là rất khác so với hình thái học và cấu trúc của những tế bào nhạy cảm colistin [49] Quan sát bằng kính hiển vi điện tử đã phát hiện thấy, tế bào

vi khuẩn kháng colistin có hình cầu trong khi tế bào nhạy thuốc có hình que, với sự hiện diện của tiêm mao ở tất cả các giai đoạn tăng sinh Số lượng và độ dài của tiêm mao ở những tế bào vi khuẩn kháng colistin giảm nhiều và đây

có thể là nguyên nhân dẫn tới các tế bào này kháng colistin không có khả năng tạo được biofilm

1.5.5.Gen kháng kháng sinh colistin

Tháng 11 năm 2015, Liu và cộng sự đã phát hiện một plasmid mang gen

kháng colistin (Mediated Colistin Resistance gene, mcr-1) ở vi khuẩn E.coli

Kết quả này đã thách thức quan niệm rằng các vi khuẩn gram âm chỉ hình thành tính trạng kháng colistin qua cơ chế đột biến nhiễm sắc thể hoặc các cơ chế thích ứng như sự thay đổi của tế bào màng ngoài của vi khuẩn hoặc sự

hiện diện của một bơm ngoài ngoài Phát hiện mới về tính kháng colistin là có khả năng truyền ngang các yếu tố di truyền di động [4] Sáu tháng sau đó, gen

mcr-1 được phát hiện thấy trên nhiều đối tượng ở trên khắp thế giới bao gồm: động vật, thực phẩm, môi trường Tháng 5/2016, gen mcr-1 lần đầu tiên được

báo cáo thấy ở vi khuẩn E.coli phân lập từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân tại Mỹ

đã mở rộng phân bố địa lý của gen này lên 27 quốc gia trên thế giới Ở châu

Âu, gen mcr-1 được phát hiện trong mẫu bệnh phẩm của con người từ năm

2011 ở Đan Mạch, Đức, Ý, Hà Lan, Tây Ban Nha, Thụy Điển và Anh; phát hiện thấy trong động vật nuôi từ năm 2005 ở Bỉ, Pháp, Đức, Ý, Hà Lan, Anh; phát hiện thấy trong thức ăn từ năm 2009 ở Bỉ, Đan Mạch, Pháp, Bồ Đào

Nha, Hà Lan, Anh (Skov, 2016) Ở châu Á, ngoài Trung Quốc, gen mcr-1 đã

được phát hiện ở các nước: Thái Lan [7], Lào[7], Nhật Bản [8], Việt Nam [9], Campuchia[10] và Malaysia [6]

Hình 1.2 Các nước trên thế giới phát hiện gen mcr-1 trong cơ thể động vật

Hình 1.3 Các nước trên thế giới phát hiện gen mcr-1

trong thực phẩm và môi trường

Hình 1.4 Các nước trên thế giới phát hiện gen mcr-1 ở người

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn thuộc 03 loài vi khuẩn gram âm:E,coli, Salmonella, Campylobacter phân lập từ mẫu thịt lợn ở lò mổ, thịt gà bán tại chợ, mẫu tăm bông manh tràng gà, mẫu tăm bông trực tràng lợn, mẫu chất thải chuồng nuôi

gà, mẫu chất thải chuồng nuôi lợn

2.2.Nội dung nghiên cứu

- Mức độ nhiễm E.coli, Salmonella, Campylobacterở một số loại mẫu

thực phẩm, động vật nuôi và môi trường chăn nuôi

- Mức độ kháng các loại kháng sinh phổ biến của các chủng vi khuẩn phân lập

- Mức độ kháng kháng sinh colistin của các chủng vi khuẩn phân lập

2.3 Thiết bị, dụng cụ, môi trường hóa chất

- Máy điện di gel

- Máy soi gel

2.3.2 Dụng cụ

- Các dụng cụ thủy tinh: bình tam giác, ống nghiệm, đĩa hộp lồng, đèn cồn, phiến kính, lá kính,…

- Các dụng cụ nhựa: ống falcon, tube PCR, eppendorf, …

- Các dụng cụ khác: micropippet, que cấy, đèn cồn, chai lấy mẫu,…

- Nước gan yếm khí

- Oxford Agar, PALCAM agar

- PEMBA Agar

- Kamali Broth, Kamali Agar

- Các hóa chất làm phản ứng sinh hóa khác

2.4.Phương pháp nghiên cứu

2.4.1.Phương pháp lấy mẫu thịt gà, lợn (Theo QCVN01-04: 2009/BNNPTNT)

- Lấy mẫu thịt lợn bán tại chợ: lấy từ 10g - 20g thịt vào túi đựng mẫu

vô trùng

- Lấy mẫu gia cầm: chọn ngẫu nhiên tối thiểu 15 thân thịt cho một lần lấy mẫu, mỗi thân thịt lấy 10g (không cắt chỗ da nơi cắt tiết) cho vào túi đựng mẫu vô trùng

Các mẫu thịt được bảo quản trong thùng lạnh 2-40C và vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập vi khuẩn Chú ý tránh để các mẫu đông lạnh hoặc tiếp xúc trực tiếp với các khối đá đông lạnh Mẫu được bảo quản ở 20C ±

20C tối đa 24h

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu tăm bông trực tràng gà, lợn

Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng lợn mắc tiêu chảy chưa dùng thuốc kháng sinh điều trị Tăm bông thấm ướt phân gà, lợn được bảo quản trong typ vô trùng, vặn chặt nắp, giữ ở 2-40C và vận chuyển về

phòng thí nghiệm để phân lập vi khuẩn E.coli, Salmonella, Campylobacter.Chú ý tránh để các mẫu đông lạnh hoặc tiếp xúc trực tiếp với các khối đá đông lạnh Mẫu được bảo quản ở 20C ± 20C tối đa 24h

2.4.3.Phương pháp lấy mẫu chất thải trong môi trường chăn nuôi

Dùng túi đựng mẫu vô trùng, lấy chất độn chuồng nuôi gà hoặc ống falcon 50 ml vô trùng lấy mẫu nước thải nuôi lợn trong các hồ chứa của trang trại Giữ mẫu ở 2-40C và vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập vi

khuẩn E.coli, Salmonella, Campylobacter Chú ý tránh để các mẫu đông lạnh

hoặc tiếp xúc trực tiếp với các khối đá đông lạnh Mẫu được bảo quản ở 20C ±

20C tối đa 24h

2.4.4 Phương pháp xử lý mẫu

- Đối với mẫu thịt: Bổ sung nước sinh lý vô trùng vào túi đựng mẫu theo

tỷ lệ 1/10, dập mẫu bằng máy đồng nhất mẫu Để lắng huyễn dịch, thu nước

nổi để phân lập các vi khuẩn E.coli, Salmonella, Campylobacter

- Đối với mẫu chất độn chuồng gà, nước thải, tăm bông: Bổ sung nước sinh lý vô trùng vào túi đựng mẫu theo tỷ lệ 1/10, lắc đều mẫu Để lắng huyễn

dịch, thu nước nổi để phân lập các vi khuẩn E.coli, Salmonella, Campylobacter

2.4.5.Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli

Mẫu thu thập được xử lý rồi cấy trải trên thạch MacKonkey Nuôi đĩa cấy trong tủ ấm 370C trong 24 giờ

Quan sát các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch Các khuẩn lạc nghi ngờ

thuộc loài E.coli có màu hồng cánh sen

Thực hiện các phản ứng sinh hóa trên môi trường Kligler iron agar, vi

khuẩn E.coli tạo màu vàng đồng nhất trong ống thạch do lên men đường

glucose, lên men đường lactose, sinh hơi, không sinh H2S

2.4.6.Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella

Mẫu thu thập được cấy ria cấy trên môi trường XLT4 (Xylose Lysine Tetrathionate 4) hoặc môi trường XLD (Xylose Lysine Deroxycholate), nuôi cấy ở 37oC/18-24h Khuẩn lạc Salmonella có màu đen, tròn, bóng, lồi trên

mặt thạch

Từ môi trường XLD (XLT4), chọn ra khuẩn lạc điển hình kiểm tra đặc tính sinh hoá trên môi trường Kligler bằng đường chích sâu, để tủ ấm

37oC/18-24h, sau đó đọc kết quả:

+ Nếu phần thạch nghiêng có màu hồng: Lactose âm tính

+ Nếu phần thách đứng có màu vàng: Glucosa dương tính

+ Nếu có bọt khí: Sinh hơi dương tính

+ Nếu dọc đường cấy trích sâu có màu đen: H2S dương tính

2.4.7.Phương pháp phân lập vi khuẩn Campylobacter

Mẫu thu thập sau xử lý được bổ sung vào môi trường tăng sinh Preston theo tỷ lệ 1/10 Vặn chặt nút của bình tăng sinh, đặt ở 42±10C trong 48 giờ với điều kiện có không khí

Lấy đầy một vòng que cấy (10µl) canh thang đã được tăng sinh cấy vào đĩa thạch phân lập Campylobacter Đặt các đĩa này vào bình yếm khí, sau đó cắt các túi khí điều chỉnh môi trường để ở 42±10C trong 48 giờ Nhỏ 1 giọt glycerol vào giấy lọc, đặt tấm giấy này ở đáy bình yếm khí nhằm hấp thụ bớt

độ ẩm và hạn chế sự phát triển tràn lan của vi khuẩn

- Tất cả những khuẩn lạc ướt, phẳng, xám trắng được giả định là

Campylobacterjejuni Một vài loài Campylobacter có khuẩn lạc màu hơi

xanh, mặt hơi khô, có hoặc không có ánh kim