Nghiên cứu, tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể ức chế vi khuẩn gây bệnh listeria monocytogenes trong sữa

Nguyên nhân là do con người sử dụng các loại thực phẩm đã bị nhiễm các loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố của chúng.. - Phân lập, tuyển chọn, và đánh giá được hiệu quả ức chế của các dòng

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-oOo -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỰC KHUẨN THỂ ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : ThS Nguyễn Hồng Hải SINH VIÊN THỰC HIỆN : Lê Thị Trang

LỚP : 1302

HÀ NỘI – 2017

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-oOo -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes trong sữa

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : ThS Nguyễn Hồng Hải

SINH VIÊN THỰC HIỆN : Lê Thị Trang

LỚP : 1302

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, làm việc tại Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội và Phòng Vi Sinh – Viện Di truyền Nông Nghiệp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình từ các Thầy Cô, anh chị và các bạn bè đồng nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới Ths Nguyễn Hồng Hải – Viện Di truyền Nông Nghiệp, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn cô chú, anh chị cán bộ phòng Công nghệ vi sinh – viện Di truyền nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã trang bị cho tôi những kiến thức trong suốt quá trình học tập và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường Cuối cùng tôi xin bày tỏ tình cảm chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và những người thân thiết đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập

Bước đầu đi vào thực tế, tìm hiểu và lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến thức của tôi còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn để kiến thức của tôi trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Trang

Mục Lục

LỜI CẢM ƠN 1

DANH MỤC BẢNG 5

DANH MỤC HÌNH 6

MỞ ĐẦU 7

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 7

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 8

3 NỘI DUNG NGHÊN CỨU 8

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Listeria monocytogenes 9

trên thế giới và Việt Nam 9

1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Listeria monocytogenes trên thế giới 9

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Listeria monocytogenes ở Việt Nam 13

1.2 Vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes 15

1.2.1 Cấu trúc 15

1.2.2 Phân loại 18

1.2.3 Đặc tính sinh hóa 19

1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố 20

1.2.5 Khả năng lây bệnh 20

1.2.6 Cơ chế gây bệnh 21

1.2.7 Miễn dịch 25

1.3 Tổng quan về thực khuẩn thể (Biobacteria Phage) 25

1.3.1 Sơ lược về thực khuẩn thể 25

1.3.2 Phương pháp khảo sát thực khuẩn thể 27

1.4 Ứng dụng của thực khuẩn thể 28

1.4.1 Ứng dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử 28

1.4.2 Ứng dụng trong chuẩn đoán và dịch tễ học 29

1.4.3 Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm 29

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu 30

2.1.1 Chủng nghiên cứu 30

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 30

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 30

2.1.4 Các môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn L monocytogenes (Theo TCVN 6401 : 1998) 33

2.2.2 Phân lập thực khuẩn thể 34

2.2.3 Đánh giá khả năng kí sinh của các dòng thực khuẩn thể trên các chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau 34

2.2.4 Đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes của các dòng thực khuẩn thể 35

2.2.5 Nhận dạng thực khuẩn thể bằng giải trình tự gen Lys 35

2.2.6 Đánh giá hoạt tính kháng của thực khuẩn thể với vi khuẩn gây bệnh 36

Listeria monocytogenes có trong sữa 36

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Phân lập vi khuẩn Listeria monocytogenes 37

3.2 Phân lập các dòng thực khuẩn thể có khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes 40

3.2.1 Phân lập thực khuẩn thể 40

3.2.2 Khả năng ký sinh của các dòng TKT và các chủng L.monocytogenes phân lập được 42

3.2.3 Đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes của các dòng thực khuẩn thể 42

3.3 Đánh giá khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh các dòng thực khuẩn thể 43

3.4 Phân loại dòng thực khuẩn thể triển vọng LM1 44

3.5 Đánh giá hoạt tính kháng của thực khuẩn thể với vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có trong sữa 46

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Tiếng Việt 50

Tiếng Anh 51

Tài liệu Internet 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Cấu trúc kháng nguyên 20

Bảng 2: Nguồn gốc của các chủng phát triển được trên môi trường chuyên biệt 37

Bảng 3: Kết quả thử nghiệm sinh lý, sinh hóa của các chủng phát triển 37

Bảng 4: Nguồn gốc của các dòng thực khuẩn thể phân lập được 40

Bảng 5: Khả năng ký sinh (tạo vết tan) của các dòng thực khuẩn thể 42

Bảng 6: Đường kính vòng phân giải vi khuẩn L monocytogenes của các 42

Bảng 7: Hoạt tính phân giải của dòng TKT NA6 trên vi các vi khuẩn gây bệnh 44

Bảng 8: Độ tương đồng các đoạn gen của dòng TKT LM1 46

Bảng 9: Mật độ của dòng TKT LM1 sau 24, 48 giờ nuôi cấy 46

Bảng 10: Mật độ vi khuẩn L monocytogenes sau 24, 48 giờ nuôi cấy 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes 15

Hình 2: Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes 16

Hình 3: Lông roi của vi khuẩn Listeria monocytogenes 18

Hình 4: Vi khuẩn Listeria monocytogenes 18

Hình 5: Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Listeria monocytogenes 23

Hình 6: Sự di chuyển của vi khuẩn Listeria monocytogenes 24

Hình 7: Ảnh hiển vi điện tử các phage bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn (trái); Hình mặt cắt (giữa) và hình dạng ngoài phage T2 26

Hình 8: Đốm tan -“plaque”của phage λ đối với vi khuẩn E coli 28

Hình 9: Hình dạng và thử nghiệm làm tan máu của chủng Listeria monocytogenes 40

Hình 10: Dòng TKT NA6 lập trên được phân môi trường LEB và vi khuẩn 41 Hình 11: Dòng thực khuẩn thể LM1 được tách dòng trên môi trường TSB 43

Hình 12: Đánh giá khả năng phát triển và hoạt tính của dòng TKT NA6 47

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Ngộ độc thực phẩm hiện nay đã và đang là mối lo ngại nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng trên thế giới Nguyên nhân là do con người sử dụng các loại thực phẩm đã bị nhiễm các loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố của chúng Mặc dù đã có công nghệ hiện đại, các phương pháp thực hành sản xuất và kiểm soát chất lượng, vệ sinh tốt nhưng số lượng các trường hợp bị ngộ độc

và bị bệnh do thực phẩm vẫn tăng lên trong suốt thập kỷ qua Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, chỉ trong 4 tháng đầu năm 2016, cả nước đã xảy ra gần 30 vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, làm trên 1.386 người bị ngộ độc, trong đó có 2 trường hợp tử vong Hầu hết các bệnh nhân bị ngộ độc do ăn

phải thức ăn bị nhiễm vi sinh vật như E.coli, Listeria, Staphylococcus aureus,

tác nhân gây bệnh listeriosis và là vi khuẩn gây bệnh đứng thứ 3 thuộc nhóm

B sau Streptococus và Ecoli Đồng thời là nguồn chính gây nhiễm bệnh cho

người trong các sản phẩm bảo quản lạnh, vi sinh vật này có khả năng tồn tại tăng trưởng trong sản phẩm suốt quá trình bảo quản lạnh Đối với vi sinh vật ngộ độc thực phẩm khác, chúng sẽ phát bệnh khi con người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh các triệu chứng lâm sàn biểu hiện Trong

đó Listeria monocytogenes hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, khi vào cơ thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội Mặc dù bệnh

do Listeria monocytogenes gây ra là ở tần số thấp, 2-5 trường hợp trên một

triệu người một năm, nhưng tỉ lệ chết do vi khuẩn này là rất cao, 25 – 30 % trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh

Tình hình nhiễm bệnh là như vậy nhưng việc sử dụng các chất hóa học

để bảo quản thực phẩm ít được chấp nhận vì nhiều chất bảo quản hóa học đã làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng Trong số các chất bảo quản sinh học hiện nay, thực khuẩn thể cũng được xem như một tác nhân phòng trừ

sinh học quan trọng và đã được thương mại mại hóa để phòng trừ vi khuẩn

(Micreos) cũng được FDA cấp phép cho lưu hành sử dụng năm 2006 như một

chất phụ gia bảo quản thực phẩm dùng để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria

Đây là chế phẩm có nguồn gốc từ thực khuẩn thể được sử dụng rộng rãi ở Mỹ và các nước trên thế giới mà không gây ảnh hưởng đến chất lượng của thực phẩm

Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu ghi nhận về sử dụng thực khuẩn thể trong

phòng trừ vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có trong thực phẩm, đặc biệt là có trong sữa Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm “phân lập, tuyển chọn và đánh giá hiệu quả ức chế vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes của các

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Phân lập được vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes trong sữa

- Phân lập, tuyển chọn, và đánh giá được hiệu quả ức chế của các dòng

thực khuẩn thể tới vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes trong sữa

3 NỘI DUNG NGHÊN CỨU

- Phân lập, tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể có khả năng ức chế vi

khuẩn Listeria monocytogenes trong sữa

- Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes

của các dòng thực khuẩn Phân lập vi khuẩn Listeria monocytogenes

- Nghiên cứu các đặc điểm sinh lí, hóa sinh của dòng thực khuẩn thể tuyển chọn

- Phân loại dòng thực khuẩn thể tuyển chọn

- Đánh giá hoạt tính kháng của thực khuẩn thể với vi khuẩn gây bệnh

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Listeria monocytogenes trên thế giới

và Việt Nam

1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Listeria monocytogenes trên thế giới.

Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản xuất và phân phối một các sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm Đồng thời, trong quá trình công nghiệp hóa, thực phẩm được sản xuất hàng loạt đã làm khả năng nhiều người tiêu dung mắc bệnh tăng cao Số ca mắc các bệnh do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây

Mặc dù y học hiện nay đã phát triển, song các tác nhân gây bệnh tiếp từ thực phẩm vẫn nhập viện và 1,8/5 nghìn ca tử vong do nhiễm trùng đọc thực phẩm là chuẩn đoán được chính xác nguyên nhân Trong số các nguyên nhân

đã được xác định, có một số mầm bệnh có khả năng gây nhiễm trùng độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao như:

Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio

cholera, Salmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica.v.v Listeria

khuẩn này có thể gây viêm màng não, nhiễm khuẩn đường tiết niệu và tử vong, đặc biệt nguy hiểm với những người suy giảm miễn dịch có khả năng

lây nhiễm cao như: ung thư, AIDS, nghiện rượu, đái tháo đường

Trong vấn đề ngộ độc thực phẩm, bệnh Listériosis do vi khuẩn L

bệnh Listériosis đã được nói đến cách nay 70 năm, nhưng phải đợi đến những năm 1980 vi khuẩn L monocytogenes mới được chính thức xác nhận là tác

nhân gây ra bệnh ngộ độc từ thực phẩm

Listeria monocytogenes là tác nhân gây bệnh listeriosis Vi khuẩn này

được xếp là tác nhân gây bệnh đứng thứ ba thuộc nhóm B sau Streptococus và

Ecoli Đồng thời là nguồn chính gây nhiễm bệnh cho người trong các sản phẩm bảo quản lạnh, vi sinh vật này có khả năng tồn tại tăng trưởng trong sản phẩm suốt quá trình bảo quản lạnh Đối với vi sinh vật ngộ độc thực phẩm khác, chúng sẽ phát bệnh khi con người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ

bệnh các triệu chứng lâm sàn biểu hiện Trong đó Listeria monocytogenes

hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, khi vào cơ thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội Mặc dù bệnh do Listeria monocytogenes gây

ra là ở tầng số thấp, 2-5 trường hợp trên một triệu người một năm, nhưng tỉ lệ chết do vi khuẩn này là rất cao, 25 – 30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh

Đối tượng bị nhiễm bệnh do Listeria monocytogenes gây ra thường gặp

ở trẻ em, trẻ sơ sinh, người già, thai phụ và người có hệ miễn dịch kém

hoặc sốt, viêm dạ dày ruột, đồng thời cũng là nguyên nhân gây ra trẻ chết sau khi sinh, đẻ non và sẩy thai ở phụ nữ

Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn hoặc độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc hại đối với người ăn Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều người tại cùng một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng một loại thức ăn Ngộ độc thực phẩm có những triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu chảy v.v hoặc kèm theo các triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ độc Thực phẩm ô nhiễm các vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở cả các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu kém phát triển Hiện nay, loài người đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200 bệnh truyền nhiễm thông qua thực phẩm Các triệu chứng lâm sàng khá đa dạng, từ mức viêm dạ dày, ruột nhẹ cho tới nhiễm trùng, nhiễm độc nặng với nguy cơ tử vong cao, hoặc dẫn tới các biến chứng phức tạp, ảnh hưởng tới đời sống của bệnh nhân Hậu quả và thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua

thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày càng tăng Ví dụ, mỗi năm ở Hoa Kỳ

có khoảng 76 triệu ca mắc bệnh các loại do thực phẩm ô nhiễm, 325 nghìn ca nhập viện và 5 nghìn ca tử vong Các chi phí điều trị cho các bệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại do nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm Các loại mầm bệnh gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm: Người tiêu dùng có thể mắc bệnh khi sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm các mầm bệnh vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật hoặc một số kim loại độc Trong số hơn 200 bệnh có nguồn gốc

từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật đã được xác định vai trò gây bệnh Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus, trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% số ca bệnh tử vong ở người

- Năm 1929, Nyfeldt phân lập được Listeria monocytogenes từ máu của

một bệnh nhân bị sốt kèm theo viêm hạch và ông tin rằng đó là tác nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng Tất nhiên, nhiều tác giả khác đã không đồng ý với lập luận của Nifeldt Nhiều năm sau đó, những công bố kinh điển về bệnh nhiễm Listeria (Listeriosis) trên người, kể cả ở trẻ sơ sinh và người lớn, cho thấy những bằng chứng giống như trong y văn nhưng có nhũng tranh luận rằng, khả năng truyền bệnh từ động vật sang người là cực kỳ hiếm

- Đến những năm 1980, thực phẩm được coi là tác nhân chính gây truyền

nhiễm Listeriosis

- Vào những năm 1981, tại Canada, một trận đại dịch từ thực phẩm đã làm ảnh hưởng đến 41 bệnh nhân là do ăn phải cải bắp lây nhiễm từ các phân

tử cừu bị nhiễm bệnh

- Vào năm 1983, ở Boston có 49 người bị nhiễm bệnh Listeriosis do tiêu

thụ phải sữa không được tuyệt trùng kỹ lưỡng

- Năm 1985, các trận dịch bệnh lớn xãy ra ở Bắc Mỹ tại California bắt nguồn từ phomat mềm có 142 người bị nhiễm, những phomat khác gây ra 122

trường hợp bị nhiễm Listeriosis ở Switzerland Trong khi ở Anh, có 300 trường hợp bị nhiễm trùng Listeriosis

- Những năm 1990, ở Pháp dịch bện xãy ra do ăn phải lưỡi lợn, thịt lợn, phomat mềm bị nhiễm khuẩn

- Vào ngày 19/3/2007, cơ quan quản lý thực phẩm Anh quốc có lệnh thu hồi các loại bánh mì kẹp thịt, do công ty thực phẩm Anchor cung cấp cho hệ thống bệnh viện và trường học tại Luân Đôn, do sản phẩm này bị nhiễm vi

khuẩn Listeria monocytogenes

- Đây không phải là lần đầu, mà từ nhiều năm qua vi khuẩn này đã gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm lớn tại một số quốc gia trên thế giới (Mỹ, Úc, Canada, Pháp, Bỉ…) Chúng ta có thể điểm qua vài vụ ngộ độc điển hình như sau:

- Vào tháng 12 năm 1999, tại Pháp có vụ ngộ độc do ăn phải hamburger

có nhiễm vi khuẩn Listeria gây cho 27 người mắc bệnh Trong đó, có 7 người chết Theo thống kê của Mỹ, hàng năm số bệnh lây nhiễm Listeria khoảng

2500 người, với gần 500 người chết Thống kê tại Anh từ năm 2001-2005 có

1933 người mắc bệnh do vi khuẩn Listeria gây ra…

- Trong những năm qua, những con cá hun khói, và bơ có liên quan đến

dịch Listeriosis do vi khuẩn Listeria gây ra tại Thụy Điển và Finland

- Cơ quan hữu quan các nước trên từng cảnh báo về loại vi khuẩn này Đồng thời cũng đề ra các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt nguồn nguyên liệu thực phẩm Nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ gây ra ngộ độc thực phẩm mà quan trọng hơn là chúng gây ra các bệnh lý nguy hiểm như xảy thai, viêm màng não, nhiễm trùng huyết Thường giai đoạn ủ bệnh từ vài ngày đến

2 tháng Chính vì vậy, người ta thường không nhận biết được ngay sự lây nhiễm của loại vi khuẩn này Dấu hiệu khởi phát của bệnh là có sốt, khó chịu, đau lưng Nếu độc tố đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng nôn mủa, tiêu chảy, đau quặn bụng, nhức đầu…

- Theo thông báo ngày 26-9-2011 của Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh Hoa Kỳ (CD) về trường hợp ngộ độc thực phẩm từ loại dưa đỏ đã bị nhiễm khuẩn, gây cho trên 61 người mắc, trong đó có 12 người đã tử vong

Nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc:

- Trường hợp ngộ độc mang tính chất phân tán như trên là do vi khuẩn

tại nông trại Jensen, bang Colorado Sản phẩm trên được phân phối rộng rãi tại nhiều tiểu bang của Mỹ Cách nay 3 tuần, lần lượt các ca ngộ độc đã được báo cáo tại 15 tiểu bang, theo số liệu chưa đầy đủ đã có trên 61 người mắc và

có 12 ca tử vong Theo điều tra bước đầu, một số dưa đỏ đã bị nhiễm khuẩn

trong quá trình thu hái và vận chuyển Vi khuẩn Listeria monocytogenes phân

tán rất rộng rãi trong môi trường đất, nước, phân gia súc nên rất dễ lây nhiễm qua thực phẩm

- Việc phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes trong thực phẩm

không phải là sự cố lần đầu, mà từ nhiều năm qua chúng đã gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm tại nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Úc, Canada, Pháp, Bỉ Các vụ ngộ độc này thường dẫn đến tình trạng tử vong Theo thống kê từ năm

2002 tại Mỹ, hàng năm tại nước này, số bệnh nhân nhiễm bệnh do vi khuẩn

2005 có 1.993 người mắc, với trên 300 ca tử vong, tại Canada hàng năm vẫn

thường xảy ra các vụ ngộ độc do vi khuẩn Listeria Gần đây tại Trung Quốc

cũng đã báo cáo vài vụ ngộ độc do vi khuẩn này Các nước đang phát triển, do thiếu điều kiện xét nghiệm, tầm soát loại vi khuẩn này, nên các trường hợp nhiễm bệnh hoặc ngộ độc thường bị bỏ qua

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Listeria monocytogenes ở Việt Nam

Ở Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hay xảy ra, đặc biệt là ngộ độc tập thể, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại các bếp ăn tập thể không đảm bảo vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm) Theo một thống

kê năm 2008, mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 250 - 500 ca ngộ độc thực

phẩm với 7000 – 10000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong Có 8 triệu người ngộ độc thực phẩm mỗi năm tại Việt Nam Đây là công bố của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) về tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam Tuy nhiên chỉ

có 8000 người được thống kê, phát hiện, bằng 1% số người ngộ độc thực phẩm trên thực tế

Trong thời gian vừa qua, trước tình hình số lượng các mẫu cá tra đông

lạnh bị phát hiện nhiễm Listeria monocytogenes ngày càng gia tăng, thực

hiện chỉ đạo của lãnh đạo bộ, cục quản lý chất lượng nông lâm thủy hải sản (NAFIQAD) đã có quyết định thành lập nhóm công tác chủ trì thực hiện đề

tài khoa học cấp cơ sở “Xác định nguyên nhân lây nhiễm và đề xuất giải

pháp kiểm xoát mối nguy hiểm Listeria monocytogenes trong sản phẩm cá

giá kết quả thực hiện đề tài

Theo số liệu các kết quả phân tích của đề tài cho thấy 162/485 mẫu (bao gồm 29/120 mẫu nguyên liệu được lấy tại các nhà máy chế biến, 79/186 mẫu

vệ sinh công nghiệp sau khi vệ sinh, 8/28 mẫu tay công nhân, 24/36 mẫu bán

thành phẩm) bị phát hiện nhiễm Listeria monocytogenes

cao đến 440C Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý việc làm vệ sinh ống dẫn lạnh trên trần vì đó là nơi có điều kiện thuận lợi cho Listeria phát

triển và tích tụ Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn

chưa được biết Bệnh bắt đầu từ đường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các đại thực bào và gây nhiễm trùng máu Vi khuẩn tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể xâm nhập vào bào thai trong bệnh mẹ gây sẩy

thai, đẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi Listeria monocytogenes đã được phân

lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau như thịt, cá, rau, sữa và cà bề mặt nước Cần lưu ý kiểm tra sự hiện diện của vi sinh vật ở mọi công đoạn trong quá trình chế biến thực phẩm, từ môi trường, nguyên liệu, điều kiện sản xuất,

vận chuyển đến sản phẩm cuối cùng Nấu chín thực phẩm là một biện pháp hữu hiệu để giảm nguy cơ nhiễm bệnh

1.2 Vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes

Hình 1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Đôi nét về listeria: Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae gồm những trực khuẩn nhỏ không sinh bào tử, có lông ở một đầu nên có thể

di động, gam dương, có phản ứng catalase dương tính, oxydase âm tính Hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý và có khả năng lên men đường Giống này gồm nhiều loài

gây bệnh cho gia súc và người, trong đó có loài Listeriamonocytogenes là loài gây

bệnh sảy thai truyền nhiễm ở cừu và làm tăng số bạch cầu đơn nhân trong máu của nhiều loài động vật như bò, ngựa, dê, cừu, heo, chuột, kể cả người

1.2.1 Cấu trúc

2.1.1 Cấu trúc di truyền

- Genome của Listeria monocytogenes và Listeria innocua được giải

trình tự có độ dài là 2.94 Mbp với 2583 khung đọc mở và mol % G+C là 39

thành phần mol 5% G+C là 37 Một điều đáng chú ý là nhiều protein được mã hóa bởi vi khuẩn này mang độ tương đồng rất cao so với Bacillus subtilis

vậy,chúng có tới 331 gen mã hóa cho các protein vận chuyển khác nhau

(11,6% trong số tất cả các gen dự kiến) và 209 các vị trí điều hòa quá trình dịch mã được tìm thấy trên loài vi khuẩn này

- Khoảng 0-79% các chủng Listeria monocytogenes có chứa plasmid này ở

dạng ẩn, sự đề kháng với cadmium là hiện tượng phụ thuộc plasmid và các plasmid đặc hiệu cho hiện tượng đề kháng với một hoặc nhiều loại kháng sinh đã được ghi nhận Plasmid thường thấy trong các chủng Listeria monocytogenes thuộc nhóm huyết thanh 1

1.2.1.2 Cấu trúc tế bào

- Nhân: là vùng nhân nguyên thủy, chưa có màng nhân nên không có

hình dạng cố định vì vậy còn gọi là vùng nhân

- Ribosome: nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng của tế bào chất Ribosome gồm hai tiểu phần ( 50S và 30S), hai tiểu phần này kết hợp với nhau tạo thành ribosome 70S

- Màng tế bào: Màng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL) chiếm 30 – 40% khối lượng của màng, các protein chiếm 60-70% khối lượng các màng Đầu phosphate của PL tích điện phân cực, ưa nước Đầu hydrocacbon không tích điện, không phân cực, và có tính kỵ nước

Hình 2: Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes

+ Chức năng chủ yếu của màng

- Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất

- Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường của tế bào

- Là nơi sinh tổng hợp của thành phần tế bào và các polymer của bao nhầy

- Là nơi sinh tổng hợp của nhiều enzyme, các protein của chuỗi hô hấp

- Cung cấp năng lượng cho sự hoạt động của tiên mao

- Tiên mao: chúng quyết định khả năng và phu7o7nmg pháp di động của vi khuẩn, tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể quan sát cấu trúc khi nhuộm theo phương pháp riêng Dưới kính hiển

vi điện tử có thể thấy rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao

- Tetrapepid chứa cả D- và L- axit amin

- Thành tế bào rất dày, hấp thu và giữ lại màu tím khi nhuộm với thuốc nhuộm tím tinh thể

- Thành tế bào làm những nhiệm vụ sau :

- Tham gia quá trình trao đổi chất

- Là nơi chứa đựng nhiều chất có chứa hoạt tính sinh học

- Bao nhầy :

- Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn

- Bảo vệ vi khuẩn tránh khỏi bị thực bào

- Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn

- Giúp vi khuẩn bám vào giá thể

Hình 3: Lông roi của vi khuẩn Listeria monocytogenes

1.2.2 Phân loại

Hình 4: Vi khuẩn Listeria monocytogenes

- Loài khuẩn giống Listeria là những vi khuẩn hình que Gram dương,

ngắn, chúng kỵ khí, dương tính với catalase, âm tính với oxidase, di động ở 20- 25ºC và không di động ở 37ºC

- Phân loại học của Listeria.spp trong giới vi sinh vật như sau:

Thuộc giới: Bacteria

Listeria wells

Listeria seeligeri

Listeria grayi (loài này hiện bao gồm cả loài cấp dưới Listeria murayi.)

- Trong đó, các loài này chỉ có 2 loài gây bệnh qua thực nghiệm và tự

nhiên, Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii Trước kia, chúng gây

bệnh cho người và động vật, sau này chúng gây bệnh chủ yếu cho động vật

Cả 2 loài này và loài Listeria seeligeri đều sản sinh ra β_ haemolysis trên

Sheep Blood Agar và đây chính là sợi dây nối kết với mầm bệnh Tuy nhiên,

đặc điểm này như là một giả định về khả năng gây bệnh của các loài Listeria

1.2.3 Đặc tính sinh hóa

Lên men chậm các loại đường như glucose, rhamnose, salicin, levulose Không lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose Phản ứng Catalaza dương tính

Sức đề kháng

Khi tiến hành phân tích chẩn đoán Listeriosis và khảo sát nguồn nhiễm

khuẩn thì thấy rằng vi khuẩn này có thể tồn tại trong thời gian dài lâu có thể là 90 ngày từ khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn và xuất hiện triệu chứng Thời gian trung bình từ khi nhiễm khuẩn vào cơ thể đến khi phát bệnh khoảng 30 ngày

Vi khuẩn này rất bền Nó kháng nhiệt (mặc dầu nhiệt độ không cao, dưới 60ºC), muối, nitrite và acid, sống sót ở điều kiện lạnh đông và thậm chí

có thể sinh sôi phát triển chậm chạp trong tủ lạnh(ở khoảng 4ºC) Vi khuẩn bị diệt ở 60ºC trong 30 phút và 72ºC trong 15 giây Vi khuẩn đề kháng với sự khô hạn Có thể sống sót trong thực phẩm và đất nhưng bị diệt bởi những chất sát trùng thông thường Nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng tetracycline cho kết quả tốt nhất Người ta có thể kết hợp giữa Trimethoprim với Sulphamethazol trong điều trị, vi khuẩn kháng lại với Quinolones Erythromycine, ampicillin được dùng trong điều trị bệnh cho người

1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố

Cấu trúc kháng nguyên

- Cấu trúc kháng nguyên của L.monocytogenes phức tạp, được chia thành

16 serotype căn bản dựa trên kháng nguyên O và H

- Kháng nguyên O: Bền với nhiệt được chia thành 14 loại, ký hiệu 1-14

- Kháng nguyên H: Không bền với nhiệt, chia làm 4 loại:a, b, c, d Hiện nay có 3 chủng là nguyên nhân gây bệnh chính có cấu trúc kháng nguyên là: 1/2a; 1/2b; 4b

IX (III), V, VII (III), VI, VIII (III), V, VI, VIII, IX)

1.2.5 Khả năng lây bệnh

Trong tự nhiên vi khuẩn gây bệnh Listeriosis và ở dạng thần kinh đôi khi

được gọi là bệnh quay mòng (circling disease) phổ biến nhất đối với động vật

nhai lại như bò, cừu đặc biệt vào mùa đông và đầu mùa xuân với mọi lứa tuổi Đối với dạng phủ tạng thường gặp ở động vật dạ dày đơn Bệnh có thể gây sảy thai ở ngựa Ngoài ra vi khuẩn còn gây bệnh cho gia cầm và cá Ở người thường gặp sảy thai, thai chết và viêm não Ở vài động vật thể hiện sự gia tăng bạch cầu đơn nhân

Trong phòng thí nghiệm: Dùng thỏ và chuột lang Chuột nhạy cảm, chết sau khi tiêm nhiễm 48 giờ với bệnh tích hoại tử gan Dùng test ANTON gây viêm kết mạc mắt

+ Một bệnh do L.monocytogenes

Viêm màng não mủ, hay viêm màng não nhiễm khuẩn, là hiện tượng viêm của các màng bao bọc quanh hệ thần kinh trung ương (não và tủy sống) do sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh trong khoang dịch não tủy Sự viêm nhiễm này sẽ gây nên tình trạng sinh mủ bên trong hệ thống thần kinh trung ương

Những bệnh nhân suy giảm miễn dịch như người già, trẻ sơ sinh, bệnh nhân điều trị thuốc ức chế miễn dịch, AIDS thường có nguy cơ bị bệnh Viêm màng não mủ sơ sinh do tác nhân này thường nằm trong bối cảnh nhiễm trùng huyết nặng Các dấu hiệu nghi ngờ trên lâm sàng là: mẹ thường có sốt, sinh non không rõ nguyên nhân, nhau thai có tổn thương hạt

1.2.6 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn Listeria monocytogenes từ đường tiêu hóa, vi khuẩn xẩm nhập

vào máu và các mô, bao gồm cả bánh rau của phụ nữ có thai, từ đó vi khuẩn xâm nhập vào các tế bào mẫn cảm và nhân lên nhiều lần trong các tế bào này Người có nguy cơ cao nhất là trẻ sơ sinh, người trung niên, người bị tổn

thương hệ miễn dịch và phụ nữ có thai Bệnh do nhiễm khuẩn listeria (hay còn gọi là bệnh Listeriosis) có hai thể:

- Listeriosis khu trú ở ruột: bệnh chỉ khu trú ở hệ thống tiêu hóa

(người bệnh sẽ trải qua các triệu chứng nhẹ giống như bị cúm thường như sốt

và đau mỏi cơ cũng như có hiện tượng tiêu chảy)

- Listeriosis thể lan tỏa và xâm nhiễm: Sự nhiễm bệnh không tập trung

tại đường tiêu hóa mà còn xâm nhập vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu hoặc lan sang cả hệ thần kinh trung ương và não bộ gây viêm màng não Những người có hệ miễn dịch yếu có thể làm cho tình trạng nhiễm khuẩn thêm nặng hơn: trẻ em, người già từ 60 tuổi trở lên, người đang trong giai đoạn dùng các phương pháp điều trị làm suy giảm chức năng miễn dịch như hóa xạ trị, người có hệ miễn dịch yếu như bị HIV/AIDS, tiểu đường, phụ nữ mang thai

- Từ lâu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng vi khuẩn Listeria lây

lan từ tế bào này sang tế bào khác trong cơ thể con người Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóng tạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và đẩy sang tế bào liền kề Khi đó vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề đó

Hình 5: Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Listeria monocytogenes Hamon et al Nature Reviews Microbiology 4, 423–434

(June 2006) | doi:10.1038/nrmicro1413

a | L monocytogenes đi vào tế bào như thể thực bào

b | Vi khuẩn bên trong không bào (Được biết như là thể thực bào)

c,d | Màng của không bào bị phá vỡ bởi sự tiết ra hai loại phospholipases:

PlcA và PlcB, and độc tố listeriolysin O Vi khuẩn được giải phóng trong

tế bào chất, nơi chúng được nhân lên nhiều lần và bắt đầu với sự trùng hợp actin)

e | Sự trùng hợp actin cho phép vi khuẩn tạo thành một cấu trúc theo hình

ngón tay nhô ra từ tế bào và vào tế bào chất tế bào liền kề

f |Trong tế bào bên cạnh, vi khuẩn hiện diện ở màng kép không bào từ đó

chúng có thể thoát khỏi sự duy trì của chu kỳ

Giáo sư Ireton và nhóm của ông đã phát hiện ra một quá trình thứ hai hỗ trợ việc lây lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh mà trước đây chưa từng được biết đến

Quá trình này dần dần đã làm suy yếu khả năng tự vệ khỏi việc nhiễm bệnh của tế bào thứ hai và đã xuất hiện trong lần xuất bản tuần này của tạp chí khoa học Nature Cell Biology

Hình 6: Sự di chuyển của vi khuẩn Listeria monocytogenes

Vi khuẩn Listeria di chuyển qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể

người sử dụng một phần của khung tế bào gọi là các sợi actin, vi khuấn

actin hình thành một cấu trúc dạng đuôi phía sau vi khuẩn Những sợi actin

này có tác dụng đẩy Vi khuẩn Listeria qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể

người Những mũi tên trong ảnh cho thấy một con vi khuẩn đang chuyển động trong tế bào chất

Màng tế bào, hay lớp ngoài cùng của những tế bào khỏe mạnh thông thường căng ra Tình trạng căng đó được kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn

vi khuẩn không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton phát hiện ra rằng một loại pro-tê-

in trong vi khuẩn Listeria gọi là InIC xuất hiện làm giảm đi độ căng của

màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn để xuyên thủng màng tế bào và sau đó lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng hơn

Phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton cũng đưa ra bản báo cáo cho thấy cách mà InIC làm giảm độ căng là ngăn chặn chức năng của protein Tuba trong cơ thể người Thông thường, chức năng của Tuba trong tế bào người không nhiễm bệnh là tạo ra độ căng của màng tế bào Protein InIC trong vi

khuẩn Listeria đã khống chế sự hoạt động của Tuba, làm giảm độ căng và

giúp vi khuẩn lây lan sang các tế bào liền kề

1.2.7 Miễn dịch

Cơ thể thú có thể hình thành miễn dịch sau khi nhiễm Miễn dịch trung gian

tế bào là chủ yếu Hiện nay có hai loại vaccine chết và nhược độc có thể đem lại kết quả Vaccine thường sử dụng: 1a và 4b đạt kết quả phòng bệnh trên cừu

1.3 Tổng quan về thực khuẩn thể (Biobacteria Phage)

1.3.1 Sơ lược về thực khuẩn thể

1.3.1.1 Cấu trúc của thực khuẩn thể

- Cấu trúc: phage có 3 dạng cơ bản: cấu trúc hình khối không đuôi, cấu trúc hình khối có đuôi và cấu trúc dạng sợi hay dạng que Dạng có đuôi (chẳng hạn phage T2) gồm đầu hình lục giác; cổ; đuôi có dạng hình trụ, cuối đôi có các sợi lông như chân để bám vào vi khuẩn và đĩa gốc với 6 sợi lông đuôi