THIẾT kế mẫu nội KIỂM ĐÁNH GIÁ mức độ xử lý DNA với BISULFITE

Các biến đổi di truyền ngoại sinh đã trở thành dấu chuẩn phân tử trong chẩn đoán bệnh. Trong đó, hiện tượng methyl hóa được nghiên cứu phổ biến hơn cả do sự methyl hóa quá mức của một số gen có liên quan chặt chẽ tới quá trình hình thành và phát sinh ung thư. Trong các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu hiện tượng này, xử lý DNA với bisulfite có những ưu thế hơn hẳn các phương pháp khác. Tuy nhiên, hầu như chưa có một hệ thống nội kiểm nào thực sự hoàn thiện để kiểm soát quá trình xử lý bisulfite. Việc bổ sung mẫu nội kiểm cho phương pháp phân tích methyl hóa này sẽ góp phần kiểm định tính chính xác của kết quả, hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng đúng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Thiết kế mẫu nội kiểm đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite” nhằm đưa ra một công cụ hỗ trợ việc kiểm soát quá trình xử lý bisulfite và đánh giá được mức độ xử lý DNA với bisulfite. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -    - Nguyễn Thu Trang THIẾT KẾ MẪU NỘI KIỂM ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -    - Nguyễn Thu Trang THIẾT KẾ MẪU NỘI KIỂM ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Võ Thị Thương Lan Hà Nội - 2017 Lời cảm ơn Để hoàn thành tốt luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Võ Thị Thương Lan – người trực tiếp hướng dẫn em tiến hành đề tài Cơ tận tình bảo giúp đỡ em nhiều suốt trình làm việc học tập thời gian qua Cô không truyền thụ cho em kiến thức, kinh nghiệm quý báu cơng việc mà khơi gợi, bồi đắp tính cẩn thận, tự giác, đạo đức nghề nghiệp lòng say mê nghiên cứu khoa học em, giúp em vượt qua khó khăn để tự tin, vững bước đường chọn Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Phạm Anh Thùy Dương, chị người bảo, chia sẻ với em nhiều cơng việc sống, giúp em có thái độ nghiêm túc, chu với việc giao Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Tạ Bích Thuận, người động viên, khích lệ em nhiều suốt thời gian qua, giúp em hồn thành tốt cơng việc Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Ngơ Thị Hà, CN Nguyễn Quang Duy bạn phòng thí nghiệm Sinh Y ln bên cạnh, cổ vũ tinh thần ủng hộ em suốt thời gian qua Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè ln tin tưởng, ủng hộ động viên, giúp em hoàn thành tốt luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thu Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Ribonucleic acid gDNA : Genomic DNA (DNA hệ gen) cs : Cộng IC : Internal control (mẫu nội kiểm) SHOX2 : Short Stature Homeobox ACTB : Beta actin CFF : Cytosine free fragment dNTPs : Deoxynucleotide triphosphates PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Real-time PCR : Phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng RT-PCR : Reverse Transcription - PCR (PCR phiên mã ngược) Ct : Threshold cycle (chu kì ngưỡng) UV : Ultraviolet (tia cực tím) GMO : Genetically Modified Organism SNPs : Single Nucleotide Polymorphism DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Trình tự oligo mồi sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Thành phần điều kiện phản ứng tổng hợp đoạn IC 26 UnIC Bảng 2.3 Thành phần điều kiện phản ứng PCR IC UnIC với 26 cặp mồi Trans-CFF Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR IC sau xử lý bisulfite với cặp 27 mồi Shox-UnCFF Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR gDNA sau xử lý bisulfite với 27 cặp mồi Shox-Me-F/R Bảng 2.6 Thành phần điều kiện phản ứng Real-time PCR khuếch 29 đại mẫu nội kiểm sau xử lý bisulfite Bảng 2.7 Thành phần phản ứng nối IC UnIC vào vector pTZ57 30 Bảng 2.8 Thành phần điều kiện phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc 31 với cặp mồi vector pTZ57 Bảng 2.9 Thành phần điều kiện phản ứng mở vòng plasmid 32 enzyme giới hạn Bảng 3.1 Kết đo nồng độ IC UnIC sau tinh 36 Bảng 3.2 Giá trị ΔCt trung bình mẫu chuẩn 41 Bảng 3.3 Kết khảo sát pUnIC nồng độ khác 42 Bảng 3.4 Giá trị ΔCt tỷ lệ xử lý bisulfite nhóm pIC trộn 44 gDNA mẫu máu Bảng 3.5 Giá trị ΔCt tỷ lệ xử lý bisulfite nhóm pIC trộn gDNA mẫu bệnh phẩm 46 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1 Chu kì nhiệt PCR Hình 1.2 Hệ thống đầu dò Taqman Hình 1.3 Thuốc nhuộm SYBR Green I Hình 1.4 Sự methyl hóa cytosine đứng trước guanine 14 Hình 1.5 Trình tự DNA trước sau xử lý bisulfite 15 Hình 1.6 Các phản ứng trình xử lý bisulfite 16 Hình 1.7 Phổ hấp thụ UV 18 Hình 1.8 Phân tích ACTB/CFF dựa vào Real-time PCR 19 Hình 2.1 Mơ hình IC 21 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế IC từ Oligo-CFF-F, Oligo-CFF-R cặp 22 mồi Trans-CFF-F, Trans-CFF-R Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế UnIC từ Oligo-UnCFF-F, Oligo-UnCFF-R 22 cặp mồi Trans-CFF-F, Trans-CFF-R Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm 33 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn IC 34 UnIC gel polyacrylamide 8% Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn IC 35 UnIC cặp mồi Trans-CFF-F Trans-CFF-R gel polyacrylamide 8% Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm IC, UnIC tinh gel polyacrylamide 8% 36 Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc mang 37 đoạn chèn IC (giếng 1-7), mang đoạn chèn UnIC (giếng 814) gel agarose 2% Hình 3.5 Kết điện di pIC (giếng 1) pIC (giếng 2) gel 37 agarose 1% Hình 3.6 Kết điện di gel agarose 1% plasmid IC trước 38 (giếng 1) sau cắt (giếng 2) với enyme giới hạn ScaI Giếng 3: plasmid UnIC sau cắt với ScaI Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR mẫu MT15 39 MT15-XL với cặp mồi Trans-CFF Shox-UnCFF gel polyacrylamide 8% Hình 3.8 Đồ thị so sánh giá trị ΔCt ba nhóm mẫu chuẩn 41 Hình 3.9 Đường chuẩn pUnIC nồng độ khác nhau, từ 0.4 pg 43 đến 200 pg Hình 3.10 Đồ thị so sánh tỷ lệ xử lý bisulfite ba nhóm pIC phối 45 trộn gDNA mẫu máu Mẫu chuẩn pUnIC sử dụng làm đối chứng tương đương với pIC xử lý hồn tồn với bisulfite Hình 3.11 Đồ thị so sánh tỷ lệ xử lý bisulfite ba nhóm pIC 47 phối trộn gDNA mẫu bệnh phẩm Mẫu chuẩn pUnIC sử dụng làm đối chứng tương đương với pIC xử lý hoàn toàn với bisulfite Hình 3.12 Kết giải trình tự pIC số mẫu sau xử lý bisulfite 48 Hình 3.13 (A) Kết giải trình tự pIC mẫu đúc KP65 thả 0.005 ng 49 IC (B) Kết giải trình tự vùng promoter gen SHOX2 mẫu đúc KP65 thả 0.005 ng IC MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG 1.1.1 Giới thiệu kỹ thuật PCR 1.1.2 PCR định lượng (Real-time PCR) 1.1.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng 1.2 MẪU NỘI KIỂM 1.2.1 Mẫu nội kiểm DNA 10 1.2.2 Mẫu nội kiểm RNA 12 1.3 QUÁ TRÌNH XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE 13 1.3.1 Giới thiệu phương pháp xử lý DNA với bisulfite 13 1.3.2 Nguyên tắc trình xử lý DNA với bisulfite 15 1.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG DNA SAU XỬ LÝ BISULFITE 17 1.4.1 Xác định nồng độ DNA phương pháp đo quang phổ 17 1.4.2 Định lượng DNA sau xử lý bisulfite Real-time PCR 18 1.4.3 Xác định mức độ xử lý DNA với bisulfite 19 CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 21 2.2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 24 2.2.1 Nguyên liệu 24 2.2.2 Hóa chất 25 2.2.3 Thiết bị 25 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Phương pháp xử lý DNA với bisulfite 25 2.3.2 Phương pháp PCR 25 2.3.3 Phương pháp Real-time PCR 28 2.3.4 Phương pháp tách dòng 29 2.3.5 Phương pháp biến nạp 30 2.3.6 Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc 31 2.3.7 Phương pháp tách plasmid 31 2.3.8 Phương pháp cắt enyme giới hạn 32 2.3.9 Phương pháp điện di 32 2.3.10 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 33 2.3.11 Phương pháp giải trình tự gen 33 2.3.12 Phương pháp phân tích thống kê 33 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 THIẾT KẾ IC VÀ UnIC 34 3.1.1 Tổng hợp đoạn IC UnIC 34 3.1.2 Tách dòng IC UnIC 36 3.1.3 Kiểm tra tính đặc hiệu IC 38 3.2 KHẢO SÁT pUnIC (MẪU CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG pIC) 40 3.2.1 Khảo sát giá trị ΔCt mẫu chuẩn 40 3.2.2 Dựng đường chuẩn pUnIC 42 3.3 KHẢO SÁT LƯỢNG pIC CHO QUÁ TRÌNH XỬ LÝ BISULFITE 43 3.3.1 Đánh giá mức độ xử lý bisulfite cho nồng độ khác pIC 43 3.3.2 Giải trình tự 48 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 ĐẶT VẤN ĐỀ Các phương pháp sinh học phân tử áp dụng chẩn đốn lâm sàng đòi hỏi độ xác, độ nhạy độ đặc hiệu cao Một công cụ hữu hiệu giúp nâng cao độ tin cậy cho thử nghiệm phân tử sử dụng mẫu đối chứng nội kiểm Đối chứng nội kiểm tham gia kiểm soát quy trình, phản ứng mà khơng ảnh hưởng đến chất phân tử đích, đảm bảo kết xác với có độ tin cậy cao Các mẫu nội kiểm sử dụng nhiều cho quy trình tách chiết khuếch đại DNA/RNA góp phần xây dựng hệ thống phát biến đổi di truyền hay chẩn đoán mầm bệnh hiệu Các biến đổi di truyền ngoại sinh trở thành dấu chuẩn phân tử chẩn đốn bệnh Trong đó, tượng methyl hóa nghiên cứu phổ biến methyl hóa mức số gen có liên quan chặt chẽ tới trình hình thành phát sinh ung thư Trong phương pháp sử dụng để nghiên cứu tượng này, xử lý DNA với bisulfite có ưu hẳn phương pháp khác Tuy nhiên, chưa có hệ thống nội kiểm thực hồn thiện để kiểm sốt q trình xử lý bisulfite Việc bổ sung mẫu nội kiểm cho phương pháp phân tích methyl hóa góp phần kiểm định tính xác kết quả, hỗ trợ chẩn đốn tiên lượng Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: “Thiết kế mẫu nội kiểm đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite” nhằm đưa cơng cụ hỗ trợ việc kiểm sốt q trình xử lý bisulfite đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite Đề tài thực Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 3.3.1.2 Trộn pIC với gDNA mẫu bệnh phẩm Tương tự với mẫu máu, chúng tơi trộn cố định 0.5 µg gDNA mẫu bệnh phẩm tách chiết từ mô đúc nến với ba lượng pIC khác 10 ng, 0.3 ng 0.005 ng để xử lý bisulfite Giá trị ΔCt tỷ lệ xử lý pIC so sánh với mẫu chuẩn pUnIC kiểm định Anova nhân tố Kết trình bày cụ thể Bảng 3.5 Hình 3.11 Bảng 3.5 Giá trị ΔCt tỷ lệ xử lý bisulfite nhóm pIC trộn gDNA mẫu bệnh phẩm Mẫu Lượng xử lý bisulfite (ng) UnIC p (vs UnIC) ΔCt ± SD 0.48 ± 0.03 Tỷ lệ xử lý bisulfite ± SD p (vs UnIC) 1.00 IC (n=18) 10 0.77 ± 0.14