Giáo trình phương pháp nghiên cứu sinh học cá

Trong phương pháp thu mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi cá thểtrong quần thể sẽ được gán cho một số gọi là số ngẫu nhiên – random numbers khiđó những cá thể nào được thu làm mẫu sẽ được xác

Giáo trình:

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC CÁ

2 Lịch sử phát triển của nghiên cứu cá

Lịch sử nghiên cứu cá chưa phát triển lâu, mặc dù nghề khai thác và nuôi cáđược biết là phát triển trước đó rất nhiều Có lẽ nghiên cứu sinh học cá chỉ bắt đầusau thế kỷ 18 khởi đầu là các nghiên cứu về ngư loại học, mà lúc nầy cũng tập trungnhiều về hình thái và phân bố (Biswas, 1993) Người đầu tiên viết về các loài cá ở

Ấn Độ là Block (Day, 1878), sau đó là hàng loạt các báo cáo viết về hình thái cánhư Hamilton (1822), Cuvier và Valenciennes (1824-1849)

Đến đầu thế kỷ 20 thì các nghiên cứu về ngư loại học phát triển nhanh vềnhiều lĩnh vực như (i) hình thái và phân bố; (ii) phân loại; (iii) sinh lý và sinh hóa;(iv) sinh thái; (v) bệnh học; (vi) cấu trúc quần thể; (vii) di truyền; và (viii) bảo tồn, hàng loạt các nghiên cứu về sinh học các đã được tiến hành như nghiên cứu về sinhhọc sinh sản của nhiều loài cá khác nhau như của Hickling (1930), Clark (1934),…

về tuổi và sinh trưởng của các loài các biển và cá nước ngọt như của Van Oosten

1

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học

cá

(1929), Hickling (1933), Ford (1933), Pillay (1958),… về đánh giá trữ lượng quần thể như Ricker (1954, 1975), Welcomme (1975, 1979),…

3 Tầm quan trọng của phương pháp nghiên cứu và mục tiêu của giáo trình

Trong nghiên cứu các vấn đề về thức ăn, sinh trưởng, sinh sản, biến động quầnthể,… của cá đều cần có một phương pháp phù hợp và chuẩn mực để có thể đưa racác nhận định hay đánh giá chính xác và có thể so sánh kết quả giữa các nghiêncứu

Hiện nay có rất nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học cá được viết trongnhiều tài liệu khác nhau ở các cấp độ khác nhau Nhiều nhà nghiên cứu làm việc ởcác quốc gia phát triển (Tây Âu, Nhật Bản, Mỹ, ) luôn sử dụng các phương phápmới, phức tạp và ứng dụng công nghệ thông tin hay thiết bị hiện đại, tất nhiên sẽ tiếtkiệm thời gian, cho kết quả chính xác hơn, nhưng chi phí có thể cao hơn

Ở một số quốc gia, hay đối với một số đối tượng bắt đầu tiếp cận với phươngpháp nghiên cứu cá (như sinh viên) thì rất cần các phương pháp đơn giản và dễ ứngdụng Trên ý tưởng đó, giáo trình nầy được biên soạn trên cơ sở tổng hợp nhiềuphương pháp đã ứng dụng trong nghiên cứu cá và trình bày có tính logic và dễ hiểunhằm phục vụ cho sinh viên chuyên ngành thuỷ sản bậc đại học Giáo trình nầy vìthể chỉ trình bày một số phương pháp quan trọng và phổ biến ở dạng cụ thể và íttrình bày các lý luận sâu cho từng phương pháp Học qua giáo trình nầy sinh viên cóthể ứng dụng ngay vào các nghiên cứu của mình để phục vụ cho các nghiên cứu làmluận văn hay chuyên đề tốt nghiệp và có thể ứng dụng cho các nghiên cứu đơn giảntrong công tác

II Nội dung của giáo trình

Giáo trình được kết cấu thành 8 chương, với những kiến thức cơ bản nhấttrong nghiên cứu sinh học bao gồm:

- Chương 1: Phương pháp thu và xử lý mẫu

- Chương 2: Phương pháp nghiên cứu hình thái cá

- Chương 3: Phương pháp nghiên cứu mô học

- Chương 4: Phương pháp nghiên cứu dinh dưỡng

- Chương 5: Phương pháp nghiên cứu sinh học sinh sản

3

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học

cá

- Chương 6: Phương pháp nghiên cứu tuổi và sinh trưởng

- Chương 7: Phương pháp nghiên cứu sinh học quần thể

- Chương 8: Phương pháp đánh giá trữ lượng cá

Chương 1PHƯƠNG PHÁP THU VÀ XỬ LÝ MẪU

I Giới thiệu

Có lẽ yêu cầu trọng nhất trong nghiên cứu về sinh học các là phải thu được sốmẫu lớn và có tính đại diện Ngoài việc chọn lựa vị trí (địa điểm) thu mẫu phù hợpthì cần phải thu được số mẫu đủ lớn để kết quả phân tích phản ánh chính xác nộidung nghiên cứu mong muốn Có nhiều cách để thu được mẫu và loại mẫu thu cũngphải tùy thuộc vào nội dung của nghiên cứu, ví dụ thu mẫu để xác định giống loài,thành phần loài hay là thu để đánh giá trữ lượng,… Có những nội dung nghiên cứuđòi hỏi người thu mẫu phải có công cụ đánh bắt riêng, nhưng có nội dung có thểdựa vào thu mẫu từ ngư dân, trao đổi để ghi nhận thông tin từ ngư dân, thu từ chợhay từ những người có liên quan khác ở địa bàn nghiên cứu Tuy nhiên, trong thực

tế thì việc thu thập các thông tin qua ngư dân không phải lúc nào cũng đầy đủ hoặcnhận được các trả lời chính xác hoàn toàn, bởi lẽ ngư dân không có ghi chép cácthông tin, hoặc đôi lúc vì một lý do nào đó mà họ không thể nói thật hết những điều

họ làm hay biết Trong trường hợp nầy, người thu mẫu phải tạo ra một sự thân thiệnnhất định và biết cách trao đổi để có thể khai thác được thông tin chính xác nhất vềmẫu thu của mình

Bên cạnh đó, không phải lúc nào các mẫu thu đều có thể xử lý (phân tích)ngay tại chỗ mà phải mang về phòng thí nghiệm để phân tích Vì thế, vấn đề xử lýmẫu thu cũng đòi hỏi phải được thực hiện nghiêm túc và khoa học để có thể cóđược kết quả phân tích chính xác Phương pháp xử lý vào bảo quản mẫu vì thế tuỳthuộc vào từng nội dung nghiên cứu

II Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu

1 Nguyên tắc trong thu mẫu

a) Định danh chính xác mẫu thu

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nghiên cứu sinh học cá là phảixác định chính xác loài cá nghiên cứu Nhưng đây không phải là công việc dễ dàng,nhất là khi mẫu thu là các loại cá trong giai đoạn con non Thỉnh thoảng ngườinghiên cứu không phân biệt được 2 loài có quan hệ gần nhau và gọi chúng với cùng

một tên loài Tùy theo địa phương, mỗi loài cá có thể có những tên gọi khác nhau, cho nên việc sử dụng tên khoa học của loài là thuận tiện và chính xác nhất.

Định danh loài thường được tiến hành bằng cách xác định một loạt các đặcđiểm hình thái bao gồm: (i) mô tả hình thái của loài như hình dạng cơ thể, các loại

vi, vị trí miệng, kiểu vẩy, (ii) Các chỉ tiêu số lượng (thí dụ công thức vi) như sốlượng tia vi, vẩy, đốt sống Số lượng gai và tia vi thường là một chỉ số không đổigiữa các cá thể trong cùng 1 loài, vì vậy công thức vi là một công cụ quan trọng đểđịnh danh loài Ngoài công thức vi, số lượng vẩy, công thức răng hầu, số tia mang,

số đốt sống cũng là các chỉ tiêu số lượng quan trọng để định danh loài (iii) Các số

đo hình thái như chiều dài đầu, cao thân, mối tương quan của các chỉ số này vớichiều dài tổng cộng hay chiều dài chuẩn Các số đo này thường được biểu hiện bằng

tỉ lệ hay phần trăm

b) Chọn địa điểm thu mẫu

Mẫu thu dùng cho nghiên cứu sinh học cá có thể thu ở chợ, cảng cá hay trựctiếp đánh bắt bằng các dụng cụ chuyên dùng (lưới kéo, lưới cào, chài,…) Tuynhiên, vị trí thu mẫu là yếu tố quyết định đến kết quả của nghiên cứu Thôngthường, thu mẫu ở các cảng cá phù hợp hơn việc thu ở chợ, bởi lẽ đó là nơi mà mẫuthu thể hiện tính đại diện cho ngư trường mà họ khai thác như biển, sông, hồ chứa,

… Bên cạnh đó, việc thu mẫu ở các cảng cá cũng sẽ rất quí cho việc tính toán sảnlượng khai thác vì nó phản ánh chính xác nhất lượng cá khai thác theo ngư trườnghay theo ngư cụ khai thác

Vị trí thu mẫu bằng cách đánh bắt trực tiếp có ý nghĩa rất quan trọng trongviệc xác định vùng phân bố, tập tính di cư, bãi đẻ, tập tính sinh sản, Các yếu tốmôi trường nơi thu mẫu đôi khi cũng cần phải được xác định như độ vẫn đục, độmặn, pH, mật độ phiêu sinh vật để có kết luận chính xác hơn về tập tính dinhdưỡng, các thích nghi sinh lý, vòng đời của đối tượng nghiên cứu

c) Chuẩn bị biểu mẫu

Khi thực hiện công tác thu mẫu thường phải chuẩn bị các biểu mẫu để có thểghi chép một số thông tin về mẫu thu và cũng có thể xác định một số chỉ tiêu đo đạtnhanh Thông thường, mẫu thu phải có ghi đầy đủ các thông tin như:

1 Nơi khai thác (tên sông, hồ, ngư trường,…)

2 Địa điểm thu mẫu

3 Loại tàu khai thác

4 Ngư cụ khai thác và kích thước mắc lưới

5 Độ sâu ngư trường khai thác

6 Diện tích khai thác (nếu được)

7 Loài khai thác, tỉ lệ thành phần loài,

Nếu cần có thể ghi nhận nhanh kích cỡ về chiều dài và trọng lượng của cá tạinơi thu mẫu Thông thường thì có thể phân nhóm theo kích cỡ cá để đo đạt, trongtrường hợp cá có kích thước lớn hơn 30 cm chiều dài thì có thể đo độ chính xác là 1

cm, cá kích cỡ nhỏ hơn 30 cm thì độ chính xác là 0,5 cm và đối với cá nhỏ có thể đo

ở độ chính xác 1 mm (Holden và Rait 1974)

2 Thu mẫu phân tích ở phòng thí nghiệm

Thu mẫu cho các phân tích ở phòng thí nghiệm yêu cầu phải có tính đại diệncho quần thể Mẫu thu cần phải được giữ càng tươi càng tốt Tùy theo yêu cầu màmẫu thu cũng có thể khác nhau, nếu như thu mẫu cho nghiên cứu mô học phải làmẫu sống thì thu mẫu phân tích tính ăn của cá phải thu vào buổi sáng (5:00-7:00giờ) để không bị ảnh hưởng bởi chu kỳ ăn trong ngày (diurnal rhythm) và khả năngtiêu hóa thức ăn của cá Theo Robotham (1977) đối với mẫu phân tích dinh dưỡngthì sau khi thu phải cho ngay vào dung dịch Chloral hydrate 10%, sau khi gây mê(narcotization) thì cố định trong formol trung tính 40% và sau đó pha loãng còn 5%

để bảo quản lâu dài Với cách nầy ông cho rằng sẽ giữa được tốt các thành phầntrong dạy dày và ngăn cản sự biến mất một số thành phần

Hầu hết các nghiên cứu về sinh học cá được tiến hành trên một số ít mẫu thuđược từ một quần thể có số lượng lớn Khái niệm quần thể ở đây là tất cả các cá thểthuộc một loài và đang sống ở một khu vực địa lý nhất định, quần thể cũng có thểđược xem như một nhóm các cá thể thuộc loài đang được nghiên cứu (Moller,1979) Toàn bộ quần thể thì quá lớn cho nghiên cứu, hơn nữa cũng không thể tiếnhành các phân tích trên tất cả các cá thể đánh bắt được Vì vậy, việc chọn mẫu đạidiện là cần thiết cho các nghiên cứu sinh học Có nhiều cách để thu mẫu, tuy nhiên

có thể chia ra thành 2 phương pháp chính là (i) thu mẫu ngẫu nhiên (randomsampling) và (ii) thu mẫu có chọn lọc (non-random sampling) Tuy nhiên phươngpháp thu mẫu ngẫu nhiên được áp dụng nhiều nhất, trong phương pháp này tất cảcác mẫu trong quần thể đều có khả năng được chọn lựa bằng nhau

Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên lại được chia là 2 phương pháp là (i) thumẫu hoàn toàn ngẫu nhiên (simple random) và (ii) thu mẫu ngẫu nhiên có giới hạn(restricted random) Trong phương pháp thu mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi cá thểtrong quần thể sẽ được gán cho một số (gọi là số ngẫu nhiên – random numbers) khi

đó những cá thể nào được thu làm mẫu sẽ được xác định bằng các bảng số ngẫunhiên (random table) Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên có giới hạn lại có 2 cáchthu mẫu: (i) thu mẫu phân tầng (stratified sampling) đối với quần thể không đồngnhất, khi đó quần thể sẽ được chia thành các phần đồng nhất và mẫu sẽ được thuđộc lập từ các phần đồng nhất đó; và (ii) thu mẫu nhiều giai đoạn (multi-stagesampling), khi quần thể quá lớn (thậm chí số lượng rất lớn cho một mẫu đại diện)khi đó việc thu mẫu được chia thành 2 giai đoạn Trước tiên quần thể muốn thu mẫuđược chia thành các quần thể đại diện (sub-population) và mẫu sẽ được thu từ cácquần thể đại diện (mẫu cấp 1) Bước tiếp theo, từ các mẫu thu của các quần thể đạidiện, tiến hành thu các mẫu đại diện (mẫu cấp 2) Mẫu cấp 2 có thể được thu nhiềuhơn 2 giai đoạn tùy thuộc vào nghiên cứu và kích cỡ của quần thể, do vậy phươngpháp này được gọi là phương pháp thu mẫu nhiều giai đoạn

Vấn đề quan trọng nhất của việc thu mẫu là xác định số lượng mẫu thu Cónhiều ý kiến cho rằng số lượng mẫu nên dao động từ 1-25% kích cỡ quần thể Khi

số lượng mẫu quá nhỏ có thể sẽ không đại diện được cho toàn bộ quần thể, trái lại

số lượng mẫu quá lớn sẽ tốn rất nhiều thời gian để phân tích và làm gia tăng chi phí

Số lượng mẫu thu cũng phụ thuộc vào từng nghiên cứu, tuy nhiên số lượng từ

80-100 mẫu với các kích cỡ khác nhau cho mỗi tháng là thích hợp cho các nghiên cứuthông thường về sinh học cá

3 Kỹ thuật bảo quản mẫu

Yêu cầu mẫu cho nghiên cứu sinh học phải còn tốt, những mẫu hư sẽ rất khócho các phân tích vì thế mẫu cần được bảo quản càng nhanh càng tốt Mẫu sau khithu cần được rửa ngay bằng nước ngọt để mẫu được sạch đồng thời loại bỏ các visinh vật có thể bám theo mẫu, nhất là mẫu thu từ ngư dân Mẫu sau khi rửa sạch thìcần đánh dấu và cân trọng lượng và chiều dài, và tất nhiên chi tiết của mẫu cầnđược ghi chép cẩn thận trong sổ Đối với các mẫu cá có kích cỡ lớn rất cần thiếtphải gắn các thẻ hay phiếu có ghi các chi tiết như nơi đánh bắt, chiều dài, trọnglượng và giới tính Mẫu không ghi rõ sẽ khó sử dụng trong nghiên cứu

Mẫu thu có thể cố định ngay trong dung dịch formol Mẫu dùng cho phân tích

dạ dày cần phải được cố định ngay sau khi thu Dung dịch cố định mẫu thườngdùng là formol 10% (1 phần formol và 9 phần nước) cho những mẫu có kích thước

lớn (lớn hơn 15 cm) và 5% cho các mẫu có kích thước nhỏ Dung dịch được dùngcho cố định mẫu phải là dung dịch trung tính, thông thường borax sẽ được thêm vàotrong formol (1:1000).

Phần bụng của mẫu cá có kích thước lớn nên được mổ và cắt sâu vào trong cơhai bên thân cá để dung dịch cố định có thể thấm vào bên trong Những cá nhỏ hơn

15 cm dài chỉ cần mổ phần dụng cá là đủ Mẫu cá thường được cố định khoảng 7-10ngày, sau đó rửa sạch và cố định lại trong dung dịch formol 10% hay cồn 70%(ethyl alcohol) Nếu như giữa mẫu trong dung dịch cồn thì trước tiên nên giữ trongcồn 50% từ 5-7 ngày trước khi chuyển sang cồn 70% Trong trường hợp muốn giữamẫu lâu, nếu dùng formol thì phải thay hàng tháng còn nếu giữa trong cồn (alcohol)thì thay mỗi 3 tháng Tuy nhiên, tùy từng cơ quan của cá mà cách bảo quản mẫu cóthể khác nhau để có thể giúp cho quá trình phân tích mẫu đạt kết quả tốt nhất

Vảy, đá tai, gai vi lưng hay gai vi ngực thường được sử dụng để xác định tuổi

cá Vảy cá thường được thu từ 5-10 vảy cho mỗi cá thể Thông thường vảy tròn(cycloid scale) được lấy ở vùng giữa của vi lưng và đường bên, trong khi vảy lược(ctenoid scale) được thu ở vùng vi ngực Trước khi thu vảy, mẫu cần phải được rửasạch để loại bỏ các vảy dính trên thân cá (các vảy này có thể là của các mẫu cá khácdính vào), và chỉ thu các vảy còn đính chặt vào thân cá Cũng có thể dễ dàng nhậnbiết các vảy tái sinh do sự sắp xếp không theo trật tự và thiếu các vòng đồng tâmgần, các vảy này không nên thu mẫu Nên chọn thu đủ số lượng mẫu với các vảyđồng dạng Khi lấy vảy cần cẩn thận tránh làm tổn hại phần rìa của vảy Mẫu vảycủa mỗi cá thể có thể được chứa riêng trong các túi (giấy hay nilon) có dán nhãn vớiđầy đủ các thông tin về mẫu

Mặt cắt thẳng đứng của đá tai cũng được sử dụng để xác định tuổi của cá Đátai thì nằm trong một khe của tai trong Cách thu đá tai dễ dàng nhất là thu qua mộtđường mở nằm ngang trên đầu phía sau mắt, hoặc mở nắp hộp sọ Một phươngpháp khác để thu đá tai mà vẫn giữ nguyên hình dạng mẫu vật là lấy từ phần vòmmiệng, tuy nhiên phương pháp này khó thực hiện hơn Trước khi cắt mẫu, đá taiphải được đúc thành khối trong polyester hay nhựa thông Có thể bảo quản đá taibằng các phương pháp sau:

- Giữ trong dung dịch glycerin và nước theo tỉ lệ 1:1

- Giữ đá tai trong creosol hay terpineol (Gibson và Ezzi, 1978)

- Ngâm trong dung dịch 1% potassium hydroxide (KOH) để loại trừ hết các

mô liên kết sau đó làm khô và giữ trọng lọ kín (Strum, 1978)

Gai cứng của vi lưng (hoặc vi ngực) cũng được sử dụng để xác định tuổi cá.Gai vi được cố định trong dung dịch formal-calcium ít nhất 24 giờ Cách chuẩn bịdung dịch này như sau:

40% formaldehyde 10 mL

Calcium chloride khan 10 g

Nước cất 80 mL

Bột CaCO3 thêm vào quá mức bão hòa

Sau khi cố định, mẫu được rửa sạch bằng nước cất và chuyển vào dung dịchkhử canxi trong thời gian từ 6-12 giờ tùy thuộc vào chiều dài của gai vi Dung dịchkhử canxi được chuẩn bị bằng cách trộn lẫn 2 loại dung dịch A và B (Perry, 1967).Dung dịch A gồm 50 g sodium citrate và 250 mL nước cất, dung dịch B gồm 125

mL acid formir và 125 mL nước cất

Các phần khác của bộ xương như xương nắp mang, cột sống, xương gốc viđuôi, có thể được thu bằng cách đun mẫu trong nước sôi khoảng 5 phút, khi đócác cơ bám vào xương sẽ dễ dàng tách ra Mẫu xương được làm khô ở nhiệt độphòng trong thời gian khoảng 24 giờ Sau đó giữ mẫu trong các túi có dán nhãn vớicác thông tin về mẫu cá

Cố định tuyến sinh dục đúng phương pháp là khâu rất quan trọng cho cácnghiên cứu về sinh học sinh sản Theo Gibson và Ezzi (1978) thì sau khi thu mẫutinh sào cần phải đo chiều dài (tính bằng mm), cân trọng lượng và cho vào cố địnhtrong cồn 70% Buồng trứng sau khi thu cũng cần phải cân và đo sau đó xẻ dọc đểcho dung dịch cố định thấm vào Để cố định trứng thì Simpson (1951) đề nghị dùngdung dịch “Gilson’s fluid” Dung dịch nầy không những có tác dụng cố định trứng

mà còn giúp phá vỡ các mô liên kết trong buồng trứng và làm tách rời trứng Đểtách rời trứng khỏi các mô liên kết có thể cần giữ mẫu vài tuần trong dung dịchGilson, lắc nhẹ lọ chứa trứng đến khi thấy hầu hết các trứng tách ra khỏi các mô củabuồng trứng Loại bỏ các mô của buồng trứng và nếu như trứng còn dính nhau thìtiếp tục giữ trong dung dịch cố định Trứng đã tách rời phải được rửa sạch bằng cồntuyệt đối và sau đó bảo quản trong cồn tuyệt đối cho các phân tích về sau (đo vàđếm số trứng) Cách chuẩn bị dung dịch “Gilson’s fluid” như sau:

formol-để trứng tách rời ra khỏi các mô cơ liên kết Dung dịch cố định cần được thay định

kỳ đến khi mẫu trứng được đem ra phân tích

4 Kỹ thuật cố định mẫu cho các nghiên cứu mô học

Đây là kỹ thuật rất cần thiết cho các nghiên cứu mô học trên các cơ quan khácnhau của cá Ống tiêu hóa và tuyến sinh dục là 2 cơ quan được nghiên cứu phổ biếnnhất vì sự khác biệt về tổ chức mô của 2 cơ quan này sẽ giúp người nghiên cứu hiểubiết hơn về sự phát triển, tập tính dinh dưỡng và giai đoạn thành thục sinh dục củatừng loài cá Kỹ thuật này cũng rất cần thiết cho các nghiên cứu về bệnh trên cácloài thủy sản

Mẫu thu cho các nghiên cứu mô học phải là mẫu tươi được lấy từ cá mới đượcgiết chết hay cá được gây mê Tùy loại mô và kích thước mẫu mà có các loại dungdịch cố định và thời gian cố định mẫu khác nhau Với các nghiên cứu về ống tiêuhóa, mẫu ống tiêu hóa của cá trưởng thành có thể được cố định bằng dung dịchBouin trong thời gian 12 giờ sau đó chuyển sang bảo quản trong cồn 70%, với cábột hay cá hương thì có thể cố định bằng dung dịch formol trung tính 10% Đối vớimẫu buồng trứng thì cố định bằng dung dịch Bouin ít nhất 24 giờ sau đó chuyểnsang bảo quản trong cồn 70% Mẫu cố định bằng dung dịch Bouin, khi bảo quảntrong cồn 70% cần thay cồn nhiều lần cho đến khi màu vàng của dung dịch bảoquản được loại bỏ Một loại dung dịch cố định cũng thường được sử dụng (nhất làtrong các nghiên cứu mô học trên tôm) là dung dịch AFA (alcohol – formalin – acidacetic), hàm lượng formalin và acid acetic có thể thay đổi tùy thuộc vào loại mẫu

-Dung dịch Bouin được chuẩn bị như sau:

Dung dịch axit picric bão hòa 750 mL

Formol 40% 250 mL

Acid acetic 50 mL

- Cách chuẩn bị dung dịch formol trung tính:

Sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) 4 g

Sodium phosphate (Na2HPO4) 6,5 g

Hòa tan trong 750 mL nước cất, thêm vào 100 mL formol (37- 40%); sau đó thêm nước vào cho đủ 1000 mL

Thanh chắn

Thước đo

Chương 2PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI CÁ

Nghiên cứu hình thái cá là một khía cạnh quan trọng trong nghiên cứu cá, nócung cấp nguồn thông tin chủ yếu cho các nghiên cứu về phân loại và tiến hóa của

cá Mặc dù các kết quả nghiên cứu đạt được về di truyền, sinh lý, tập tính, và sinhthái cũng phục vụ cho mục đích này, hệ thống phân loại cá vẫn phụ thuộc rất nhiềuvào hình thái học Những đặc điểm của loài như hình dáng, kích cỡ, màu sắc, sự sắpxếp của vi, vảy và các chỉ tiêu hình thái khác là tiêu chuẩn trợ giúp cho việc nhậndạng, định danh và phân loại cá Các phương pháp đo đếm các chỉ tiêu hình thái và

sự tương quan của các chỉ tiêu sẽ được trình bày trong chương này

I Nguyên lý trong đo mẫu cá

Đo mẫu cá là một trong các phương pháp của nghiên cứu hình thái cá, tùy theokích cỡ cá mà có các phương pháp đo thích hợp để có được các số liệu chính xác.Phương pháp căn bản dùng dùng bàn đo (board) (Hình 2.1), bàn đo được thiết kếgồm bàn bằng gỗ hay kim loại, bên trên bàn có gắn cố định một thước và phần đầucủa bàn đo có một tấm chắn để khi đo đầu cá đặt chạm vào tấm chắn nầy Chiều dàicủa bàn đo tùy vào kích thước cá dự kiến sẽ đo

Hình 2.1: Dụng cụ dùng để đo cá (bàn đo cá)

Đối với các mẫu có lớn (lớn hơn 50 cm) thì có thể dùng thước để đo, tuy nhiênđối với cá có kích thước nhỏ có thể dùng thước đo (caliper) hay thước có phân cỡ.Thông thường nên đo cá ngay tại nơi thu mẫu, lúc nầy cá còn tươi và ẩm, nhữngmẫu cá bị khô có thể rất khó đo chính xác vì hình dáng của cá có thể bị biến dạng,nhất là không thể kéo thẳng để đo Trong trường hợp đo mẫu cá sống có kích cỡ lớn

thì rất cần thiết phải gây mê cá trong dung dịch Sandoz Ms 222 ở nồng độ thườngdùng là 1/1.000, hoặc có thể dùng dung dịch 2 - phenoxy ethanol với hàm lượng từ

20 – 30 mL/100 L nước

II Đo chiều dài và trọng lượng cá

Thuật ngữ chiều dài của cá thường để chỉ chiều dài tổng cộng (chiều dài toànthân) của cá Ngoài ra còn có các khái niệm khác như chiều dài chuẩn và chiều dàifork Chiều dài chuẩn thường được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng, tuy nhiên khi thumẫu với số lượng lớn và cần phải đo nhanh cá ở hiện trường thì khó thực hiện chínhxác Chiều dài fork thường không thể dùng trong trường hợp các loài cá có vây đuôikhông phân thùy như cá rô đồng chẳng hạn Chọn loại chiều dài nào để sử dụng tùythuộc rất nhiều vào ý đồ của người nghiên cứu Phương pháp đo thường dùng là đểsát đầu cá vào tấm chắn (phía tay trái), sau đó vuốt cá thẳng ra về phía tay phải vàxác định chiều dài của cá dựa vào thước đã gắn trên bàn đo

Phương pháp xác định khối lượng cá thường dùng là cân, có thể cân đĩa haycân thăng bằng và tùy theo trọng lượng của cá mà dùng cân có mức cân tương thích.Cân thăng bằng thường ít được sử dụng do mất nhiều thời gian và độ chính xáccũng thấp Cân điện hiện đang được áp dụng phổ biến và cho kết quả chính xác hơn.Xác định khối lượng cá cũng phải tùy vào tình trạng của cá (tươi hay đã qua cốđịnh), trong trường hợp cá đã được cố định thì thường bị mất nước nên khối lượngthực của cá bị thay đổi và trong trường hợp nầy phải tìm hệ số qui đổi để có thểchuyển từ khối lượng cá đã cố định sang cá tươi Ngoài ra, trong một số trường hợpkhi cân khối lượng cá cũng phải xem xét tính đồng nhất của mẫu cá cân (mức độ ẩmchẳng hạn) để giảm sai số Trong trường hợp không thể cân trực tiếp khối lượng cáthì có thể cân qua dụng cụ chứa cá, chẳng hạn dùng một dụng cụ chứa cá và cânkhối lượng dụng cụ trước, sau đó cho cá vào cân lại Trọng lượng cá chính là phầnchênh lệch giữa khối lượng dụng cụ và cá so với khối lượng dụng cụ

III Các chỉ tiêu hình thái

Các chỉ tiêu đo theo đề xuất của Lowe-McConnel (1971) và Grant & Spain(1977) trong nghiên cứu sinh học các gồm:

1 Chiều dài tổng cộng (total length): thể hiện giá trị lớn nhất của chiều dài

cơ thể cá từ đầu đến cuối cơ thể Nó là khoảng cách được xác định theođường thẳng từ mút đầu (miệng cá) đến cuối của vi đuôi Trong trường hợp

cá có vi đuôi dạng phân thùy thì đo đến điểm mút cuối cùng của vi đuôi

2 Chiều dài fork (fork length): chiều dài fork được tính từ mút đầu (miệng

cá) đến giới hạn ngoài (điểm giữa) khía chữ V hoặc vị trí phân thùy của viđuôi cá

3 Chiều dài chuẩn (standard length): chiều dài chuẩn được đo từ mút đầu

của cá (miệng) đến cuống vi đuôi (khớp vi đuôi và cơ thể cá) Vị trí này cóthể nhận biết rõ khi bẻ đuôi cá sang 2 bên, một rãnh nhỏ sẽ được hìnhthành

4 Chiều dài đầu (head length): chiều dài đầu được xác định từ mút đầu

mõm (xương trước hàm) đến điểm cuối của xương nắp mang

5 Chiều dài trước vi lưng (pre-dorsal fin): chiều dài nầy được tính từ mút

đầu (miệng cá) đến gốc tia (gai) vi lưng đầu tiên

6 Chiều dài phần trước mắt hay dài mõm (pre-orbital hoặc snout

length): khoảng cách từ mút đầu cơ thể đến rìa trước ổ mắt

7 Chiều rộng giữa 2 mắt (inter-orbital width): được xác định từ mặt lưng

của cơ thể, là khoảng cách từ rìa trên của ổ mắt trái đến rìa trên của ổ mắtphải Khoảng cách này còn được gọi là khoảng cách nhỏ nhất giữa 2 mắt

8 Chiều dài sau mắt (post-orbital length): Khoảng cách từ rìa sau ổ mắt

đến điểm cuối của xương nắp mang

9 Đường kính mắt: Khoảng cách từ mép trước đến mép sau của mắt theo

trục chiều dài thân

10.Chiều dài hàm trên (upper jaw length): khoảng cách giữa điểm mút

xương trước hàm và điểm cuối của xương hàm trước

11.Chiều dài hàm dưới (lower jaw length): khoảng cách giữa 2 điểm cuối

(điểm giao nhau của hàm trên và hàm dưới) dọc theo mép của hàm dưới

12.Chiều dài trước hậu môn (anal length): khoảng cách từ mút đầu cơ thể

đến giới hạn trước của lỗ hậu môn

13.Chu vi thân (girth length): vòng đo tại điểm rộng nhất của cơ thể (không

tính vi) Chỉ số này thỉnh thoảng được dùng để xác định mức độ thành thụccủa cá (đặc biệt là cá cái)

14.Chiều cao thân (body depth): là khoảng cách giữa mặt lưng và mặt bụng

tại điểm rộng nhất của cơ thể

15.Chiều cao đầu (head depth): khoảng cách thẳng đứng tính từ điểm sau

gáy (gốc sau của xương trên chẩm) đến mặt bụng của đầu

16.Độ rộng miệng (gape width): còn được hiểu như chiều rộng miệng, là

khoảng cách giữa 2 góc khi miệng cá đóng lại

17.Chiều cao vi lưng (dorsal fin height): chiều dài của tia vi lưng lớn nhất

hay của gai vi lưng

18.Chiều dài gốc vi lưng (dorsal fin base): khoảng cách giữa giới hạn trước

và sau của vi lưng dọc theo chiều dài của cơ thể

19.Chiều dài vi ngực (pectoral fin length): chiều dài lớn nhất của tia vi

ngực

20.Chiều rộng gốc vi ngực (pectoral fin base): khoảng cách giữa điểm trên

và dưới gốc vi ngực nơi các tia vi ngực đính vào

Hình 2.2: Một số chỉ tiêu hình thái của cá

21.Chiều dài vi hậu môn (anal fin length): chiều dài tia vi hậu môn dài nhất.

22 Chiều dài gốc vi hậu môn (anal fin base): khoảng cách từ điểm trước

đến điểm sau gốc vi hậu môn

23 Chiều dài vi bụng (ventral fin length): Chiều dài tia vi bụng dài nhất

24.Rộng gốc vi bụng (ventral fin base): khoảng cách giữa 2 giới hạn ngoài

gốc vi bụng

25.Chiều cao qua miệng (depth at mouth): khoảng cách giữa mặt lưng và

mặt bụng của đầu, xác định tại đường kẻ thẳng đứng qua góc sau miệng

26.Chiều cao qua mắt (depth at eye): khoảng cách giữa mặt lưng và mặt

bụng của đầu, xác định tại đường kẻ thẳng đứng qua mắt

27 Chiều cao thân qua vi lưng (depth at dorsal fin): chiều rộng cơ thể xác

định bằng đường kẻ thẳng đứng qua giới hạn trước gốc vi lưng

28.Chiều cao thân qua vi ngực (depth at pectoral fin): chiều rộng cơ thể

qua gốc vi ngực

29 Chiều cao thân qua hậu môn (depth at anus): chiều rộng cơ thể tại

đường kẻ thẳng đứng qua hậu môn

30.Chiều cao vi đuôi (caudal fin height): chiều rộng khi kéo căng các thùy

của vi đuôi ra

31.Chiều dài cuống đuôi (length of caudal peduncle): khoảng cách từ điểm

cuối gốc vi hậu môn đến điểm giữa khớp vi đuôi

32.Chiều cao nhỏ nhất cuống vi đuôi (least height of the caudal peduncle):

cũng là thuật ngữ chỉ chiều cao nhỏ nhất của cơ thể Là chiều cao nhỏ nhấtcủa cuống vi đuôi trong khoảng giữa điểm cuối gốc vi hậu môn và điểmxuất phát của vi đuôi Thực tế, nó là chiều rộng của cuống đuôi tại vị tríxương gốc vi đuôi

Sơ đồ minh họa cho các chỉ tiêu đo được thể hiện trong hình 2.2 và 2.3

Hình 2.3: Các chỉ tiêu đo ở cá

Trong đó:

TL: chiều dài tổng cộng; FL: chiều dài fork; SL: chiều dài chuẩn; BD:chiều cao thân; HL: chiều dài đầu; PD: chiều dài trước vi lưng; PO: dàimõm; PtO: dài đầu sau mắt; ED: đường kính mắt; AL: chiều dài trướchậu môn; IW: chiều rộng giữa 2 mắt; HPC: chiều cao nhỏ nhất cuống viđuôi; HD: chiều cao vi lưng; BDF: chiều dài gốc vi lưng; PFL: chiều dài

vi ngực; PFB: chiều rộng gốc vi ngực; VFL: chiều dài vi bụng; BV: chiềudài gốc vi bụng; AFL: chiều dài vi hậu môn; AFB: chiều dài gốc vi hậumôn

IV Các chỉ tiêu số lượng

Các chỉ tiêu số lượng là các chỉ tiêu sinh học có thể đếm được như số đốtsống, tia vi, vảy, sức sinh sản (Holden và Raitt, 1974) Để thuận tiện cho việc minhhọa, chúng ta hãy xét trường hợp đơn giản là đếm số lượng tia vi (công thức vi) vàvảy

Có 2 dạng tia vi – tia vi đơn hay gai vi và tia vi kép (phân nhánh) hay tia vimềm Với các mẫu cá lớn, có thể dễ dàng phân biệt các gai và tia vi, tuy nhiên vớicác mẫu cá nhỏ việc quan sát bằng kính hiển vi là cấn thiết để phân biệt tia vi mềm

và gai cứng Các ký tự như D, P, V, A, C, Ll, L.tr được sử dụng để biểu thị cho vilưng, vi ngực, vi bụng, vi hậu môn, vi đuôi, vảy đường bên, và vảy ngang đườngbên Dấu gạch chéo (/) được dùng để tách biệt giữa gai vi cứng và tia vi mềm.Thỉnh thoảng những gai cứng được biểu thị bằng chữ số La mã và tia vi mềm đượcbiểu thị bằng chữ số A rập Thông thường phần phân nhánh của tia vi cuối cùng của

vi lưng và vi hậu môn kéo dài đến tận gốc vi, như vậy cả 2 nhánh này phải đượctính như 1 tia vi Hãy xem một số thí dụ minh họa về công thức vi được trình bàydưới đây:

i) D 2/9 – 11: nghĩa là vi lưng có 2 gai cứng và có từ 9-11 tia vi mềm

ii) D1 1/4, D2 5: nghĩa là vi lưng thứ I có 1 gai cứng và 4 tia vi, vi lưng thứ II

có 5 tia vi và không có gai cứng

iii) D 2/15/0: Nghĩa là vi lưng thứ nhất có 2 gai cứng và 15 tia vi trong khi vi lưng thứ II thì không có gai và tia vi

iv) P 12 – 14: nghĩa là vi ngực có từ 12 đến 14 tia vi nhưng không có gai cứng

Vảy đường bên (Ll) là các vảy có lỗ (hoặc răng cưa) nằm dọc theo đường bên(từ góc trên nắp mang đến gốc vi đuôi) Thông thường vảy đường bên không liêntục, trong trường hợp này L.r sẽ được dùng biểu thị công thức vảy thay thế cho Ll.Vảy ngang đường bên (L.tr.) được đếm như sau: các vảy bên trên đường bên đượcđếm từ trên xuống và về phía sau bắt đầu từ khởi điểm gốc vi lưng cho đến vảyđường bên; các vảy dưới đường bên được đếm từ dưới lên trên và về phía trước bắtđầu từ khởi điểm gốc vi hậu môn (Hình 2.2) Thí dụ L.tr 14 có thể được viết thành8/1/5 hoặc 8½ /5½

V Các chỉ số sinh trắc

Theo Tobor (1974) mỗi chỉ tiêu cơ thể (dài đầu, đường kính mắt, cao thân, )trong một mối tương quan với chiều dài cơ thể được xem như một chỉ số sinh trắc(biometric index) Trong mỗi chỉ số liên hệ giữa chỉ tiêu cơ thể với chiều dài (chiềudài đầu/đường kính mắt; chiều dài tổng cộng/chiều dài đầu ), giá trị trung bình củachỉ số sinh trắc sẽ được xác định Theo Bayagbona (1963), nếu trong tất cả các

8 HL/ED TL/HL TL/BD7B

6

C5

A4

length (cm)

nhóm kích cỡ cá nghiên cứu, chỉ số sinh trắc của mỗi đặc điểm riêng (chỉ tiêu) biểuhiện một tỉ lệ giảm liên tục, lúc đó đặc điểm khảo sát thể hiện một mối tương quanthuận (+), trái lại thì đặc điểm khảo sát thể hiện mối tương quan nghịch (-) Nếu chỉ

số sinh trắc không biến đổi nghĩa là sự phát triển của chỉ tiêu khảo sát trong mốiliên hệ với chiều dài là một tương quan đồng đẳng (Hình 2.4)

Hình 2.4: Chỉ số sinh trắc của cá Labeo pangusia

Giá trị a và b được xác định bằng công thức sau:

n: tổng số nhóm chiều dài khảo sát

x : giá trị trung bình của x

y: giá trị trung bình của y

VI Tương quan chiều dài trọng lượng và hệ số điều kiện

1 Tương quan chiều dài và trọng lượng

Có một nguyên lý chung đó là sự tăng trưởng của cá và các sinh vật khác cóảnh hưởng đến chiều dài của chúng Vì thế, có thể nói rằng chiều dài và tăng trưởngcủa của loài có mối tương quan với nhau Huxley (1924) đã đề xuất công thức sinhtruởng của cá qua mối quan hệ giữa chiều dài và trọng lượng theo công thức:

Le Cren (1951) đã chuyển đổi phương trình trên thành dạng log như sau:

log W = log a + b log L

Giá trị a và b được xác định bằng công thức sau:

n: tổng số nhóm chiều dài khảo sát

x: giá trị chiều dài trung bình

y: giá trị trọng lượng trung bình

Vì thế khi biết được giá trị của a và b có thể tìm được trọng lượng của cá vàngược lại Đường hồi qui của log W theo log L phải được tính bằng phương phápbình phương nhỏ nhất (least squares) bằng cách chia các số liệu khảo sát thành cácnhóm nhỏ theo các nhóm kích cỡ Số lượng nhóm phụ thuộc vào sự biến động vềkích cỡ của mẫu thu được Tuy nhiên số lượng nhóm không được dưới 10 nhóm Sốliệu phải được thu trọn năm và sự phân chia có thể theo nhóm chiều dài, nhóm giớitính và mùa vụ,… để có thể thấy được sự thay đổi

Hệ số tương quan r được dùng để kiểm tra mức độ chặt chẽ của đường hồi qui

và được tính bằng công thức sau:

Bên cạnh mối tương quan giữa chiều dài và trọng lượng, thì từng cá thể cũng

có những biến động trong quá trình sinh trưởng Sự biến động cá thể được phân tíchthông qua một chỉ số gọi là hệ số điều kiện (condition factor hay K-factor) và có

nhiều cách tính toán khác nhau Tuy nhiên, Hile (1936) và Beckman (1948) đề nghị công thức dưới đây để tính hệ số điều kiện :

K = (W x 105) / L3

Trong đó:

K: hệ số điều kiện

W: khối lượng cá

L: chiều dài của cá

105 là hệ số làm cho hệ số điều kiện K trở nên gần đồng nhất (Carlander,1970) Hệ số điều kiện của cá bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi của tuyến sinh dục theomùa và lượng thức ăn Vì thế, khi tính toán hệ số điều kiện không nên dùng tổngkhối lượng mà nên dùng khối lượng không nội tạng (nominal body weight), vì nókhông bị ảnh hưởng bởi tuyến sinh dục và dạ dày (Papageorgiou, 1979) Khối lượngkhông nội tạng (Wn) được tính toán bằng cách lấy tổng khối lượng trừ đi khốilượng tuyến sinh dục (Wg) và dạ dày (Ws):

Wn = W – (Wg + Ws)

Hệ số điều kiện nên được tính toán theo mùa, theo giới tính và theo nhóm kích

cỡ để xem có hay không sự biến động về giá trị của hệ số K

kỷ XIX như việc chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtone), cho phép người ta nghiêncứu tỉ mỉ cấu trúc vi thể của tế bào và mô Những kết quả đạt được trong lĩnh vựcnghiên cứu cấu tạo vi thể tế bào đã cho phép người ta tách việc nghiên cứu tế bàothành một phần riêng biệt trong Mô học gọi là Tế bào học Học thuyết tế bào khôngchỉ là cơ sở của việc nghiên cứu cấu tạo mô bình thường mà còn là cơ sở của viêcnghiên cứu những thay đổi bệnh lý của mô, cơ quan và đồng thời nó cũng là cơ sởcủa việc nghiên cứu những hoạt động sinh lý.

Mô học, một môn học của Sinh học và là khoa học nghiên cứu của sự pháttriển, cấu tạo và hoạt động của các mô, các cơ quan, các bộ máy của cơ thể Mô học

có quan hệ qua lại với nhiều môn học khác trong ngành Sinh học như Hình thái học,Sinh lý học, Phôi học Trong chương này giới thiệu những kỹ thuật cần thiết đểnghiên cứu mô, và mức độ nhỏ hơn là tế bào

II Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu mô

Tế bào và mô phải được quan sát bằng các loại kính hiển vi, do đó khi nghiêncứu mô và tế bào cần phải cắt mẫu với các độ dầy thích hợp đảm bảo cho ánh sángxuyên qua trong quá trình quan sát dưới kính hiển vi Qui trình xử lý mẫu và tạotiêu bản bắt đầu từ cố định mẫu, cắt tỉa định hướng mẫu, khử nước, ngấm mẫu trongparaffin, đúc khối và cắt lát mỏng, dán lát cắt vào lam và nhuộm màu Phủ lamellelên tiêu bản, lúc này lát cắt có thể quan sát được dưới kính hiển vi Tương tự, quitrình xử lý mẫu bằng kỹ thuật lạnh cũng có thể được áp dụng Qui trình này tươngđối đơn giản hơn, mẫu được đông lạnh nhanh, cắt, nhuộm, phủ lamelle lên tiêu bản.Phương pháp này được ứng dụng trong các nghiên cứu về các enzyme nội tiết vì cácenzyme dễ bị mất đi trong phương pháp xử lý mẫu thông thường, nhưng kết quả xử

24

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học

cá

lý mẫu thường không ổn định và khó nhận biết được các cấu trúc chi tiết, qui trình

xử lý mẫu vì thế phụ thuộc vào từng trường hợp nghiên cứu cụ thể

Sơ đồ các bước xử lý mẫu trong nghiên cứu mô học như trong hình 3.1

QUI TRÌNH XỬ LÝ MẪU

THÔNG THƯỜNG QUI TRÌNH XỬ LÝ MẪULẠNH

Hình 3.1: Sơ đồ các bước trong qui trình xử lý mẫu (Hinton, 1990)

1 Cố định mẫu (Fixation)

Hoàn tất tiêu bản

Cố định mẫu là kỹ thuật làm chết tế bào nhưng vẫn giữ chúng trong tình trạng giống như khi chúng còn sống.

Mẫu mô hay cơ quan của cá hoặc tôm sau khi tách ra khỏi cơ thể sẽ chết đi vàtrải qua quá trình hoại tử (tự phân hủy) và nhanh chóng tan rã (Trump và ctv, 1980)

vì vậy cần phải ngăn chặn sự hoại tử và tan rã đó bằng việc cố định nhanh và ít gây

ra sự thay đổi cấu trúc nhất Ngoài tác dụng ngăn chặn quá trình hoại tử, việc sửdụng các loại hóa chất cố định còn giúp cho các tổ chức mô giữ vững cấu trúc trongsuốt quá trình xử lý và nhuộm mẫu bằng nhiều loại hóa chất khác nhau

Một mẫu mô được cố định tốt khi những tế bào cấu tạo nên mô đó vẫn giữnguyên hình dáng, không có sự thay đổi bào tương, không bị trương lên, không bị

co lại, làm thể hiện được nhiều chi tiết và cấu trúc, đồng thời giữ được mối liênquan tương hỗ trong tế bào và trong mô giống như còn sống

Các loại hóa chất cố định mẫu

Có thể cố định tế bào và mô bằng nhiều cách như phương pháp vật lý (bằngnhiệt độ), phương pháp hoá học (bằng hoá chất) Cố định tế bào và mô bằng hóachất là tốt hơn cả Có nhiều loại dung dịch hóa chất dùng để cố định mẫu, trong đómột số dung dịch hoá chất thường sử dụng là:

- Formalin trung tính 10%

- Dung dịch cố định Bouin

- Và hỗn hợp của cồn, acid acetic, và formalin với các tỉ lệ pha trộn khácnhau (Hopwood, 1977; Coolidge và Howard, 1979; Humason, 1979; Clark,1981)

Chọn dung dịch cố định

Các dung dịch cố định có rất nhiều, mỗi loại dung dịch cố định thích hợp choviệc cố định loại mô và cơ quan khác nhau Vì vậy việc chọn dung dịch cố định phụthuộc mô cần cố định và vào mục đích nghiên cứu Thí dụ như khi nghiên cứu sựphát triển của tuyến sinh dục của cá hoặc tôm hoặc cua dung dịch Bouin thườngđược sử dụng; khi nghiên cứu nhân tế bào người ta thường dùng dung dịch có chứaacid acetic, đối với tôm sử dụng dung dịch cố định Davidsion' AFA là tốt nhất Mặc khác cũng tùy thuộc vào loại thiết bị quan sát (kính hiển vi quang học hay kínhhiển vi điện tử) mà dung dịch cố định mẫu cũng sẽ khác nhau Với kính hiển vi điện

tử dung dịch cố định thường được sử dụng là hỗn hợp của formalin và các aldehyde

khác Aldehyde có tác dụng liên kết protein, trong khi hỗn hợp cồn và acid acetic(được gọi là coagulant) là protein biến dạng hoặc kết tủa protein thành một dạngnhư bọt xốp hay dạng lưới để liên kết các thành phần khác của tế bào.

Phương pháp cố định: Tuỳ theo từng loại mô mà có cách xử lý khác nhau.

Kích thước của mẫu mô có ảnh hưởng đến kết quả cố định Đối với loại dungdịch cố định có khả năng ngấm kém, chiều dầy mẫu mô không quá 1-2 mm Nếudung dịch có khả năng ngấm mạnh và sâu thì chiều dài của mô cũng không quá 5

mm Theo Gabe (1976) chiều dầy của mẫu mô tốt nhất là nhỏ hơn 3 mm Diện tích

bề mặt mẫu mô không ảnh hưởng tới sự cố định

Khối lượng dung dịch cố định: thể tích dung dịch cố định cần lớn hơn nhiềulần so với thể tích mẫu mô (ít nhất 50 lần)

Thời gian cố định: Thời gian cố định phụ thuộc vào từng loại dung dịch,thường dao động từ 4-24 giờ Trên nguyên tắc kéo dài thời gian cố định tốt hơn rútngắn Đối với dung dịch làm giòn mô thì phải đúng thời gian cố định Cố định quádài làm thay đổi tính bắt màu của tế bào Cố định lâu quá làm nhân kém bắt màu

Nhiệt độ cố định: Nhiệt độ cao làm tăng và lạnh làm chậm khả năng ngấm củadung dịch cố định Đối với loại dung dịch cố định dễ bay hơi nên tiến hành ở nhiệt

độ thấp

Khi thực hiện các bước của qui trình mô học cần phải có sự cẩn thận để đảmbảo sự an toàn Quá trình cố định, pha chế hóa chất và nhuộm mẫu tốt nhất thựchiện trong tủ hút Cần mang găng tay, khẩu trang trong suốt quá trình làm việc trongphòng thí nghiệm Acid piric, thành phần chủ yếu trong dung dịch cố định Bouin, làchất dễ nổ khi ở trạng thái khô vì vậy cần giữ trong điều kiện ẩm ướt, tốt nhất là làbảo quản trong nước cất (Brown 1969)

Rửa mô sau khi cố định

Rửa mô sau khi cố định có tầm quan trọng lớn vì chất cố định có ảnh hưởngđến quá trình nhuộm màu và bảo tồn phiến đồ Thời gian rửa bằng thời gian cố địnhnếu rửa bằng nước; hoặc rửa trong cồn 50%; sau đó chuyển sang cồn 7% để bảoquản trong thời gian dài

2 Cắt tỉa và định hướng cho mẫu mô đã được cố định (Trimming and

Orientation)

Mẫu mô đã cố định thường phải được cắt tỉa trước khi đúc khối, việc xác địnhchính xác mẫu (tổ chức mô) cần quan sát không những tiết kiệm được thời gian, chiphí, mà còn làm nổi bật lên cấu trúc của mẫu vật Mẫu mô đã được cố định phải rắnchắc, từng cơ quan riêng biệt hoặc cả một mẫu cá nhỏ có thể được cắt tỉa bằng lưỡidao cạo hoặc dao mổ để đạt được kích cỡ mong muốn và cắt bỏ những mô không có

ý định nghiên cứu hoặc dành cho các nghiên cứu khác Mẫu mô có thể được cắt đôitheo chiều nằm ngang, hoặc cắt thẳng đứng dọc ở giữa

3 Loại nước, làm trong mẫu, ngấm paraffin (Dehydration, Clearing, Infiltration)

Paraffin wax, một loại sáp thường được sử dụng để đúc khối, thì không thểngấm vào trong mô khi có sự hiện diện của nước Vì vậy cần thiết phải loại nước,

có sẵn trong mô và từ các dung dịch cố định, ra khỏi mẫu mô (Preece, 1972; Gabe1976) Việc khử nước phải đảm bảo nguyên tắc là loại bỏ hết nước trong mô ra màkhông làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí của thành phần cấu tạo tế bàotrong mô bị thay đổi Quá trình loại nước được thực hiện bằng cách nhúng mẫu môqua một loạt các dung dịch cồn (ethanol) với các nồng độ gia tăng (10% cho mỗibước) từ cồn 50% đến cồn 80%, sau đó nhúng mẫu vài lần trong cồn 95% và cuốicùng là chuyển sang cồn 100% Thời gian khử nước thay đổi tuỳ theo độ dầy mẫumô

Sau khi hoàn thành quá trình khử nước, cồn cũng cần phải loại ra khỏi mẫu

mô bởi vì cồn không thể hoà lẫn với paraffin (Drury và Wallington 1980, Gabe1976) Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô đó sẽ bị co rút lại, khối mẫu đúc trongparaffin sẽ không đồng nhất, tạo nên những lỗ hỗng trên lát cắt Do đó cần làmngấm vào trong mẫu mô một loại dung môi trung gian có thể hoà tan được parffin

và cồn Quá trình này được gọi là quá trình làm trong (clearing) mẫu vì phần lớncác loại hóa chất sử dụng cho mục đích này thường có chỉ số khúc xạ cao và làmcho mẫu trở nên trong suốt Mục đích chính của bước này là dùng dung môi hoà tanparaffin để đẩy cồn ngấm trong mô ra Dung môi được sử dụng thường là các dungmôi hữu cơ như, xylen, toluen, benzen Xylen là loại dung môi thường được sửdụng nhất do tính thấm nhanh Thời gian làm ngấm dung môi hoà tan paraffin tuỳthuộc vào kích thước mẫu mô, thông thường mẫu mô cần ngâm trong 3 lọ khoảng

từ 30 phút đến 2 giờ

Sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được chuyển sang bước ngấm paraffin(infiltration) Mẫu được ngâm trong các lọ paraffin nóng chảy (57 – 60o) với thờigian thay đổi từ 1 đến 3 giờ tuỳ theo kích thước mẫu mô Đối với những mô ngấmchậm phải kéo dài thời gian ngâm trong paraffin có thể ngâm từ 6 đến 12 giờ Sựngấm paraffin sẽ không thành công nếu quá trình khử nước, khử cồn trong môkhông tốt Việc chuyển mẫu mô qua nhiều lọ paraffin là nhằm mục đích để chodung môi của paraffin trong miếng mô được đẩy ra hết.

Bảng 3.1: Qui trình xử lý mẫu

Từ giai đoạn cố định mẫu đến giai đoạn ngấm paraffin, mẫu mô có thể được

xử lý bằng một trong 2 qui trình: xử lý bằng tay hoặc xử lý tự động bằng máy.Trong các bước xử lý, mỗi bước lập lại có nghĩa là phải có sự thay đổi dung dịch xử

lý Nhiệt độ xử lý mẫu là nhiệt độ trong phòng, trừ các giai đoạn cần thiết xử lý ởnhiệt độ cao

1 Qui trình xử lý bằng tay (Brown 1969)

Paraffin 15 phút ở 60oC 15 phút ở 60oC

Paraffin 15 phút ở 60oC 15 phút ở 60oC

Paraffin 3 giờ ở 60oC 1 giờ ở 60oC

2 Qui trình xử lý mẫu bằng máy tự động (Coolidge và Howard, 1979)

≥ 5 mm < 5 mm < 3 mm < 1 mm

Cồn 80% (ethanol) 30 phút 20 phút 10 phút 5 phút

4 Đúc khối (Embedding)

Trước khi cắt mẫu, mẫu mô phải được giữ chặt trong một khung cố định,thường thì đặt trong khung bằng paraffin Mẫu mô đã được ngấm paraffin tốt sẽđược đặt trong khuôn bằng nhựa hay inox Định hướng miếng mô cho đúng, cẩnthận đổ paraffin nóng chảy vào khuôn Để đảm bảo mẫu được giữ đúng hướng (vi

trí) việc làm lạnh khuôn có thể được thực hiện trong quá trình đúc khối Khi miếng

mô đã được vùi vững chắc vào paraffin, làm rắn paraffin lại bằng cách đặt khuônvào trong tủ lạnh, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn Ngoài paraffin, một vàichất khác cũng được dùng để đúc khối, thí dụ epoxy resin cũng dùng để đúc khốikhi cần quan sát mẫu dưới kính hiển vi điện tử

Trở ngại chính trong quá trình đúc khối paraffin là làm miếng mô co lại,nguyên nhân là do nhiệt độ nóng chảy của paraffin (Bennett & ctv, 1976) Các nhànghiên cứu đã so sánh mức độ ảnh hưởng của chất dùng để đúc khối đến sự thay đổicủa mẫu mô, thí dụ trường hợp của gan cá hồi nếu được đúc khối theo kỹ thuậtthường sử dụng là bằng paraffin thì mức độ co của mẫu mô so với ban đầu khoảng25%, trái lại nếu đúc khối bằng glycol methacrylate thì mẫu mô chỉ co lại khoảng 1-2% (Hampton 1986)

Khi cần phân tích các thể huyền phù trong tế bào bằng kính hiển vi quang họcthì một số kỹ thuật trong qui trình xử lý mẫu sẽ được thay đổi Thí dụ như khinghiên cứu tế bào máu người ta sử dụng phương pháp xét nghiệm kính phết (mẫucủa một chất được phết lên phiến kính để soi trên kính hiển vi) khi đó thì mẫu được

cố định và nhuộm trực tiếp trên phiến kính (Humason 1979) Khi nghiên cứu dịchhuyền phù của tế bào (thí dụ trong nuôi cấy mô), thì quá trình cố định được thựchiện bằng việc thêm một lượng chất cố định bằng thể tích của mẫu cần cố định Saumỗi bước của quá trình khử nước, dịch huyền phù được ly tâm nhẹ để cô đặc tế bào

và nước được gạn chắt khỏi dịch huyền phù Với qui trình này, dịch huyền phùtrong tế bào được loại nước, làm trong, và được đúc khối trong môi trường thíchhợp Tất cả các qui trình tiếp theo được thực hiện theo các bước của qui trình truyềnthống

5 Phương pháp cắt mẫu (Sectioning)

Mục đích của bước này là nhằm cắt mẫu mô thành những lát thật mỏng có khảnăng cho ánh sáng xuyên qua để có thể quan sát bằng kính hiển vi Có nhiềuphương pháp và nhiều loại máy (microstome) để cắt mẫu Máy cắt quay với lưỡidao thép, hay lưỡi dao mỏng đặc biệt thường được sử dụng nhất Có 2 phương phápcắt mẫu thường được áp dụng

Cắt lạnh (frozen sectioning)

Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu mô nhanh nhất và hạn chế được các khiếmkhuyết nhân tạo hình thành trên mẫu mô do ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu

Mẫu được cắt bằng máy cắt lạnh (freezing microtome), thường thì khí CO2 hóa lõngđược dùng để làm lạnh mẫu và máy cắt Tuy nhiên trong phương pháp cắt lạnh, cáclát cắt không tạo thành một dãy băng như khi cắt mẫu đúc trong paraffin, mặt kháckhó có thể cắt thành các lát cắt mỏng hơn 3 µm Formal-saline là chất cố định tốtnhất cho mẫu cắt lạnh, khối mẫu có thể đặt trực tiếp vào máy cắt mà không cần đúckhối Tuy nhiên, trong vài trường hợp, để tránh làm lát cắt vỡ vụn, mẫu mô có thểđược đúc khối trong gelatine hay agar (Drury và Wallington, 1980).

Cắt mô đúc trong khối paraffin

Với máy cắt quay người ta có thể điều chỉnh độ dầy của lát cắt và điều chỉnhhướng của lưỡi dao Lưỡi dao là phần quan trọng nhất trong việc cắt mẫu Muốn cónhững lát cắt đẹp phải có lưỡi dao sắc, nên dùng lưỡi dao có sống dầy để tránh sựrung động khi cắt Quá trình cắt gồm các giai đoạn đoạn:

Chuẩn bị máy cắt

Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặc Độ lệch của lưỡi dao với mặt cắt củakhối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-300 Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắtkhi tay quay của máy cắt xoay tròn, mỗi một vòng xoay thì một lát cắt được hìnhthành

Cắt mẫu

Trước khi tiến hành cắt, phải điều chỉnh độ dầy của lát cắt Có thể bắt đầubằng những lát cắt 10-12 µm Sau khi đã cắt bằng mặt khối nến và đạt đến vị trímong muốn, điều chỉnh độ dầy theo từng nghiên cứu cụ thể, thông thường là từ 4-6

µm Độ dầy lát cắt của hệ thần kinh kể cả tủy sống là 10-20 µm, của thận là 1-2 µm.Nếu việc đúc khối với paraffin được thực hiện tốt, lưỡi dao sắc, nhiệt độ trongphòng thích hợp, các lát cắt sẽ nối tiếp sẽ dính vào nhau thành một dãy băng dài Sựdính thành dãy băng thể hiện sự thành công của kỹ thuật cắt mẫu và là ưu điểm củaphương pháp cắt mẫu đúc trong khối paraffin, đặc biệt là trong các trường hợp cầnnghiên cứu những phiến đồ nối tiếp nhau theo thứ tự

Dán lát cắt vào phiến kính (slide)

Khi dãy băng các lát cắt dài từ 10-15 cm, chúng sẽ được lấy ra khỏi lưỡi daomột cách nhẹ nhàng, cẩn thận bằng cách chèn kim giải phẩu vào giữa lát cắt và daocắt Đặt tạm cả phiến băng lên giấy vẽ đen và tách các lát cắt ra với độ dài thích hợp

(phụ thuộc vào phiến kính hay vào mục đích của nghiên cứu) Sau đó đặt lát cắt nổitrong một chậu nước ấm (40 - 44oC) để giúp các lát cắt giãn thẳng ra trước khi dánvào phiến kính.

Có nhiều cách để dán lát cắt vào phiến kính, cách thông dụng nhất là dán bằngdung dịch Mayer's albumen hoặc gelatin (Luna, 1968; Humason, 1979; Coolidge vàHoward, 1979) Đối với dung dịch albumen, cho một giọt rất nhỏ dung dịch lênphiến kính, dùng tay xoa đều để tạo thành một màng mỏng albumen trên phiến kính.Sau khi làm giản thẳng lát cắt trong chậu nước ấm, nhúng phiến kính vào chậu nước

ấm ngay bên dưới lát cắt Cẩn thận đính một đầu của lát cắt vào phiến kính, điềuchỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính khỏi nước, lát cắt sẽ được dán chặtvào phiến kính Đối với dung dịch gelatin thì đơn giản hơn, cho dung dịch gelatinvào thẳng trong chậu nước ấm (40 - 45oC) lát cắt sẽ được thả nổi trong dung dịchnày và cách dán lát cắt được thực hiện tương tự

Cách chuẩn bị các dung dịch để dán mẫu như sau:

i) Dung dịch Mayer's albumen: lòng trắng trứng và glycerol với tỉ lệ 1:1

theo theo thể tích Trộn đều sau đó lọc qua giấy lọc thô hay bông gòn, quátrình lọc có thể thực hiện nhanh bằng cách nâng nhiệt độ của hỗn hợp lên

55 – 60oC Thêm vào một ít tinh thể thymol để ngăn vi sinh vật phát triển(Kiernan, 1990)

ii) Dung dịch gelatin: Dung dịch 1% gelatin và 1% potassium dichromate

được trộn đều với nhau theo tỉ lệ 1:1 Cho dung dịch này vào chậu nước ấm

để tạo thành dung dịch 0,002% cho mỗi chất (Drury và Wallington, 1980)

Phiến kính cần phải được làm sạch trước khi dán lát cắt vào Sau khi dán látcắt vào tiến hành làm khô phiến kính bằng cách sấy khô phiến kính 12 giờ (1 đêm)trong tủ sấy ở nhiệt độ 37oC, hoặc sấy khô bằng bàn sấy ở nhiệt độ 58-60oC để loại

bỏ paraffin

6 Nhuộm màu (Staining)

Nhuộm màu là một kỹ thuật quan trọng để nghiên cứu tế bào và mô bằng kínhhiển vi Ở tế bào sống, các thành phần cấu tạo tế bào và mô có chỉ số chiết quanggần giống nhau nên khó phân biệt dưới kính hiển vi quang học Khi nhuộm màu,các thành phần này bắt màu khác nhau, tạo ra độ tương phản giữa các thành phần.Mặt khác, mỗi thành phần của tế bào và mô có ái lực đối với một loại thuốc nhuộm

nên khi được nhuộm màu, mỗi thành phần có một màu đặc biệt, căn cứ vào đó người nghiên cứu sẽ phân biệt được chúng.

Có nhiều phương pháp để nhuộm mẫu, tuỳ thuộc mục tiêu nghiên cứu và loại

tổ chức (mô, tế bào) mà có thể áp dụng phương pháp thích hợp Qui trình chung choviệc nhuộm mẫu gồm các bước sau:

i) Loại bỏ paraffin: do paraffin rất khó thấm (hoặc không thấm được) các

loại thuốc nhuộm, nên cần phải loại chúng ra khỏi mẫu Xylen là loại hóachất thường được sử dụng cho mục đích này, mẫu sẽ được nhúng qua các lọxylen trong vài phút

ii) Loại bỏ xylen bằng cồn tuyệt đối: xylen không hòa tan được trong các

dung dịch có nước do đó cần loại xylen ra khỏi mẫu

iii) Xử lý mẫu qua cồn với nồng độ giảm dần: nhằm làm giảm các dòng

nước khuyếch tán, tránh sự co giản đột ngột có thể làm cho mẫu bị vỡ vụn

và tách rời khỏi phiến kính, mẫu sẽ được nhúng qua một loạt dung dịch cồnvới nồng độ giảm dần từ 95, 70, 50% (có thể đến 30%)

iv) Làm cho mẫu ngậm nước: là bước trung gian để chuyển mẫu về cùng

điều kiện với dung môi hòa tan loại thuốc nhuộm được sử dụng đầu tiên.Thông thường nước cất được sử dụng cho mục đích này Trong trường hợpdung môi hòa tan thuốc nhuộm là cồn, chuyển mẫu trực tiếp từ bước(iii) sang dung dịch thuốc nhuộm tại điểm có nồng độ cồn tương đương

v) Nhuộm màu: mẫu được nhuộm bằng 1 dung dịch (đơn chất hay hỗn hợp)

hoặc bằng nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau Thời gian nhuộm mẫu có thể

từ vài phút đến vài giờ tùy vào loại thuốc nhuộm

vi) Khử nước: Hầu hết các trường hợp, lát mẫu cắt trong paraffin phải được

cố định và bảo quản trong một môi trường có thể hòa tan với xylen Vì vậy,cần thiết phải loại nước ra khỏi mẫu bằng cồn trước khi chuyển mẫu sangxylen Hơn nữa lát cắt cũng sẽ không trong suốt nếu việc khử nước khôngtốt, các vết mờ đục và các giọt nước nhỏ xung quanh lát cắt là biểu hiện củaviệc khử nước không hoàn chỉnh

vii) Làm trong mẫu: Mẫu được làm trong và cồn được loại hoàn toàn ra khỏi

lát cắt khi nhúng mẫu vào trong xylen Nếu lát cắt vẫn còn vết mờ đục hay

việc khử nước chưa tốt, cần thiết phải chuyển mẫu trở lại cồn tuyệt đối.Một vài loại thuốc nhuộm như eosin thì có thể hòa tan một ít trong xylenmặc dù không thể quan sát rõ ràng cả sau khi ngâm mẫu vài giờ trongxylen.

viii)Đóng khung: Sau khi nhuộm, phủ một phiến kính mỏng lên trên lát cắt để

bảo quản và duy trì mẫu lâu dài Dung môi dùng để đóng khung thường làloại chất lõng sánh đặc, dễ đông cứng lại và phải thỏa mãn các điều kiện(i) giữ mẫu sạch và trong suốt, (ii) không làm đổi màu sắc hay phản ứng vớiphẩm nhuộm và (iii) giữ cố định phiến kính phủ trên mẫu Độ chiết quangcủa dung môi thì tương đương với độ chiết quang của thủy tinh KeoCanada là loại dung môi thường được sử dụng nhất

Bảng 3.2: Kỹ thuật nhuộm mẫu bằng Mayer's Hematoxylin và Eosin (Hinton, 1990)

1 Mayer's H&E là phương pháp nhuộm thường được áp dụng cho hầu hết các loại tổ chức mô

2 Áp dụng cho mẫu mô được cố định bằng các loại dung dịch cố định thông thường

3 Qui trình nhuộm được tiến hành với mẫu cắt trong paraffin, lát cắt được loại paraffinbằng cách sấy qua đêm ở nhiệt độ 56 – 60oC

4 Phiến mẫu sau khi loại paraffin sẽ được làm ngậm nước theo các bước sau

a Nhúng phiến mẫu vào xylen 2 – 3 phút

b Chuyển sang xylen sạch 1 – 2 phút

c Nhúng trong cồn tuyệt đối 1 – 2 phút

d Chuyển lần lượt sang các dung dịch cồn 95%, 70%, và 50%, 1 phút cho mỗi dung dịch

e Rửa mẫu trong nước cất

5 Chuẩn bị phẩm nhuộm (cần thiết chuẩn bị trước) và nhuộm mẫu

a Mayer's Hematoxylin: Hòa tan 1 g tinh thể hematoxylin trong 750 mL nước cất.Thêm vào 0,2 g sodium iodate (NaIO3); 1 g acid citric và 50 g chloral hydrate.Thêm nước vào cho đủ 1 lít

b Dung dịch chuẩn 1% eosin: 1 g eosin Y, 20 mL nước cất và 80 mL cồn (ethanol)95% Dung dịch nhuộm eosin được chuẩn bị như sau: 1 thể tích dung dịch chuẩn1% eosin + 3 thể tích cồn 80% Trước khi sử dụng thêm vào 0,5 mL acid aceticcho mỗi 100 mL dung dịch nhuộm eosin.

c Nhúng phiến mẫu trong Mayer' s hematoxylin 15 phút

d Rửa phiến mẫu dưới vòi nước 20 phút

e Nhúng phiến mẫu vào dung dịch nhuộm eosin từ 15 giây đến 2 phút tùy vào mức

độ bắt màu của mẫu

6 Chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn 95% (chuyển sang dung dịch mới cho mỗi lần lậplại), mỗi lần 2 phút để rửa hết eosin thừa Quan sát phiến mẫu bằng kính hiển vi,mẫu đạt yêu cầu khi nền mẫu trong và tế bào chất bắt màu từ hồng nhạt đến cam

7 Rửa phiến mẫu lại trong cồn 95% , sau đó chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn tuyệtđối, mỗi lần 2 phút Làm trong mẫu bằng xylen 2 lần mỗi lần 2 phút Sau khi nhuộm,dán phiến kính mỏng lên trên

8 Với phương pháp nhuộm này, nhân tế bào sẽ có màu xanh dương (blue) Vùng tếbào chất với lưới nội chất (tế bào gan, tuyến tụy ngoại tiết) có màu xanh nhạt haytím Phần tế bào chất còn lại sẽ dao động quanh màu hồng sậm

Chương 4PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DINH DƯỠNG CÁ

I Thức ăn tự nhiên của cá

Biswas (1993), chia thức ăn tự nhiên của cá ra thành 4 nhóm chính: sinh vậtphù du (plankton), sinh vật tự bơi (nekton), sinh vật đáy (benthos) và chất vẩn(detritus)

1 Sinh vật phù du (plankton)

Là các loài vi sinh vật (tảo hay động vật có kích thước rất nhỏ) sống trôi nổitrong nước Tùy vào sự hiện diện hay vắng mặt của diệp lục tố (chlorophyll) mà cóthể chia thành 2 nhóm chính: thực vật phù du (phytoplankton) và động vật phù du(zooplankton)

Tùy thuộc vào kích thước, sinh vật phù du lại được chia thành các nhóm (i)sinh vật nổi cực nhỏ (nannoplankton) kích thước nhỏ hơn 0,03 mm; (ii) sinh vật nổinhỏ (microplankton) có kích thước từ 0,03-3 mm; và sinh vật nổi lớn(macroplankton) với kích thước lớn hơn 3 mm (Biswas, 1993)

Plankton thì khác biệt với nhóm neuston (sinh vật màng nước), nhóm các loàiđộng vật sống quanh màng nước chúng có thể sống ở bên trên (epineuston) hay bêndưới (hyponeuston) màng nước Nhóm sinh vật này một số sống thường xuyên ởmàng nước, một số chỉ sống một thời gian (ấu trùng của nhiều loài động vật)

2 Sinh vật tự bơi (Nekton)

Đây là nhóm động vật có kích thước lớn, sống và bơi lội tự do trong các tầngnước của thủy vực Nhóm này bao gồm giáp xác, thân mềm, cá, rắn, cá sấu

3 Sinh vật đáy (Benthos)

Là nhóm sinh vật sống ở nền đáy của các thủy vực, sinh vật đáy có thể là thựcvật đáy (phytobenthos) hay động vật đáy (zoobenthos)

4 Chất vẩn (Detritus)

Thành phần chính của chất vẩn là một giá thể là một mảnh vật chất hữu cơđang phân hủy, ngoài ra còn có vi khuẩn, tảo, nguyên sinh động vật và cả các loàiluân trùng ăn vi khuẩn sống trên giá thể Có 2 loại chất vẩn là chất vẩn lơ lững vàchất vẩn lắng đọng dưới nền đáy (Qasim, 1972) Có nhiều ý kiến khác nhau về giátrị dinh dưỡng của chất vẩn Nhiều tác giả cho rằng chất vẩn là loại thức ăn quantrọng vì nó là thức ăn trực tiếp của nhiều loài cá, đặc biệt là nhiều loài cá ăn đáy(David và ctv, 1969; Karamchandani và Mishra, 1978) Giá trị dinh dưỡng của chấtvẩn chủ yếu là từ tập hợp nhiều loại vi khuẩn sống trên giá thể và các sản phẩm củachúng (Thanh, 1974) Tuy nhiên một số khác thì lại cho rằng giá trị dinh dưỡng củachất vẩn thì không rõ ràng (Prinslow và ctv, 1974; Verigina, 1977)

II Phổ dinh dưỡng

Theo Schaperclaus (1933), thức ăn của cá được chia thành 3 loại: (i) thức ănchính (main food) hay thức ăn tự nhiên (natural food) là loại thức ăn chính yếu mà

cá ưa thích nhất với loại thức ăn này cá sẽ phát triển tốt nhất; (ii) thức ăn phụ(occasional food) là loại thức ăn có giá trị dinh dưỡng tương đối cao, thức ăn nàycũng được cá sử dụng một khi chúng xuất hiện; (iii) thức ăn bắt buộc (emergencyfood) là loại thức ăn mà cá bắt buộc sử dụng khi không có các loại thức ăn khác

Nikolsky (1963), phân chia thức ăn của cá ra thành 4 loại căn cứ trên tầm quantrọng của loại thức ăn đó trong khẩu phần ăn của cá (i) Thức ăn cơ bản (basicfood): là loại thức ăn được cá thường xuyên sử dụng và chiếm tỉ trọng lớn nhấttrong khối lượng thức ăn mà cá ăn vào (ii) Thức ăn thứ cấp (secondary food) là loạithức ăn thường phát hiện trong ống tiêu hoá của cá, nhưng với số lượng ít (iii)Thức ăn ngẫu nhiên (incidental food) chiếm số lượng rất ít trong ống tiêu hóa; (iv)

và thức ăn cưỡng bức (obligatory food) là loại thức ăn được cá sử dụng khi thiếuthức ăn cơ bản

Tùy vào khối lượng của các loại thức ăn được cá sử dụng Nikolsky (1963)chia tập tính dinh dưỡng của cá ra thành các nhóm như (i) cá ăn đơn (monophagic)chúng chỉ ăn 1 loại thức ăn duy nhất; cá có phổ dinh dưỡng hẹp (stenophagic)chúng ăn dược một số loại thức ăn khác nhau; và cá có phổ dinh dưỡng rộng(curyphagic) chúng ăn được nhiều loại thức ăn khác nhau

Tập tính dinh dưỡng của cá cũng có thể được phân chia theo vị trí của chuỗithức ăn (hay loại thức ăn) sẵn có hay nơi mà loại thức ăn ưa thích của cá xuất hiện