Nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ ngãi đen (kaempferia parviflora wall ex baker)

3 Bảng 1.3 Bảng tóm tắt tác dụng sinh học của chi Kaempferia 8 Bảng 1.4 Các flavonoid phân lập từ thân rễ Ngãi đen Kaempferia parviflora Wall... Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của flavonoid

(Kaempferia parviflora Wall.ex Baker)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI- 2017

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS

Vũ Văn Điền–người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho em được thực hiện và hoàn thành khóa luận tại Viện Dược liệu

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Trần Thanh Hà vàcác chị, các bạn tại khoa Hóa thực vật 2- Viện Dược liệu đã hướng dẫn, chỉ bảo nhiệt tình cả về

lý thuyết lẫn thực hành cho em trong suốt thời gian làm nghiên cứu trên Viện

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Thực vật- Trường đại học Dược Hà Nội cùng TS.Trần Thế Bách- Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã nhiệt tình giúp đỡ em nghiên cứu đặc điểm thực vật và xác định tên khoa học của cây Lấu

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đã luôn bên

em, chia sẻ khó khăn, động viên, và giúp đỡ em trong học tập cũng như trong cuộc sống

M C L C

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG i LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ VÂN

1201694

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THÂN RỄ NGÃI ĐEN

(Kaempferia parviflora Wall.ex Baker)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

2 Bộ môn Dược học cổ truyền Trường Đại học Dược Hà Nội

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đỗ Thị Hà và các cán bộ, nhân viên khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cám ơn đến Ths Lê Thị Loan - người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin cảm ơn tới những người đã tài trợ kinh phí cho đề tài "Khai thác

và phát triển nguồn gen cây thuốc Sâm tố nữ (Pueraria candollei Grah ex Benth var mirifica Airy Shaw & Suv.) và Ngải đen (Kaempferia parviflora

Wall ex Baker)"

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn.

i

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Kaempferia 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Đa dạng và phân bố 2

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Tác dụng sinh học và công dụng 8

1.2.Tổng quan về loài Kaempferia parviflora Wall Ex Baker 10

1.2.1.Đặc điểm thực vật 10

1.2.2 Phân bố 10

1.2.3 Thành phần hóa học 11

1.2.4 Tác dụng sinh học 13

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên liệu, dung môi, hóa chất 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2.Dung môi, hóa chất 18

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị, máy móc 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Định tính nhóm chất thường gặp bằng các phản ứng hóa học đặc trưng 19 2.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất từ Ngãi đen 23

2.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 24

CHƯƠNG III - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

ii

3.1 Thực nghiệm, kết quả 25

3.1.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp bằng phản ứng hóa học đặc trưng 25

3.1.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất từ thân rễ Ngãi đen 26

3.1.3 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 31

3.2 Bàn luận 41

3.2.1 Về kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp 41

3.2.2 Về kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc 41

CHƯƠNG IV - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

4.1 Kết luận 43

4.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……….44

PHỤ LỤC

i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13

C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Cacbon 13 Nuclear

Magnetic Nesonance Spectroscopy)

KPE Dịch chiết ethanol của Kaempferia parviflora Wall Ex Baker

MS Phổ khối lượng phân tử (Mass Spectrometry)

3 Bảng 1.3 Bảng tóm tắt tác dụng sinh học của chi Kaempferia

8 Bảng 1.4 Các flavonoid phân lập từ thân rễ Ngãi đen (Kaempferia

parviflora Wall ex Baker) 11

Bảng 1.5 Bảng tóm tắt tác dụng sinh học của thân rễ Kaempferia

Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất có trong dược liệu 25

Bảng 3.2 Bảng so sánh dữ liệu phổ của D4 và

Bảng 3.3 Bảng so sánh dữ liệu phổ của D6 và

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của flavonoid phân lập từ một số loài

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của steroid phân lập từ loài Kaempferia

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của một số flavonoid dạng glycosid phân

lập từ thân rễ Kaempferia parviflora Wall ex Baker 12

Hình 1.9 Cấu trúc hóa học của một số glycosid phân lập từ thân rễ

Kaempferia parviflora Wall ex Baker 13

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học củaβ-sitosterol, daucosterol 13

Hình 3.2 SKLM cao phân đoạn diclomethan sử dụng các hệ dung

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngãi đen có tên khoa học làKaempferia parviflora Wall ex Baker, họ

Gừng(Zingiberaceae) là một loài thảo dược lâu năm Cây phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, Trung Quốc, Malaisia, Thái Lan và Lào [12], [21] Ở Việt Nam loài này mới được phát hiện ở các tỉnh ĐăkLăk, Gia Lai và Thanh Hóa [1] Ở vùng Đông Bắc Thái

Lan, thân rễ của Kaempferia parviflora Wall ex Bakerđã được sử dụng để điều trị

bệnh đường miệng [11], đau bụng, đầy hơi, rối loạn tiêu hóa [36], rối loạn colic, loét dạ dày, tá tràng [37], tăng cường sinh lực và điều trị gút, áp xe [38] Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của

cây Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy loài Kaempferia parviflora

Wall ex Bakercó nhiều tác dụng như chống viêm [24], [25], [34], kháng khuẩn[8], chống dị ứng [35], bảo vệ dạ dày [22], giãn mạch [33], ức chế phosphodiesterase [32], ức chế xanthin oxidase [19].Các nghiên cứu ngoài nước về thành phần hóa học

từ loài Kaempferia parvifloria cho biết nhóm chất chủ yếu gồm flavonoid[10],[25], chalcon, tecpenoid [17],[37] Kaempferia parviflora Wall ex Bakerlà một loài tiềm

năng trong nghiên cứu ứng dụng Tại Việt Nam, mới có một nghiên cứu về thành phần hóa học và thử tác dụng chống oxy hóa và tác dụng độc tế bào thực hiện bởi Bùi Kim Anh và cộng sự (2017)[1] Tuy nhiên, nghiên cứu chưa xác định các nhóm chất chính trong cây, số lượng chất phân lập được còn khiêm tốn so với những nghiên cứu ngoài nước

Xuất phát từ những thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học từ

thân rễ cây Ngãi đen (Kaempferia parviflora Wall ex Baker)” được thực hiện với

mục tiêu sau:

1 Định tính các nhóm chất trong cây bằng phản ứng hóa học

2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất

2

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chi Kaempferia

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan công bố năm 2009 [40], chi

Kaempferiacó vị trí phân loại như sau:

3

Trong nước, chi Kaempferiacó 9 – 10 loài [5] Phân bố của một số loài thuộc

chi Kaempferiaở Việt Nam được trình bày ở Bảng 1.1 [1], [5], [6]

Bảng 1.1 Phân bố của một số loài thuộc chi Kaempferiaở Việt Nam

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc

chi Kaempferia L Kết quả cho thấy chi này chứa các hợp chất chính thuộc nhóm:

tinh dầu [3], [5], [28], [30], flavonoid [3], [41], [42], steroid [42], ester [42], [43]

Bảng 1.2 Bảng tóm tắt thành phần hóa học của chi Kaempferia L

methoxycinnamic, ethyl cinamat và p

ethyl cinamat chiếm tớ

methoxy ethylcinamat, borneol,

u là thành phần điển hình của các loài thuộc chi này

Kaempferia galanga khá cao ( trong khoảng t

các loài khác tương đối thấp như trong thân rễ

chỉ khoảng 0,2 -0,3% [3]

u các loài Kaempferia có sự khác biệt Thân r

thành phần chính là n-pentadecan, camphen, camphor và bornyl

n chủ yếu trongthân rễKaempferia galanga

methoxycinnamic, ethyl cinamat và p-methoxy ethylcinamat, trong đó

ới 30%, ngoài ra còn có n-pentadecan, A3methoxy ethylcinamat, borneol, cineol, aldehyd cinamic [3], [5]

Kaempferia rotunda thành phần chính trong thân r

pentadecan, camphen, cineol [28]

A3-caren o-methoxy ethylcinamat

c chi này [3] Hàm lượng

ng từ 2,4- 3,9%) [3]

ễ loài Cầm địa –

Thân rễKaempferia

pentadecan, camphen, camphor và bornyl

Kaempferia galanga là acid

p-methoxy ethylcinamat, trong đó, hợp chất

ntadecan, A3-caren, camphen,

ất phân lập từ tinh dầu của một số loài thu

ộc chi này, có một số hợp chất thuộc nhóm flavonoid đpinostrobin, pinocembrin, 2’,6’-dihydroxy-

cardamonin, boesenbergin A từ thân rễKaempfevia pandurata

con ở loài Kaempfevia angustifolia Kaempfevia galanga [3]

Kaempfevia pandurata[41], 2-hydroxy-4,

angustifolia [42], kaempferol,

boesenbergin A

trimethoxychalcon

Hydroxy-4,4’,6’-kaempferid|

ột số loài thuộc chi

6

Từ thân rễKaempfevia angustifoliaphân lập được một số lanosta-9(11), 25-dien-3 -ol, and -sitosterol-3-O- -D-glucopyranosid [42]

steroid:(24S)-24-methyl-(24S)-24-methyl-lanosta-9(11),

25-dien-3 -ol -sitosterol-3-O- -D-glucopyranosid

Hình 1.3.Cấu trúc hóa học của steroid phân lập từ loài Kaempferia angustifolia

Hình 1.4.Cấu trúc hóa học của ester phân lập từ loài Kaempferia angustifolia

Theo Lallovà cộng sự (2014),11 ester đã được phân lập từ thân

rễKaempferia rotunda: diepoxycyclohexan- 2,3,4,5-tetrol (1), 2-[(benzoyloxy)methyl]cyclohex-5-en-1,2,3,4- tetrol,1,4-diacetat (2), cretopoxid (3), diepoxyd cyclohexan I,II,III, (–)-6-acetylzeylenol (6), 2-hydroxymethylcyclohex-5-en-1,2,3,4-tetrol,1,4-dibenzoat (7), (–)-zeylenol (8), 2-acetylretopoxid B (9), benzylbenzoat (10) [43]

diepoxyd cyclohexan I,II,III

thân rễ Kaempferia parviflora Wall ex Baker

daucosterol

u trúc hóa học của kaempfolienol, panduratin A

ng sinh học và công dụng

ợc sử dụng theo kinh nghiệm dân gian tại nhi

ã được nghiên cứu

ex Bakerphân lập được 2

panduratin A, β-sitosterol,

i nhiều quốc gia, một sitosterol

R= Glucose: Daucosterol

8

1.1.5.2 Công dụng

Thân rễKaempferia angustifoliadùng trị ho và được sử dụng trong ngành thú

y [3]

Kaempferia rotunda có thân rễ dùnglàm thuốc chữarối loạn kinh nguyệt, đại

tiện ra máu, lở láy,lợi tiêu hóa [3] Phần lá làm thuốc đắp ngoài [3], giúp làm lành nhanh vết thương [3],[6] Ở Trung Quốc, cả cây dùng trị đau dạ dày [3] Ở Indonesia, thân rễ trị đau xương, đau bụng [3]

Theo kinh nghiệm dân gian, Kaempferia galangađược dùng để trị tiêu chảy,

đau dạ dày [3],[6] Ở Philipin, nước sắc thân rễ địa liền chữa ăn uống khó tiêu, sốt rét, lá giã nát hơ nóng, đắp chữa tê thấp [6] Ở Malaysia, thân rễ địa liền được dùng chữa cao huyết áp, lở loét, hen suyễn, cảm lạnh, ho và đau họng [6]

1.1.5.2 Tác dụng sinh học

Có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của chi này, tập trung vào một số

loài như: Kaempferia galanga, Kaempferia parviflora Wall ex Baker, Kaempferia angustifolia…

Bảng 1.3 Bảng tóm tắt tác dụng sinh học của chi Kaempferia

1.1.5.2.1 Tác dụng giảm đau

Trên mô hình gây đau nội tạng bằng cách tiêm dung dịch acid acetic 0,6%,

liều 5g/ kg, dùng đường uống,cao chiết ethanol từ thân rễ Kaempferia galangalàm

giảm 69% số lần xuất hiện cơn đau sau 1 giờ ( p< 0,02)[5]

1.1.5.2.2 Tác dụng chống viêm

9

Trên mô hình gây phù bàn chân chuột cống trắng bằng nhũ dịch kaolin 10%,

Kaempferia galanga có tác dụng chống viêm, dùng dạng cao cồn liều 10g/kg, ức

chế viêm 63,8% hiệu quả hơn dạng cao nước với liều 10g/kg, ức chế viêm 60% (P<

0,02) Tinh dầu và dạng tinh thể chiết từKaempferia galanga cũng có tác dụng chống viêm tương tự [5]

1.1.5.2.3 Tác dụng hạ sốt

Trên thỏ gây sốt thực nghiệm bằng pyrogen chuẩn, liều 5g/kg, đường uống, 2

giờ sau khi dùng cao chiết thân rễ Kaempferia galanga, hạ sốt 0,4 – 0,5ºC so với lô

đối chứng [5]

1.1.5.2.4 Tác dụng kháng khuẩn

Thân rễ loài Kaempferia pandurata ức chế một số chủng vi khuẩn: Streptococcus mutans, Actinobacillus, Actinomycetemcomitans [46] Hợp chất

panduratin A phân lập từ loài này cũng cho thấy tác dụng ức chế đối với một số

chủng: Streptococcus mutans, Streptococcussanguis, Actinomyces viscosus [48], Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes [47] Theo Sukandar và cộng sự, cao chiết ethanol phần thân rễ Kaempferia pandurata có tác dụng ức chế đối với các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus kháng Methicillin, Coagulase Negative Staphylococci kháng Methicillin, Staphylococcus aureus nhạy cảm Methicillin, Bacillus subtilis, Salmonella typhi với MIC tương ứng là 16 ppm, 4 ppm, 8 ppm, 16 ppm, 8 ppm [45]

1.1.5.2.5 Tác dụng chống nấm

Loài Kaempferia panduratacó tác dụng chống nấm trên một số chủng như: Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Mucor sp., Saccharomyces cerevisiae, Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida tropicalis và Torulopsis glabrata[45]

Thân rễ Kaempferia galangacó tác dụng ức chế sự phát triển của một số nấm

thường gây bệnh ngoài da, chất p- methoxycinamic acid ethylester có phổ kháng nấm khá rộng [5]

1.1.5.2.6 Tác dụng giãn mạch

LoàiKaempferia angustifolia có tác dụng gây độc tế bào trên các dòng: tế bào ung

thư bạch cầu, tế bào ung thư vú, tế bào ung thư trực tràng và tế bào ung thư cổ tử

cung Một số hợp chất phân lập từ thân rễ Kaempferia angustifolia được chứng

minh là có tác dụng gây độc với các dòng tế bào ung thư kể trên Kaempfolienol ức chế dòng tế bào ung thư bạch cầu và dòng tế bào ung thư vú với IC50 tương ứng là 24,22 ± 0,30 µg/ml, 23,50 ± 1,70 µg/ml Zeylenol ức chế dòng tế bào ung thư bạch cầu với IC50 là 11,65 ± 0,52µg/ml Zeylenol diacetat ức chế dòng tế bào ung thư đại trực tràng với IC50 là 6,73 ± 0,68 µg/ml [44]

Cao chiết ethanol của Kaempferia galanga có tác dụng độc tế bào đối với tế

bào ung thư cổ tử cung[5]

1.2 Tổng quan Kaempferia parviflora Wall ex Baker

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Ngải đen có tên khoa học làKaempferia parviflora Wall ex Baker,họ

Gừng(Zingiberaceae) là một loài thảo dược lâu năm.Cây có chiều cao đến 90cm, lá mỏng, hình trứng, sáng bóng màu xanh lá cây, cuống lá dài, hoa màu trắng với màu tím nhuốm màu tối hơn ở giữa;mỗi cây có một củ nhiều nhánh, bên trong có màu tím sẫm và có vị đắng [1]

1.2.2 Phân bố

Cây phân bố chủ yếu ở: Ấn Độ, Trung Quốc, Malaisia, Thái Lan và Lào[12], [21] Ở Việt Namloài này được phát hiện ở các tỉnh ĐăkLăk, Gia Lai và Thanh Hóa [1]

1.2.3 Thành phần hoá học

Kaempferia parviflora Wall ex Bakerchứa các nhóm chất chính bao gồm:

flavonoid [10], [17], [25], [37],glycosid [8], [10], steroid [1] Trong đó chủ yếu lànhóm flavonoid với thành phần chính là dẫn xuất 7- methoxy, hàm lượng cao nhất

11

là 5,7-dimethoxyflavon, 5,7,4'-trimethoxyflavon và 3,5,7,3 ', 4'-pentamethoxyflavon [25]

1.2.3.1 Flavonoid

Nhiều hợp chất thuộc nhóm flavonoid đã được phân lập từ thân rễ

Kaempferia parviflora Wall ex Baker[10], [17], [25], [37] Danh sách các

flavonoid được trình bày trong Bảng 1.2

Hình 1.7.Cấu trúc hóa học của chung của các flavonoid trong cây Ngãi đen

Bảng 1.4.Các flavonoid phân lập từ thân rễ Ngãi đen (Kaempferia parviflora Wall

ex Baker)

5-hydroxy-3,7,4’-trimethoxyflavon OCH3 H H OCH3 H

5,3’-dihydroxy-3,7,4’-trimethoxyflavon OCH3 H OH OCH3 H

5-hydroxy-3,7,3’,4’-tetramethoxyflavon OCH3 H OCH3 OCH3 H

3,5,7,3’,4’-pentamethoxyflavon OCH3 CH3 OCH3 OCH3 H

12

5-hydroxy-7,3’,4’-trimethoxyflavon H H OCH3 OCH3 H

5,7,3’,4’-tetramethoxyflavon H CH3 OCH3 OCH3 H

Ngoài các hợp chất kể trên, theo Azuma và cộng sự (2011), thân rễ Ngãi đen còn phân lập được một số hợp chất là flavonoid dạng glycosid: tilianin, tamarixetin 3-O-rutinosid, tamarixetin 3-O-rutinosid [8]

Glc: β-D-glucopyranosyl

Rha: -L-Rhamnopyranosyl Tên chất

Rha1-6Glc CH3 OCH3 OH OCH3

Hình 1.8.Cấu trúc hóa học của một số flavonoid dạng glycosid phân lập từ thân rễ

Kaempferia parviflora Wall ex Baker 1.2.3.2 Glycosid

Chaipech và cộng sự (2012) đãphân lập được một số glycosid từ thân rễ Ngãi

đen:kaempferiaosid A, kaempferiaosid B và 2,4,6-trihydroxyacetophenon 2,4-di-O- β-D-glucopyranosid [10]

Hình 1.9.Cấu trúc hóa học của một số glycosid phân lập từ thân rễ Kaempferia

parviflora Wall ex Baker 1.2.3.3 Các nhóm chất khác

Theo tài liệu [1], từ thân rễ Ngãi đen còn phân lập được 2 steroid:

β-sitosterol, daucosterol Azuma và cộng sự (2011) đã phân lập được một ether từ thân rễ Ngãi đen: ( 2R, 3R)-aromadendrin trimethyl ether [8]

R= H: β-sitosterol

R= Glucose: Daucosterol

( 2R, 3R)-Aromadendrin trimethyl ether

Hình 1.10.Cấu trúc hóa học củaβ-sitosterol, daucosterol, ( 2R, 3R)-aromadendrin

trimethyl ether

1.2.4 Tác dụng sinh học

14

Kaempferia parviflora Wall ex Bakerđã được nghiên cứu và chứng minh có

nhiều tác dụng dược lý bao gồm:chống viêm[24],[25], [34],kháng khuẩn [8], chống

dị ứng[35], bảo vệ dạ dày[22], tác dụng trên tim mạch[33], tác dụng trên hệ sinh

dục [32], ức chế xanthin oxidase[19]

1.2.4.1 Tác dụng chống viêm

Cao chiếtethanol thân rễ Kaempferia parviflora Wall ex Bakerđược chứng

minh là có tác dụng chống viêmtrên mô hình gây phù chân chuột bằngcarrageenanvới IC50 là 9,2 µg/ml [24] Việc sử dụng cao chiếtchloroform và n-hexan liều 150 mg/kg, đường uống cho thấy tác dụng chống viêm sau 3-5 giờ với phần trăm ức chế lần lượt là 25,4% và 25,3%, hiệu quả cao hơn indomethacin liều

10 mg/kg đường uống có phần trăm ức chế là 18,3% sau 3 giờ.Cao chiết ethanol, ethylacetat, nước cũng sử dụng liều 150 mg/kg, đường uống nhưngcho hiệu quả chống viêm thấp hơn với phần trăm ức chế lần lượt là 12,9%, 5,6% và 6,2% sau 3 giờ[24]

Cơ chế chống viêm của KP chủ yếu là do bất hoạt lipopolysaccharidtrên thành tế bào vi khuẩn từ đó ức chế đại thực bào giải phóng các chất trung gian hóa học gây viêm như: nitric oxide, prostaglandin E2, yếu tố hoại tử khối u[25], [34]

Trong các hợp chất phân lập từ cao chiết n-hexan của KP, hợp chất hydroxy-3,7,3 ,4 –tetramethoxyflavon có tác dụng ức chế giải phóng nitric oxidevới IC50 tương ứng là 16,1 µM, hợp chất 5-hydroxy-7,4 -dimethoxyflavon có IC50 là 24,5 µM và 5-hydroxy-3,7,4 –trimethoxyflavon có IC50 là 30,6 µM Ba chất này cho thấy hiệu quả cao hơnL –nitroarginine - một chất ức chếnitric oxide synthase có IC50 tương ứng là 61,8 µM Hợp chất 5-hydroxy-3,7,3 ,4 –tetramethoxyflavon và 5-hydroxy-7,4 –dimethoxyflavon cũng cho hiệu quả cao hơnindomethacin (indomethacin có IC50 là 25,0 µM) Riêng 5-hydroxy-3,7,3 ,4 –tetramethoxyflavon còn thể hiện tác dụng ức chế sự giải phóng PGE2 với IC50 là 16,3 µM [34]

5-1.2.4.2 Tác dụng kháng khuẩn

Caochiết diclomethan và ethyl acetat của Kaempferia parviflora Wall ex

Bakerđược chứng minh có tác dụng kháng khuẩn Bốn hợp chất bao gồm:

15

dimethoxyflavon, 5,3'-dihydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon, 3,5,7-trimethoxyflavon

và 5-hydroxy-7-methoxyflavon cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng

Salmonella typhimurium[8]

1.2.4.3 Tác dụng bảo vệ dạ dày ở chuột

Cao chiết ethanol của Kaempferia parviflora Wall ex Bakercho thấy tác

dụng chống loét dạ dày trên các mô hình chuột được gây loét bởi indomethacin,

HCl / EtOH và stress ngấm nước Việc sử dụng cao chiết ethanol của Kaempferia parviflora Wall ex Bakerđường uống, liều 30, 60 và 120 mg/kg ức chế đáng kể sự

hình thànhloét dạ dày, hiệu quả tương đương với cimetidine liều 100 mg/kg Cơ chế

có thể do cao chiết ethanol của Kaempferia parviflora Wall ex Bakerlàm tăng chất

nhầy – yếu tố bảo vệ dạ dày, từ đó, góp phần ức chế sự hình thành các vết loét trên niêm mạc dạ dày [22]

chế β-hexosaminidase là 5-hydroxy-3,7,3 ', 4'-tetramethoxyflavon với IC50 tương

ứng là 8,0 μM, 5-hydroxy-7-methoxyflavon với IC50 là 20,6 μM và dimethoxyflavonvới IC50 là 26,0 μM[35]

5-hydroxy-7,4'-1.2.4.5 Tác dụng trên tim mạch

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác động của Kaempferia parviflora Wall ex

Bakertrên tim mạch Wattanapitayakul và cộng sự (2008) đã chỉ ra rằng cao chiết ethylacetat của Kaempferia parviflora Wall ex Bakerức chế co thắt động mạch chủ

ở chuột[39] Theo Tep-areenan và cộng sự (2010), cao chiết ethylacetat của

Kaempferia parviflora Wall ex Bakercó tác dụng giãn động mạch chủ ở chuột,

trong đó, hợp chất 5,7-dimethoxyflavon có tác dụng giãn mạch phụ thuộc nồng độ dựa trên cơ chế mở kênh K + và ức chế Ca2 + ngoại bào [33]

1.2.4.6 Tác dụng trên hệ sinh dục

16

Chaturapanich và cộng sự (2008) cũng đã chứng minh rằng lưu lượng máu tới tinh hoàn tăng lên sau khi điều trị dài ngày với cao chiết ethanol của Kaempferia parviflora Wall ex Baker [14].Các dẫn chất 7-methoxy từthân rễ của Kaempferia parviflora Wall ex Bakercó tác dụng ức chếphosphodiesterase:PDE5 và PDE6,

trong đó tác dụng mạnh nhất là 5,7-dimethoxyflavonvới IC50 là 10,64 ± 2,09 μM[32]

1.2.4.7 Tác dụng ức chế xanthin oxidase

So sánh tác dụng ức chế xanthin oxidase của cao chiết từ thân rễ bốn loài

thuộc họ Zingiberaceae: Curcuma longa, Zingiber officinale, Curcuma Zedoaria, Kaempferia parviflora Wall ex Bakerở các nồng độ20, 50, 200 và 500 µg/ml.Chỉ

có cao chiết của hai loài:Kaempferia parviflora Wall ex Bakervà Curcuma longa

cho thấy tác dụng ức chế xanthin oxidase tại nồng độ 500 µg/ml Trong đó,

Kaempferia parviflora Wall ex Bakercho thấy hoạt động ức chế xanthin oxidase (38% ở 500 μg/ml) mạnh hơn so với Curcuma longa(25% ở 500 μg/ml).Một số chất phân lập từ thân rễ Kaempferia parviflora Wall ex Bakercũng cho thấy tác dụng ức

chế xanthin oxidase, tại nồng độ 400 µM,3,5,7,4',5'-pentamethoxyflavonức chế xanthin oxidase 36% và 3',4 ',5,7-tetramethoxyflavonlà 52% [19]

Bảng 1.5 Bảng tóm tắt tác dụng sinh học của thân rễ Kaempferia parviflora

Wall ex Baker

STT Tác dụng Mô hình/ cơ chế Cao chiết/hoạt chất

1 Chống

viêm

-Mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan [23]

Cao chiết ethanol [23]

tetramethoxyflavon, 5-hydroxy-7,4-dimethoxyflavon, 5-hydroxy-3,7,4-rimethoxyflavon [33]

17

typhimurium[7] 5,7-dimethoxyflavon,

5,3'-trimethoxyflavon, 3,5,7-trimethoxyflavon và 5-hydroxy-7-methoxyflavon [7]

Cao chiết ethanol [21]

4 Chống dị

ứng

Ức chế giải phóng

β-hexosaminidase, khi bị kích thích bởi kháng nguyên [34]

Cao phân đoạn n-hexan 5-hydroxy-3,7,3 ', 4'-tetramethoxyflavon, 5-hydroxy-7-methoxyflavonvà 5-hydroxy-7,4'-dimethoxyflavon [34]

18

CHƯƠNG II- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, dung môi, hoá chất

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thu tại tỉnh Thanh Hóa, vào ngày 22/09/2016, được xác định tên khoa

học làKaempferia parviflora Wall.ex Baker, thuộc họ Gừng (Zingiberaceae).Thân

rễđược làm nhỏ, sấy khô ở 50oC, bảo quản trong túi nilong kín để nghiên cứu thành phần hoá học

2.1.2 Dung môi, hoá chất

Dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu thành phần hóa học bao gồm: TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT diazo mới pha, FeCl3 5%, geletin 1%, chì acetat 5%, TT Lugol, dung dịch natri nitroprussiat, TT ninhydrin 3%, ethanol

96%, n-hexan, diclomethan, ethylacetat, methanol, n-butanol, toluen, acid acetic,

acid formic,…

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị, máy móc

Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa thủy tinh, pipet, bình gạn,…

Máy cô quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi), Rotary Evaporator WEV – 1020

Đèn tử ngoại

Cột sắc ký dùng chất hấp phụ là silicagel F254 cỡ hạt 0,04-0,063mm (Merck) Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C

Máy đo phổ:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Brucker Avance 500 Hz (Viện Hóa học)

Phổ khối lượng (MS): Hewlett Packard HP 5890, Serie II

Máy đo nhiệt độ nóng chảy

2.2 Phương pháp nghiên cứu

19

2.2.1 Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp bằng các phản ứng hoá học đặc trưng

Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo các tài liệu[2]

2.2.1.1 Định tính alcaloid

Cho 2g bột dược liệu vào bình cầu dung tích 50 ml Thêm 15ml dung dịch

H2SO4 1N Đun cách thủy 30 phút Để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch ammoniac 6N (khoảng 8 ml) đến pH 9-

10 (thử bằng giấy quỳ) Chiết alkaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml) Gộp các dịch chiết chloroform Lắc dịch chiết chlorofrom với acid H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5 ml) Gộp các dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống nghiệm 1 ml, để làm các phản ứngsau:

Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy

xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dươngtính

Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat,

nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dươngtính

Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử

Dragendoff, nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dươngtính

2.2.1.2 Định tính glycosid tim

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 100 ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24h.Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều Lọc loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1 ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với chloroform (3 lần, mỗi lần 5 ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi, cho từ trên nồi cách thuỷ cho đến khô Cắn còn lại để làm các phản ứng định tínhsau:

Phản ứngLiebermann-Burchardt: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 1 bằng 1

ml anhydrid acetic, lắc đều Nghiêng ống 45o cho từ từ theo thành ống 1 ml H2SO4

20

đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên

màu xanh lá thì phản ứng dương tính

Phản ứngBaljet: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng khoảng 1 ml ethanol

90%, lắc đều, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng

dươngtính

Phản ứngLegal:Hòa tan cắn trong 0,5ml ethanol 90%, lắc kỹ Nhỏ 1 giọt

thuốc thử Natrinitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính

2.2.1.3 Định tính saponin

Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước

Thêm nước cất đến khoảng 10 ml, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát cột bọt thấy cột bọt bền sau 15

phút thì dươngtính

Phản ứng Salkowski: Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm,

nghiêng ống 45o, cho từ từ 2 - 3 giọt H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, mặt phân cách xuất hiện vòng đỏ tím, lắc nhẹ dung dịch có màu đỏ thì dương tính

2.2.1.4 Định tính flavonoid

Phản ứng cyandin: cho 2 ml dịch chiết nước vào một ống nghiệm, thêm một

ít bột magie kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ thì dương tính

Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: cho 2 ml dịch chiết nước vào một ống

nghiệm, thêm 2 - 3 giọt FeCl3 5% , dung dịch có màu xanh sẫm thì dương tính

Phản ứng với kiềm:Nhỏ vài giọt dịch chiết nước lên một mảnh giấy lọc, hơ

khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ ammoniac đặc thấy màu vàng hiện rõ, khi soi dưới đèn tử ngoại thấy có màu vàng sáng thì dương tính

21

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết nước Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sẽ thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1 ml nước cất, tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên thì dương tính

Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi Để nguội rồi quan sát

+ Ống 1: có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng thì phản ứng dương tính

+ Ống 2: trong

Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát + Ống 1: trong suốt thì phản ứng dương tính

+ Ống 2: có tủa đục

Phản ứng chuyển dạng cis-trans: Nhỏ 1 giọt dịch chiết coumarin lên giấy

lọc Nhỏ tiếp 1 giọt NaOH 5%, sấy nhẹ Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại rồi chiếu tia tử ngoại trong 2 phút Bỏ miếng kim loại

ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều sáng như nhau thì phản ứng dương tính

Phản ứng diazo hóa: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết Thêm vào 2ml

dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội Nhỏ vài giọt thuốc thử diazo mới pha, xuất hiện màu đỏ gạch thì phản ứng dương tính

2.2.1.6 Định tính anthranoid

Cho vào ống nghiệm 2 g dược liệu Thêm 5ml dung dịch H2SO41N Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi Lọc nóng dịch chiết vào bình gạn dung tích 50 ml Làm nguội dịch lọc Chiết với chloroform (5 ml) Giữ lớp chloroform để làm phản ứng:

Phản ứng Borntraeger:

22

Lấy 1ml dịch chiết chloroform, thêm 1 ml dung dịch ammoniac Lắc nhẹ, lớp nước có màu đỏ sim Nếu lớp chloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có chứa acid chrysophanic Thêm tiếp từng giọt dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Lớp chloroform mất màu, lớp nước màu đỏ đậm hơn lúc ban đầu

Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Lớp nước có màu đỏ sim thì phản ứng dương tính

2.2.1.7 Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước và cô tới cắn Hòa tan cắn trong 1ml nước và thêm vài tinh thể natri carbonat thấy có bọt khí nổi lên thì dương tính

Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc

Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện màu hoặc tủa xanh đen hoặc xanh nâu nhạt thì phản ứng dương tính

Phản ứng với dung dịch Pb(CH 3 COO) 2 10%: Cho vào ống nghiệm 2 ml

dịch lọc Thêm 2 giọt dung dịch Pb(CH3COO)2 10%, xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương tính

Phản ứng với dung dịch Gelatin 1%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc,

thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%, xuất hiện tủa bông trắng thì dương tính

Phản ứng với đồng acetat: cho vào ống nghiệm dịch chiết dược liệu 2 -3

giọt dung dịch đồng acetat, phản ứng dương tính thì xuất hiện tủa bông

2.2.1.10 Định tính đường khử

Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết nước Thêm vào 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 ml dung dịch Fehling B Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính

Quan sát màu ống 2 đậm hơn ống 1 thì phản ứng dương tính

2.2.1.13 Định tính sterol

Cho vào ống nghiệm một ít cắn dược liệu, hòa tan trong 2 ml chloroform và 1ml anhydrid acetic Để ống nghiệm nghiêng 45o, thêm từ từ H2SO4đậm đặc theo thành ống nghiệm thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì phản ứng dương tính

tăng dần: n-hexan, diclomethan, ethylaetat Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm,

thu được các cao phân đoạn tương ứng

24

- SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254

(Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 366nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96%

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên tính chất cảm quan, các thông số vật lý (nhiệt độ nóng chảy) và các phương pháp phổ bao gồm:phổ khối lượng(MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,13C-NMR,DEPT)và so sánh dữ

liệu phổ thu được với các dữ liệu phổ đã công bố

Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất có trong dược liệu

26

Phản ứng với chì acetat 10% + Phản ứng với đồng acetat +

13 Sterol Phản ứng Liebermann – Burchardat + Có

Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính

(+): Phản ứng dương tính

Kết quả:Định tính các nhóm chất hữu cơ trong rễ của cây Ngải đen

(Kaempferia parviflora Wall ex Baker), nhận thấy dược liệu này có chứa

flavonoid, tanin, đường khử, acid amin, sterol

3.1.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất từ thân rễ Ngãi đen

3.1.2.1 Điều chế các cao chiết

571,05g thân rễ cây ngãi đen chiết với dung môi EtOH 75% bằng phương pháp chiết hồi lưu ở nhiệt độ 65ºC, tỷ lệ 20:1, 2 lần, mỗi lần 3 giờ Lọc, gộp dịch chiết cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 42,2g cao EtOH 75% Cao tổng phân tán trong 500ml nước, chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần hexan, diclomethan, ethylacetat tỷ lệ 1:1, 3 lần, gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được các cao phân đoạn tương ứng hexan (2,49g), diclomethan (3,05g), ethylacetat (3,2g) và phân đoạn nước (33,398g) Sơ

đồ điều chế các cao chiết được trình bày ở hình 3.1

27

Hình 3.1.Sơ đồ chiết xuất các cao phân đoạn

Cao ethylacetat 3,2 g Dịch chiết nước 3

Dược liệu khô

571, 05g

1 Chiết với ethanol 75% (2 lần, 10l/3 giờ/lần)

2 Lọc, cất thu hồi ethanol 75%

Cao diclomethan

3, 05 g Dịch chiết nước 2

Cao nước

33, 398 g

1 Chiết lỏng lỏng với n-hexan

2 Cất thu hồi n-hexan

1 Chiết lỏng lỏng với dichlomethan

2 Cất thu hồi diclomethan

1 Chiết lỏng lỏng với ethyl acetat

2 Cất thu hồi ethyl acetat

28

3.1.2.2 Phân lập các hợp chất

Khảo sát điều kiện sắc ký

Mục đích: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để phân lập chất

Tiến hành: Sử dụng sắc ký lớp mỏng với bản mỏng pha thường tráng sẵn

silisa gel GF254(Merck) đã hoạt hóa, sử dụng các hệ dung môi khác nhau: hệ

n-hexan: aceton (2:1),hệ n-hexan : ethylacetat (2:1, hệ diclomethan : methanol ( 40:1)

để khảo sát sự phân tách các chất

Phát hiện: Quan sát tại bước sóng 254nm và 365nm, phun thuốc thử hiện

màu là dung dịch H2SO4 10% /EtOH 10%, quan sát ở ánh sáng thường

Kết quả: Sau khi khảo sát thấyhệ diclomethan : methanol ( 40:1) cho sự phân

tách tốt nhất

Hình 3.2 SKLM cao phân đoạn diclomethan sử dụng các hệ dung môi khác nhau

(A)hệ n-hexan: aceton (2:1)

Các cao chiết phân đoạn được điều chế như mô tả ở mục 2.2.1 Sau khi khảo sát,

lựa chọn phân đoạn diclomethan để tiến hành phân lập các hợp chất Phân đoạn

Chuẩn bị cột sắc ký: Cân 100g silica gel (cỡ 40-63μm) cho vào cốc thuỷ tinh Thêm DCM vào tạo thành một hỗn dịch, dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho hết bọt khí

Sử dụng cột thuỷ tinh cao 65cm, đường kính 4cm, phía dưới có nhồi bông Đổ DCM lên cột, mở khoá cho dung môi chảy xuống rồi đưa hỗn dịch silica gel trong DCM lên cột Dùng quả bóp cao su gõ nhẹ tới khi không còn bọt khí Dùng đũa thuỷ tinh dàn đều trên mặt silica gel Cho DCM chảy qua vài lần để ổn định cột Đưa hỗn hợp silica gel tẩm chất lên cột Cho lên trên 1 ít bông để tránh bị xáo trộn

bề mặt Giải hấp phụ bằng hệ dung môi DCM-MeOH (100:0-0:100), hứng ống 20ml, kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM pha thường, hệ dung môi n-hexan:ethylacetat(2:1), diclomethan:methanol (40:1) Gộp các ống hứng, cô thu hồi dung môi, thu được 7 phân đoạn, ký hiệu KPD1 – KPD7

Phân đoạn KPD1 (1102 mg)khi cô thu hồi dung môi, thấy xuất hiện tinh thể

hình kim Lọc lấy tinh thể, kết tinh lại nhiều lần bằng aceton thu hợp chất D1 (529 mg)

Phân đoạn KPD2 (302 mg)khi cô thu hồi dung môi, thấy xuất hiện tinh thể

hình kim Lọc lấy tinh thể, kết tinh lại nhiều lần bằng aceton thu hợp chất D2 (73 mg)

Phân đoạn KPD3 (166 mg)khi cô thu hồi dung môi, thấy xuất hiện tinh thể

hình kim Lọc lấy tinh thể, kết tinh lại nhiều lần bằng aceton thu hợp chất D3 (13 mg)

Phân đoạn KPD4 (240 mg)khi cô thu hồi dung môi, thấy xuất hiện tinh thể

hình kim Lọc lấy tinh thể, kết tinh lại nhiều lần bằng aceton thu hợp chất D4 (140 mg)