Nghiên cứu thành phần hóa học thân, rễ và tác dụng kháng nấm của cây bạch hạc

m BỘ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN VÁN NHƯỢNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THÂN, RỄ VÀ TÁC DỤNG KHÁNG NẤM CỦA CÂY BẠCH HẠC ■ ■ ■ (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHOÁ 1998 - 2003) Người hướng dẫn: ThS. NGUYỄN THẾ HÙNG TS. CAO VĂN THƯ Nơi thực hiện: BỘ MÔN Dược HỌC c ổ TRUYỀN BỘ MÔN CÔNG NGHIỆP Dược Thỏi gian thực hiện: 02 —05 / 2003 '?■ ị . m ỵ ỹ , u r iu w } ’ ' HÀ NỘI, 05 - 2003 m íL U O ----- N ĩỷi a Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới : ThS. Nguyễn Thế Hùng. TS. Cao Văn Thu. TS. Nguyễn Mạnh Cường. những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình làm kììoá luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sự giúp đỡ quí báu của các thầy cô giáo, các cô kỹ thuật viên trong Bộ môn Dược học có truyền, phòng li sinh - kháng sinh Bộ môn Công nghiệp dược, phòng Hoạt chất sinh học - Viện Hoá họcTrung tâm khoa học tự nhiên vù công nghệ quốc gia dã tạo diêu kiện giúp dỡ lỏi hoàn thành khoá luận này. Cuối cùng tôi xin được cảm ơn những người thân và bạn bè đã giúp đỡ tôi hoàn thành kìĩoá luận này. Hà Nội ngày 30/05/2003. Sinh viên Nguyễn Văn Nhượng. CÍỘI1Ị> viên MỤC LỤC Trang ĐẶT VÂN ĐỂ 1 PHẦN I- TỔNG QUAN 2 1.1 Bệnh nấm và các thuốc điều trị 2 1.1.1 Đặc điểm của bệnh nấm 2 ỈA .2 Các thuốc thường dùng để chống nấm 3 1.2 Khảo sát sơ bô các cây thuốc có khả năng kháng nấm 4 1.3 Cây Bạch hạc 5 1.3.1 Mô tả cây 5 1.3.2 Phân bố, thu hái, chế biến 5 1.3.3 Thành phần hoá học 5 1.3.4 Tác dụng 10 PHẦN II- THỤC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 11 2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 11 2.1.1 Nguyên vật liệu 11 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 12 2.2 Kết quả và nhận xét 13 2.2.1 Đặc điểm thực vật cây Bạch hạc 13 2.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hoá học 14 2.2.3 Thăm dò tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá Bạch hạc 19 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng kháng nấm của rễ Bạch hạc 23 2.3 Bàn luận 31 PHẦN III- KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 32 PHẨN IV- TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 DANH MỰC CÁC CHỮVIÊT TẮT Dd : dung dịch A . niger : Aspergillus niger c . albicans : Candida albicans s . cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae SKLM : Sắc ký kớp mỏng SK : Sắc ký D/C : Dịch chiết DẶT ván DỂ Nước ta nằm trong vùng nhiệt đỏi gió mùa, có hệ sinh thái thực vật da dạng và phong phú. Từ lâu, nhân dân ta dã biết sử dụng nhiều loại cây cỏ để phòng bệnh và chữa bệnh. Tuy nhiên, có IIÌIÌCLI loại cây thuốc còn dùng trong phạm vi kinh nghiệm dân gian. Vì vậy, việc nghiên cứu các cây thuốc này một cách khoa học nhằm làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian, đẩy mạnh việc khai thác sử dụng, nâng cao tính an loàn, hiệu quả điều trị là một vấn đề cần thiết. Bệnh nấm là một bệnh khá phố biến và hiện nay đang phát triển mạnh. Đặc biệt điều kiện khí hậu của nước la Iiónu ấm rất lliích hợp cho sự phát triển của nấm. Đồng thời còn do những liến bộ trong y học như: chiếu xạ, thay thế phủ tạng, sử dụng nhiều thuốc corticoid và kháng sinh phổ rộng kéo dài, hoá trị liệu ung thư, do HIV...D0 đó, việc tìm thuốc để điều trị bệnh này là một vấn đổ đáng được quail (full. Trước thực tế dỏ chúng tôi dã lựa chọn nghiên cứu một trong số các cây thuốc nam thường được nhân dân ta sử dụntĩ để chữa nấm. Đó ]à cây Bạch ỉ lạc, có lổn khoa học: kl)in;ic;iiill)iis Iiiisuliis (I. ) Kill'/,, họ Ổ rỏ Acanlliíiccíic với các mục tiêu sau: - Thăm dò thành phần hoá học (rong rễ, thân, lá. - Thăm dò hoạt tính chống nấm của rẻ, thân, lá. - Phân lập và nhận dạng các chất có hoạt t ính. Qua đó góp phần làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian trong việc sử dụng cây thuốc này để chữa nấm. Trên co' sở đó từng bước đưa dược liệu vào ứng dụng rộng rãi sau này. I PHẨN I: TỔNG QUAN 1.1. Bệnh nấm và các thuốc điều trị 1.1.1. Đặc điểm của bệnh nấm Bệnh nấm (mycoses) là hậu quả của sự kí sinh của vi nấm ở trên da, niêm mạc, xương khứp, thần kinh và trong các pluì lạng khác. Trong số 100.000 loài vi nấm đã được biếl đến liiộn nay thì đã có tới hàng trăm loài có khả năng gây bệnh cho người. [71. Các nhà vi nấm y học chia các bệnh vi nấm ra làm 3 nhóm chính - [7] : Bệnh vi nấm ngoại biên (superficiel mycoses): bệnh hăm, bệnh viêm giác mạc do nấm, bệnh viêm tai do nấm, bệnh trứng tóc, bệnh lang ben... -Bệnh vi nấm ngoài da (clcrmarlophytoses): bệnh do Microsporum, bệnh do Epidermophyton, bệnh do Trichophyton... -Bệnh vi nấm nội tạng (systemic mycoses): bệnh do Candida, bệnh do Histoplasma, bệnh do Aspergillus, bệnh do Mucor, bệnh do Cryptococcus... Trong vòng khoảng 20 năm trỏ' lụi dây, các bệnh do vi nấm gây ra gia tăng mạnh do mồi trường bị ô nhiễm nghiêm Irọng và do những tiến bộ trong y học. Các bệnh này thường; eặp nhiều ở những người có hệ miễn dịch suy yếu (do ghép CƯ quan, do lioá (rị liệu mm thư, (lo IIIV ...), người tlượe dùng các phương pháp điều trị xâm nhập (đặt ống dẫn lưu bay những dụng cụ ngoại lai ...) [lj. Đen nay, những bệnh vồ nam cỏ lý lộ cao và là nguyên nhân gây lử vong quan trọng tronụ sô hộnli nhân Iiltập viện. Tíìn suât của bệnh nâm Candida tăng lên 10 lần và trở thành một quần thề phân lập được trong máu hay gặp thứ tư. Bệnh nấm Aspergillus xám nhập ở phối là nguyên nhân chủ yếu gây tử vone; ỏ' bệnh nhân e,hép tuỷ [ 11. Nhiều trường hợp nhiễm nấm cơ hội không thể chẩn đoán dirực bằiiíi pillion 12, pháp nuôi cay máu thông tỉurờng và chỉ được điều trị theo kinh nghiệm ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch nghiêm trọng.[l] 1.1.2. Các thuốc thường dùng đ ể chống nấm Theo cấu trúc hoá học các thuốc chống nấm được phân chia thành các nhóm trong bảng sau: Bảng ] : Các thuốc thường dùng để chống nấm.[24], STT Nhóm thuốc 1 Polyen 2 3 4 5 Nystatin Amphotericin B Piramicin Naftitine Allyamin Terbinifine Thiocarbamat Tolnaftat Tương tự nucleotide Azole 7 Bcnzofuran Grisovin Pyrimidine 8 Diamidine 9 Antifonate 6 Tên thuốc Cơ chế tác dụng Huỷ hoại tính bán thấm của màng tế bào ức chế sự tổng hợp chất ergosterol của màng tế bào nấm. ức chế sự tổng hợp chất ergosterol của màng tế bào nấm. ức chế tổng hợp thành tế bào. Nikkomicin Polyoxin Butoconazole Clotrimazole Econazole Fluconazole Itraconazole Kctoeonazolc Miconazole Oxiconazole Sulconazole Terconazole Tioconazole Griscofulvin ức chế sự tổng hợp chất ergosterol có trong màng tế bào nấm. ức chế quá trình phân chia nhân 5- Fluorocytosine ức chế quá trình tổng hợp a.nucleic Tác động lên chức năng a.nucleic Pentamidine Isothionate Trimethoprim/ Sulfamethoxazol 3 ức chế sự tổng hợp a.nucleic Hình 1: Vị trí tác dụng của một số thuốc chống nấm.[l] Tổng hợp thành tế bào . Polyoxin . Nikkomycin Chức năng màng . Amphotericin B . Nystatin Chức năng acid nucleic . Fentamidin \ Tổng hợp ergosterol . Azol . Allyamin .Thiocarbamat \ Phân cilia nhân. . Griseofulvin , Benomyl Tổng hợp acid nucleic . 5 Fluorocytosin . Trimethoprim . Sulphamethoxazol Tổng họp Protein . Blasticidin . Sinefulgin ,1.2 Khảo sát so bộ các cây thuốc có khả năng kháng nấm: Các cây thuốc có tác dụng kháng nấm tương đối phổ biến và có mặt ở nhiều họ thực vật. Theo các tác giả Đỗ Tất Lợi [18], Phạm Hoàng Hộ [16], Võ Văn Chi [12] và tài liệu của Viện Dược liệu, trong hệ cây thuốc Việt Nam có khoảng 59 họ và 150 loài thực vật có khả năng kháng nấm, trong đó có nhiều cây đã xác định được hoạt chất kháng nấm. Ba họ thực vật có số loài có tác dụng kháng nấm nhiều nhất là: -Họ Đậu(Fabaceae) - có 14 loài. -Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) - có 12 loài. - Họ Cúc (Asteraceae) - có 9 loài. 4 1.3. Cây Bạch hạc Cây Bạch hạc còn có tên là Kiến cò, cây lác, chòm phón (Nùng), Nam uy linh tiên, có tôn khoa học Rhinacantluis nasutus (L.) Kurz họ Ôrô Acanthaceae. [12, 13, 17, 18]. 1.3.1. Mô tả cây Cây nhỏ mọc thành bụi, thân đứng cao l-2m có nhiều cành. Thân non có lông mịn, lá đơn, nguyên, mọc đối, phiến lá hình trứng thuôn dài, phía cuống tù, đầu nhọn, dài khoảng 2-9cm, rộng khoảng l-3cm, mặt trên nhẵn, mặt dưới hơi có lông mịn. Hoa nhỏ màu trắng, mọc thành xim ở kẽ lá hay đầu cành, nom dáng như đàn hạc bay, nên gọi là Bạch hạc. Lá bắc hình chỉ, có lông. Đài 5, hình chỉ, có lông, gần đều nhau, rời từ gốc. Tràng hoa màu trắng hay hoa cà điểm hồng, ống tràng đài, phía trên xẻ hai môi khác nhau rõ rệt: môi trên hình mác xẻ 2, môi dưới khía 3 thuỳ . Nhị 2, bao phấn 2 ô, hướng trong, không có nhị lép, bầu trên. Quả nang dài, có lông, phía dưới dẹt lép, phía trên chứa 4 hạt, có khi chỉ có 2 hạt. Hạt hình trứng hai mặt lồi. 1.3.2. Phân bố, thu hái, chế biến Cây Bạch hạc mọc hoang ở nhiều tỉnh miền Bắc nước ta, còn thấy mọc ở Ấn Độ, Malayxia, Thái Lan, Đông châu Phi. Cây Bạch hạc có khi được trồng làm cảnh, thường được trồng bàng cành, gốc, rễ vào mùa xuân. Bộ phận sử dụng: cành, lá (thường dùng tư ơ i), rễ (tươi và khô ). Có thể thu hái quanh năm, nhưng tốt nhất là vào mùa đông. [12,13,17,18] 1.3.3. Thành phần hóa học 1.3.3.1. Các nhóm chất đã được xác định * Rễ chứa các nhóm chất: alkaloid [27], benzennoid [26, 27, 28], steroid [25, 26], quinoiđ [21, 23, 25, 27, 28], triterpen [25, 26], flavonoid [27, 28], coumarin [27, 28]. * Thân và lá chứa các nhóm chất: triterpen [26], quinoicl ị20, 261, benzenoid [26J, steroid 127]. * Hoa chứa Rutin và Quercetin [22]. 5 Bảng % : Các hợp chất lioá học đuọc phân lập từ Rhinacanthus nasutusịL.) Acanthaceae ị 19-23, 25-28] STT Tên chất Nhóm chất Bộ phận cây Tên nước 1 Allantoin Alkaloid Rễ Đài Loan 2 Amyrin, beta Tri terpen Lá, thân Đài Loan 3 Daucosterol Steroid Rễ Đài Loan 4 Glutinol Triterpen Lá, thân Đài Loan 5 Lupeol Tri terpen Rễ Đài Loan Lá, thân Đài Loan Hàm lượng (%) 0,17241 0,01194 6 Oroxylin A FI avon Rễ Đài Loan 0,000206 7 Praeruptorin. Coumarin Rễ Đài Loan 0,00013 8 Rlỉinacanlhin A Quinoitl RỒ Đài Loan 0,00333 9 Rhinacanthin B Quinoid Rễ Đài Loan 0,01724 10 Rhinacanthin c Quinoid Thân Thái Lan 0,005 RỖ Đài Loan 0,11379 Thân Thái Lan 0,0007 RỖ Đài Loan 0,00255 11 Rhinacanthin D Quinoid 12 Rhinacanthin E Lignan Thân, lá Thái Lan 0,00079 13 Rhinacanthin F Lignan Thân, lá Thái Lan 0,00048 14 Rhinacanthin G Quinoid Rễ Đài Loan 0,00462 15 Rhinacanthin H Quinoid Rễ Đài Loan 0,00275 16 Rhinacanthin I Quinoid Rễ Đài Loan 0,00372 6 17 Rhinacanthin J Quinoid Re Đài Loan 0,00151 18 Rhinacanthin K Quinoid Rễ Đài Loan 0.00172 19 Rhinacanthin L Quinoicl RỖ Đài Loan 0.000206 20 Rhinacanthin M Quinoid Rễ Đài Loan 0.00365 21 Rhinacanthin N Quinoid Rễ Đài Loan 0,00117 22 Rhinacanthin 0 Quinoid Rễ Đài Loan 0,00034 23 Rhinacanthin p Quinoid Rễ Đài Loan 0,00006 24 Rhinacanthin Q Quinoid Rễ Đài Loan 0,000206 25 Rhinacanthon Quinoid Thân, lá Ấn Độ 0,00933 Rẽ Đài Loan 0,00020 0,04 26 Rutin Flavonol Hoa Ấn Độ 27 Sitoaterol, beta Steroid Rễ Đài Loan Lá, thân Đài Loan RỖ Đài Loan Lá, thân Đài Loan 28 29 Stigmasteron Syringaldehyd Steroid Benzenoid Rễ Đài Loan 0,00013 Rễ Đài Loan 0,00013 30 Syringic acid Benzenoid Lá, thân Đài Loan 31 Umbelliferon Benzenoid Lá, thân Đài Loan 32 Vanillic acid Benzenoid Lá, thân Đài Loan 33 Wogonin FI avon Rễ Đài Loan 0,000345 Rễ Đài Loan 0,00034 7 I J .3.2.Cấn trúc lióa liọc did mội sô hợp cIkÍI a. Nhóm Naphtopyran: /O J Ị^ j ' ị, u o K illin ’’ kh iiiin iinlhin A, B, í hức (R) Ti ll c hill -OH Rhinacanlhin A _ > ° _ v ° o Rhinacanthin 0 / Ó Rhinacanthin p 1 ò h ° / Ọ / Rliinacanlhin B OH b. Nhóm Naphtoquinon o Khung chung 8 o, p. '{ ^ ° y ' L () As./ Rhinacnnthin D Rhiiiacaiilliin 11 Rliiiiacaiilhii) ( ì o Rhinacnnthin c Nhóm thế R Ten chất Nhóm thế R / Tên chất II 011 0 Rliinacanlliiii J Khinacanthin 1 0 -. Y(.. OH 1 Ỵ L^ / U- L If0 0 OH Rhinacanthin L Rhinacanthin K 0 0 OH 0H OMe Rhinacanthin M Rhinacanthin N 0 X H2OOC JốO 0H OMe Rhinacanthin Q CII,,OCX'. r Ị o OMe c. Nhóm Lignan 9 1.3.4. Tác dụng ì .3.4.1. Tác dụng dược lý Các nghiên cứu với dịch chiết toàn phần cũng như các phân đoạn và các chất chiết được từ Bạch hạc cho thấy nó có những tác dụng sau: - Kháng nấm [12, 13, 17-19, 27, 28] - Kháng virus [19, 27, 28] - Kháng vi khuẩn [4] - Chống ung thư [27, 28] - Chống tăng huyếl áp [12, 13, 17, 18] 1.3.4.2. Công dụng và cách dùng theo y học cổ truyền a. Rề Vị đắng, tính ấm. Qui kinh can, phế, tỳ. Tác dụng thông kinh lạc, trừ phong thấp, sát trùng ngoài da. 1111 *1* Dùng trong: Ngâm rượu đê uống có tác dụng tiêu thũng thống, chữa khí hư, bạch đới, phong thấp tê bại, đau lưng, nhức gân xương. Có thể dùng 6-12g/ngày dưới dạng thuốc sắc. [11] ♦> Dùng ngoài: Chữa hắc lào và một số bệnh ngoài da nhu' chốc, lở, mụn rộp (herpes), eczema mãn tính. Đem rễ thái nhỏ, ngâm rượu hoặc dấm, sau 7 ngày lấy dịch bôi lên chỗ bị bệnh. Bôi liên tục 10-15 ngày. Có thể thêm bột long não và dịch quả chanh ( tỉ lệ lOg rễ bạch hạc với lg bột long não và nửa thìa chanh) tác dụng càng tốt hơn. [12, 13, 17, 18] b. Thân, lá [12, 13, 18] Thường dùng trị: *1* Lao phổi khởi phát, viêm phế quản cấp và mạn Cách dùng: thân và lá bạch hạc 20g sắc nước cho thêm đường uống. ♦♦♦ Huyết áp cao: Liều dùng 9-15 g dạng thuốc sắc. *1* Dùng ngoài trị hắc lào, lở ngứa, eczema. Lấy lá cây tươi đắp hoặc nấu nước rửa, giã một lượng vừa đủ lá cây tươi, them cồn 70° hoặc dầu hỏa ngâm 7 ngày rồi đem dùng ngoài. 10 PHẨN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu. 2.1.1 Nguyên vật liệu. 2.1.1.1 Nguyên liêu. Nguycn liệu nghiên cứu là cây hạch hạc thu hái ở trung tâm trồng và chế biến cây thuốc của Viện Dược liệu. Cây đã được giáo sư Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học là Rhinacanthus nasutus (L.) Kurz Acanthaceae. Thu hái cây vào tháng 2 lúc cây dang ra hoa và tlưực 2 năm sau khi Irổng. Cây sau khi thu hái tách riêng rễ, thân, lá. Sau đó rửa sạch, hong khô. Sấy ở 110°c trong 10 phút để diệt men. Sấy khô dược liệu ở 60°c. Tán dược liệu thành bội, bảo quản hột dược liệu trong, bình Ill'll Ảm dể làm thí nghiệm. 2.1.1.2 Hoá chất và dung cu thí nghiêm. Các dung môi, hoá chất và thuốc thử dùng trong ngiên cứu đạt tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam. - Máy xác định độ ẩm dược liệu Precisa HA60 (Thụy Sỹ) - Nồi hấp tiệt trùng Hyrayama (Nhật). - SKLM dùng ban mỏng tráng san Ỉ \ V( của Merck (Đức). - SK cột dùng chất hấp phụ silicagel cỡ hạt 5-40 |Limcủa Viện Kiểm nghiệm. 2.1.1.3. Vi nấm kiểm đinh và mồi trường dinh dưỡng. *Vi nấm kiểm định. - Candida albicans CIDV 216. - Saccharomyccs ccrcvisiae DĨPC I 12. - Aspergillus niger DIPC 109. ♦ Môi trường dinh dưỡng. ♦ Môi trường Sabouraud lỏng (MT1) Pepton 10, Og. Glucose: 20,Og Nước cất vđ 1000ml. pH = 5,8 ± 0,2 ♦ Môi trường Sabouraud đặc (MT2) Nước cất vđ: 1000ml Pepton 10, Og. pH = 5,8 ± 0,2 Glucose: 20,Og. Thạch 16,0g. Các môi trường được hấp tiệt trùng ở 0.9alm/ 30 phút. 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 2.1.2.1. Phương pháp đinh tính các nhổm chất hữu cơ trong dươc liêu Tiến hành theo phương pháp của các tài liệu: [2, 3, 14] 2.1.2.2. Phương pháp khuếch tán trên thach Nguyền tắc: Các khoanh giấy có tẩm dịch chiết được đặt trên mặt đĩa thạch dinh dưỡng đã cấy vi nấm chỉ thị. Các hoạt chất có trong dịch chiết sẽ khuếch tán vào mỏi trường, tiêu diộl hoặc ức chế vi nấm pliát triển tạo thành vòng vô nấm có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ của các hoạt chất. Khả năng kháng iiAìn của (lịch cliicí được thổ liiỌn bằng đường kính vòng vỏ nấm. Các phần dịch chiết của rễ, thân, lá được thử định tính kháng nấm bằng phương pháp này. 2.1.2.3. Phương pháp phủ thach trưc tiếp lẽn bản sác ký lớp mòng Phương pháp này được áp dụng để tìm các vết có hoạt tính kháng nấm. Tiến hành: đưa dịch chiết lên bản mỏng và khai triển bằng hệ dung môi n-hexan : EtOAc [7:3], bản mỏng để khô tự nhiên, soi u v để đánh dấu các vết. Phủ thạch đã trộn vi nấm chỉ thị (C. albicans). Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các vết thông qua vòng vô nấm xuất hiện ở các vết. 2.1.3.4. Phương pháp phân lâp chất cổ hoat tính * Sắc ký cột: được áp dụng để tách các chất ở phần dịch chiết ether dầu của rễ. Dùng silicagel cỡ hạt 5-40 |»im làm chất hấp phụ và dung môi rửa giải là hệ n-hexan : EtOAc (10:0 -» 0:10). * Dùng SKLM để kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập được và đối chiếu với các vết có hoạt tính . 2.1.3.5. Xác đinh cấu trúc của chất phân lâp dươc Dựa trên các phổ: ‘H - NMR, l3C - NMR, có tham khảo phổ của các chất đã được phân lập. 12 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 2.2.1. Đặc điểm thực vật cây Bạch hạc Rhinacanthus nasutus(L.) Kurz Acanthaceae. Đã tiến hành quan sát hình thái thực vật cây Bạch hạc được trổng làm thuốc ở trung tâm trồng và chế biến cây thuốc ở Văn Điển của Viện Dược liệu. Cây nhỡ, cao khoảng l-2m, thường mọc thành bụi. Lá đơn, nguyên, mọc đối, phiến lá hình ti ứng dài khoảng 2-9cm, rộng khoảng l-3cm. Hoa nhỏ mẩu trắng, mọc thành xim ở kẽ lá. Hoa không đều, lưỡng tính. Lá bấc hình chỉ,có lông. Đài 5, hình chỉ, có lông, gần đều nhau, rời từ gốc. Tràng hoa màu trắng, ống tràng dài, phía trcn xỏ 2 môi khác nhau rõ rệt: môi trên hình mác xẻ 2, môi dưới khía 3 thuỳ. Nhị 2, bao phấn 2 ô, hương trong, nhị dính vào ống iràng, không có nhị lép, báu trên. Quan sát cây ở hình 2. Ảnh 1: Cành mang hoa của cây Bạch hạc 13 2. 2 . 2. Đ ịn h tín h c á c I1Ỉ1ÓI11 cliấl h ữ u cơ pliiỉn II'IIJH lioíí học * Định tính alkaloid. Cho khoảng 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch NH4OH 6 N. Sau 30 phút cho 15 ml chloroform vào, đậy kín. Ngâm 12h, gạn dịch chloroform vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ với dd H2S041N, gạn lấy dịch chiết acid, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống lml.Tiến hành các phản ứng với thuốc thử tạo tủa chung của alkaloid: TT Mayer, TT Bouchardat, TT Dragendorff. Dịch chiết rễ cho kết quả dương tính, dịch chiết thân và lá cho kết quả âm tính. Kết luận: rễ có alkaloid, thân và lá không có alkaloid. * Định tính anthranoỉd. - Phản ứng Bornlracgcr Lấy 3 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml. Thêm 40 ml dung dịch H2S04 2 N, đun sôi cách thuỷ trong vòng 15 phút. Đổ nguội, lọc lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc với 5ml ether ethylic, gạn lấy lớp ether ethylic. Tiến hành phản ứng Borntraeger với dd NaOH 10%. Nhận thấy lớp nước của 3 dịch chiết có màu đỏ sim. Kết luận: rễ, thân, lá có anthranoid. * Định tính saponin. - Phản ứng tao bot Cho vào ống nghiệm to lml dịch chiết ethanol của bột dược liệu. Thêm 5ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, để yên trong 15 phút. Nhận thấy cột bọt của cả 3 dịch chiết đẻu cao và bền vững. Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá. - Phản ứng Liebermann- Burchardt Cho lml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm. Bốc hơi tới cắn. Hoà tan cắn bằng chloroform. Thêm hỗn hợp để lạnh ở 0°c (lml anhydric acetic + lml chloroform + 1 giọt H2S04 đặc), nhận thấy xuất hiện màu hổng ở cả ba mẫu thử. Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá. 14 - Phản ứng Salkowski Cho lml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm. Bốc hơi tới cắn. Hoà tan cắn bằng 1till chloroform. Thôm từ lừ Iml acid II2S 04 đặc llieo (hành ống nghiệm. Nhận thấy xuất hiện vòng màu hồng ở cả ba mẫu thử. Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá. Kết luận: rễ, thân, lá có saponin. * Định tính Tanin. Cho vào bình nón dung tích 100ml khoảng 5g bột dược liệu, thêm 20ml nước cất đun sôi trên bếp qua lưới amiăng trong thời gian khoảng 5 phút, lọc nóng, dịch lọc được làm các phản ứng: - Phán ứng với dd FcCU 5% Lấy Iml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọl dd FeCl3 5%. Thấy xuất hiện màu xanh ở cả ba mẫu thử. - Phản ứng với dd gelatin 1% Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm, them vài giọt dd gelatin ỉ %. Thấy xuất hiện tủa bông trắng ở cả ba mẫu thử. Kết luận: rễ, thân, lá có tanin. * Định tính Flavonoid. - Phản ứng Cvanidin Cho lml địch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại và vài giọt acid HC1 đặc, đun nóng trên nồi cách Ihuỷ. Nhận thấy mẫu thử thân có màu vàng, phản ứng âm tính. Mãu thử rễ, lá xuất hiện màu hồng đỏ, phản ứng dương tính. - Phản ứng vứi kiém Cho lml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm thêm vài giọt dd NaOH 10%. Nhận thấy mẫu thử rễ cho màu đỏ, mẫu thử lá có màu vàng đậm, mẫu thử thân không phản ứng. 15 - Phản ứng với dd FeCU 5% Cho Iml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm vài giọt dd FeCl3 5%. Mẫu thử rễ, lá xuất hiện tủa xanh đen. Mẫu thử thân không thấy phản ứng xảy ra. Kết luận: rễ, lá có ílavonoid, thân không có flavonoid. * Định tính Coumơrin. Chiết nóng khoảng 5g bột dược liệu bằng cồn 90°, lấy dịch chiết cồn làm các phản ứng định tính. - Phản ứng mở đổng vòng lacton + Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống lml dịch chiết. ống 1 thêm 0,5rnl dd NaOH 10%. ống 2 để nguyên. + Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi- để nguội. Nhận thấy: ống 1 của 3 mẫu thử đều đục vàng, ống 2 của 3 mẫu thử đều trong + Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều. Nhộn thấy: ống I: của 3 mẫu thử đều írong suốt. ống 2: của 3 mẫu thử đều có tủa đục. + Acid hoá ống 1 bằng 2 giọt HC1 đặc thấy ống 1 trở lại đục như ống 2 ở cả ba mẫu thử. Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá. - Soi huỳnh quang dưới ánh sáng u v Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên trên giọt đó 1 giọt dđ NaOH 10%. Để khô rồi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại thấy có huỳnh quang ở cả 3 mẫu thử. Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá. Kết luận: rễ, thân, lá có coumarin. * Định tính acid hữu cơ. Cho lg dược liệu vào ống nghiệm, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội, lọc. Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2C 03. Không thấy có bọt C 0 2bay lên ở cả 3 mẫu thử. Kết luận: rễ, thân, lá không có acid hữu cơ. 16 * Định tính đường khử. Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10mlcồn. Đun cách thuỷ 10 phút, lọc. Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ,thêm3 giọt thuốc thử Feling A và 3 giọt thuốc thử Feling B, đun cách thuỷ trong 10 phút, thấy có tủa đỏ gạch ở cả 3 mẫu thử. Phản ứng dương tính với cả ha dịch chiết rễ, thân, lá. Kết luận: rễ, thân, lá có đường khử tự do. * Định tính chất béo. Chiết bằng dụng cụ Soxhlct trên nồi cách thuỷ khoảng 5g bộl dược liệu với dung môi ether dầu hoả, cất thu hồi bớt dung môi, dịch chiết đậm đặc được dùng làm phản ứng định tính. Chấm 3 giọt dịch chiết đậm đặc trôn giấy bóng mờ, hơ trên bếp điện đến khô, không thấy để lại vết mờ ở cả 3 mẫu thử. Kết luận: rễ, thân, lá không có chất béo. * Định tính Carotenoid. Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết ether dầu hoả. Đun cách Ihuỷ cho bay hơi hết dung môi. Thêm 2 giọt H2S04 đặc, không thấy xuất hiện màu xanh lá ở 3 mẫu thử. Kết luận: rễ, thân, lá không có carotenoid. * Đinh tính phytosterol Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết ether dầu hoả. Bốc hơi dung môi đến khô, cho vào ống nghiệm lml anhydric acetic, lắc kỹ, thêm 1ml H2S04 đặc theo thành ống nghiệm. Thấy ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng của mẫu thử thân và lá xuất hiện một vòng tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh. Mẫu thử rễ không xảy ra phản ứng. Kết luận: lá, thân có phytosterol; rễ không có phytosterol. Kết quả định tính các thành phần hoá học bằng phản ứng trong ống nghiệm được tóm tắt ở bảng 3. 17 Bảng 3: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cây TT 1 Anthranoid 3 Saponin 4 5 6 thuốc thử Tanin Flavonoid Coumarin Rễ Thân Lá - Phán ứng với thuốc thử Maycr + - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat + _ _ - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff + — — +++ ++ ++ - Phản ứng tạo bọt ++ ++ +++ - Phản ứng Liebermann-Burchard H—h ++ +++ - Phản ứng Salkowski ++ ++ +++ - Phản ứng với dung dịch FeCỈ3 5% ++ ++ ++ - Phản úng với dung dịch Gelatin 1% ++ ++ ++ - Phản ứng Cyan id in ++ - Phản ứng với NaOH 10% + _ ++ - Phản ứng với FeCl3 5% ++ — ++ - Phản ứng mở đóng vòng lacton ++ ++ ++ - Soi huỳnh quang ƯV ++ ++ ++ -- — — ++ ++ ++ -- — — Alkaloid 2 Kết quả Phản ứng định tính với các Nhóm chất Phản ứng Borntraeger _ ++ 7 Acid hữu cơ - Phản ứng với Na2C 0 3 8 Đường khử - Thuốc thử Fehling (A+B) 9 Chất béo - Để lại vết mơ trên giấy bóng 10 Carotenoid - Phản ứng với H2S04 đặc -- — — 11 Phytosterol - Phản ứng Liebermann — ++ +++ Ghi chú: - (+) : Phản ứng dương tính. - (+++): Phản ứng lên rất rõ. - (++) : Phản ứng lên rõ. - (-):Phảnứngâmtín Nhân xét: kết quả thu được từ các phản ứng định tính sơ bộ trong ống nghiệm cho thấy: Rễ có chứa alkaloid, anthranoid, saponin, tanin, flavonoid, coumarin, đường khử. ThAn có chứa anlliraiioid, saponin, lanin, coumarin, dường khử, phytosterol. Lá có chứa anthranoid, saponin, lanin, riavonoid, coumarin, đường khử, phytosterol. 2.2.3. Thăm dò tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá Bạch hạc. 2.2.3.1. Chuẩn bị. Tiến hành chiết xuất dược liệu với các dung môi ether dầu hoả, methanol 80%, nước cất. Các dịch chiết lọc qua bông và được cô đặc đến tỷ lệ 1:1 theo sơ đồ 1: Sơ đổ 1: Sư dồ cliiêi xiiâl cltrực liệu R|, T|, L,: dịch chiết ether dầu của rễ, thân, lá. R2, T2, L2: dịch chiết Methanol của rễ, thân, lá. R„ T„ L,: dịch chiết nước của rỗ, Ihân, lá. 19 * Chuẩn bị khoanh giấy lọc. Dùng khoanh giấy có đường kính khoảng 6mm. Mỗi khoanh thấm được khoảng 0,1 ml dịch chiết. Khoanh giấy được sấy tiệt trùng ở 118°c trong 30 phút trước khi tẩm dịch chiết. Tẩm với dịch chiết 3 lần, sau mỗi lần sấy khô khoanh giấy ở 40-45°C. * Môi trường dinh dưỡng. - Môi trường Sabouraud lỏng (MT1). - Môi trường Sabouraud đặc (MT2). - Dung dịch tween 0.5% - Dung dịch NaCl 0.9% Các môi trường và dung dịch được hấp tiệt trùng ở 0,9 atm / 30 phút * Chuẩn bị nhũ dịch vi nấm Các chủng vi nấm c. albicans và s. cerevisiae trước khi thử được cấy vào môi trường dinh dưỡng Sabouroud lỏng. Sau 18 - 24h nuôi cấy, pha trong dung lỉịcli nước muối sinh lý NaCI 0,9% (lổ (lược các nhũ (lịch vi nấm vó nồng độ khoảng 107- 108tếbào/ml. Dùng dd tween 0.5% lấy bào tử vi nấm A. niger trong môi trường dinh dưỡng thạch tạo nhũ dịch bào tử vi nấm có nồng độ khoảng 107-108 bào tử/ml. 2.2.3.2. Tiến hành. Trên các hộp petri có đường kính như nhau. Cho vào mỗi hộp petri 20ml môi trường Sabouroud có trộn nhũ dịch vi nấm kiểm định với tỷ lệ 2,5% so với môi trường. Sau khi thạch nguội, các khoanh giấy đã tẩm dịch chiết được đặt lên bề mặt thạch theo một sơ đồ đã qui định, ủ các hộp petri trong tủ ấm ở 28°c. Sau 18- 24h đối với nấm men và sau 24-48h đối với nấm mốc, kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn với độ chính xác đến 0,1 mill. Song song tiến hành trong cùng điều kiện với mẫu so sánh là nipazil với nồng độ 40mg/ml ( ký hiệu: N0). 20 T iến hành 3 Kill, IAy kết C ]iiả trung bình. Kốl quả dược Ihd hiện (Vbảng 4. Bảng 4: Kết quả thử tác dụng kháng nấm của các (lịch chiết toàn phần. Đường kính vòng vô khuẩn (ìnm) TT Mẫu thử C.albicans Saccharoniyces A.niger cerevisiae 1 R| 18,3 19,4 16,5 2 r2 20,4 22,6 19,3 3 r3 17,2 18,5 9,1 4 T, 12,4 14,3 7,4 5 t2 14,8 15,4 9,3 6 t3 8,6 9,7 7,1 7 L. 13,1 15,3 8,5 8 L2 15,2 17,4 10,6 9 L3 10,5 11,2 7,8 10 N0 9,7 9,5 9,2 Nhận xét: các dịch chiết của rễ, thân, lá đều có tác dụng kháng nấm. Trong các dịch chiết thì dịch chiết cồn 80% ở cả ba bộ phận của cây là có tác dụng cao nhất. Trong ba bộ phận của cây thì các dịch chiết của rễ cho kết quả cao hơn các dịch chiết tương ứng của thân và lá. Như vậy rễ có tác dụng kháng nấm cao nhất. Vì vậy, tiếp tục tạp trung nghiên cứu sâu hơn tác dụng kháng nấm của rễ. 21 Ảnh 2: Vòng vô nấm của Rj, Tị, L|, No đối vói c . albicans c . albicans Ảnh 3: Vòng vô nấm của R2, T2, L2, No đối với A. niger L2 • T2 No £ R2 A.niger 22 2.2.4. Nghiên cứu tác dụng kháng nấm của rễ Bạch hạc 2.2.4.1. Thủm dò túc dụng chống nấm của các pliân íioụtì dịch chiết của rễ Bạch hạc. * Tiến hành chiết rễ Bạch hạc bằng các dung môi từ không phân cực đến phân cực theo sơ đồ. Các dịch chiết được cô đặc đến tỷ lệ 1:1 để thử tác dụng kháng nấm. Sơ đồ 2: Sơ đồ chiết xuất rễ Bạch hạc Bột dược liệu Rther dổn 1r D/C ether dầu Bã dược liệu Ký hiệu:D, V Chloroform D/C Chloroform Ký hiệu: D2 Bã dược liệu ,r Methanol Bã dược liệu D/C Methanol Ký hiệu: D3 r r Nước 1r .... ....... D/C nước Bã dược liệu Ký hiệu: D4 bỏ _ Các dịch chiết ether dầu hoả, chloroform, methanol, nước được tiến hành thử định tính tác đụng kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, dùng khoanh giấy tẩm dịch chiết. Kết quả được trình bày trong bảng 5. Bảng 5: Kết quả thử tác dụng kháng nấm các phân đoạn dịch chiết của rễ Bạch hạc Đường kính vòng vô khuẩn Mẫu thử TT 1 4 5 c. albicans A. nigcr 19,6 16,7 D, 2 d2 15,2 12,4 3 d3 11,5 — d4 — — 10,3 9,2 K * Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy với dịch chiết tỷ lệ 1:1 phân đoạn dịch chiết ether dầu hoả (D|) và phân đoạn Chloroform (D2 ) có tác dụng kháng nấm mạnh. Phân đoạn dịch chiết methanol chỉ có tác dụng đối với nấm men. Phân đoạn nước hầu như không có tác dụng. Trong các phân đoạn thì phân đoạn ether dầu hoả có tác dụng cao nhất. 2.2.4.2. Nghiên cứu phân đoạn ether dầu hoả của rễ Bạch hạc. * Phân tích các chất tail trong phân đoạn ether dầu ìiod bằng SKLM. Sử dụng bản mỏng tráng sẵn GF234 của hãng Merck. Triển khai với hệ dung môi n-hcxan : ElOAc [7:3].Kết quả trôn sắc ký đổ xuất hiộn 7 vết. 24 Ảnh 4: Vòng vô nấm của D|, D2, D3, D4, No đối với C.albicans Ảnh 5: Vòng vô nấm của D|, D2, D3, D4, No đối với A. niger # 1 D2 No A.niger 25 Bảng 6 : Giá trị Rf và inàu sắc các vết của dịch chiết ether dầu Màu / UV3Ó511111 h 2s o 4 đặc Vết Rf Màu (hrói ánh sáng thường 1 0,81 vàng 2 0,74 đỏ đen đỏ đậm vàng 3 0,68 đỏ đen đỏ thẫm vàng 4 0,60 đỏ đen đỏ vàng 5 0,55 đỏ đen đỏ vàng 6 0,24 xanh tím đen 7 0,12 vàng xanh đen Màu / u v 254I1I11 NH, đcn xanh lư Nhận xét: các vết 2, 3, 4, 5, là các vết đậm trên sắc ký đồ. Trong đó vết thứ 2 là vết to và đậm nhất, có thể nói đây là thành phẩn chính của dịch chiết ether dầu. Hình 2: Sắc ký đồ phân đoạn cther dầu của rễ Bạch hạc (Hệ dung môi n-hcxan : clhylaccial - 7 : 3 ) # + 26 * Ấp dung kỹ thuât SKLM phủ thach để phát hiên các vết có hoat tính kháng nấm Dịch chiết được đưa lên bản mỏng, khai triển với hệ dung môi n-hexan : EtOAc [7:3]. Soi dưới đèn tử ngoại để đánh dấu các vết. Tiến hành phủ thạch có trộn nhũ dịch vi nấm c. albicans lên bản mỏng. Mức độ chống nấm được đánh giá thông qua vòng vô nấm. Bảng7: vòng vô nấm xuất hiện trên bản inỏng phủ thạch. TTvết 1 DK vòng vô khuẩn Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng nấm Không hoạt tính — 2 9,5 Có hoạt tính 3 6,6 Có hoạt tính 4 5,30 Có hoạt tính 5 4,2 Có hoạt tính 6 — 7 — Không hoạt tính Không hoạt tính Nhăn xct: Kết quả thu được cho thấy trong pliAn đoạn cthcr dầu có 4 chất có hoạt tính kháng nấm. Trong đó vết thứ 2 là vết đậm nhất trên sắc ký đồ và cho vòng vô nấm lớn nhất. Kết quả này giúp định hướng trong việc phân lập các hoạt chất bằng SK cột. 27 Ảnh 6: Vòng vô nấm trên bản mỏng phủ thạch 28 * Triển khai sắc ký cổt để phân lâp các chất cổ hoat tính sinh hoc. Tiến hành triển khai sắc ký cột với chất hấp phụ là Silicagcl, cỡ hạt 5- 40Mm, theo tỷ lệ silicagel(g): mẫu(g) [10:1]. Dung môi rửa giải là hệ n -Hexan: EtOAc (10:0—>0:10). Kết quả thu được ở phân đoạn 2 cho một đơn chất có Rf tương ứng với vết thứ 2 trên sắc ký đồ của SKLM. Ảnh 7: Sắc ký đồ của chất phân lập được và dịch chiết ether dầu của rễ Tiến hành tinh chế lại bằng SK cột với chất hấp phụ là Silicagel theo tỷ lệ silicagel(g): mẫu(g) (30:1). Dung môi rửa giải là hệ n-Hexan:chloroform (9:1). Sau khi tinh chế thu được chất hoàn toàn tinh khiết có thể dạng dầu vàng, tạm đặt tên là: Bh-1. Nhân xét: Như vậy bằng kỹ thuật sắc ký cột đã phân lập được hoạt chất chính của phân đoạn ether dầu. 29 * Xác định cấu trúc của chất phân lập được. Tiến hành do phổ: 'II- NMk, nC-NMR của Bh-1 và đối chiếu với phổ của các chất đã được phân lập từ Rhinacanthus nasutus (L.). Nhận thấy rằng các giá trị trên phổ của Bh-1 trùng hợp với các phổ của Rhinacanthin c đã được Sendl, A và cộng sự xác định.[21] (xem phụ lục 1, 2). Rhinacanthin c Kết quả được thể hiện trong bảng 8. Bảng 8: Giá trị phổ 'H - NMR và 13c - NMR của Bh -1 và Rhinacanthin c Vị trí 2 3 4 ô „ ( B h - l) 3,92 s 2 H 2,71 s 2 H 4a 5 5a 6 8,12 dd (7.5,1.0) 7 8 7.75 đt (7.5, 1.5) 7.68 dt (7.5, 1.5) 9 9a 8.07 dd (7.5, 1.0) 10 10a 11, 12 ôc (Bh - 1) 72.75 (CH2) 37.06 (O 32.21 (CH2) 121.84 (C) 184.83 (C) 133.01 (C) 126.06 (CH) 134.91 (CH) 132.88 (CH) 127.02 (CH) 129.39 (C) 181.22 (C) 5.21 dq 7.5, 1.5 154.29(C) 25.23 (2 X CH,) 168.12(C) 127.69 (C) 141.98 (CH) 27.17 (CH2) 38.20 (CH2) ■134.59 (C) 119.30 (CH) 1.56 dd 6.5, 1.0 13.34 (CH3) 9’ 1.80 brs 3H 10’ 1.59 brs 3H 1.02 s 6 H V 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 6.70 dt (7.5, 1.5) 2.17 dd 7.5 2.02 t 7.5 ô|i(Bh - 1) 3.90 (2H, s) 2.71 (2H, s) ôc Rhinacanthin c 72.9 (CH2) 37.0 (C) 32.2 (CH2) 121.8(C) 8.12 (đ,8) 7.77 (t,8) 184.0 (C) 133.1 (C) 126.1 (CH) 134.9 (CH) 7.70 (t,8) 8.09 (d,8) 132.9 (CH) 127.1 (CH) 1.02 (6 H, s) 129.2 (C) 181.0 (C) 154.3 (C) 25.2 (2 X CH,) 168.5 (C) 127.7 (C) 142.3 (CH) 6.70 (t, 7) 2.17 (2H, dt, 7) 2.02 (2H, t, 7) 5.20 (d, 7) 27.2 (CH2) 38.2 (CMj) 134.5(C) 119.3 (CH) 13.3 (CH,) 12.31 (CH,) 1.56 (3H,d, 7) 1.80 (3H, br s) 15.55 (CH,) 1.59 (3H, br s) 15.5 (CH,) 30 12.2 (CH,) 2.3. Bàn luận Từ kết quả định tính các nhóm chất có trong cây, cho thấy rễ, thân, lá Bạch hạc đều chứa anthrranoid và saponin. Do vậy có thể phỏng đoán tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá là do tác dụng của hai nhóm chất trên. Tuy nhiên trong rễ, thân, lá còn chứa nhiều nhóm chất khác nên việc chiết tách và tinh chế để định lượng và thử tác dụng kháng nấm gặp nhiều khó khăn. Do vậy chúng tôi đã tiến hành thăm dò tác dụng kháng nấm của cây bằng cách thử tác dụng kháng nấm của dịch chiết ether (Mu, methanol 80% và nước. Mục đích sử dụng ether dầu nhằm chiết các thành phần tan trong dung môi không phân cực. Sử dụng methanol 80% nhằm chiết hầu hết các chất có trong dược liệu, do nó có khả năng hoà tan được các chất không phân cực đồng thời cũng tạo được dây nối hydro với các nhóm chất phân cực [14]. Sử dụng nước nhằm chiết các thành phần tan trong dung môi phân cực. Tù kết quả thử tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá cho thấy rễ, thân, lá clòu có lác dụng kháng nấm. Tuy iihiCi) lỗ có lác (lụng kháng nAm cao và lác dụng mạnh trên cả nấm men và nấm mốc, còn thân và lá có tác dụng kháng nấm thấp hơn rễ nhiều. Kết quả này làm sáng tỏ kinh nghiệm của nhân dân thường hay sử dụng rễ để chữa các bệnh nấm ngoài da, thân và lá ít được sử dụng hơn. Do rễ có tác dụng kháng nấm cao, nên chúng tôi tập trung nghiên cứu sâu hơn vào bộ phận rễ của cây. Qua kết quả thử tie dụng kháng nấm của các phân đoạn dịch chiết của rễ, nhân thấy phân đoạn dịch chiết ether dầu và chloroform có tác dụng mạnh. Điều này chứng tỏ các hoạt chất có tác dụng kháng nấm chủ yếu tan trong dung môi không phân cực. Phân đoạn ether dầu có tác dụng kháng nấm cao nhất, nên chúng tôi tập trung phân lập hoạt chất trong phân đoạn này. Kết quả bước đầu mới phan lập được 1 hoạt chất chính trong phân đoạn ether dầu, mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo cho đề tài. 31 PHẦN I I I : KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1 Kết luận Sau 3 tháng tiến hành nghiên cứu, khoá luận đã thu được một số kết quả như sau: 3.1.1 Thành phán hoá hoc * Bằng các phản ứng định tính trong ống nghiệm đã xác định sơ bộ một số nhóm chất trong rễ, thân, lá: - Rễ có chứa alkaloid, anthranoid, saponin, tanin, flavonoid, coumarin. đường khử. - Thân có chứa anthranoid, saponin, tanin, coumarin, đường khử, phytosterol. - Lá có chứa anthranoid, saponin, tanin, flavonoid, coumarin, đường khử, phytosterol. * Phân lập được hoạt chất chính trong phân đoạn ether dầu của rễ Bạch hạc và xác định được cấu trúc hoá học của chất đó là Rhinacanthin c. 3.1.2 Tác dung sinh hoc * Đã thăm dò tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá Bạch hạc. Kết quả cả ba bộ phận rễ, thân, lá đều có hoạt tính kháng nấm. Trong đó rễ có hoạt tính kháng nấm cao nhất. * Đã thăm dò tác dụng kháng nấm của các phân đoạn dịch chiết ether dầu, chloroform, methanol, nước của rễ Bạch hạc. Kết quả phân đoạn ether dầu và phân đoạn chloroform cho tác dụng kháng nấm cao. Phân đoạn ether dầu có tác dụng cao nhất. * Áp dụng kỹ thuật SKLM phủ thạch để phát hiện các vết có hoạt tính kháng nấm trong phân đoạn ether dầu của rễ, từ đó định hướng cho việc phân lập hoạt chất có tác dụng kháng nấm được nhanh hơn. 32 3.2 Đề xuất Công trình này cần được tiếp tục mở rộng nghiên cứu để xác định cụ Ihổ hơn một số (liổm sau: * Vê hoá học - Tiến hành định lượng các nhỏm cliAt Irong dược liộu. - Tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc các hoạt chất chống nấm trong Bạch hạc. * Về tác dụng sinh học - Tiến hành thử nghiêm trên các chủng vi nấm khác để xác định cụ thể hơn tác dụng kháng nấm của Bạch hạc. Xác định nồng độ ức chế vi nấm tối thiểu (MIC) của các hoạt chất phân lập được. - Tiến hành nghiên cứu các tác dụng dược lý khác của Bạch hạc đã được đề cập đến ở phần tổng quan như : kháng virus, kháng vi khuẩn, chống ung thư... nhằm đẩy mạnh việc khai thác và sử dụng Bạch hạc làm thuốc. TẢI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Viet: 1. Đàm Trung Bảo (1998). “Các bệnh nấm ở người: thuốc và đích tác dụng”. Tạp chí dược học số 5/1998, trang 26-27. 2. Bộ môn Dược liệu (1999). Bài giảng Dược liệu. Tập I, II. Trường đại học Dược Hà Nội. 3. Bộ môn Dược liệu (1999). Thực tập Dược liệu phần hóa /ỉợc.Trường đại học Dược Hà Nội. 4. Bộ môn Dược học cổ truyền (2000). Dược học cổ truyền. NXB Y học, trang 325. 5. Bộ môn Hóa Dược (1998). Hóa dược tập II. Trường đại học Dược Hà Nội, trang 143-157. 6. Bộ môn Hóa phân tích (1998,). Hóa phân tícli II. Trường đại học Dược Hà Nội. 7. Bộ môn Vi sinh (1999). Kí sinh trùng 1. Trường đại học Dược Hà Nội, trang 138-167. 8. Bộ môn Vi sinh (1999). Thực tập Vi sinh-Kí sinh. Trường đại học Dược Hà Nội. 9. Bộ Y tế (1983). Dược điển Việt Nam /, Tập II. NXB Y học, trang 204 10. Bộ Y tế (2002). Dược điển Việt Nam ///. NXB Y học. 11. .Bộ Y tê (1978). Dược liệu Việt Nam, Tập II. NXB Y học, trang Ỉ80. 12. Võ Văn Chi (1997). Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, trang 62. 13. Lê Trần Đức (1997). Cây thuốc Việt Nam. NXB Nông nghiệp, trang ]124-1125. 14. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985). Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc. NXB Y học. 15. Lê Minh Hà, Lê Mai Hương và cộng sự (2001). ”Áp dụng kỹ thuật sắc ký bán mỏng phủ thạch đổ phái hiện và phAn lộp các chất cỏ hoạt tínlì kháng khuẩn từ cây Xà sàng Việt Nam”. Tạp chí Dược học, tập 6, số 2+3, tr 91-93. 16. Phạm Hoàng Hộ (2001). Cây cỏ Việt Nam. NXB Y học. 34 17. Đỗ 7'ấl Lựi (1999). Những cây thuốc vả vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, trang 88-89. 18. Hoàng Viìn Minh (2001). Cây thuốc và vị thuốc Dôìiịị V. NXB Yhọc, trang 917. Tỉếnư Anh: 19. Kernan MR. cl al.(1997), ’’Two new lignans with activity against influenza virus from Rhinacanthus nasutus”, J. Nat. Prod., vol 60 (6), p. 635-637. 20. Kodama o . et al. (1993) / ‘Isolation and identification of an antifungal naphtopyran derivative from Rhinacanthus nasutus”, J. Nat. Prod., vol 56 (2), p. 292-294. 21. Sendl A. et al. (1996), ” Two new naphtoquinones with antiviral activity from Rhinacanthus nasutus”, J. Nat. Prod., vol 59 (8), p. 808-811. 22. Subramanian NS. et al. (1981), “Phytochemical studies on the flowers of Rhinacanthus nasutus”, J. Indian Chem. Soc., vol 58, p. 926-927. 23. Thirưmurugan RS. et al. (2000). “Antitumour activity of Rhinacanthone against Dalton’s ascitic lymphoma”, Riosci. Biotech. B io c h e m vol 23 (12), p. 1438-1440. 24. R.S.Varma; Z.K.Khan; A.P.Singh (2001). Antifungal agents: past, present, future prospects. Published by National Acadeny of Chemistry and Biology (India). 25. Wu TS. et al. (1988) “Isolation and cytotoxicity of Rhinacanthin - A and - B, two naphtoquinones, from Rhinacanthus nasutus”, Phytochemistry, vol 27 (12), p. 3787-3788. 26. Wu TS. et al. (1995). “A quinol and steroids from the leaves and stems of Rhinacanthus nasutus”, Phytochemistry, vol 40 (4), p. 1247-1249. 27. Wu TS. et al. (1998). “Naphtoquinone esters from the root of Rhinacanthus nasutus”, Chem. Pliarm. Bull., vol 46 (3), p. 413-418. 28. Wu TS. et ạl. (199&). “Rhinacanthin-Q, a naphtoquinone from Rhinacanthus nasutus and its biological activity”, Phytochemistry, vol 49 (7), p. 2001-2003. 35 PHỤ LỤC I PHỔ 'H-NMR của Bh - 1 M C I0 2 a , 1. oorr CD CL3, 1.008' 1H 2.007' 2.018. rrõ55X_ TTT55\I jsTnTC 3.293/“ 3.144/6 . 154 s = . 0°0 *•yo 3 . 1'*9 ■. 1>wl ".169 2.055 ■2 . 1 ' 4 2.039 2.136 £. . uu M C I 0 2 A , CDCL3, 1 . 800 ] . 7 1R 3 . 1 55 1H 3.111 3.293 \ "T05 3 ** Ơ5 C1rr to -3 s 10 COo o r DX rtf cn PJ CO o * Ư) s co Í 75 w0os: 'V - "0 c tTỊ Tl o c o 0' g TÍ c o o o o C /1 w ơ-> o Ơ1• I'J o • a> m o oo • oc • :c c U) 'J> ft) oo u» vr c I-' vr • (£1w J ^ ► cr ► --* (/>: o ƠV U"I£ oc (.”> r a. (>.7 r» »>.7 1(. 6. 704 6.702 6. 690 r , . f,8 7 MC102A, CDCL3, 1H n z u V. V. 3 £ c n rc o (1' PHỤ LỤC I I : PHỔ ,3C-NMR • * của Bh - 1 IV : o - o : 190 180 184 . 8 3 6 181.221 170 168.120 160 154.292 IbO ]40 MCI02 a , CDCL3, C13CPD I ?0 120 110 100 90 80 70 60 50 40 3C 20 10 0 to *0 *0 rp s o ► TJ r r*o c T3 o DOw w Ỡ5D £ T) r-3 o Mw n D -10 C OrJ TI n " n *Ọ p 5?ruis* M - - -n to c T3 a r w s w w ”1 >> ->s Ỡ) DX : tn M ÕK >'tJ ppm tJ 3 CP »-* • h-* • o 0.' ~J w M [...]... quả thử tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá cho thấy rễ, thân, lá clòu có lác dụng kháng nấm Tuy iihiCi) lỗ có lác (lụng kháng nAm cao và lác dụng mạnh trên cả nấm men và nấm mốc, còn thân và lá có tác dụng kháng nấm thấp hơn rễ nhiều Kết quả này làm sáng tỏ kinh nghiệm của nhân dân thường hay sử dụng rễ để chữa các bệnh nấm ngoài da, thân và lá ít được sử dụng hơn Do rễ có tác dụng kháng nấm cao,... cây, cho thấy rễ, thân, lá Bạch hạc đều chứa anthrranoid và saponin Do vậy có thể phỏng đoán tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá là do tác dụng của hai nhóm chất trên Tuy nhiên trong rễ, thân, lá còn chứa nhiều nhóm chất khác nên việc chiết tách và tinh chế để định lượng và thử tác dụng kháng nấm gặp nhiều khó khăn Do vậy chúng tôi đã tiến hành thăm dò tác dụng kháng nấm của cây bằng cách thử tác dụng. .. đoạn ether dầu của rễ Bạch hạc và xác định được cấu trúc hoá học của chất đó là Rhinacanthin c 3.1.2 Tác dung sinh hoc * Đã thăm dò tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá Bạch hạc Kết quả cả ba bộ phận rễ, thân, lá đều có hoạt tính kháng nấm Trong đó rễ có hoạt tính kháng nấm cao nhất * Đã thăm dò tác dụng kháng nấm của các phân đoạn dịch chiết ether dầu, chloroform, methanol, nước của rễ Bạch hạc Kết quả... dịch chiết của rễ, thân, lá đều có tác dụng kháng nấm Trong các dịch chiết thì dịch chiết cồn 80% ở cả ba bộ phận của cây là có tác dụng cao nhất Trong ba bộ phận của cây thì các dịch chiết của rễ cho kết quả cao hơn các dịch chiết tương ứng của thân và lá Như vậy rễ có tác dụng kháng nấm cao nhất Vì vậy, tiếp tục tạp trung nghiên cứu sâu hơn tác dụng kháng nấm của rễ 21 Ảnh 2: Vòng vô nấm của Rj, Tị,... Vòng vô nấm của R2, T2, L2, No đối với A niger L2 • T2 No £ R2 A.niger 22 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng kháng nấm của rễ Bạch hạc 2.2.4.1 Thủm dò túc dụng chống nấm của các pliân íioụtì dịch chiết của rễ Bạch hạc * Tiến hành chiết rễ Bạch hạc bằng các dung môi từ không phân cực đến phân cực theo sơ đồ Các dịch chiết được cô đặc đến tỷ lệ 1:1 để thử tác dụng kháng nấm Sơ đồ 2: Sơ đồ chiết xuất rễ Bạch hạc Bột... dụng kháng nấm cao, nên chúng tôi tập trung nghiên cứu sâu hơn vào bộ phận rễ của cây Qua kết quả thử tie dụng kháng nấm của các phân đoạn dịch chiết của rễ, nhân thấy phân đoạn dịch chiết ether dầu và chloroform có tác dụng mạnh Điều này chứng tỏ các hoạt chất có tác dụng kháng nấm chủ yếu tan trong dung môi không phân cực Phân đoạn ether dầu có tác dụng kháng nấm cao nhất, nên chúng tôi tập trung phân... hoả (D|) và phân đoạn Chloroform (D2 ) có tác dụng kháng nấm mạnh Phân đoạn dịch chiết methanol chỉ có tác dụng đối với nấm men Phân đoạn nước hầu như không có tác dụng Trong các phân đoạn thì phân đoạn ether dầu hoả có tác dụng cao nhất 2.2.4.2 Nghiên cứu phân đoạn ether dầu hoả của rễ Bạch hạc * Phân tích các chất tail trong phân đoạn ether dầu ìiod bằng SKLM Sử dụng bản mỏng tráng sẵn GF234 của hãng... OMe c Nhóm Lignan 9 1.3.4 Tác dụng ì 3.4.1 Tác dụng dược lý Các nghiên cứu với dịch chiết toàn phần cũng như các phân đoạn và các chất chiết được từ Bạch hạc cho thấy nó có những tác dụng sau: - Kháng nấm [12, 13, 17-19, 27, 28] - Kháng virus [19, 27, 28] - Kháng vi khuẩn [4] - Chống ung thư [27, 28] - Chống tăng huyếl áp [12, 13, 17, 18] 1.3.4.2 Công dụng và cách dùng theo y học cổ truyền a Rề Vị đắng,... chloroform, methanol, nước của rễ Bạch hạc Kết quả phân đoạn ether dầu và phân đoạn chloroform cho tác dụng kháng nấm cao Phân đoạn ether dầu có tác dụng cao nhất * Áp dụng kỹ thuật SKLM phủ thạch để phát hiện các vết có hoạt tính kháng nấm trong phân đoạn ether dầu của rễ, từ đó định hướng cho việc phân lập hoạt chất có tác dụng kháng nấm được nhanh hơn 32 ... rửa, giã một lượng vừa đủ lá cây tươi, them cồn 70° hoặc dầu hỏa ngâm 7 ngày rồi đem dùng ngoài 10 PHẨN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên vật liệu 2.1.1.1 Nguyên liêu Nguycn liệu nghiên cứu là cây hạch hạc thu hái ở trung tâm trồng và chế biến cây thuốc của Viện Dược liệu Cây đã được giáo sư Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học là Rhinacanthus nasutus ... kết thử tác dụng kháng nấm rễ, thân, cho thấy rễ, thân, clòu có lác dụng kháng nấm Tuy iihiCi) lỗ có lác (lụng kháng nAm cao lác dụng mạnh nấm men nấm mốc, thân có tác dụng kháng nấm thấp rễ nhiều... phản ứng hoá học 14 2.2.3 Thăm dò tác dụng kháng nấm rễ, thân, Bạch hạc 19 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng kháng nấm rễ Bạch hạc 23 2.3 Bàn luận 31 PHẦN III- KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 32 PHẨN IV- TÀI LIỆU... dầu rễ Bạch hạc xác định cấu trúc hoá học chất Rhinacanthin c 3.1.2 Tác dung sinh hoc * Đã thăm dò tác dụng kháng nấm rễ, thân, Bạch hạc Kết ba phận rễ, thân, có hoạt tính kháng nấm Trong rễ có