Nghiên cứu thành phần hóa học thân, rễ và tác dụng kháng nấm của cây bạch hạc

Các phần dịch chiết của rễ, thân, lá được thử định tính kháng nấm bằng phương pháp này.. Sau đó lắc kỹ với dd H2S041N, gạn lấy dịch chiết acid, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống l

BỘ Y T ẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

m

NGUYỄN VÁN NHƯỢNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THÂN, RỄ

VÀ TÁC DỤNG KHÁNG NẤM CỦA CÂY BẠCH HẠC ■ ■ ■

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHOÁ 1998 - 2003)

TS CAO VĂN THƯ

BỘ MÔN CÔNG NGHIỆP Dược

giúp đỡ tôi hoàn thành kìĩoá luận này.

Hà Nội ngày 30/05/2003.

Sinh viên Nguyễn Văn Nhượng.

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 11

DANH MỰC CÁC CHỮVIÊT TẮT

A niger : Aspergillus niger

c albicans : Candida albicans

s cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae

DẶT ván DỂ

Nước ta nằm trong vùng nhiệt đỏi gió mùa, có hệ sinh thái thực vật da dạng và phong phú Từ lâu, nhân dân ta dã biết sử dụng nhiều loại cây cỏ để phòng bệnh và chữa bệnh Tuy nhiên, có IIÌIÌCLI loại cây thuốc còn dùng trong phạm vi kinh nghiệm dân gian Vì vậy, việc nghiên cứu các cây thuốc này một cách khoa học nhằm làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian, đẩy mạnh việc khai thác sử dụng, nâng cao tính an loàn, hiệu quả điều trị là một vấn đề cần thiết

Bệnh nấm là một bệnh khá phố biến và hiện nay đang phát triển mạnh Đặc biệt điều kiện khí hậu của nước la Iiónu ấm rất lliích hợp cho sự phát triển của nấm Đồng thời còn do những liến bộ trong y học như: chiếu xạ, thay thế phủ tạng, sử dụng nhiều thuốc corticoid và kháng sinh phổ rộng kéo dài, hoá trị liệu ung thư, do HIV D0 đó, việc tìm thuốc để điều trị bệnh này là một vấn đổ đáng được quail (full

Trước thực tế dỏ chúng tôi dã lựa chọn nghiên cứu một trong số các cây thuốc nam thường được nhân dân ta sử dụntĩ để chữa nấm Đó ]à cây Bạch

ỉ lạc, có lổn khoa học: kl)in;ic;iiill)iis Iiiisuliis ( I ) Kill'/,, họ Ổ rỏ Acanlliíiccíic với các mục tiêu sau:

- Thăm dò thành phần hoá học (rong rễ, thân, lá

- Thăm dò hoạt tính chống nấm của rẻ, thân, lá

- Phân lập và nhận dạng các chất có hoạt t ính

Qua đó góp phần làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian trong việc sử dụng cây thuốc này để chữa nấm Trên co' sở đó từng bước đưa dược liệu vào ứng dụng rộng rãi sau này

I

PHẨN I: TỔNG QUAN

1.1 Bệnh nấm và các thuốc điều trị

1.1.1 Đặc điểm của bệnh nấm

Bệnh nấm (mycoses) là hậu quả của sự kí sinh của vi nấm ở trên da,

niêm mạc, xương khứp, thần kinh và trong các pluì lạng khác Trong số

100.000 loài vi nấm đã được biếl đến liiộn nay thì đã có tới hàng trăm loài có

khả năng gây bệnh cho người [71

-Bệnh vi nấm nội tạng (systemic mycoses): bệnh do Candida, bệnh do

Histoplasma, bệnh do Aspergillus, bệnh do Mucor, bệnh do Cryptococcus

Trong vòng khoảng 20 năm trỏ' lụi dây, các bệnh do vi nấm gây ra gia

tăng mạnh do mồi trường bị ô nhiễm nghiêm Irọng và do những tiến bộ trong

y học Các bệnh này thường; eặp nhiều ở những người có hệ miễn dịch suy

yếu (do ghép CƯ quan, do lioá (rị liệu mm thư, (lo IIIV .), người tlượe dùng

các phương pháp điều trị xâm nhập (đặt ống dẫn lưu bay những dụng cụ ngoại

lai .) [lj Đen nay, những bệnh vồ nam cỏ lý lộ cao và là nguyên nhân gây

lử vong quan trọng tronụ sô hộnli nhân Iiltập viện Tíìn suât của bệnh nâm

Candida tăng lên 10 lần và trở thành một quần thề phân lập được trong máu

hay gặp thứ tư Bệnh nấm Aspergillus xám nhập ở phối là nguyên nhân chủ

yếu gây tử vone; ỏ' bệnh nhân e,hép tuỷ [ 11 Nhiều trường hợp nhiễm nấm cơ

hội không thể chẩn đoán dirực bằiiíi pillion 12, pháp nuôi cay máu thông tỉurờng

và chỉ được điều trị theo kinh nghiệm ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch

nghiêm trọng.[l]

Huỷ hoại tính bán thấm của màng

tế bào

2 Allyamin Naftitine

Terbinifine

ức chế sự tổng hợp chất ergosterol của màng tế bào nấm

3 Thiocarbamat Tolnaftat ức chế sự tổng hợp chất ergosterol

của màng tế bào nấm

4 Tương tự

nucleotide

NikkomicinPolyoxin

ức chế tổng hợp thành tế bào

ClotrimazoleEconazoleFluconazoleItraconazoleKctoeonazolcMiconazoleOxiconazoleSulconazoleTerconazoleTioconazole

ức chế sự tổng hợp chất ergosterol

có trong màng tế bào nấm

6 Bcnzofuran

Grisovin

Griscofulvin ức chế quá trình phân chia nhân

7 Pyrimidine 5- Fluorocytosine ức chế quá trình tổng hợp

Hình 1: Vị trí tác dụng của một số thuốc chống nấm.[l]

Tổng hợp thành tế bào Polyoxin Nikkomycin Chức năng màng

Amphotericin B

Tổng hợp ergosterol Azol

Allyamin Thiocarbamat Chức năng acid nucleic

Fentamidin

\

Tổng hợp acid nucleic 5 Fluorocytosin Trimethoprim Sulphamethoxazol

Phân cilia nhân

Griseofulvin , Benomyl Tổng họp Protein Blasticidin Sinefulgin

,1.2 Khảo sát so bộ các cây thuốc có khả năng kháng nấm:

Các cây thuốc có tác dụng kháng nấm tương đối phổ biến và có mặt ở nhiều họ thực vật Theo các tác giả Đỗ Tất Lợi [18], Phạm Hoàng Hộ [16],

Võ Văn Chi [12] và tài liệu của Viện Dược liệu, trong hệ cây thuốc Việt Nam

có khoảng 59 họ và 150 loài thực vật có khả năng kháng nấm, trong đó có nhiều cây đã xác định được hoạt chất kháng nấm Ba họ thực vật có số loài có tác dụng kháng nấm nhiều nhất là:

-Họ Đậu(Fabaceae) - có 14 loài

-Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) - có 12 loài

- Họ Cúc (Asteraceae) - có 9 loài

1.3 Cây Bạch hạc

Cây Bạch hạc còn có tên là Kiến cò, cây lác, chòm phón (Nùng), Nam

uy linh tiên, có tôn khoa học Rhinacantluis nasutus (L.) Kurz họ Ôrô Acanthaceae [12, 13, 17, 18]

5, hình chỉ, có lông, gần đều nhau, rời từ gốc Tràng hoa màu trắng hay hoa cà điểm hồng, ống tràng đài, phía trên xẻ hai môi khác nhau rõ rệt: môi trên hình mác xẻ 2, môi dưới khía 3 thuỳ Nhị 2, bao phấn 2 ô, hướng trong, không có nhị lép, bầu trên Quả nang dài, có lông, phía dưới dẹt lép, phía trên chứa 4 hạt, có khi chỉ có 2 hạt Hạt hình trứng hai mặt lồi

1.3.2 Phân bố, thu hái, ch ế biến

Cây Bạch hạc mọc hoang ở nhiều tỉnh miền Bắc nước ta, còn thấy mọc

ở Ấn Độ, Malayxia, Thái Lan, Đông châu Phi Cây Bạch hạc có khi được trồng làm cảnh, thường được trồng bàng cành, gốc, rễ vào mùa xuân

Bộ phận sử dụng: cành, lá (thường dùng tư ơ i), rễ (tươi và khô ) Có thể thu hái quanh năm, nhưng tốt nhất là vào mùa đông [12,13,17,18]

1.3.3 Thành phần hóa học

1.3.3.1 Các nhóm chất đã được xác định

* Rễ chứa các nhóm chất: alkaloid [27], benzennoid [26, 27, 28], steroid [25, 26], quinoiđ [21, 23, 25, 27, 28], triterpen [25, 26], flavonoid [27, 28], coumarin [27, 28]

* Thân và lá chứa các nhóm chất: triterpen [26], quinoicl ị20, 261, benzenoid [26J, steroid 127]

* Hoa chứa Rutin và Quercetin [22]

5

Bảng % : Các hợp chất lioá học đuọc phân lập từ

Rhinacanthus nasutusịL.) Acanthaceae ị 19-23, 25-28]

STT Tên chất Nhóm chất Bộ phận cây Tên nước Hàm lượng (%)

2 Amyrin, beta Tri terpen Lá, thân Đài Loan

4 Glutinol Triterpen Lá, thân Đài Loan

Lá, thân

Đài Loan Đài Loan

0,01194

8 Rlỉinacanlhin A Quinoitl RỒ Đài Loan 0,00333

10 Rhinacanthin c Quinoid Thân

RỖ

Thái Lan Đài Loan

0,005 0,11379

11 Rhinacanthin D Quinoid Thân

RỖ

Thái Lan Đài Loan

0,00070,00255

12 Rhinacanthin E Lignan Thân, lá Thái Lan 0,00079

13 Rhinacanthin F Lignan Thân, lá Thái Lan 0,00048

15 Rhinacanthin H Quinoid Rễ Đài Loan 0,00275

17 Rhinacanthin J Quinoid Re Đài Loan 0,00151

19 Rhinacanthin L Quinoicl RỖ Đài Loan 0.000206

20 Rhinacanthin M Quinoid Rễ Đài Loan 0.00365

23 Rhinacanthin p Quinoid Rễ Đài Loan 0,00006

25 Rhinacanthon Quinoid Thân, lá

Rẽ

Ấn Độ Đài Loan

0,009330,00020

27 Sitoaterol, beta Steroid Rễ

Lá, thân

Đài Loan Đài Loan

Lá, thân

Đài Loan Đài Loan

29 Syringaldehyd Benzenoid Rễ

Rễ

Đài Loan Đài Loan

0,000130,00013

30 Syringic acid Benzenoid Lá, thân Đài Loan

31 Umbelliferon Benzenoid Lá, thân Đài Loan

32 Vanillic acid Benzenoid Lá, thân Đài Loan

Rễ

Đài Loan Đài Loan

0,0003450,00034

7

I J 3.2.Cấn trúc lióa liọc did mội sô hợp c I k ÍI

a Nhóm Naphtopyran:

Ị ^ j / O J

uo

*1* Dùng trong: Ngâm rượu đê uống có tác dụng tiêu thũng thống, chữa khí hư,

bạch đới, phong thấp tê bại, đau lưng, nhức gân xương Có thể dùng 6-12g/ngày dưới dạng thuốc sắc [11]

♦> Dùng ngoài: Chữa hắc lào và một số bệnh ngoài da nhu' chốc, lở, mụn rộp (herpes), eczema mãn tính Đem rễ thái nhỏ, ngâm rượu hoặc dấm, sau 7 ngày lấy dịch bôi lên chỗ bị bệnh Bôi liên tục 10-15 ngày Có thể thêm bột long não và dịch quả chanh ( tỉ lệ lOg rễ bạch hạc với lg bột long não và nửa thìa chanh) tác dụng càng tốt hơn [12, 13, 17, 18]

b Thân, lá [12, 13, 18]

Thường dùng trị:

*1* Lao phổi khởi phát, viêm phế quản cấp và mạn Cách dùng: thân và lá bạch

hạc 20g sắc nước cho thêm đường uống

♦♦♦ Huyết áp cao: Liều dùng 9-15 g dạng thuốc sắc

*1* Dùng ngoài trị hắc lào, lở ngứa, eczema Lấy lá cây tươi đắp hoặc nấu

nước rửa, giã một lượng vừa đủ lá cây tươi, them cồn 70° hoặc dầu hỏa ngâm

7 ngày rồi đem dùng ngoài

PHẨN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

2.1.1 Nguyên vật liệu.

2.1.1.1 Nguyên liêu

Nguycn liệu nghiên cứu là cây hạch hạc thu hái ở trung tâm trồng và

chế biến cây thuốc của Viện Dược liệu Cây đã được giáo sư Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học là Rhinacanthus nasutus (L.) Kurz Acanthaceae Thu hái cây vào tháng 2 lúc cây dang ra hoa và tlưực 2 năm sau khi Irổng

Cây sau khi thu hái tách riêng rễ, thân, lá Sau đó rửa sạch, hong khô Sấy ở 110°c trong 10 phút để diệt men Sấy khô dược liệu ở 60°c Tán dược liệu thành bội, bảo quản hột dược liệu trong, bình Ill'll Ảm dể làm thí nghiệm.2.1.1.2 Hoá chất và dung cu thí nghiêm

Các dung môi, hoá chất và thuốc thử dùng trong ngiên cứu đạt tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam

- Máy xác định độ ẩm dược liệu Precisa HA60 (Thụy Sỹ)

- Nồi hấp tiệt trùng Hyrayama (Nhật)

- SKLM dùng ban mỏng tráng san Ỉ \ V( của Merck (Đức)

- SK cột dùng chất hấp phụ silicagel cỡ hạt 5-40 |Lim của Viện Kiểm nghiệm.2.1.1.3 Vi nấm kiểm đinh và mồi trường dinh dưỡng

*Vi nấm kiểm định.

- Candida albicans CIDV 216

- Saccharomyccs ccrcvisiae DĨPC I 12

- Aspergillus niger DIPC 109

♦ Môi trường dinh dưỡng.

♦ Môi trường Sabouraud lỏng (MT1)

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Phương pháp đinh tính các nhổm chất hữu cơ trong dươc liêu

Tiến hành theo phương pháp của các tài liệu: [2, 3, 14]

2.1.2.2 Phương pháp khuếch tán trên thach

Nguyền tắc: Các khoanh giấy có tẩm dịch chiết được đặt trên mặt đĩa

thạch dinh dưỡng đã cấy vi nấm chỉ thị Các hoạt chất có trong dịch chiết sẽ khuếch tán vào mỏi trường, tiêu diộl hoặc ức chế vi nấm pliát triển tạo thành vòng vô nấm có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ của các hoạt chất Khả năng kháng iiAìn của (lịch cliicí được thổ liiỌn bằng đường kính vòng vỏ nấm

Các phần dịch chiết của rễ, thân, lá được thử định tính kháng nấm bằng phương pháp này

2.1.2.3 Phương pháp phủ thach trưc tiếp lẽn bản sác ký lớp mòng

Phương pháp này được áp dụng để tìm các vết có hoạt tính kháng nấm

Tiến hành: đưa dịch chiết lên bản mỏng và khai triển bằng hệ dung môi

n-hexan : EtOAc [7:3], bản mỏng để khô tự nhiên, soi u v để đánh dấu các vết Phủ thạch đã trộn vi nấm chỉ thị (C albicans) Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các vết thông qua vòng vô nấm xuất hiện ở các vết

2.1.3.4 Phương pháp phân lâp chất cổ hoat tính

* Sắc ký cột: được áp dụng để tách các chất ở phần dịch chiết ether dầu

của rễ Dùng silicagel cỡ hạt 5-40 |»im làm chất hấp phụ và dung môi rửa giải

là hệ n-hexan : EtOAc (10:0 -» 0:10)

* Dùng SKLM để kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập được và đối

chiếu với các vết có hoạt tính

2.1.3.5 Xác đinh cấu trúc của chất phân lâp dươc

Dựa trên các phổ: ‘H - NMR, l3C - NMR, có tham khảo phổ của các chất đã được phân lập

Hoa nhỏ mẩu trắng, mọc thành xim ở kẽ lá Hoa không đều, lưỡng tính.

Lá bấc hình chỉ,có lông Đài 5, hình chỉ, có lông, gần đều nhau, rời từ gốc.Tràng hoa màu trắng, ống tràng dài, phía trcn xỏ 2 môi khác nhau rõ rệt: môitrên hình mác xẻ 2, môi dưới khía 3 thuỳ Nhị 2, bao phấn 2 ô, hương trong,nhị dính vào ống iràng, không có nhị lép, báu trên Quan sát cây ở hình 2

Ảnh 1: Cành mang hoa của cây Bạch hạc

13

2.2.2 Đ ịn h t í n h c á c I1Ỉ1ÓI11 cliấl h ữ u cơ pliiỉn II'IIJH lioíí h ọ c

* Định tính alkaloid.

Cho khoảng 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch NH4OH 6 N Sau 30 phút cho 15 ml chloroform vào, đậy kín Ngâm 12h, gạn dịch chloroform vào bình gạn Sau đó lắc kỹ với dd H2S041N, gạn lấy dịch chiết acid, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống lml.Tiến hành các phản ứng với thuốc thử tạo tủa chung của alkaloid: TT Mayer, TT Bouchardat, TT Dragendorff Dịch chiết rễ cho kết quả dương tính, dịch chiết thân và lá cho kết quả âm tính

Kết luận: rễ có alkaloid, thân và lá không có alkaloid.

* Định tính anthranoỉd.

- Phản ứng Bornlracgcr

Lấy 3 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml Thêm 40 ml dung dịch H2S04 2 N, đun sôi cách thuỷ trong vòng 15 phút Đổ nguội, lọc lấy dịch lọc vào bình gạn Lắc với 5ml ether ethylic, gạn lấy lớp ether ethylic Tiến hành phản ứng Borntraeger với dd NaOH 10% Nhận thấy lớp nước của

3 dịch chiết có màu đỏ sim

Kết luận: rễ, thân, lá có anthranoid.

* Định tính saponin.

- Phản ứng tao bot

Cho vào ống nghiệm to lml dịch chiết ethanol của bột dược liệu Thêm 5ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, để yên trong 15 phút Nhận thấy cột bọt của cả 3 dịch chiết đẻu cao và bền vững Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá

- Phản ứng Liebermann- Burchardt

Cho lml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm Bốc hơi tới cắn Hoà tan cắn bằng chloroform Thêm hỗn hợp để lạnh ở 0°c (lm l anhydric acetic + lml chloroform + 1 giọt H2S04 đặc), nhận thấy xuất hiện màu hổng ở cả ba mẫu thử Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá

- Phản ứng Salkowski

Cho lml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm Bốc hơi tới cắn Hoà tan cắn bằng 1 till chloroform Thôm từ lừ Iml acid II2S 04 đặc llieo (hành ống nghiệm Nhận thấy xuất hiện vòng màu hồng ở cả ba mẫu thử Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá

Kết luận: rễ, thân, lá có saponin.

* Định tính Tanin.

Cho vào bình nón dung tích 100ml khoảng 5g bột dược liệu, thêm 20ml nước cất đun sôi trên bếp qua lưới amiăng trong thời gian khoảng 5 phút, lọc nóng, dịch lọc được làm các phản ứng:

- Phán ứng với dd FcCU 5%

Lấy Iml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọl dd FeCl3 5% Thấy xuất hiện màu xanh ở cả ba mẫu thử.

- Phản ứng với dd gelatin 1%

Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm, them vài giọt dd gelatin ỉ %

Thấy xuất hiện tủa bông trắng ở cả ba mẫu thử

Kết luận: rễ, thân, lá có tanin.

* Định tính Flavonoid.

- Phản ứng Cvanidin

Cho lml địch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại và vài giọt acid HC1 đặc, đun nóng trên nồi cách Ihuỷ Nhận thấy mẫu thử thân có màu vàng, phản ứng âm tính Mãu thử rễ, lá xuất hiện màu hồng đỏ, phản ứng dương tính

- Phản ứng vứi kiém

Cho lml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm thêm vài giọt dd NaOH 10% Nhận thấy mẫu thử rễ cho màu đỏ, mẫu thử lá có màu vàng đậm, mẫu thử thân không phản ứng

15

+ Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi- để nguội.

Nhận thấy: ống 1 của 3 mẫu thử đều đục vàng,

ống 2 của 3 mẫu thử đều trong + Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất Lắc đều

Nhộn thấy: ống I: của 3 mẫu thử đều í rong suốt

ống 2: của 3 mẫu thử đều có tủa đục

+ Acid hoá ống 1 bằng 2 giọt HC1 đặc thấy ống 1 trở lại đục như ống 2 ở cả ba mẫu thử

Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá

- Soi huỳnh quang dưới ánh sáng u v

Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên trên giọt đó 1 giọt dđ NaOH 10% Để khô rồi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại thấy có huỳnh quang ở

cả 3 mẫu thử Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá

Kết luận: rễ, thân, lá có coumarin.

* Định tính acid hữu cơ.

Cho lg dược liệu vào ống nghiệm, thêm 10ml nước cất Đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội, lọc Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2C 0 3 Không thấy có bọt C 0 2 bay lên ở cả 3 mẫu thử

Kết luận: rễ, thân, lá không có acid hữu cơ.

* Định tính đường khử.

Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml cồn Đun cáchthuỷ 10 phút, lọc Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt thuốcthử Feling A và 3 giọt thuốc thử Feling B, đun cách thuỷ trong 10 phút, thấy

có tủa đỏ gạch ở cả 3 mẫu thử

Phản ứng dương tính với cả ha dịch chiết rễ, thân, lá

Kết luận: rễ, thân, lá có đường khử tự do.

* Định tính chất béo.

Chiết bằng dụng cụ Soxhlct trên nồi cách thuỷ khoảng 5g bộl dược liệu với dung môi ether dầu hoả, cất thu hồi bớt dung môi, dịch chiết đậm đặc được dùng làm phản ứng định tính

Chấm 3 giọt dịch chiết đậm đặc trôn giấy bóng mờ, hơ trên bếp điện đến khô, không thấy để lại vết mờ ở cả 3 mẫu thử

Kết luận: rễ, thân, lá không có chất béo.

* Định tính Carotenoid.

Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết ether dầu hoả Đun cách Ihuỷ cho bay hơi hết dung môi Thêm 2 giọt H2S04 đặc, không thấy xuất hiện màu xanh lá ở 3 mẫu thử

Kết luận: rễ, thân, lá không có carotenoid.

* Đinh tính phytosterol

Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết ether dầu hoả Bốc hơi dung môi đến khô, cho vào ống nghiệm lml anhydric acetic, lắc kỹ, thêm 1 ml H2S04 đặc theo thành ống nghiệm Thấy ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng của mẫu thử thân và lá xuất hiện một vòng tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh Mẫu thử rễ không xảy ra phản ứng

Kết luận: lá, thân có phytosterol; rễ không có phytosterol.

Kết quả định tính các thành phần hoá học bằng phản ứng trong ống nghiệm được tóm tắt ở bảng 3

17

Bảng 3: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cây

TT Nhóm chất Phản ứng định tính với các

thuốc thử

Kết quả

1 Alkaloid - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat + _ _

- Phản ứng với thuốc thử Dragendorff + — —

- Phản ứng Liebermann-Burchard H—h ++ +++

4 Tanin - Phản ứng với dung dịch FeCỈ3 5% ++ ++ ++

Nhân xét: kết quả thu được từ các phản ứng định tính sơ bộ trong ống nghiệm cho thấy:

Rễ có chứa alkaloid, anthranoid, saponin, tanin, flavonoid, coumarin, đường khử

ThAn có chứa anlliraiioid, saponin, lanin, coumarin, dường khử, phytosterol

Lá có chứa anthranoid, saponin, lanin, riavonoid, coumarin, đường khử, phytosterol

2.2.3 Thăm dò tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá Bạch hạc.

2.2.3.1 Chuẩn bị.

Tiến hành chiết xuất dược liệu với các dung môi ether dầu hoả, methanol 80%, nước cất Các dịch chiết lọc qua bông và được cô đặc đến tỷ lệ 1:1 theo sơ đồ 1:

Sơ đổ 1: Sư dồ cliiêi xiiâl cltrực liệu

R|, T|, L,: dịch chiết ether dầu của rễ, thân, lá

R2, T2, L2: dịch chiết Methanol của rễ, thân, lá

R„ T„ L,: dịch chiết nước của rỗ, Ihân, lá

19

* Chuẩn bị khoanh giấy lọc.

Dùng khoanh giấy có đường kính khoảng 6mm Mỗi khoanh thấm được

khoảng 0,1 ml dịch chiết Khoanh giấy được sấy tiệt trùng ở 118°c trong 30

phút trước khi tẩm dịch chiết Tẩm với dịch chiết 3 lần, sau mỗi lần sấy khô khoanh giấy ở 40-45°C

* Môi trường dinh dưỡng

- Môi trường Sabouraud lỏng (MT1)

- Môi trường Sabouraud đặc (MT2)

so với môi trường

Sau khi thạch nguội, các khoanh giấy đã tẩm dịch chiết được đặt lên bề mặt thạch theo một sơ đồ đã qui định, ủ các hộp petri trong tủ ấm ở 28°c Sau 18- 24h đối với nấm men và sau 24-48h đối với nấm mốc, kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn với độ chính xác đến 0,1 mill

Song song tiến hành trong cùng điều kiện với mẫu so sánh là nipazil với nồng độ 40mg/ml ( ký hiệu: N0)