Sàng lọc và nghiên cứu thu nhận lectin từ bọt biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH THÀNH TRUNG SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN LECTIN TỪ BỌT BIỂN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH THÀNH TRUNG SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN LECTIN TỪ BỌT BIỂN LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS LÊ ĐÌNH HÙNG PGS.TS NGƠ ĐĂNG NGHĨA Chủ tịch Hội đồng: Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn giáo viên hƣớng dẫn giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu Phòng cơng nghệ sinh học biển – Viện nghiên cứu ứng dụng Công nghệ Nha Trang Các số liệu kết luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Khánh Hòa, ngày 19 tháng 08 năm 2017 Chữ ký học viên Đinh Thành Trung iii LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đình Hùng, Trƣởng phòng Cơng nghệ sinh học biển – Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang), PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, Viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học & môi trƣờng – Đại học Nha Trang, trực tiếp hƣớng dẫn, bảo tơi q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn cán nghiên cứu phòng Cơng nghệ sinh học biển Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu ứng dụng Công nghệ Nha Trang giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo cán công tác Viện công nghệ sinh học môi trƣờng – Đại học Nha Trang truyền đạt, trang bị cho kiến thức quý báu thời gian học tập trƣờng Và cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân bạn bè động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận văn Luận văn đƣợc hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam: “Nghiên cứu định hƣớng sử dụng hemagglutinin từ sinh vật biển” với mã số: VAST06.04/16-17, thực năm 2016-2017 Xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 19 tháng 08 năm 2017 Chữ ký học viên Đinh Thành Trung iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG .x DANH MỤC HÌNH ẢNH xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bọt biển 1.1.1 Sự phân bố bọt biển 1.1.2 Phân loại bọt biển 1.2 Tổng quan lectin 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Sự phân bố lectin sinh giới 1.2.3 Vai trò sinh học lectin 1.2.4 Một số ứng dụng lectin 1.3 Tổng quan lectin từ bọt biển 1.3.1 Các dạng lectin bọt biển 1.3.2 Một số đặc điểm lectin từ bọt biển 1.3.2.1 Trọng lƣợng phân tử 1.3.2.2 Trình tự cấu trúc .10 1.3.2.3 Tƣơng tác lectin với loại đƣờng 12 1.3.2.4 Khả gây ngƣng kết tế bào 12 1.3.2.5 Ảnh hƣởng số yếu tố lên hoạt độ lectin 12 1.3.3 Một số hoạt tính sinh học lectin từ bọt biển 13 1.3.3.1 Tác động đến phân chia tế bào 13 v 1.3.3.2 Gắn kết với tế bào .14 1.3.3.3 Gây độc tế bào 14 1.3.3.4 Sản sinh cytokine 14 1.3.3.5 Kháng vi sinh vật .15 1.3.4 Ứng dụng sinh học lectin từ bọt biển 15 1.3.5 Tình hình nghiên cứu lectin từ bọt biển 16 Phƣơng pháp thu nhận lectin 17 1.4 1.4.1 Các kỹ thuật chiết lectin .17 1.4.2 Kỹ thuật kết tủa muối trung tính 17 1.4.3 Kết tủa dung môi hữu .18 1.4.4 Thẩm tách .18 1.4.5 Các kỹ thuật tinh sắc ký 18 CHƢƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng, địa điểm thời gian nghiên cứu 20 2.2 Vât liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu bảo quản mẫu 22 2.3.2 Phƣơng pháp định danh mẫu bọt biển 22 2.3.3 Quy trình nghiên cứu tổng quát lectin từ bọt biển .23 2.3.4 Xác định hoạt độ lectin phƣơng pháp Ngƣng kết hồng cầu 24 2.3.5 Xác định hàm lƣợng Protein phƣơng pháp Lowry 25 2.3.6 Phƣơng pháp khảo sát yếu tố cho trình chiết lectin từ bọt biển 27 2.3.6.1 Khảo sát dung môi chiết 27 2.3.6.2 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) 27 2.3.6.3 Khảo sát thời gian chiết .27 2.3.6.4 Khảo sát nhiệt độ chiết 28 vi 2.3.7 Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa lectin 28 2.3.8 Tinh kỹ thuật sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 28 2.3.9 Tinh kỹ thuật sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 29 2.3.10 Kiểm tra mức độ tinh xác định trọng lƣợng phân tử lectin phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 29 2.3.11 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng pH, nhiệt độ, EDTA ion Ca2+ lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin 32 2.3.12 Phƣơng pháp khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate lectin 33 2.3.13 Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn lectin từ bọt biển 34 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết đánh giá diện lectin số mẫu bọt biển .37 3.2 Kết định danh mẫu bọt biển BB-NT01.1 .43 3.3 Ảnh hƣởng điều kiện chiết đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ bọt biển Axinyssa sp .43 3.3.1 Ảnh hƣởng dung môi .44 3.3.2 Ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) 45 3.3.3 Ảnh hƣởng thời gian chiết .46 3.3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết 47 3.4 Tinh lectin 48 3.4.1 Khảo sát nồng độ ammonium sunfate (NH4)2SO4 để kết tủa lectin .48 3.4.2 Kết tinh kỹ thuật sắc ký trao đổi ion nhựa DEAESepharose .50 3.4.3 Kết tinh kỹ thuật sắc ký lọc gel nhựa Sephacryl S-200 51 3.4.4 Kiểm tra mức độ tinh xác định trọng lƣợng phân tử lectin phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 52 3.4.5 Kết tổng hợp trình tinh lectin từ bọt biển Axinyssa sp 54 vii 3.5 Kết khảo sát số đặc tính hóa lý sinh học lectin từ bọt biển Axinyssa sp 58 3.5.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ ngƣng kết hồng cầu lectin 58 3.5.2 Ảnh hƣởng pH đến hoat độ ngƣng kết hồng cầu lectin 59 3.5.3 Ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt độ ngƣng kết hồng cầu lectin 61 3.5.4 Đặc tính liên kết carbohydrate .62 3.5.5 Hoạt tính kháng khuẩn lectin từ bọt biển Axinyssa sp 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên đầy đủ HĐR Hoạt độ riêng HĐTS Hoạt độ tổng số NKHC Ngƣng kết hồng cầu A Độ hấp thụ Tiếng Anh Absorption Kỹ thuật điện di gel SDS-PAGE polyacrylamide có diện SDS EDTA Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis Ethylenediaminetetraacetic acid Dung dịch đệm Tris TBS (hydroxymethyl) aminomethane Tris buffer saline – HCl chứa muối natri clorua PBS Dung dịch đệm phosphate chứa muối natri clorua ix Phosphate buffer saline DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.2 Các loại đƣờng glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết đƣờng lectin 33 Bảng 2.3 Các vi khuẩn kiểm định dùng thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 35 Bảng 3.1 Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu động vật dịch chiết lectin từ 16 mẫu bọt biển .38 Bảng 3.2 Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu ngƣời dịch chiết lectin từ 16 mẫu bọt biển 40 Bảng 3.3 Trọng lƣợng phân tử protein từ bọt biển Axinyssa sp 53 Bảng 3.4 Kết tinh lectin từ bọt biển Axinyssa sp 54 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt độ ngƣng kết hồng cầu lectin từ bọt biển Axinyssa sp 61 Bảng 3.6 Kết khảo sát đặc tính liên kết đƣờng lectin từ bọt biển Axinyssa sp 62 Bảng 3.7 Kết thử nghiệm khả kháng khuẩn lectin từ bọt biển Axinyssa sp .65 x Purification and mass spectrometric characterization', The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol 45(12), pp 2864-2873 21 Carté BK 1996, 'Biomedical Potential of Marine Natural Products', BioScience vol 46(4), pp 271-286 22 Cummings RD & Liu FT 2009 Chapter 33: Galectins NCBI Bookshelf 23 Dodd RY, Maclennan AP & Hawkins DC 1968, 'Haemagglutinins from Marine sponges', Vox Sang, vol 15, pp 386-391 24 Dogovic N, Sladic D, Kljiajic Z, Poznanovic S & Gasic MJ 1996, 'Isolation and partial characterization of a lectin from the marine sponge Crambe crambe.', J Serb Chem Soc , vol 61, pp 83-88 25 Donia M & Hamann MT 2003, 'Marine natural products and their potential applications as anti-infective agents', Lancet Infect Dis., vol 3(6), pp 338-348 26 Dresch RR, Lerner CB, Mothes B, Trindade VMT, Henriques AT & VozáriHampe MM 2012, 'Biological activities of ACL-I and physicochemical properties of ACL-II, lectins isolated from the marine sponge Axinella corrugata', Comparative Biochemistry and Physiology, vol Part B 161, pp 365– 370 27 Dresch RR, Zanetti GD, Irazoqui FJ, Sendra VG, Zlocowski N, Bernardi A, et al 2013, 'Staining tumor cells with biotinylated ACL-I, a lectin isolated from the marine sponge, Axinella corrugata ', Biotech Histochem, vol 88(1), pp 1-9 28 Dresch RR, Zanetti GD, Kanan JHC, Mothes B, Lerner CB, Trindade VMT, et al 2011, 'Immunohistochemical localization of an N-acetyl amino-carbohydrate specific lectin (ACL-I) of the marine sponge Axinella corrugata.', Acta Histochemica, vol 113, pp 671-674 29 Engel M, Bachmann M, Schröder HC, Rinkevich B, Kljajic Z, Uhlenbruck G, et al 1992, 'A novel galactose- and arabinose-specific lectin from the sponge Pellina semitubulosa: isolation, characterization and immunobiological properties', Biochimie, vol 74, pp 527-537 30 Fenton B, Arreguín Espinosa R, Vázquez Contreras E, Arreguín Lozano B, Sánchez Sánchez N, García Hernández E, et al 2013, 'Purification and 71 characterization of structural and functional properties of two lectins from a marine sponge Spheciospongia vesparia.', Indian J Biochem Biophys, vol 50, pp 562-569 31 Fenton B, Espinosa R Arreguin, Sánchez N Silvia, García-Hernández E, Contreras E Vázquez, Lozano B Arreguín, et al 2013, 'Purification and characterization of structural and functional properties of two lectins from a marine sponge Spheciospongia vesparia', Indian journal of biochemistry and biophysics, vol 50, pp 562-569 32 Fischer E & Brossmer R 1995, 'Sialic acid-binding lectins: submolecular specificity and interaction with sialoglycoproteins and tumour cells', Glycoconjugate Journal vol 12 (5), pp 707-713 33 Gadelha CA, Filho SMG, Cardoso JD, Anaya K, Nascimento ES, Lacerda JT, et al 2014, 'Marine Sponge Lectins: Actual Status on Properties and Biological Activities ', Molecules, vol 20(1), pp 348-357 34 Gardères J, Müller WE, Bourguet-Kondrack ML, Hamer B, Batel R & Schröder HC 2015, 'Porifera Lectins: Diversity, Physiological Roles and Biotechnological Potential ', Mar Drugs., vol 13(8), pp 5059-5101 35 Goldstein IJ, Hughes RC, Monsigny M, Osawa T & Sharon N 1980, 'What should be call a lectin?', Nature (London), vol 285, pp 66 36 Gundacker D, Leys SP, Schröder HC, IM IM Müller & WE WE Müller 2001, 'Isolation and cloning of a C-type lectin from the hexactinellid sponge Aphrocallistes vastus: a putative aggregation factor.', Glycobiology, vol 11, pp 21-29 37 Han JW, Yoon KS & Klochkova TA 2011, 'Purification and characterization of a lectin, BLP-3, from the marine green alga Bryopsis plumose', J Appl Phycol, vol 23, pp 745-753 38 Hori K, KMiyazawa & Ito K 1986a, 'Preliminary characterization of Agglutinins from seven marine algal species', Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisher, vol 52(2), pp 323-331 72 39 Hori K, Miyazawa K & Ito K 1990, 'Some common properties of lectins from marine algae', Hydrobiologia, vol 204, pp 561-566 40 Hori K, Miyazawa K & Ito K 1986b, 'Isolation and Characterization of Glycoconjugate-specific Isoagglutinins from a Marine Green Alga Boodlea coacta (Dickie) Murray et De Toni', Botanica Marina, vol 29, pp 323-338 41 Hung LD, Hori K & Nang HQ 2009, 'Screening and preliminary characterization of hemagglutinins in Vietnamese marine algae', J Appl Phycol, vol 21, pp 8997 42 Hung LD, Ly BM & Trang VTD 2012, 'A new screening for hemagglutinins from Vietnamese marine macroalgae', J Appl Phycol, vol 24, pp 227-235 43 Janzen DH, Juster HB & Liener IE 1976, 'Insecticidal action of the phytohemagglutinin in black beans on a bruchid beetle', Science, vol 192, pp 795-796 44 Kamiya H, Muramoto K & Goto R 1990, 'Purification and Characterization of a Lectin from a Marine Sponge Halichondria panicea', NIPPON SUISAN GAKKAISHI, vol 56(7), pp 1159 45 Kawabata S & Iwanaga S 1999a, 'Role of lectins in the innate immunity of horseshoe crab.', Dev Comp Immunol., vol 23, pp 391-400 46 Kawabata S & Iwanaga S 1999b, 'Role of lectins in the innate immunity of horseshoe crab', Developmental and Comparative Immunology, vol 23, pp 391400 47 Kawagishi H, Yamawaki M, Isobe S, Usui T, Kimura A & Chiba S 1994, 'Two Lectins from the Marine Sponge Halichondria okadai AN N-ACETYLSUGAR-SPECIFIC LECTIN (HOL-I) AND AN N-ACETYLLACTOSAMINE SPECIFIC LECTIN (HOL-II)', The Journal of Biological Chemistry, vol 269, pp 1375-1379 48 Kim SK 2016 Marine Glycobiology: Principles and Applications CRC Press 49 Krautter M 1998, 'Ecology of siliceous sponges-Application to the environmental interpretation of the Upper Jurassic sponge facies (Oxfordian) from Spain.', Cuadernos de Geología Ibérica, vol 24, pp 223-239 73 50 Lezica RP 2014 Lectins AccessScience McGraw-Hill Education 51 Lodish H, Berk A, Zipursky L, Matsudaira P, Baltimore D & Darnell J 2000 Molecular cell biology W.H Freeman 52 Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL & Ran RJ 1951, 'Protein measurement with the Folin Phenol reagent', The Journal of biological chemistry, vol 193, pp 265275 53 Luk’yanova PA, Chernikova OV, Kobeleva SS, Chikalovetsa IV, Molchanovaa VI & Li W 2007, 'Carbohydrate-Binding Proteins of Marine Invertebrates', Russian Journal of Bioorganic Chemistry, vol 33, pp 161-169 54 Mayer AM, Rodríguez AD, Berlinck RG & Hamann MT 2009, 'Marine pharmacology in 2005–6: Marine compounds with anthelmintic, antibacterial, anticoagulant, antifungal, anti-inflammatory, antimalarial, antiprotozoal, antituberculosis, and antiviral activities; affecting the cardiovascular, immune and nervous systems, and other miscellaneous mechanisms of action', Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol 1790, pp 283-308 55 Mebs D, Weiler I & Heinke HF 1985, 'Bioactive proteins from marine sponges: Screening of sponge extracts for hemagglutinating, hymolytic, ichthyotoxic and lethal properties and isolation and characterization of hemagglutinins.', Toxicon, vol 23(6), pp 955-962 56 Medeiros DS, Medeiros TL, Ribeiro JK, Monteiro NK, Migliolo L, Uchoa AF, et al 2010, 'A lactose specific lectin from the sponge Cinachyrella apion: Purification, characterization, N-terminal sequences alignment and agglutinating activity on Leishmania promastigotes', Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol., vol 155, pp 211-216 57 Mehbub MF, Lei J, Franco C & Zhang W 2014, 'Marine Sponge derived natural priducts between 2001 and 2010: Trends and opportunities for discovery of bioactives', Mar Drugs, vol 12, pp 4539-4577 58 Miarons PB & Fresno M 2000, 'Lectins from Tropical Sponges: Purification and Charaterization of Lectins from genus Aplysina', J Biol Chem, vol 275(38), pp 29283-29289 74 59 Molinski TF, Dalisay DS, Lievens SL & Saludes JP 2009, 'Drug development from marine natural products', Nat Rev Drug Discov., vol 8, pp 69-85 60 Moura RM, Sales MP, Queiroz AFS, Fook JMSLL, Dias ASF, Monteiro NKV, et al 2006, 'CvL, a lectin from the marine sponge Cliona varians: Isolation, characterization and its effects on pathogenic bacteria and Leishmania promastigotes.', Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol., vol 145 (4), pp 517-523 61 Müller WE, Zahn RK, Kurelec B, Lucu C, Müller I & Uhlenbruck G 1981, 'Lectin, a possible basis for symbiosis between bacteria and sponges.', Journal of Bacteriology, vol 145, pp 548-558 62 Munro MHG, Blunt JW, Dumdei EJ, Hickford SJ, Lill RE, Li S, et al 1999, 'The discovery and development of marine compounds with pharmaceutical potential', J Biotechnol., vol 70, pp 15-25 63 Ogawa T, Watanabe M, Naganuma T & Muramoto K 2011, 'Diversified carbohydrate-binding lectins from marine resources', Journal of Amino Acids, vol 2011, pp 64 Okino N, Kawabata S, Saito T, Hirata M, Takagi T & Iwanaga S 1995, 'Purification, characterization, and cDNA cloning of a 27-kDa lectin (L10) from horseshoe crab hemocytes', J Biol Chem., vol., pp 31008–31015 65 Ozeki Y, Kawsar SMA, Fujii Y, Matsumoto R, Ichikawa T, Tateno H, et al 2008, 'Isolation, purification, characterization and glycan-binding profile of a Dgalactoside specific lectin from the marine sponge, Halichondria okadai', Comparative Biochemistry and Physiology, vol 150, pp 349-357 66 Ozeki Y, Matsumoto R, Fujii Y, Kawsar SMA, Kanaly RA, Yasumitsu H, et al 2012, 'Cytotoxicity and Glycan-Binding Properties of an 18 kDa Lectin Isolated from the Marine Sponge Halichondria okadai', Toxins, vol 4(5), pp 323-338 67 Pajic I, Kljajic Z, Dogovic N, Juranic Z & Gasic MJ 2002, 'A novel lectin from the sponge Haliclona cratera: isolation, characterization and biological activity', Comparative Biochemistry and Physiology, vol 132, pp 213-221 75 68 Pearce OM & Läubli H 2016, 'Sialic acids in cancer biology and immunity.', Glycobiology, vol 26, pp 111-128 69 Peumans WJ & VanDamme EJ 1995, 'The role of lectins in plant defence', Histochem J, vol 27, pp 253-271 70 Quang Thai Minh 2013 A review of the diversity of sponges (Porifera) in Vietnam The 2nd international workshop on marine bioresources of Vietnam Hanoi 71 Queiroz AF, Silva RA, Moura RM, Dreyfuss JL, Paredes-Gamero EJ, Souza AC, et al 2009, 'Growth inhibitory activity of a novel lectin from Cliona varians against K562 human erythroleukemia cells', Cancer Chemother Pharmacol, vol 63(6), pp 1023-1033 72 Rabelo L, Monteiro N, Serquiz R, Santos P, Oliveira R, Oliveira A, et al 2012, 'A lactose-binding lectin from the marine sponge Cinachyrella Apion (cal) induces cell death in human cervical adenocarcinoma cells', Mar Drugs, vol 10, pp 727-743 73 Rabelo L, Santos E, Monteiro N, Serquiz R, Santos P, Oliveira R, et al 2012, 'A Lactose-Binding Lectin from the Marine Sponge Cinachyrella Apion (Cal) Induces Cell Death in Human Cervical Adenocarcinoma Cells', Mar Drugs, vol 10, pp 727-743 74 Rogers DJ & Fish BC 1991, 'Marine algal lectins', Sigma Chemical Company, vol 1, pp 129-142 75 Rômulo Farias Carneiro, Arthur Alves de Melo, Alexandra Sampaio de Almeida, Raniere da Mata Moura, Renata Pinheiro Chaves, Bruno Lopes de Sousa, et al 2013, 'H3, a new lectin from the marine sponge Haliclona caerulea: Purification and mass spectrometric characterization', The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol 45, pp 2864-2873 76 Saito T, Kawabata S, Hirata M & Iwanaga S 1995, 'A novel type of lemulus Lectin-L6: Purification, Primary structure, and Antibacteria activity.', J Biol Chem, vol 270(24), pp 14493-14499 76 77 Sampaio AH, Carneiro RF, Melo AA, Nascimento FEP, Simplicio CA, Nascimento KSD, et al 2013, 'Halilectin (H-1) and Halilectin (H-2): two new lectins isolated from the marine sponge Haliclona caerulea', Molecular Recognition, vol 26, pp 51-58 78 Sang VT & Kim SK 2010, 'Potential Anti-HIV Agents from Marine Resources: An Overview', Mar Drugs, vol 8, pp 2871-2892 79 Schroder HC, Boreiko A, Korzhev M, Tahir MN, Tremel W, Eckert C, et al 2006, 'Co-expression and Functional Interaction of Silicatein with Galectin: matrix guided formation of siliceous spicules in the marine Demosponge Suberites domuncula.', J Biol Chem., vol 281, pp 12001-12009 80 Schröder HC, Kljajic Z, Weiler E, Gasic M, Uhlenbruck G, Kurelec B, et al 1990, 'The Galactose-Specific Lectin from the Sponge Chondrilla Nucula Displays Anti-Human Immunodeficiency Virus Activity in vitro via Stimulation of the (2′-5′)Oligoadenylate Metabolism', Antiviral Chemistry and Chemotherapy, vol 1, pp 99-105 81 Schröder HC, Ushijima H, Krasko A, Gamulin V, Thakur NL, Seifert BD, et al 2003, 'Emergence and disappearance of an immune molecule, an antimicrobial lectin, in basal metazoa A tachylectin-related protein in the sponge Suberites domuncula', J Biol Chem., vol 278(35), pp 32810-32817 82 Sharon N 1987, 'Bacterial lectins, cell-cell recognition and infectious disease', The Second Datta Lecture, vol 217(2), pp 145-157 83 Sharon N & Lis H 2004, 'History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules', Glycobiology, vol 14(11), pp 53R-62R 84 Sharon N & Lis H 2003 Lectins Kluwer Academic Publishers 85 Sipkema D, Franssen MC, Osinga R, Tramper J & Wijffels RH 2005, 'Marine Sponges as Pharmacy', Mar Biotechnol, vol 7(3), pp 142-162 86 Smith VJ, Desbois AP & Dyrynda EA 2010, 'Conventional and unconventional antimicrobials from fish, marine invertebrates and micro-algae', Mar Drugs, vol 8, pp 1213-1262 77 87 Stalz H, Roth U, Schleuder D, Macht M, Haebel S, Strupat K, et al 2006, 'The Geodia cydonium galectin exhibits prototype and chimera-type characteristics and a unique sequence polymorphism within its carbohydrate recognition domain.', Glycobiology, vol 16, pp 88 Teixeira EH, Napimoga MH, Carneiro VA, Oliveira TMD, Nascimento KS, Nagano CS, et al 2007, 'In vitro inhibition of oral streptococci binding to the acquired pellicle by algal lectins', J Appl Microbiol, vol 103(4), pp 1001-1006 89 Ueda T, Nakamura Y, Smith CM, Copits BA, Inoue A, Ojima T, et al 2013, 'Isolation of novel prototype galectins from the marine ball sponge Cinachyrella sp guided by their modulatory activity on mammalian glutamate-gated ion channels', Glycobiology, vol 23(4), pp 412-425 90 Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, et al (eds.) 2009 Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press 91 Vozári-Hampe MM, Dresch RR, Zanetti GD, Lerner CB, Mothes B, Trindade VM, et al 2008, 'ACL-I, a lectin from the marine sponge Axinella corrugata: Isolation, characterization and chemotactic activity', Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, vol 148, pp 23-30 92 Weaver JC, Aizenberg J, Fantner GE, Kisailus D, Woesz A, Allen P, et al 2007, 'Hierarchical assembly of the siliceous skeletal lattice of the hexactinellid sponge Euplectella aspergillum', Journal of Structural Biology, vol 158(1), pp 93-106 93 Wiens M, Korzhev M, Krasko A, Thakur NL, Perović-Ottstadt S, Breter HJ, et al 2005, 'Innate immune defense of the sponge Suberites domuncula against bacteria involves a MyD88-dependent signaling pathway Induction of a perforin-like molecule', J Biol Chem, vol 280(30), pp 27949-27959 94 Xiong C, Li W, Liu H, Zhang W, Dou J, Bai X, et al 2006, 'A normal mucinbinding lectin from the sponge Craniella Biochemistry and Physiology, vol 143, pp 9-16 78 australiensis', Comparative PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Các mẫu bọt biển sử dụng sàng lọc Bảng Thông tin mẫu bọt biển sàng lọc diện lectin TT Kí hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu Thời gian thu mẫu BB-NT01.1 Hòn Một, Nha Trang 04/2016 BB-NT01.2 Hòn Một, Nha Trang 07/2016 BB-NT02.1 Mũi Mỹ - nam Hòn Một, Nha Trang 02/2016 BB-NT02.2 Mũi Mỹ - nam Hòn Một, Nha Trang 02/2016 BB-NT03.1 Bãi Lận – đầu Đầm Bấy, Nha Trang 02/2016 BB-NT04.1 Hòn Mun, Nha Trang 07/2016 BB-NT04.2 Hòn Mun, Nha Trang 07/2016 BB-NT04.3 Hòn Mun, Nha Trang 07/2016 BB-NT04.4 Hòn Mun, Nha Trang 07/2016 10 BB-VH3.1 Vĩnh Hy, Ninh Thuận 06/2016 11 BB-VH3.2 Vĩnh Hy, Ninh Thuận 06/2016 12 BB-VH3.3 Vĩnh Hy, Ninh Thuận 06/2016 13 BB-VH3.4 Vĩnh Hy, Ninh Thuận 06/2016 14 BB-VH3.5 Vĩnh Hy, Ninh Thuận 06/2016 15 BB-VH3.6 Vĩnh Hy, Ninh Thuận 06/2016 16 BB-VH3.7 Vĩnh Hy, Ninh Thuận 06/2016 PHỤ LỤC 2: Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry Bảng Giá trị mật độ quang OD tƣơng ứng với nồng độ BSA (μg/ml) A750 nm Nồng độ BSA (μg/ml) OD1 OD2 Odtb 20 0,053 0,049 0,051 40 0,095 0,105 0,1 80 0,202 0,204 0,203 120 0,295 0,288 0,292 160 0,399 0,391 0,395 200 0,482 0,518 0,5 PHỤ LỤC 3: Xác định trọng lƣợng phân tử protein điện di SDS-PAGE Bảng Giá trị Rf lg M protein thang chuẩn Khối lƣợng phân tử M (Dal) Khoảng cách di chuyển vạch Rf Lg M Protein (cm) 100000 0,90 0,15 5,00 75000 1,20 0,20 4,88 58000 1,50 0,25 4,76 46000 2,00 0,33 4,66 32000 2,60 0,43 4,51 25000 3,20 0,52 4,40 22000 3,80 0,62 4,34 17000 4,10 0,67 4,23 11000 4,80 0,79 4,04 PHỤ LỤC 4: Kết khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình chiết lectin từ bọt biển Axynissa sp Bảng Ảnh hƣởng dung môi đến hoạt độ tổng số hoạt độ riêng lectin từ bọt biển Axinyssa sp Hàm lƣợng Dung môi chiết Protein HĐTS HĐR SD tổng số (HU) (HU/ml) HĐTS SD HĐR (mg) TBS 28,76 512 17,80 0,77 PBS 40,00 512 12,80 0,23 E30 38,99 512 13,13 0,18 Nƣớc cất 40,19 512 12,74 0,13 Bảng Ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) đến Hoạt độ tổng số Hoạt độ riêng lectin từ bọt biển Axynissa sp Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) Hàm lƣợng Protein tổng số (mg) 1:2 16,76 129,07 1:4 27,51 1:6 HĐTS HĐR (HU) (HU/ml) SD HĐTS SD HĐR 10,06 1,85 0,68 512 18,61 1,31 37,39 384 10,27 0,63 1:8 39,14 256 6,54 0,34 1:10 38,93 160 4,11 0,21 Bảng Ảnh hƣởng thời gian chiết đến Hoạt độ tổng số Hoạt độ riêng lectin từ bọt biển Axinyssa sp Thời gian chiết (giờ) Hàm lƣợng Protein tổng số (mg) 10 12 23,36 27,18 32,12 33,95 34,20 34,50 HĐTS HĐR (HU) (HU/ml) 256 512 512 512 512 512 10,96 18,84 15,94 15,08 14,97 14,84 SD HĐTS SD HĐR 0 0 0 0,56 2,07 2,84 0,71 0,18 0,95 Bảng Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết đến Hoạt độ tổng số Hoạt độ riêng lectin từ bọt biển Axinyssa sp Nhiệt độ chiết (oC) Hàm lƣợng Protein tổng số (mg) HĐTS HĐR SD (HU) (HU/ml) HĐTS SD HĐR 28,32 512 18,08 1,15 10 30,35 512 16,87 0,80 20 34,25 512 14,95 1,17 30 38,38 512 13,34 0,36 Bảng Ảnh hƣởng nồng độ muối ammonium sunfate (NH4)2SO4 đến Hoạt độ tổng số Hoạt độ riêng lectin từ bọt biển Axinyssa sp Nồng độ muối (NH4)2SO4 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% Hàm lƣợng Protein tổng số (mg) 3,53 8,77 8,16 11,13 14,15 16,19 16,77 HĐTS (HU) HĐR (HU/ml) SD HĐTS SD HĐR 137,39 277,33 554,67 1126,40 1092,27 1109,33 563,20 38,88 31,63 68,00 101,24 77,17 68,50 33,58 5,91 7,39 14,78 29,56 29,56 2,36 1,10 4,34 7,32 4,54 0,40 0,22 PHỤ LỤC 5: Kết sắc ký PL5.1 Kết sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose Bảng Kết A280 nm nồng độ muối tƣơng ứng phân đoạn sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose Phân đoạn 10 11 12 13 14 15 16 17 18 A280 nm 0,021 0,006 0,009 0,019 0,064 0,084 0,12 0,167 0,196 0,231 0,272 0,318 0,363 0,413 0,445 0,497 0,555 0,543 Nồng độ NaCl Phân đoạn A280 nm Nồng độ NaCl 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 0,11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16 0,17 0,18 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 0,184 0,172 0,159 0,149 0,145 0,147 0,136 0,122 0,112 0,1 0,093 0,086 0,076 0,077 0,073 0,078 0,074 0,063 0,26 0,27 0,28 0,29 0,3 0,31 0,32 0,33 0,34 0,35 0,36 0,37 0,38 0,39 0,4 0,41 0,42 0,43 19 20 21 22 23 24 25 0,486 0,423 0,363 0,308 0,264 0,224 0,2 0,19 0,2 0,21 0,22 0,23 0,24 0,25 44 45 46 47 48 49 50 0,061 0,049 0,047 0,041 0,038 0,025 0,018 0,44 0,45 0,46 0,47 0,48 0,49 0,5 PL5.2 Sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 Bảng 10 Kết A280 nm hoạt độ ngƣng kết hồng cầu phân đoạn sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 Phân đoạn 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 A280 nm 0 0 0 0 0 0 0 0,004 0,04 0,043 0,039 0,047 0,077 0,115 0,102 0,088 0,076 Hoạt độ NKHC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Phân đoạn A280 nm 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 0,075 0,068 0,061 0,052 0,04 0,027 0,017 0,01 0,008 0,005 0,002 0,005 0,011 0,008 0,002 0 0 0 0 0 Hoạt độ NKHC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ... diện lectin bọt biển đƣợc nhóm nghiên cứu Dodd công bố lần vào năm 1986, đƣợc coi nghiên cứu sớm lectin từ bọt biển (Dodd et al 1968) 1.3.1 Các dạng lectin bọt biển Kết nghiên cứu Gardères bọt biển. .. sp., hay lectin thu nhận từ lồi Aphrocallister vastus… Tuy nhiên, có nghiên cứu mô tả đặc điểm cấu trúc lectin từ bọt biển CchG-1, galectin từ bọt biển thu c chi Cinachyrella, lectin từ bọt biển. .. 2011) Lectin từ bọt biển đƣợc nghiên cứu nhiều giới Tuy nhiên, Việt Nam, nghiên cứu lectin từ sinh vật biển chủ yếu tập trung số loài rong biển, chƣa có cơng bố thức lectin từ bọt biển Thêm vào