Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)

Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THỊ TRÀ MI Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH ĐẠI GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS KODAKARENSIS KOD1” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học : Chính quy : Cơng nghệ Sinh học : CNSH - CNTP : 2012 - 2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THỊ TRÀ MI Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS KODAKARENSIS KOD1” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : K44 - CNSH Khóa học : 2012 - 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: TS Phạm Bằng Phƣơng Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Đƣợc đồng ý khoa Khoa Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên Em thực tập tốt nghiệp Phòng Ni Cấy Mơ Tế Bào Thực Vật - Khoa Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: “Nghiên cứu khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase vi khuẩn chịu nhiệt Thermonococcus kodakarensis KOD1” Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp nỗ lực thân em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ ban giám hiệu Nhà trƣờng Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ sinh học công nghệ thực phẩm, tận tình giảng dạy thầy suốt năm học Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa toàn thể thầy cô giáo Đặc biệt, em xin đƣợc bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn tới thầy giáo TS Phạm Bằng Phƣơng ngƣời tận tình hƣớng dẫn em suốt trình em thực đề tài Em xin cảm ơn chị Ma Thị Hồn, cán phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật khoa Cơng Nghệ Sinh Học công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại HọcNông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ em q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, ngƣời thân bạn bè động viên giúp đỡ em suốt thời gian qua Do điều kiện thời gian có hạn nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, kính mong thầy đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài em đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực Lê Thị Trà Mi ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng 18 Bảng 3.2: Trình tự mồi 18 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 3.4: Chu trình nhiệt PCR 27 Bảng 4.1: Dải nhiệt độ chạy PCR 35 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Nơi phân lập Hình 2.2: Vi khuẩn T Kodakarensis kod1 Hình 2.3: Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus Hình 2.4: Sơ đồ giải trình tự gen vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 Hình 2.5: Enzyme protease 10 Hình 2.6: Cấu trúc enzyme 11 Hình 2.7: Sơ đồ phân loại enzyme protease 12 Hình 3.1: Mơi trƣờng nuôi cấy phân lập VK 23 Hình 3.2: Phân tử Ethidium bromide 25 Hình 4.1a: Mơi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn T Kodakarensis 31 Hình 4.1b: Ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số 32 Hình 4.2a: Thiết kế mồi 32 Hình ảnh 4.2b: Kết điện di sản phẩm PCR 33 Hình 4.3: Ảnh điện di kiểm tra nhiệt độ gắn mồi PCR 34 : iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT DNA :Axit deoxiribonucleic ARN : Axit ribonucleic ARNase : Ribonuclease dNTP : Deoxynucleoside triphosphate EDTA : Ethylene diamine tetra – acetic acid OD : Optical Density (Mật độ quang học) PCR : polymerase chain reaction SDS : Sodium Dodecyl Sulphate TAE : Tris- acetate- EDTA E.coli : Escherichia coli Amp : Ampicillin EtBr : Ethydium bromide Bp : base pair Kb : kilo base pair v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nội dung đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Nội dung 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm chung hệ gen 2.1.4 Đặc điểm sinh trƣởng phát triển 2.2 Tổng quan protein TK 1284 2.2.1 Enzyme proteae 2.2.2 Hệ thống phân loại enzyme protease 12 2.2.3 Ứng dụng 13 2.2.4 Aminopeptidase gene Tk1284 vi khuẩn T Kodakarensi KOD1 mã hóa 15 vi 2.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc giới 15 PHẦN 3: Đối tƣợng , nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 17 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 17 3.2.Nội dung 17 3.4 Địa điểm thời gian tiến hành 18 3.5 Thiết bị 18 3.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.5.1.phƣơng pháp so sánh trình tự protein……………………………21 3.5.2 Phƣơng pháp nuôi cấy 24 3.5.3 Phƣơng pháp tách chiết AND tổng số 234 3.5.5 Phƣơng pháp PCR 26 3.5.4 Phýõng pháp ðiện di 24 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.3 Kết kiểm tra nhiệt độ mồi ảnh hƣởng đên phản ứng PCR 34 4.1 Kết tách chiết ADN tổng số 31 4.2 Nhân gene TK 1284 từ chủng vi khuẩn Thermococcus kodakaren KOD1 phản ứng PCR 32 4.4 Kết so sánh trình tự TK 1284 với protein biết ngân hàng NCBI phần mềm Runblast bioedit 28 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt II Tài liệu tiếng Anh PHỤ LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ Công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất nhiều đƣợc sử dụng hầu hết lĩnh vực nhƣ: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…[1] Hàng năm lƣợng enzyme đƣợc sản xuất giới đạt khoảng 300 nghìn với giá trị 500 triệu USD, đƣợc phân phối ngành khác nhau[1] Phần lớn enzyme đƣợc sản xuất quy mô công nghiệp thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy[2] Khoảng 75% chế phẩm enzyme thủy phân, đƣợc sử dụng cho việc thủy phân chất tự nhiên Ngành sản xuất hóa chất cơng nghiệp dựa xúc tác sinh học cho thấy có nhiều lợi so với tổng hợp hóa học, ví dụ nhƣ sản xu ất có chọn lọc đồng phân quang học sử dụng sinh khối, hỗn hợp phức tạp phân tử hữu cơ, làm nguyên liệu[3] Việc sử dụng enzyme chịu nhiệt nhƣ chất xúc tác thiết kế quy trình chuyển hóa, chứa tồn hệ thống enzyme chịu nhiệt, cấu tạo nên chuổi phản ứng mà muốn, làm biến tính enzyme nội sinh tế bào cần bƣớc chuẩn bị để có hỗn hợp enzyme chịu nhiệt Thêm vào đó, đặc tính bền enzyme chịu nhiệt nên hạn chế bất lợi sinh chuyển hóa in vitro, khơng có khả tổng hợp tái tạo protein Protease enzyme đƣợc sử dụng nhiều số ngành sản xuất nhƣ: chế biến thực phẩm (làm đông tụ sữa làm mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lƣợng sản phẩm sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nhƣ nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm đƣợc tạo nhiều Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease cao, hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme sản xuất Protease phân bố thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme chế phẩm thu đƣợc sau q trình ni cấy sản xuất enzyme chƣa phải chế phẩm có độ tinh khiết cao protein chiếm từ 20-30 %[1] Protease động vật hay thực vật chứa hai loại endopeptidase exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả sinh hai loại trên, protease vi khuẩn có tính đặc hiệu chất cao Chúng có khả phân hủy tới 80% liên kết peptide phân tử protein Đặc biệt vi khuẩn cổ sống mơi trƣờng khắc nghiệt, có tính chống chịu với nhiệt hay axít kiềm, nguồn tạo enzyme hoạt động dƣới điều kiện khắc nghiệt Những enzyme phát đƣợc tạo từ vi khuẩn có khả chịu nhiệt 130˚C, tồn phát triển nơi có nồng độ acid cao… [1]với khả nhƣ có ý nghĩa nghiên cứu khoa học, cho phát triển ngành sản xuất Chính vậy, việc nghiên cứu tạo enzyme từ vi khuẩn cấp thiết, đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme protease nghiên cứu nói chung cơng nghiệp xuất nói riêng quan trọng cấp thiết, xuất phát từ lý trên, xin tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” hy vọng khuyếch đại đƣợc dòng gene Tk 1284 mã hóa enzyme aminopeptidase vi khuẩn T Kodakarensis đáp ứng nhu cầu cần thiết 1.2 Mục đích nội dung đề tài 1.2.1 Mục đích  Nghiên cứu gene Tk 1284 enzyme peptidase gen Tk 1284 vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa  Nhân nhanh gene Tk1284 vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 phản ứng PCR ... phát từ lý trên, xin tiến hành đề tài: Nghiên cứu khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” hy vọng khuyếch đại đƣợc dòng gene Tk 1284. ..ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THỊ TRÀ MI Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS KODAKARENSIS. .. 1284 mã hóa enzyme aminopeptidase vi khuẩn T Kodakarensis đáp ứng nhu cầu cần thiết 1.2 Mục đích nội dung đề tài 1.2.1 Mục đích  Nghiên cứu gene Tk 1284 enzyme peptidase gen Tk 1284 vi khuẩn Thermococcus