Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. (Khóa luận tốt nghiệp)

Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o VŨ THỊ THÙY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o VŨ THỊ THÙY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: TS Phí Quyết Tiến Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài nghiên cứu luận văn này, tơi nhận giúp đỡ tận tình thầy cán Phòng Cơng nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trước hết xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến – Phó viện trưởng Viện Cơng nghệ Sinh học, Trưởng phòng Cơng nghệ Lên men, Viện Cơng nghệ Sinh học, người tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới NCS Vũ Thị Hạnh Ngun – cán phòng Cơng nghệ Lên men, người trực tiếp hướng dẫn thực đề tài nghiên cứu Đồng thời xin cảm ơn CN Nguyễn Phú Tâm cán Phòng Cơng nghệ Lên men bảo tơi nhiệt tình, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn ThS Bùi Đình Lãm thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, thầy cô, cán trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đồng hành suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, người giúp đỡ, động viên tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực tập Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh viên Vũ Thị Thùy ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 11 Bảng 2.2 Tổng hợp số nghiên cứu giới loài xạ khuẩn nội sinh thực vật 14 Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 26 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái số chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ mẫu Màng tang 28 Bảng 4.2 Số liệu thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 45 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ Màng tang 32 Bảng 4.3 Khả sinh anthracycline chủng xạ khuẩn 34 Bảng 4.4 Màu sắc khuẩn lạc chủng MPT25 nuôi cấy môi trường khác 36 Bảng 4.5 Khả đồng hóa nguồn carbon, nguồn nitơ chủng xạ khuẩn MPT25 sau 7-14 ngày nuôi cấy 30°C 37 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng chủng MPT25 38 Bảng 4.7 Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn MPT25 39 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA 17 Hình 4.1 Hình ảnh khuẩn lạc đại diện chủng xạ khuẩn nội sinh ba môi trường đặc hiệu phận khác sau tuần nuôi cấy (A-Rễ, BThân, C-Lá) 27 Hình 4.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố phận Màng tang 29 Hình 4.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân theo môi trường phân lập 30 Hình 4.4 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn nội sinh phân theo nhóm màu 31 Hình 4.5 Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A), Pseudomonas aeruginosa CNLM (B) chủng xạ khuẩn nội sinh 33 Hình 4.6 Hình thái khuẩn lạc mơi trường ISP4(A), hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử kính hiển vi có độ phóng đại 5.000 lần (B) 20.000 lần (C) chủng MPT25 36 Hình 4.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% 39 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt STT Tên đầy đủ CA Citrate acid-agar DAB Deacetil baceatin DNA Deoxyribonucleotide acid DNR Daunorubicin DOX1 Doxorubicin HV Humic acid-agar IDA Idarumycin NaOCl Sodium hypochlorite RNA Ribonucleic acid 10 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar 11 VSV Vi sinh vật v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Xạ khuẩn nội sinh dược liệu 2.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh dược liệu 2.1.2 Đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn 2.1.3 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 2.1.4 Cơ chế nội sinh xạ khuẩn thực vật 2.1.5 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh thực vật 2.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 13 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 2.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 2.3 Khả sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 16 2.4 Cây Màng tang tiềm phân lập xạ khuẩn nội sinh 18 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 3.1 Vật liệu nghiên cứu 20 3.1.1 Thu thập mẫu Màng tang, chủng gống vi sinh vật 20 3.1.2 Hóa chất 20 3.1.3 Thiết bị 21 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 21 vi 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 21 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Lấy mẫu Màng tang 22 3.4.2 Phương pháp xử lý bề mặt mẫu 22 3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn 22 3.4.4 Đánh giá khả sinh anthracycline 23 3.4.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT25 23 3.4.6 Phân loại chủng xạ khuẩn MPT25 dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA 25 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh Màng tang thu thập tỉnh Phú Thọ 27 4.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang 29 4.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo phận Màng tang 29 4.2.2 Đa dạng xạ khuẩn Màng tang theo môi trường phân lập 30 4.2.3 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty 31 4.3 Khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn nội sinh 32 4.3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn 32 4.3.2 Khả sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline 34 4.4 Đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn MPT25 35 4.4.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT25 35 4.4.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn MPT25 38 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, người phải đối mặt với nhiều dịch bệnh gây vi khuẩn, nấm, virus vi sinh vật khác Để điều trị bệnh truyền nhiễm gây vi sinh vật, kháng sinh sử dụng chủ yếu Tuy nhiên, vi khuẩn gây bệnh có khả kháng thuốc kháng sinh vấn đề nghiêm trọng thu hút mối quan tâm hàng hàng đầu cộng đồng Vì vậy, việc nghiên cứu lựa chọn tác nhân kháng khuẩn từ tự nhiên ưu tiên hàng đầu nhà khoa học công ty dược phẩm giới Cho đến nay, nhà khoa học không ngừng tìm kiếm nguồn hợp chất tự nhiên khác để phát triển loại thuốc kháng sinh loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu tác dụng phụ tới sức khỏe người bệnh số thuốc tổng hợp hóa học gây Theo nghiên cứu Berdy, 2005 ước tính khoảng 70% kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên sử dụng y học lâm sàng sản sinh xạ khuẩn [10] Gần đây, số nghiên cứu cho thấy hợp chất chuyển hóa thứ cấp chủng xạ khuẩn nội sinh dược liệu sinh đa dạng mặt số lượng hoạt tính sinh học như: chất kiểm soát sinh học, chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ,chất kích thích sinh học kiểm soát sinh học… [9, 48] Hơn nữa, nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cho thấy vai trò chức chúng cách tiếp cận đầy hứa hẹn để khắc phục mối đe dọa gia tăng kháng thuốc, chống lại tác nhân gây bệnh cho người thực vật Tuy nhiên, so với đa dạng giới thực vật, số lượng nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh thực vật hạn chế Một nguồn phân lập xạ khuẩn nội sinh thực vật, đặc biệt dược liệu Trong số đó, Màng tang (Litsea cubeba) loài dược liệu trồng lâu để khai thác với nhiều công dụng như: kháng khuẩn, kháng nấm, nhức đầu, đau dày, đầy hơi, phong thấp… Ngoài giá trị khoa học thành phần mang lại, qua khảo sát ban đầu cho thấy Màng tang mơi trường cho xạ khuẩn nội sinh có khả sinh tổng hợp chất kháng sinh, chất chống ung thư Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu xạ khuẩn Màng tang nói riêng dược liệu nói chung Việt Nam hạn chế Vì vậy, thực đề tài: “Phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học xạ khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)” 1.2 Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả tổng hợp chất kháng khuẩn nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp kháng sinh cao 1.3 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập đánh giá khả sinh tổng hợp kháng sinh số chủng xạ khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) thu thập tỉnh Phú Thọ 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài kế thừa kết số nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu kết nghiên cứu trong, nước lĩnh vực khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật, nguồn hợp chất kháng sinh, kháng ung thư Đề tài chọn đối tượng Màng tang nghiên cứu nhiều trước đây, đặc biệt liên quan đến nghiên cứu tách chiết tinh dầu tách chiết hợp chất tự nhiên có tiềm kháng vi sinh vật, kháng tế bào ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o VŨ THỊ THÙY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) ... học xạ khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) ” 1.2 Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả tổng hợp chất kháng khuẩn nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân. .. sinh học phân loại xạ khuẩn 2.1.3 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 2.1.4 Cơ chế nội sinh xạ khuẩn thực vật 2.1.5 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh thực vật 2.2 Tình hình nghiên cứu xạ