Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang (litsea cubeba (lour ) pers

62 623 1
Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang (litsea cubeba (lour ) pers

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o VŨ THỊ THÙY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o VŨ THỊ THÙY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: TS Phí Quyết Tiến Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài nghiên cứu luận văn này, nhận giúp đỡ tận tình thầy cô cán Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trước hết xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến – Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, người tận tình hướng dẫn suốt trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên – cán phòng Công nghệ Lên men, người trực tiếp hướng dẫn thực đề tài nghiên cứu Đồng thời xin cảm ơn CN Nguyễn Phú Tâm cán Phòng Công nghệ Lên men bảo nhiệt tình, giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt trình thực tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn ThS Bùi Đình Lãm thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, thầy cô, cán trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đồng hành suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, người giúp đỡ, động viên tạo điều kiện cho suốt trình thực tập Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh viên Vũ Thị Thùy ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 11 Bảng 2.2 Tổng hợp số nghiên cứu giới loài xạ khuẩn nội sinh thực vật 14 Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 26 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái số chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ mẫu Màng tang 28 Bảng 4.2 Số liệu thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 45 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ Màng tang 32 Bảng 4.3 Khả sinh anthracycline chủng xạ khuẩn 34 Bảng 4.4 Màu sắc khuẩn lạc chủng MPT25 nuôi cấy môi trường khác 36 Bảng 4.5 Khả đồng hóa nguồn carbon, nguồn nitơ chủng xạ khuẩn MPT25 sau 7-14 ngày nuôi cấy 30°C 37 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng chủng MPT25 38 Bảng 4.7 Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn MPT25 39 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA 17 Hình 4.1 Hình ảnh khuẩn lạc đại diện chủng xạ khuẩn nội sinh ba môi trường đặc hiệu phận khác sau tuần nuôi cấy (A-Rễ, BThân, C-Lá) 27 Hình 4.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố phận Màng tang 29 Hình 4.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân theo môi trường phân lập 30 Hình 4.4 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn nội sinh phân theo nhóm màu 31 Hình 4.5 Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A), Pseudomonas aeruginosa CNLM (B) chủng xạ khuẩn nội sinh 33 Hình 4.6 Hình thái khuẩn lạc môi trường ISP4(A), hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử kính hiển vi có độ phóng đại 5.000 lần (B) 20.000 lần (C) chủng MPT25 36 Hình 4.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% 39 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt STT Tên đầy đủ CA Citrate acid-agar DAB Deacetil baceatin DNA Deoxyribonucleotide acid DNR Daunorubicin DOX1 Doxorubicin HV Humic acid-agar IDA Idarumycin NaOCl Sodium hypochlorite RNA Ribonucleic acid 10 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar 11 VSV Vi sinh vật v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Xạ khuẩn nội sinh dược liệu 2.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh dược liệu 2.1.2 Đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn 2.1.3 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 2.1.4 Cơ chế nội sinh xạ khuẩn thực vật 2.1.5 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh thực vật 2.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 13 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 2.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 2.3 Khả sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 16 2.4 Cây Màng tang tiềm phân lập xạ khuẩn nội sinh 18 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 3.1 Vật liệu nghiên cứu 20 3.1.1 Thu thập mẫu Màng tang, chủng gống vi sinh vật 20 3.1.2 Hóa chất 20 3.1.3 Thiết bị 21 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 21 vi 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 21 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Lấy mẫu Màng tang 22 3.4.2 Phương pháp xử lý bề mặt mẫu 22 3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn 22 3.4.4 Đánh giá khả sinh anthracycline 23 3.4.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT25 23 3.4.6 Phân loại chủng xạ khuẩn MPT25 dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA 25 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh Màng tang thu thập tỉnh Phú Thọ 27 4.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang 29 4.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo phận Màng tang 29 4.2.2 Đa dạng xạ khuẩn Màng tang theo môi trường phân lập 30 4.2.3 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty 31 4.3 Khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn nội sinh 32 4.3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn 32 4.3.2 Khả sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline 34 4.4 Đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn MPT25 35 4.4.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT25 35 4.4.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn MPT25 38 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, người phải đối mặt với nhiều dịch bệnh gây vi khuẩn, nấm, virus vi sinh vật khác Để điều trị bệnh truyền nhiễm gây vi sinh vật, kháng sinh sử dụng chủ yếu Tuy nhiên, vi khuẩn gây bệnh có khả kháng thuốc kháng sinh vấn đề nghiêm trọng thu hút mối quan tâm hàng hàng đầu cộng đồng Vì vậy, việc nghiên cứu lựa chọn tác nhân kháng khuẩn từ tự nhiên ưu tiên hàng đầu nhà khoa học công ty dược phẩm giới Cho đến nay, nhà khoa học không ngừng tìm kiếm nguồn hợp chất tự nhiên khác để phát triển loại thuốc kháng sinh loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu tác dụng phụ tới sức khỏe người bệnh số thuốc tổng hợp hóa học gây Theo nghiên cứu Berdy, 2005 ước tính khoảng 70% kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên sử dụng y học lâm sàng sản sinh xạ khuẩn [10] Gần đây, số nghiên cứu cho thấy hợp chất chuyển hóa thứ cấp chủng xạ khuẩn nội sinh dược liệu sinh đa dạng mặt số lượng hoạt tính sinh học như: chất kiểm soát sinh học, chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ,chất kích thích sinh học kiểm soát sinh học… [9, 48] Hơn nữa, nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cho thấy vai trò chức chúng cách tiếp cận đầy hứa hẹn để khắc phục mối đe dọa gia tăng kháng thuốc, chống lại tác nhân gây bệnh cho người thực vật Tuy nhiên, so với đa dạng giới thực vật, số lượng nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh thực vật hạn chế Một nguồn phân lập xạ khuẩn nội sinh thực vật, đặc biệt dược liệu Trong số đó, Màng tang (Litsea cubeba) loài dược liệu trồng lâu để khai thác với nhiều công dụng như: kháng khuẩn, kháng nấm, nhức đầu, đau dày, đầy hơi, phong thấp… Ngoài giá trị khoa học thành phần mang lại, qua khảo sát ban đầu cho thấy Màng tang môi trường cho xạ khuẩn nội sinh có khả sinh tổng hợp chất kháng sinh, chất chống ung thư Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu xạ khuẩn Màng tang nói riêng dược liệu nói chung Việt Nam hạn chế Vì vậy, thực đề tài: “Phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học xạ khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)” 1.2 Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả tổng hợp chất kháng khuẩn nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp kháng sinh cao 1.3 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập đánh giá khả sinh tổng hợp kháng sinh số chủng xạ khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) thu thập tỉnh Phú Thọ 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài kế thừa kết số nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu kết nghiên cứu trong, nước lĩnh vực khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật, nguồn hợp chất kháng sinh, kháng ung thư Đề tài chọn đối tượng Màng tang nghiên cứu nhiều trước đây, đặc biệt liên quan đến nghiên cứu tách chiết tinh dầu tách chiết hợp chất tự nhiên có tiềm kháng vi sinh vật, kháng tế bào 40 So sánh trình tự gen 16S rDNA với gen tương ứng công bố GenBank cho thấy: gen 16S rDNA chủng MPT25 có độ tương đồng cao (98%) so với gen tương ứng rDNA chủng Streptomyces cavourensis (Bảng 4.7) Dựa vào kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý-sinh hóa phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng xạ khuẩn MPT25 định danh Streptomyces cavourensis MPT25 Theo công bố trước đây, loài Streptomyces cavourensis phát lần vào năm 1978, nhóm xạ khuẩn phổ biến tự nhiên, thường phân lập từ đất vùng rễ loại thực vật hay môi trường nước Ngoài ra, chủng xạ khuẩn có khả sinh chromomycin, flavensomycin-loại kháng sinh sử dụng rộng rãi điều trị bệnh gây vi khuẩn nấm sử dụng kháng sinh điều trị ung thư 41 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập 45 chủng xạ khuẩn nội sinh từ mẫu Màng tang thu thập tỉnh Phú Thọ loại môi trường phân lập khác Tỷ lệ xạ khuẩn phân lập từ thân, rễ, đạt tỷ lệ 24,4; 44,5 31,1% Môi trường HV, SA, STA cho khả phân lập tỷ lệ xạ khuẩn cao nhất, đạt đạt 17,8; 17,8 15,5% Các xạ khuẩn thu có khuẩn ty khí sinh thuộc nhóm màu vàng (48,9%), trắng (28,9%), xanh (11,1%), xám (11,1%) Sàng lọc 28 chủng xạ khuẩn có khả kháng loại VSV số loại VSV kiểm định: tỷ lệ kháng Escherichia coli ATCC 11105, Proteus vulgaris CNLM, Salmonella enterica ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa CNLM, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Sarcina lutea CNLM, Staphylococus epidermidis ATCC 12228, Bacillus cereus ATCC 11778, Candida albicans ATCC 10231 đạt 4,4; 33,3; 11,1; 44,4; 8,9; 6,7; 48,9; 44,4; 0% Trong 28 chủng xạ khuẩn kháng sinh có 20 chủng tổng hợp kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin Chủng MPT25 có khả sinh kháng sinh phổ rộng, hoạt tính cao phân loại thuộc loài Streptomyces cavourensis dựa phân tích đặc điểm hình thái, sinh hóa trình tự gen 16S rDNA Chủng MPT25 định danh Streptomyces cavourensis MPT25 5.2 Kiến nghị 1.Tiếp tục khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS tham gia tổng hợp kháng sinh Tiếp tục nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường, điều kiện lên men nhằm thu nhận kháng sinh chủng Streptomyces cavourensis MPT25 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng việt Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, NXB Khoa học Kĩ Thuật, Hà Nội Lê Mai Hương, Trần Thị Như Hằng, Trần Huy Thái, Dương Đức Huyến (2005), Phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn chủng nấm nội ký sinh thực vật phân lập từ số vườn thuốc phía Bắc Việt Nam, Tạp chí Hóa Học 352: 20-23 Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học sinh học, Hà Nội, 1994 Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kỳ Sơn, Phạm Thanh Huyền, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Trương Quốc Phong, Nguyễn Tiến Thành, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), Đa dạng di truyền xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ quế tỉnh Hòa Bình, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 52 (5B), 577-582 II Tiếng anh Abdul K, Anisa BK (2011), Isolation of endophytic actinomycetes from Catharanthes roseus (L) G Don leaves and their antimicrobial activity, Iranian journal of biotechnology, 9: 302-306 Ajit K, Vineet K, Ratul S, Vijai K and Singh P (2015), Isolation, abundance and phylogenetic affiliation of endophytic actinomycetes associated with medicinal plants and screening for their in vitro antimicrobial biosynthesis potential, Original reseach, 6: 1-13 Anonymous (1977), The Chinese Herbal Medicine Dictionary Vol 2, People’s, Shanghai Araujo WL, Marcon J, WJr M, Van Elsas JD, JWVan V, Azevedo JL (2002), Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants, Appl Environ Microbiol 68: 4906–4914 Bacon CW, White JF (2000), Microbial endophytes, New York Marcel Dekker 10 Berdy J (2005), Bioactive microbial metabolites, J Antibiot 58:1-26 11 Cao LX, Qiu ZQ, You JL, Tan HM, Zhou S (2005), Isolation and characterization of endophytic Streptomycete antagonists of fusarium wilt pathogen from surface-sterilized banana roots, FEMS Microbiol Lett 247: 147-15 12 Castillo U, Harper JK, Strobel GA, Sears J, Alesi K, Ford E, Lin J, Hunter M, Maranta M, Ge H, Yaver D, Jensen JB, Porter H, Robison R, Miller D, Hess WM, Condron M, Teplow D (2003), Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia, FEMS Microbiol Lett 234: 183–190 13 Castillo UF, Strobel GA, Ford EJ, Hess WM, Porter H, Jensen JB, Albert H, Robison R, Condron MAM, Teplow DB, Stevens D, Yaver D (2002), Munumbicins, wide-spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans, Microbiology, 148:2675–2685 14 Chen-Lung Ho, Ou Jie-Ping, Yao-Chi Liu, Chien-Ping Hung, Ming-Chih Tsai, Pei- Chun Liao, Eugene I- Chen Wang, Yi-Lin Chen and Yu- Chang Su (2010), Compositions and in vitro Anticancer activities of the Leaf and Fruit Oils of Litsea cubeba from Taiwan, Natural Product Communications, 617 – 620 15 Clark CA, Matthews SW (1987), Histopathology of sweet potato root infection by Streptomyce sipomoea, Phytopatholog, 77:1418–1423 16 Conn VM, Walker AR, Franco CMM (2008), Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana, Mol Plant Microbe Interact 21: 208–218 17 Coombs JT, Franco CMM (2003), Isolation and identification of actinobacteria isolated from surface-sterilized wheat roots, Appl Environ Microbiol 69:5603–5608 18 Dhanasekaran D, Thajuddin N, Panneerselvam A, (2012), Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine, Fungicides for Plant and Animal Diseases, pp 1-27 19 Ezra D, Castillo UF, Strobel GA, Hess WM, Porter H, Jensen JB, Condron MAM, Teplow DB, Sears J, Maranta M, Hunter M, Weber B, Yaver D, (2004), Coronamycins, peptide antibiotics produced by a verticillate Streptomyces sp (MSU-2110) endo-phytic on Monstera sp Microbiology 150:785–793 20 Franco C, Michelsen P, Percy N, Conn V, Listiana E, Moll S, Loria R, Coombs J (2007), Actinobacterial endophytes for improved crop performance, Australas Plant Pathol, 36:524–531 21 Fiedler, H P., Bruntner, C., Riedlinger, J., Bull, A T., Knutsen, G., Goodfellow, M.,et al (2008), Proximicin A, B and C, novel aminofuran antibiotic and anticancer compounds isolated from marine strains of the actinomycete Verrucosispora, J Antibiot 61, 158–163 doi: 10.1038/ja.2008.125 22 Garcia LC, Martinez-Molina E, Trujillo ME (2010), Micromonospora pisisp nov., isolated from root nodules ofPisum sativum, Int J Syst Evo 60:331–337 23 Garrity GM, Holt JG (2001), The road map to the manual, In Bergey’s manual of systematic bacteriology: 119-166 New York: Springer, 119-166 24 Gewirtz DA (1999), A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics Adriamycin and daunorubicin, Biochem pharmacol, 57 (7):727 25 Giorgio M, Pierantonio M, Emanuela S, Gaetano C, Luca G (2004), Anthracyclines: Molecular Advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity, Pharmacol Rew 56: 185-229 26 G.F Gauze et al., (1983), Opredelitels actinomycetov, Nauka M 34-35 27 Hasegawa S, Meguro A, Shimizu M, Nishimura T, Kunoh H (2006), Endophytic actinomycetes and their interactions with host plants, Actinomycetologica 20: 72–81 28 Huang JS (1986), Ultrastructure of bacteria lpenetration in plants, Annu Rev Phytopathol, 24:141–157 29 Igarashi Y (2004), Screening of novel bioactive compounds from plantassociated actinomycetes, Actinomycetologica 18:63–66 30 Jiang, Z.; Akhtar, Y.; Bradbury, R.; Zhang, X.; Isman, M.B,(2009), Comparative toxicity of essential oils of Litsea pungens and Litsea cubeba and blends of their major constituents against the cabbage looper, Trichoplusiani J Agric FoodChem, 57, 4833–4837 31 Janso JE, Carter GT (2010), Biosynthetic potential of phylogenetically unique endophytic actinomycetes from tropical plants, Appl Environ Microbiol 76:4377–4386 32 Küster E, Williams ST (1964), Media for the isolation of Streptomycetes: starch casein medium, Nature 202: 928–929 33 Lee SO, Choi GJ, Choi YH, Jang KS, Park DJ, Kim CJ, Kim JC (2008), Isolation and characterization of endophytic actinomy-cetes from Chinese cabbage roots as antagonists toPlasmodio-phora brassicae, J Microbiol Biotechnol 18:1741–1746 34 Li J, Zhao GZ, Chen HH, Wang HB, Qin S, Zhu WY, Xu LH, Jiang HC and Li WJ(2008), Antitumour and antimicrobial activities of endophytic streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest, Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-8254 35 Linlin Si , Yicun Chen , Xiaojiao Han , Zhiyong Zhan , Shengping Tian, Qinqin Cui and Yangdong Wang (2012), Chemical Composition of Essential Oils of Litsea cubeba Harvested from Its Distribution Areas in China, Molecules 2012,17, 7057-7066 36 Loria R, Bukhalid RA, Fry BA, King RR (1997), Plant pathogenecity in the genus Streptomyces, Plant Dis 81: 836-846 37 Lu CH, Shen YM ,(2007), A novel ansamycin, naphthomycin K from Streptomyces sp J Antibiot 60:649–653 38 Madhurama G, Sonam D, Urmil PG, Ravindra NK (2014), Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India, Afr J Microbiol Res 8(2): 184-191 39 Merzaeva OV, Shirokikh IG (2010), The production of auxins by the endophytic bacteria of winter rye, Appl Biochem Microbiol 46:44–50 40 Nejad P, Johnson PA (2000), Endophytic bacteria induce growth promotion and wilt disease suppression in oilseed rape and tomato, Biol Control 18:208–215 41 Nduka O (2007), Modern Industrial Microbiology and Biotechnology, Science, Enfield, pp 429-453 42 Priham TG and Tenser HD (1974), Streptomyces, Waksman and first and second studies Int J Syst Bacteriol 18: 279 43 Pullen C, Schmitz P, Meurer K, Bamberg DD, Lohmann S, Franc SDC, Groth I, Schlegel B, Möllmann U, Gollmick F, Gräfe U, Leistner E (2002), New and bioactive compounds from Streptomyces strains residing in the wood of Celastraceae, Planta 216:162–167 44 Qin Z, Peng V, Zhou X, Liang R, Zhou Q, Chen H., Hopwood DA., Keiser T, Deng Z, (1994), Development of a gene cloning system for Streptomyces hygroscopicus varying chengensis, a producer of three useful antifungal compounds by elimination of three barriers to DNA transfer J Bacteriol., 176: 2090-2095 45 Qin S, Chen HH, Klenk HP, Zhao GZ, Li J, Xu LH, Li WJ (2009a), Glycomyces scopariaesp nov andGlycomyces maytenisp nov., isolated from two medicinal plants in China, Int J Syst Evol Microbiol 59:1023–1027 46 Qin S, Li J, Chen HH, Zhao GZ, Zhu WY, Jiang CL, Xu LH, Li WJ,(2009b) ,Isolation, diversity, and antimicrobial activity of rare actinobacteria from medicinal plants of tropical rain forests in Xishuangbanna, China Appl Environ Microbiol 75:6176–6186 47 Qin S, Xing K, Fei SM, Lin Q, Chen XM, Cao CL, Sun Y, Wang Y, Li WJ, Jiang JH, (2010b), Pseudonocardia sichuanensis sp nov., a novel endophytic actinomycete isolated from the root of Jatropha curcasL, Antonie Leeuwenhoek doi:10.1007/s10482-010-9504-7 48 Qin S, Xing K, Jiang JH, Xu LH, Li WJ, (2011), Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria, Appl Microbiol Biotechnol 89: 457-473 49 Qin S, Zhao GZ, Klenk HP, Li J, Xu LH, Li WJ, (2009d), Nonomuraea antimicrobica sp nov., an endophytic actinomycete isolated from leaves of Maytenus austroyunnanensis, Int J Syst Evol Microbiol 59: 2453–2457 50 Quadt-Hallmann A, Benhamou N, Kloepper JW (1997), Bacterial endophytes in cotton: mechanisms of entering the plant, Can J Microbiol 43: 577-582 51 Ramasamy Vijaykumar, Chinnasamy Muthkumar, Nooruddin Thajuddin, nnamalai Pannerrselvam, Rangasamy Saravanamuth, (2007), Studies on the diversity of actinomycetes in the Palk Strait region of Bay of Begal, India, Actinomycetologica 52 Sardi P, Saracchi M, Quaroni S, Petrolini B, Borgonovi GE, Merli S (1992), Isolation of endophytic Streptomyces strains from surfacesterilized roots, Appl Environ Microbiol, 58: 2691–2693 53 Sessitsch A, Reiter B, Berg G (2004), Endophytic bacterial commu-nities of field-grown potato plants and their plant-growth promoting and antagonistic abilities, Can J Microbiol 50:239–249 54 Shirling EB, Gottlieb D, (1966), Methods for characterization of Streptomyces species, Int J Syst Bacteriol 16:313–340 55 Smith GE (1957), Inhibition of Fusarium oxysporum f sp lycopersici by a species of Micromonospora isolated from tomato, Phytopathology 47:429–432 56 Strobel G, Daisy B (2003), Endophytes as sources of bioactive products, Microbes Infect 5: 535–544 57 Sun Y, Cheng Z, Glick BR, (2009), The presence of a 1aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase deletion mutation alters the physiology of the endophytic plant growth promoting bacterium Burkholderia phytofirmans PsJN, FEMS Microbiol Lett 296:131–136 58 Taechowisan T, Peberdy JF, Lumyong S (2003), Isolation of endophytic actinomycetes from selected plants and their antifun-gal activity, World J Microbiol Biotechnol 19:381–385 59 Taechowisan T, Lu C, Shen Y, Lumyong S (2005), Secondary metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their antifungal activity Microbiology 151: 1691–1695 60 Trenser HD and Danga F, (1958), Hydrogen sulfide production by Streptomyces as criteria for species differentiation J Bacteriol 76: 239 61 Verma VC, Gond SK, Kumar A, Mishra A, Kharwar RN and Gange AC (2009), Endophytic actinomycetes from Azadirachta indica A Juss.: isolation, diversity, and anti-microbial activity, Microb Ecol, 57: 749–756 62 Vijitha M Vijayan, M Radhakrishnan, and R Balagurunathan (2014), Bioprospecting of Endophytic Actinomycetes for Antiphytofungal Activity, International Journal of ChemTech Research, 2689-2694 63 Yacine Goudjal, Omrane Toumatia, Nasserdine Sabaou, Mustapha Barakate, Florence Mathieu, Abdelghani Zitouni (2013), Endophytic actinomycetes from spontaneous plants of Algerian Sahara: indole-3acetic acid production and tomato plants growth promoting activity, World J Microbiol Biotechnol, doi 10.1007/s11274-013-1344-y 64 Zhao GZ, Li J, Huang HY, Zhu WY, Zhao LX, Tang SK, Xu LH, Li WJ (2010a), Pseudonocardia artemisiaesp nov., a novel actino-bacterium isolated from surface-sterilizedArtemisia annual, Int J Syst Evol Microbiol 65 Zhao PJ, Fan LM, Li GH, Zhu N, Shen YM (2005), Antibacterial and antitumor macrolides from Streptomyces sp ls9131, Arch Pharm Res 28:1228–1232 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi cấy - Môi trường TWYE (g/L): Cao thịt 0,25; K2HP04 0,5; agar 15,0; H2O 1000mL; pH 7,2 - Môi trường STA (g/L): Tinh bột 15,0; K2HP04 0,5; MgSO4.7H2O 0,05; FeSO4.7H2O 0,01; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường HV (g/L): Humic acid 8,0; Na2HPO4 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; CaCO3 0,02; NaNO2 0,9; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường TA (g/L): Trehalose 18,0; CaCl2 0,3; Na2HPO4 0,3; CaCO3 0,02; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường SA (g/L): Sodium succinate 15,0; K2HPO4 0,6; FeSO4.7H2O 0,001; CaCl2.2H2O 0,2; KCl 0,3; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường CA (g/L): Citrate acid 12,0; K2HPO4.3H2O 0,4; CaCl2.H2O 0,05; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trường SPA (g/L): peptone 12,0; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O 0,1; agar 15,0; H2O 1000 mL, pH 7,2 - Môi trường YIM38 (g/L): Cao malt 4; cao men 4; glucose 4; agar 20; H2O 1L; pH 7,2 - Môi trường LBA (Luria-Bertani) (g/L): Cao nấm men 5; Tryptone 10; NaCl 10; agar 15; H2O 1L; pH= 6,5-7,0 - Môi trường MPA (g/L): Cao thịt 3; peptone 10; NaCl 5; agar 18g; H2O 1L; pH - Môi trường Hansen (g/L): Glucose 20; peptone 10; KH2PO4 2; MgSO4 2; cao nấm men 3; agar 18g; H2O 1L; pH 6,5 - Môi trường Bennett (g/L): Cao thịt 1; glucose 10; cao men 1; Casamino acid 2; agar 18-20; H2O 1L; pH 7,3-7,5 - Môi trường ISP-1 (g/L): Tryptone 5; cao nấm men 3; agar 18g; H2O 1L; pH - Môi trường ISP-2 (g/L): Cao nấm men 3, cao malt 10; dextrose 4; agar 20g; H2O 1L; pH 7-7,2 - Môi trường ISP-3 (g/L): Bột kiều mạch 20; muối A 1ml; agar 20g; H2O 1L; pH 7,2 - Môi trường ISP-4 (g/L): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1; MgSO4.7H2O 1; NaCl 1; (NH4)2SO4 2; CaCO3 2; muối A 1ml; agar 18g; H2O 1L; pH - Môi trường ISP-5 (g/L): Asparagin 1; glixerin 10; K2HPO4 1; muối A 1ml; agar 20g; H2O 1L; pH 7-7,4 - Môi trường ISP-6 (g/L): Peptone 10; cao nấm men 1; xitrat sắt 0,5; agar 18g; H2O 1L; pH 7-7,2 - Môi trường ISP-7 (g/L): Glycerol 15; L-tyrosine 0,5; L-asparagine 1; FeSO4.7H2O 0,01; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; NaCl 0,5; muối A 1ml; agar 20g; H2O 1L; pH 7,2-7,4 - Môi trường ISP-9 (g/L): (NH4)2SO4 2,64; KH2 PO4 2,38; K2HPO4 5,65; MgSO4 1; dung dịch muối B 1ml, nguồn cacbon 10; agar 20g; H2O 1L; pH 6,8-7 - Dung dịch muối A (%): FeSO4 0,1; ZnSO4 0,15; MnCl2 0,1; H2O 100ml - Dung dịch muối B (%): CuSO4 0,64; FeSO4 0,11; MgCl2 0,79; H2O 100ml Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) STT Ký hiệu chủng MPT03 17,16 ±0,05 14,73 ± 0,32 0 20,3 ± 0,34 13,96 ± 0,15 MPT04 0 15,73 ± 0,68 0 12,86 ± 0,28 7,76 ± 0,2 MPT05 4,8 ± 0,26 0 0 10,7 ± 0,26 4,5 ± 0,5 MPT07 5,16 ± 0,3 9,03 ± 0,15 0 12,96 ± 0,11 3,23 ± 0,15 MPT08 12,53 ±0,25 17,43 ±0,57 13,6 ± 0,4 21,0 ± 0,1 7,06 ± 0,5 12,53 ± 0,25 23,6 ±0,01 16,93 ± 0,05 MPT11 14,56 ± 0,5 16,36 ± 0,55 0 14,76 ± 0,35 MPT14 14,96 ± 0,11 16,06 ± 0,30 0 19,16 ± 0,57 14,33 ± 0,2 MPT15 0 17,33 ± 0,28 0 0 MPT18 0 0 10,93 ± 0,32 12,13 ± 0,32 0 10 MPT20 0 0 5,1 ± 0,1 0 11 MPT21 14,3 ± 0,26 14,36 ± 0,47 0 18,83 ± 0,57 13,46 ± 0,05 12 MPT22 13,86 ± 0,58 14,66 ± 0,11 0 12,7 ± 0,26 13 MPT23 0 0 0 4,9 ± 0,1 0 14 MPT24 0 14,23 ± 0,2 0 10,06 ± 0,15 6,0 ± 0,26 15 MPT25 15,03 ± 0,20 12,93 ± 0,45 18,2 ± 0,3 0 22,23 ± 0,63 15,73 ± 0,46 16 MPT26 0 0 0 9,16 ± 0,11 0 17 MPT27 0 0 0 18,83 ± 0,57 2,5 ± 0,5 18 MPT28 7,96 ±0,11 10,13 ± 0,25 16,0 ± 0,36 23,6 ± 0,65 12,43 ± 0,11 7,96 ± 0,11 32,5 ± 0,1 0 19 MPT29 6,2 ± 0.3 12,26 ± 0.3 0 14,43 ± 0,55 8,53 ± 0,25 20 MPT30 0 0 0 13,73 ± 0,25 7,63 ± 0,47 21 MPT33 18,93 ± 0,15 20,0 ± 0,1 0 20,3 ± 0,34 17,13 ± 0,2 22 MPT34 9,93 ± 0,15 12,66 ± 0,49 0 5,9 ±0,01 23 MPT35 0 18,7 ± 0,34 0 10,96 ± 0,05 9,83 ± 0,15 24 MPT37 16,06 ± 0,15 14,03 ± 0,11 19,6 ± 0,43 0 17,73 ± 0,05 25 MPT42 0 0 4,7 ± 0,01 6,03 ±0,11 0 26 MPT43 20,1 ± 0,17 21,33 ± 0,58 0 12,66 ± 0,28 16,33 ± 0,28 27 MPT44 0 14,23 ± 0,15 0 12,73 ± 0,23 0 28 MPT45 0 15,03 ± 0,23 20,6 ± 0,55 0 14,9 ± 0,26 10,53 ± 0,55 Ghi chú:1 Escherichia coli ATCC 11105; Proteus vulgaris CNLM; Salmonella enterica ATCC 14028; Pseudomonas aeruginosa CNLM; Enterobacter aerogenes ATCC 13048; Sarcina lutea CNLM; Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Bacillus cereus ATCC 1177; Candida albicans ATCC 10231 Phụ lục 3: Trình tự 16 Trình tự 16S rDNA chủng MPT25 TACAATGCACGTCGAACGATGGAAACCGCTGTCGGATCGGTGGAT TAGTGGCGTTCGGGTGAGTACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCT GGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAATACTCCTG CCTGCATGGGTGGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCC CGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGA CGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG CACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGA CGGCCTTCAGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGATGAAGCGCAA GTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGG CGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTGTTCCGTCCG ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o VŨ THỊ THÙY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers. )... khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. )” 1.2 Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả tổng hợp chất kháng khuẩn nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại chủng xạ. .. sinh học phân loại xạ khuẩn 2.1.3 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 2.1.4 Cơ chế nội sinh xạ khuẩn thực vật 2.1.5 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh thực vật 2.2 Tình hình nghiên cứu xạ

Ngày đăng: 11/03/2017, 10:18

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan