Nghiên cứu phẫu thuật ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy điều trị rối loạn nặng bề mặt nhãn cầu hai mắt

1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Bề mặt nhãn cầu (BMNC) đóng vai trò quan trọng việc bảo vệ nhãn cầu chống lại tác nhân gây bệnh, đảm bảo cho giác mạc (GM) suốt trì chức thị giác Rối loạn BMNC nặng suy giảm tồn tế bào gốc vùng rìa thách thức nhà nhãn khoa mức độ khó khăn điều trị tiên lượng Biểu rối loạn BMNC xâm lấn biểu mô kết mạc, tổ chức xơ tân mạch vào GM gây giảm thị lực trầm trọng, thường kèm theo dấu hiệu kích thích ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống người bệnh Phẫu thuật ghép tế bào gốc tự thân từ tế bào gốc vùng rìa mắt lành để điều trị cho bệnh nhân có rối loạn BMNC mắt phương pháp tối ưu áp dụng thành công giới Việt nam Tuy nhiên áp dụng phương pháp với bệnh nhân bị bệnh mắt không tế bào gốc Mặt khác, phương pháp ghép tế bào gốc dị thân đòi hỏi phối hợp thuốc ức chế miễn dịch toàn thân kéo dài để chống thải ghép, nguy tổn hại chức gan thận, nhiễm trùng tồn thân chỗ, hạn chế việc áp dụng Cùng với phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào, việc sử dụng tế bào biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy làm nguồn cung cấp biểu mô cho việc kiến tạo BMNC giải pháp cho điều trị bệnh nhân có rối loạn BMNC mắt, phương pháp áp dụng thành công nhiều nước phát triển Với mong muốn áp dụng phương pháp ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy điều trị cho bệnh nhân bị rối loạn BMNC mắt Việt Nam, tiến hành đề tài với mục tiêu: Nghiên cứu phẫu thuật ghép tự thân biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy thỏ thực nghiệm Đánh giá kết bước đầu phẫu thuật ghép tự thân biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy bệnh nhân rối loạn nặng bề mặt nhãn cầu hai mắt Tính cấp thiết đề tài Rối loạn nặng BMNC suy giảm tồn tế bào gốc vùng rìa thách thức nhãn khoa điều trị tiên lượng khó khăn Các bệnh nhân bị suy giảm toàn tế bào gốc mắt nằm tình trạng gần mù lòa thị lực thấp, điều trị ghép tế bào gốc dị thân nhiều hạn chế thải loại miễn dịch nguy dùng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài Do việc nghiên cứu phương pháp để điều trị hiệu bệnh lý cần thiết Nhờ phát triển công nghệ tế bào gốc, việc sử dụng biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy làm nguồn cung cấp biểu mô cho việc kiến tạo BMNC giải pháp cho điều trị bệnh nhân có rối loạn BMNC mắt Những đóng góp luận án Đây nghiên cứu Việt Nam ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy điều trị rối loạn nặng BMNC mắt, nghiên cứu thực nghiệm ứng dụng bệnh nhân Với thời gian theo dõi dài sau phẫu thuật đến 62 tháng , nghiên cứu chứng minh hiệu độ an toàn phương pháp việc kiến tạo BMNC ổn định, giảm viêm, giảm tân mạch GM, chứng minh biểu mô tồn lâu dài gắn với mô GM sau ghép Nghiên cứu cho thấy ưu việt việc kết hợp nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng Thành công từ nghiên cứu thực nghiệm sở khoa học việc ứng dụng phẫu thuật việc điều trị cho bệnh nhân Đồng thời nghiên cứu thực nghiệm giúp định hướng, rút kinh nghiệm hoàn thiện bước nghiên cứu áp dụng lâm sàng Bố cục luận án Luận án gồm 101 trang: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (34 trang), Đối tượng phương pháp nghiên cứu (10 trang), Kết (25 trang), Bàn luận (27 trang), Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang) Trong luận án có bảng, biểu đồ, 32 hình, phụ lục Có 115 tài liệu tham khảo, tiếng Việt, 112 tiếng Anh Chương TỔNG QUAN 1.1 Cấu tạo chức bề mặt nhãn cầu yếu tố liên quan BMNC trì ổn định nhờ tồn vẹn giải phẫu chức sinh lý yếu tố có liên quan bao gồm mi mắt, phim nước mắt, biểu mô kết mạc, giác mạc vùng rìa • Mi mắt: có vai trò bảo vệ nhãn cầu, dàn phim nước mắt • Phim nước mắt: từ vào gồm lớp lipid, nước, mucin Phim nước mắt có tác dụng bơi trơn, cung cấp chất dinh dưỡng, trì áp suất thẩm thấu, ổn định khúc xạ bề mặt giác mạc • Biểu mô kết mạc (KM): chứa vi nhung mao giúp gắn kết glycocalyx, tế bào đài chế tiết mucin, tuyến lệ phụ tiết nước, lớp đệm chứa lympho bào • Biểu mơ vùng rìa: chứa tế bào gốc thành phần quan trọng có vai trò tăng sinh biệt hóa biểu mơ, ngăn chặn kết mạc xâm nhập vào giác mạc • Biểu mơ giác mạc (GM): gồm 5-7 hàng tế bào lát tầng khơng sừng hóa, suốt Trong đó: lớp tế bào bề mặt biệt hóa cao, chứa nhiều vi nhung mao gắn mucin, lớp đáy hình trụ đơn có khả phân chia, màng đáy giúp biểu mô di cư, phân tầng trật tự liên tục 1.2 Rối loạn bề mặt nhãn cầu 1.2.1 Chẩn đoán lâm sàng rối loạn BMNC Mất ổn định BMNC biểu tùy theo mức độ tổn hại tế bào gốc Khi toàn tế bào gốc tổn thương xuất rối loạn nặng BMNC  Cơ năng: giảm thị lực, sợ ánh sáng, chảy nước mắt, co quắp mi tiển sử viêm mạn tính mắt  Thực thể - Rối loạn mi, tuyến Meibomius, khơ mắt - Hiện tượng “kết mạc hóa giác mạc”, cấu trúc giải phẫu vùng rìa - Biểu mơ GM khơng đều, xuất tróc biểu mô tái phát, khuyết biểu mô dai dẳng, nhuyễn hoại tử GM - Tân mạch sẹo đục GM - Giai đoạn muộn xuất sừng hóa BMNC 1.2.2 Chẩn đốn cận lâm sàng Có vai trò hỗ trợ chẩn đốn xác định mức độ tổn thương bệnh - Test áp tế bào, sinh thiết KM, chất nạo BMNC - Đo liềm nước mắt, đo áp suất thẩm thấu phim nước mắt máy giao thoa - Chụp Meibography, soi hiển vi đồng tiêu cự - Test nhanh xác định dấu ấn phản ứng viêm - Máy đo cảm giác GM 1.2.3 Các nguyên nhân gây rối loạn BMNC - Viêm bờ mi kéo dài - Khô mắt nặng - Viêm kết mạc dị ứng - Mộng tân sản biểu mơ BMNC - Rối loạn dính kết biểu mơ - Bỏng hóa chất bỏng nhiệt - Tổn hại tế bào gốc bẩm sinh: dị tật khơng có mống mắt, loạn dưỡng GM dạng giọt gelatin, viêm GM kèm thiểu nội tiết, củng mạc hóa GM - Rối loạn BMNC bệnh tự miễn: pemphigoid, dị ứng thuốc, viêm khớp dạng thấp - Tổn hại tế bào gốc liên quan đến điều trị (do số thuốc phẫu thuật nhiều lần vùng rìa) 1.2.4 Phân loại mức độ tổn thương BMNC Bảng 1.1 Phân loại mức độ tổn thương BMNC Thiếu hụt phần tế bào gốc (mức Inhẹ) Thiếu hụt tồn tế bào gốc (mức IInặng) KM bình KM viêm cũ thường hết (mức “a”) (mức “b”) Bệnh GM Bỏng cũ (Ib) KTX, suy giảm tế bào gốc có liên quan điều trị, tăng sản nội BM (Ia) Dị tật khơng có Bỏng cũ MM, bệnh GM nặng (IIb) KTX nặng, suy giảm tế bào gốc có liên quan điều trị (IIa) KM viêm (mức “c”) Dị ứng thuốc pemphigoid nhẹ, bỏng (Ic) Dị ứng thuốc pemphigoid nặng, bỏng nặng (IIc) Mức độ suy giảm tế bào gốc vùng rìa tình trạng viêm KM đóng vai trò quan trọng việc xác định mức độ tổn thương BMNC, từ định chiến lược điều trị tiên lượng bệnh 1.3 Điều trị rối loạn BMNC 1.3.1 Nội khoa: điều trị mắt toàn thân, bao gồm kiểm sốt tình trạng viêm, tăng cường dinh dưỡng thúc đẩy hàn gắn biểu mô Điều trị nội khoa làm cải thiện tình trạng BMNC, trì, tăng hiệu phẫu thuật, tránh phẫu thuật khơng cần thiết 1.3.2 Kính tiếp xúc (KTX): có tác dụng giảm đau, tăng liền biểu mơ số trường hợp tróc biểu mơ tái phát, khuyết biểu mô dai dẳng 1.3.3 Phẫu thuật bảo vệ BMNC: nạo biểu mơ, gọt GM, đóng điểm lệ, cò mi áp dụng số trường hợp 1.3.4 Phẫu thuật kiến tạo BMNC: Các bệnh nhân có tổn hại trầm trọng tế bào gốc điều trị nội khoa qua giai đoạn viêm cấp, tùy mức độ tổn thương lựa chọn loại phẫu thuật kiến tạo BMNC phù hợp - Ghép màng ối áp dụng trường hợp cần che phủ hàn gắn bề mặt tách dính mi cầu, lt khó hàn gắn, bỏng cấp, dị ứng thuốc cấp Nhược điểm là chất ko thay biểu mơ, q trình biểu mơ hóa khó khăn, dễ bị xâm nhập xơ mạch vào GM - Ghép tự thân KM rìa (CLAU) biểu mơ GM vùng rìa ni cấy từ mắt lành (Auto-CLET) phương pháp cho hiệu cao an toàn áp dụng cho bệnh nhân bị rối loạn BMNC mắt - Với bệnh nhân bị rối loạn BMNC nặng suy giảm tế bào gốc mắt, ghép KM rìa(Lr-CLAL)/ biểu mơ vùng rìa ni cấy đồng lồi (Lr-CLET) từ người đồng huyết thống từ vành GM hiến (KLAL), phương pháp nhiều khó khăn vấn đề thải loại miễn dịch nguy dùng thuốc ức chế miễn dịch toàn thân kéo dài 1.4 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy ứng dụng điều trị rối loạn BMNC 1.4.1 Cấu trúc biểu mô niêm mạc miệng: nghiên cứu mô học niêm mạc miệng có nguồn gốc từ ngoại bì, lát tầng khơng sừng hóa, lớp đáy có khả phân chia, tế bào gốc nằm lớp đáy (đỉnh nhú chân bì) 1.4.2 Các nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy Sự phát triển mạnh mẽ công nghệ nuôi cấy tế bào ứng dụng thành tựu y học tái tạo cho phép nuôi tạo biểu mô từ biểu mô niêm mạc miệng Tấm biểu mô ni cấy có cấu trúc mơ học, chức tương đồng với biểu mô GM 1.4.3 Ứng dụng biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy điều trị rối loạn BMNC: Trên giới có nhiều nghiên cứu thực nghiệm bệnh nhân ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy để điều trị rối loạn BMNC hai mắt (COMET) - Nakamura (2003), Hayashida (2005) thành công thỏ gây bỏng - Nishida (2004), Inatomi (2006), Chen (2009), Nakamura (2011), Satake (2011), Kocaba (2014) thực thành công bệnh nhân, thời gian theo dõi 14 đến 55 tháng, với cỡ mẫu – 40 ca - Kết chung: Tấm biểu mơ niêm mạc miệng ni cấy có khả tồn giúp trì ổn định BMNC sau thời gian dài, giải pháp an toàn, hiệu cho điều trị bệnh lý rối loạn BMNC nặng mắt Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nghiên cứu thực nghiệm: 15 thỏ khỏe, ± 0.2 kg, ni điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Mô – phôi, Đại học Y Hà Nội 2.1.2 Nghiên cứu bệnh nhân: 12 bệnh nhân rối loạn BMNC nặng mắt điều trị khoa Kết giác mạc – Bệnh viện Mắt Trung Ương 1/2009 - 6/2014 o Tiêu chuẩn lựa chọn: suy giảm toàn tế bào gốc mắt, xơ mạch GM tồn bộ, khơng nhiễm trùng, qua giai đoạn viêm cấp o Tiêu chuẩn loại trừ: Bất thường mi, khô mắt nặng đến mức sừng hóa BMNC, khơng hợp tác nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu thực nghiệm: 15 thỏ chia lô ngẫu nhiên o Thiết kế: Nghiên cứu thực nghiệm, thực Bộ môn Mô phôi - ĐHYHN o Các bước: – Gây bỏng mắt thỏ – Sau tuần sinh thiết niêm mạc miệng thỏ (đường kính 3mm), ni tạo biểu mơ – định danh, ghép tự thân cho thỏ – Đánh giá đại thể, vi thể GM thỏ sau mổ: 7, 15, 30, 60, 180 ngày 2.2.2 Nghiên cứu bệnh nhân: o Thiết kế: thử nghiệm lâm sàng, tiến cứu, thực Bệnh viện Mắt TW o Các bước: – Đánh giá bệnh nhân trước mổ: mức độ kích thích năng, thị lực, nhãn áp, tình trạng BMNC Điều trị trước mổ: chống viêm, dinh dưỡng, điều trị mi, phẫu thuật tách dính – Sinh thiết niêm mạc miệng (3mm), nuôi tạo biểu mô – định danh, ghép tự thân cho bệnh nhân – Đánh giá tình trạng mắt sau phẫu thuật: ngày/lần tuần đầu, hàng tuần tháng, tuần/ lần tháng, sau tháng/ lần Tiêu chí đánh giá chất lượng biểu mơ ni cấy: Các tiêu chí đại thể, cấu trúc vi thể siêu vi biểu mơ Tiêu chí đánh giá kết phẫu thuật: Cải thiện triệu trứng năng, thị lực, tình trạng biểu mơ BMNC 2.3 Thu thập phân tích số liệu Mẫu bệnh án, ảnh chụp tổn thương GM BMNC, hình ảnh lâm sàng mơ học, video phẫu thuật 2.4 Mơ hình nghiên cứu Gây bỏng cho thỏ tuần tuần Ghép tự thân cho thỏ Nuôi tạo BM tuần Đánh giá mắt thỏ Thực nghiệm thành công Nuôi tạo BM cho BN 2-3 tuần Lâm sàng Thực nghiệm 10 Ghép tự thân BM cho BN 2.5 Đạo đức nghiên cứu Đánh giá mắt BN sau ghép Là phần nội dung Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu quy trình sử dụng tế bào gốc để điều trị số bệnh bề mặt nhãn cầu”, mã số ĐTĐL.2010T/15 thuộc Bộ môn Mô-phôi ĐHYHN, Hội đồng đạo đức trường ĐHYHN chấp thuận (số 77/HĐĐĐ – YHN) Chương KẾT QUẢ 3.1 Kết thỏ thực nghiệm 3.1.1 Đặc điểm thỏ thực nghiệm: 15 thỏ sống suốt trình nghiên cứu 3.1.2 Kết định danh biểu mơ ni cấy  Hình ảnh mơ học: Tấm biểu mơ phẳng, có 4-5 hàng tế bào đa diện nhau, lớp đáy hình trụ nhân lớn, bào quan phát triển, lớp dẹt dần, lớp nhân, bề mặt chứa nhiều vi nhung mao Các tế bào liên kết với thể liên kết, liên kết với màng ối thể bán liên kết  Hóa mơ miễn dịch: diện p63 nhân lớp đáy, K3 lớp trên, khơng có tế bào đài 3.1.3 Kết ghép biểu mô thỏ thực nghiệm  Lâm sàng: 14/15 thỏ có biểu mơ áp tốt, trong, BMNC nhẵn, khơng có tân mạch GM; thỏ có tân mạch vào phần chu biên GM 12 13 3.2.2 Kết định danh biểu mô nuôi cấy o Mô học: 4-5 hàng tế bào đa diện lát tầng Lớp đáy nhân lớn, bào quan phát triển, lớp dẹt dần, lớp nhân, nhiều vi nhung mao ngắn bề mặt Có thể liên kết tế bào, thể bán liên kết tế bào giá đỡ o Hóa mơ miễn dịch: diện p63 nhân lớp đáy, K3 lớp Hình 3.13 Tấm biểu mô niêm mạc miệng BN Nguyễn Hữu C (KHV soi ngược x 250) Hình 3.14 Tấm biểu mô niêm mạc miệng BN Phạm Ngọc T (HE x 500) 1.Biểu mô 2.Màng ối 14 3.2.3 Kết ghép biểu mô bệnh nhân  Sau sinh thiết, niêm mạc miệng liền tốt, sẹo nhỏ mịn Khơng có biến chứng sau q trình sinh thiết  Khơng có biến chứng sau phẫu thuật ghép biểu mô  Tỷ lệ thành công 14/20 (70%): Kết tốt 6/20 (30%), 4/20 (20%), trung bình 4/20 (20%) Tỷ lệ thất bại cho kết xấu 6/20 (30%) A B Hình 3.21 Mắt bệnh nhân có kết tốt sau phẫu thuật năm A Trước mổ: biểu mô GM gồ ghề, màng xơ tân mạch xâm lấn toàn vùng rìa 360 vào đến trung tâm GM B Sau mổ năm: GM trong, biểu mơ nhẵn, khơng có tân mạch  Kết cải thiện triệu chứng Có 12 trường hợp (60%) cải thiện triệu trứng sau phẫu thuật, bệnh nhân giảm hết triệu chứng chói sợ ánh sáng, cảm giác khơ mắt, cảm giác đau Có trường hợp cải thiện triệu chứng, trường hợp cải thiện triệu chứng Khơng có trường hợp thấy triệu chứng nặng 15  Kết thị lực • Nhìn xa: 14/20 ca (70%) thị lực tăng, 13 ca tăng rõ rệt • 7/20 ca thị lực tăng hàng, thị lực cao 20/60 • Thị lực trước mổ + 2,17, sau mổ +1,415 (logMAR): mức cải thiện – 0,755 • 9/20 trường hợp cải thiện thị lực gần 3.5 TL trước mổ TL cuối Thị lực (LogMar) 2.5 1.5 0.5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Biểu đồ 3.1 Kết thị lực nhìn xa  Diễn biến tình trạng bề mặt nhãn cầu sau phẫu thuật Ở mắt thành cơng: tháng đầu có tân mạch nhỏ nằm lớp nông biểu mô, dừng quanh rìa chu biên, thối triển rút dần sau 3-6 tháng  Kết chung nghiên cứu: phương pháp cho tỷ lệ thành công 14/20 trường hợp với thời gian theo dõi trung bình 18,95 16 tháng (12-62 tháng), cho tỷ lệ 70% Ở trường hợp này, giác mạc trơn nhẵn, giảm tân mạch, bề mặt nhãn cầu ổn định  Biến chứng phẫu thuật: • Khơng có biến chứng xảy suốt q trình nghiên cứu • Trong q trình theo dõi khơng gặp vấn đề miễn dịch thuốc ức chế miễn dịch Thời gian dùng steroid ngắn, không gặp biến chứng steroid (tăng nhãn áp, bội nhiễm) • Phương pháp thực lần số bệnh nhân lần đầu thất bại, diễn an toàn  Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phẫu thuật o Nguyên nhân bệnh: nhóm loạn dưỡng cho kết tốt nhóm bỏng o Tổn thương phối hợp: trường hợp có tổn thương biểu mơ dai dẳng, tổn thương phối hợp nhãn cầu cho kết o Quy trình phẫu thuật chăm sóc sau mổ có ảnh hưởng đến kết phẫu thuật o Chất lượng biểu mô nuôi cấy: trường hợp biểu mơ bị dính chặt vào đáy giếng ni cấy rách phẫu thuật cho kết xấu Chương BÀN LUẬN 4.1 Ghép tự thân biểu mô thỏ thực nghiệm 4.1.1 Đặc điểm biểu mô nuôi cấy 17 o Mơ học: biểu mơ có hình thái tương đồng với biểu mô GM, lớp nhân, thể đặc tính khơng sừng hóa Lớp tế bào đáy hình trụ có nhân lớn, bào quan phát triển Các vi nhung mao giúp tăng diện tích tiếp xúc bề mặt, tăng lưu giữ nước mắt Thể liên kết gắn kết chặt chẽ tế bào với tạo nên hàng rào bảo vệ biểu mô, thể bán liên kết gắn chặt tế bào với giá đỡ giúp biểu mơ bám dính tốt o Hóa mơ miễn dịch: Hiện diện p63 lớp đáy thể đặc tính tế bào gốc, đảm bảo khả tái sinh biểu mô sau ghép 4.1.2 Kết ghép tự thân biểu mô thỏ thực nghiệm Về lâm sàng, tất thỏ có GM ổn định sau mổ Kết sinh thiết GM thỏ thời điểm xác định tình trạng biểu mơ ni cấy sau ghép: Sau tháng, biểu mô tồn nguyên vẹn, áp chặt nhu mô, tế bào xếp đặn, lớp nhân, khơng sừng hóa Kết tương tự với nghiên cứu Nakamura (2003) Hayashida (2005) 4.1.3 Kinh nghiệm thu hoạch từ nghiên cứu thực nghiệm o Hoàn thiện kỹ phẫu thuật, loại bỏ tối đa yếu tố ảnh hưởng tới thành công phẫu thuật o Kinh nghiệm áp dụng lâm sàng: Nghiên cứu thỏ thuận lợi gây bỏng cho thỏ chủ động bề mặt: phản ứng viêm ít, khơng tổn hại phim nước mắt, áp dụng bệnh nhân cần lưu ý bổ sung thuốc dinh dưỡng chống viêm Ngồi thỏ có mí phụ 18 có tác dụng bảo vệ tốt cho BMNC, tiến hành phẫu thuật bệnh nhân cần sử dụng kính tiếp xúc lâu dài o Hình ảnh mơ học GM thỏ chứng tỏ tồn biểu mô sau ghép qua thời gian o Kết nghiên cứu tương tự công bố tác giả nước Nghiên cứu thực nghiệm thành công minh chứng khoa học cho phương pháp ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy, tạo sở cho việc áp dụng phẫu thuật cho bệnh nhân 4.2 Kết bệnh nhân 4.2.1 Vị trí kích thước vùng sinh thiết: trung tâm niêm mạc má: niêm mạc dày, nhú chân bì rõ, nhân tế bào đáy có độ diện p63 cao Như niêm mạc vùng má có đặc điểm thích hợp để ni cấy, khả thu tế bào gốc vùng cao Đường kính sinh thiết mm: Sinh thiết không đau, nhanh liền, lấy nhiều lần 4.2.2 Đặc điểm biểu mô nuôi cấy o Mô học tương đồng với biểu mô GM, lớp nhân, thể đặc tính khơng sừng hóa Các vi nhung mao giúp tăng diện tích tiếp xúc bề mặt, làm tăng lưu giữ nước mắt Thể bán liên kết gắn kết chặt chẽ tế bào với tạo hàng rào bảo vệ biểu mô, thể bán liên kết gắn chặt tế bào với giá đỡ giúp biểu mơ bám dính tốt Hóa mơ miễn dịch: có diện p63 nhân lớp đáy thể đặc tính gốc, K3 lớp thể đặc tính biểu mơ GM biệt hóa Như biểu mơ chứa tế bào gốc lẫn tế bào trưởng thành, đảm bảo chức giữ ổn định BMNC khả tái sinh bền vững biểu mô sau ghép qua thời gian Kết tương tự với: 19 • Madhira (2008): 2-3 hàng tế bào ko sừng hóa, chứa thể liên kết, bán liên kết, có diện p63 lớp đáy, K3 lớp • Sen (2011): Tấm biểu mơ lát tầng ko sừng hóa, chứa thể liên kết, bán liên kết Có diện p63, K3, đặc biệt hạt mucin tế bào: MUC gắn màng 1,13,15,16, MUC tạo keo 5B,6 , làm cải thiện tình trạng khơ mắt • Klingbeli (2010): có diện pAkt PTEN (protein chống ung thư), ko có p53 MDM2 (protein gây ung thư) Điều thể độ an tồn khơng làm xuất tế bào đột biến nuôi cấy 4.2.3 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu o Đối tượng bệnh nhân trẻ, tuổi trung bình: 26,2 (12 – 57 tuổi), nhu cầu học tập lao động cao, có mắt bị bệnh, lại có thị lực thấp, gần mù lòa: thị lực xa: 95% < ĐNT 1m; thị lực gần (-) việc tìm giải pháp để nâng cao thị lực cho bệnh nhân cần thiết o nhóm ngun nhân bệnh loạn dưỡng GM giọt gelatin (3 bệnh nhân) bỏng hóa chất (9 bệnh nhân): phù hợp với đặc điểm tuổi bệnh nhân 4.2.4 Hiệu phẫu thuật ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy  Cải thiện triệu chứng năng: 12/20 ca cải thiện triệu chứng, ca cải thiện triệu chứng, ca cải thiện triệu chứng Kết tương tự với Burillon (2012) Kocaba (2014) Giảm kích thích giúp cải thiện chất lượng sống, giảm phản ứng viêm bề mặt, làm ổn định BMNC 20  Thị lực: khơng phải mục tiêu điều trị rối loạn BMNC nặng, phẫu thuật có khả làm tăng thị lực trường hợp bệnh lý tổn thương lớp biểu mô nhu mô nông Với trường hợp đục nhu mô sâu, biểu mơ có vai trò kiến tạo bề mặt ổn định, giảm tân mạch để tạo thuận lợi cho ghép quang học nhằm tăng thị lực Ở nhóm nghiên cứu chúng tơi, thị lực nhìn xa tăng đáng kể, sau mổ có 14 ca tăng thị lực, 13 ca tăng rõ rệt (đạt tỷ lệ 70%) Có ca tăng hàng, thị lực cao 20/60 Tính theo LogMAR, chúng tơi đưa thị lực trung bình từ +2,17 +1,415, mức cải thiện đạt -0,755 Nghiên cứu Sotozono (2013) Kocaba (2014) cho kết tương tự  Đặc biệt, có ca cải thiện rõ rệt thị lực nhìn gần Điều có ý nghĩa quan trọng đa số bệnh nhân trẻ nhu cầu học tập lao động cao, trình điều trị đưa từ trạng thái gần mù lòa tới mức thị lực định cho dù ỏi làm tăng đáng kể chất lượng sống người bệnh  Diễn biến tình trạng bề mặt nhãn cầu sau phẫu thuật: Ở mắt thành cơng: tháng đầu có tân mạch nhỏ nằm lớp nông biểu mô, dừng quanh rìa chu biên, thối triển rút dần sau 3-6 tháng Kết tương tự với Inatomi (2006), Satake (2011), Nakamura (2011), điều giải thích biểu mơ giác mạc bệnh nhân sau mổ có nguồn gốc từ niêm mạc miệng nên chứa yếu tố phát triển nội mạch 21  Tổng hợp so sánh, kết chung tương đối khả quan so với tác giả khác giới với số lượng đủ lớn thời gian theo dõi tương đối dài 22 Bảng 4.1 Tỷ lệ thành công nghiên cứu ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy Nghiên cứu Tỷ lệ thành công Thời gian theo dõi Cỡ mẫu Inatomi (2006) 67% 20 tháng 15 Nakamura (2011) 79% 55 tháng 19 Satake (2011) 64,8% sau năm 59% sau năm 25,5 tháng 40 Burillon (2012) 64% 360 ngày 26 Sotozono (2013) 48% 28,7 tháng 46 Kocaba (2014) 62,5% 28 tháng 26 N T T Thủy (2016) 70% 18,95 tháng 20  Ưu điểm phương pháp: o Độ an tồn • Ghép tự thân: không gặp vấn đề miễn dịch, không cần dùng thuốc ức chế miễn dịch Thời gian dùng corticoid ngắn hơn, giảm biến chứng (tăng nhãn áp, bội nhiễm) • Nguồn nguyên liệu dồi dào, diện sinh thiết nhỏ, phẫu thuật thực đơn lớp bề mặt: xâm lấn dễ thực Như phương pháp an tồn, nhắc lại 23  Khả tồn biểu mô sau ghép Trong nghiên cứu có 14 trường hợp BMNC ổn định, ko bị tân mạch KM xâm nhập đến thời điểm cuối 12-62 tháng điều chứng tỏ diện tế bào gốc biểu mô GM sau ghép, biểu mơ GM tiếp tục tự đổi cách định qua thời gian dài, tránh KM hoá, điều phù hợp với kết định danh biểu mô hóa mơ miễn dịch thấy có diện p63, thể đặc tính tế bào gốc biểu mô Các nghiên cứu giới chứng minh tồn lâu dài biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy sau ghép: Chen (2009) sau 10-22 tháng, Kocaba (2014) sau 28 tháng: định danh mảnh GM sau phẫu thuật ghép GM quang học 2: biểu mơ tồn ngun vẹn, có diện p63  Nhược điểm phương pháp: o Tân mạch rìa GM sau ghép: hoạt động yếu tố phát triển nội mạch tồn biểu mô, ý tưởng phối hợp antiVEGF với phẫu thuật số tác giả đề xuất o So với biểu mơ vùng rìa ni cấy biểu mô niêm mạc miệng mờ, dầy đồng hơn, giá đỡ màng ối nguồn gốc từ niêm mạc miệng nên tế bào ni cấy có kích thước lớn hơn, xếp đồng hơn, gây tượng tán xạ ánh sáng, ảnh hưởng đến thị lực Trong nghiên cứu Nakamura (2011), Ma (2009), Inatomi (2006), thấy đề cập đến vấn đề  Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phẫu thuật 24 o Nguyên nhân bệnh: kết nhóm loạn dưỡng tốt nhóm bỏng (do mức độ sâu tổn thương, tình trạng tổn hại phim nước mắt khác nhau) o Tổn thương phối hợp: tổn thương biểu mô dai dẳng, tổn thương phối hợp nhãn cầu có kết – Satake (2011) cho kết tương tự o Quy trình phẫu thuật (gọt ghép nhẵn, tránh tổn thương biểu mô phẫu thuật) chăm sóc sau mổ (tra thuốc dinh dưỡng liên tục, kính tiếp xúc kéo dài) giúp biểu mô ổn định tốt o Chất lượng biểu mô nuôi cấy: mức độ dai đàn hồi lớp giá đỡ, khả tách rời khỏi đáy giếng phẫu thuật đem lại thành công cao KẾT LUẬN Nghiên cứu ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 15 thỏ thực nghiệm 20 lượt phẫu thuật cho 12 bệnh nhân rối loạn nặng bề mặt nhãn cầu hai mắt, nhận thấy: Kết ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy mắt thỏ thực nghiệm Đã góp phần ni tạo thành cơng biểu mô niêm mạc miệng thỏ thực nghiệm, biểu mơ thu có đặc điểm hình thái cấu trúc mô học tương tự biểu mô giác mạc thỏ bình thường Đã ghép tự thân biểu mơ niêm mạc miệng nuôi cấy thành công cho 15 thỏ Theo dõi đến tháng, có 14 thỏ đạt kết tốt, thỏ 25 đạt kết Bề mặt giác mạc ổn định, biểu mô tồn nguyên vẹn gắn chặt với mô giác mạc qua thời điểm theo dõi Kết ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy bệnh nhân Đã góp phần ni tạo thành công biểu mô niêm mạc miệng bệnh nhân, biểu mơ thu có hình thái cấu trúc siêu vi giống biểu mơ giác mạc bình thường Phẫu thuật ghép tự thân biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy đạt tỷ lệ thành công 14/20 trường hợp (tỷ lệ 70%),trong 6/14 ca tốt, 4/14 ca khá, 4/14 ca trung bình Việc ghép tự thân biểu mơ niêm mạc miệng ni cấy có tác dụng kiến tạo bề mặt nhãn cầu ổn định cho bệnh nhân suy giảm tế bào gốc mắt, làm giảm viêm giảm tân mạch giác mạc Ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy cải thiện dấu hiệu 12/20 trường hợp (60%), cải thiện thị lực nhìn xa cho 13/20 trường hợp (65%), 9/20 trường hợp (45%) có cải thiện rõ rệt thị lực nhìn gần Trong nhóm nguyên nhân gây bệnh, nhóm bỏng hóa chất cho kết so với nhóm loạn dưỡng giác mạc dạng giọt gelatin Ngoài tổn thương biểu mô dai dẳng trước mổ tổn thương sâu nhãn cầu yếu tố tiên lượng xấu đến kết điều trị Chất lượng biểu mơ (mức độ dai, khả bóc tách khỏi đáy giếng ni cấy) có ảnh hưởng đến kết phẫu thuật 26 Sử dụng kính tiếp xúc thuốc dinh dưỡng giác mạc liên tục thời gian đầu sau mổ có tác dụng giúp cho biểu mơ ni cấy bám dính ổn định tốt bề mặt giác mạc KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu với số lượng bệnh nhân lớn thời gian theo dõi dài để đánh giá xác hiệu phương pháp Phối hợp với labo ni cấy để tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình ni cấy xây dựng tiêu chuẩn biểu mô tốt nhất, phù hợp với điều kiện Việt Nam Nghiên cứu phối hợp ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy với sử dụng thuốc ức chế phát triển nội mạch (anti-VEGF) với đối tượng nguy cao đánh giá kết ... với biểu mô GM 1.4.3 Ứng dụng biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy điều trị rối loạn BMNC: Trên giới có nhiều nghiên cứu thực nghiệm bệnh nhân ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy để điều trị rối loạn. .. miễn dịch toàn thân kéo dài 1.4 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy ứng dụng điều trị rối loạn BMNC 1.4.1 Cấu trúc biểu mô niêm mạc miệng: nghiên cứu mô học niêm mạc miệng có nguồn gốc từ ngoại bì,... giếng phẫu thuật đem lại thành công cao KẾT LUẬN Nghiên cứu ghép biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 15 thỏ thực nghiệm 20 lượt phẫu thuật cho 12 bệnh nhân rối loạn nặng bề mặt nhãn cầu hai mắt, nhận