NGUYÊN NHÂN và PHƯƠNG PHÁP KHẮC PHỤC HIỆN TƯỢNG KHÓ bóc TÁCH tấm BIỂU mô NIÊM mạc MIỆNG NUÔI cấy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI DIÊM THỊ YẾN NGUYÊN NHÂN VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẮC PHỤC HIỆN TƯỢNG KHÓ BÓC TÁCH TẤM BIỂU MÔ NIÊM MẠC MIỆNG NUÔI CẤY ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI DIÊM THỊ YẾN NGUYÊN NHÂN VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẮC PHỤC HIỆN TƯỢNG KHÓ BÓC TÁCH TẤM BIỂU MÔ NIÊM MẠC MIỆNG NUÔI CẤY Chuyên ngành: Mô - Phôi Thai Học Mã số: 62720101 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Bình ThS Đào Thị Thúy Phượng HÀ NỘI - 2015 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO EDTA EGF FBS FCS FGF 3-day transfer, inoculum 3x105 cells ATP-binding cassette subfamily G member Bovine serum albumin 5-Bromo-2-deoxyuridine Collagen-glycosaminoglycan Collagen-glycosaminoglycanchitosan Dulbecco's modified eagle's medium Dimethyl sulfoxide Ethylenediaminetetraacetic acid Epithelial growth factor Fetal bovine serum Fetal caft serum Fibroblast growth factor GAG HGF Glycosaminoglycan Hepatocyte growth factor HLA Human leukocyte antigen IL KGF KHV LSCD OCT P.A.S PBS PCR PDGF Interleukin Keratinocyte growth factor SEM SHEM Scanning electron microscope Supplemental hormonal epithelial medium 3T3 ABCG BSA BrdU C-GAG CGC DMEM Limbal stem cell deficiency Optical coherence tomography Periodic acid Shiff Phosphate buffer saline Polymerase chain reaction Plate derive growth factor Albumin huyết bò Yếu tố phát triển biểu mô Huyết bào thai bò Huyết bào thai bò Yếu tố phát triển nguyên bào sợi Yếu tố phát triển tế bào gan Kháng nguyên bạch cầu người Chất tương tác tế bào Yếu tố phát triển tế bào sừng Kính hiển vi Suy giảm tế bào gốc vùng rìa Phản ứng khuếch đại chuỗi Yếu tố phát triển có nguồn gốc tiểu cầu Kính hiển vi điện tử quét Môi trường nuôi cấy biểu mô có bổ sung hormon TGF Transformer growth factor HIV Human immunodeficiency virus Yếu tố phát triển chuyển dạng Vi rút gây suy giảm miễn dịch người MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Cấu trúc niêm mạc khoang miệng 1.2.Ứng dụng lâm sàng biểu mô niêm mạc miệng 1.2.1.Ứng dụng lâm sàng lính vực nhãn khoa 1.2.2.Ứng dụng lâm sàng lĩnh vực khác 1.3.Nghiên cứu nuôi tạo biểu mô niêm mạc miệng 1.3.1.Các phương pháp nuôi cấy .8 1.3.1.1.Nuôi cấy dịch treo .8 1.3.2.Các loại giá thể dùng nuôi cấy 13 1.3.3.Lớp tế bào nuôi .16 1.3.4.Môi trường nuôi cấy 19 1.3.5.Định danh tế bào biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 2.2.2.Phương pháp nuôi tạo biểu mô .22 Nuôi mảnh biểu mô với lớp tế bào nuôi nguyên bào sợi tự thân Lớp tế bào nuôi nuôi theo cách khác nhau: 23 2.2.6.Quy trình trích thủ xử lý mảnh niêm mạc miệng cho nuôi cấy 24 2.2.9.Quy trình nuôi cấy theo dõi 26 2.2.10.Thu hoạch định danh tế bào nuôi cấy 27 2.2.10.1.Thu hoạch 27 2.2.10.2.Định danh tế bào 28 2.4.Địa điểm thời gian nghiên cứu 30 2.5.Thiết kế nghiên cứu .30 2.6.Đạo đức nghiên cứu 30 CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 31 3.1.Kết nuôi tạo biểu mô niêm mạc miệng phương pháp nuôi mảnh biểu mô 31 3.1.1.Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô niêm mạc miệng 31 3.1.2.Chất lượng biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 32 3.2.Hình thái tốc độ phát triển tế bào biểu mô niêm mạc miệng 32 3.3.Hình thái tốc độ phát triển lớp nguyên bào sợi 34 CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 36 4.1 Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô niêm mạc miệng phương pháp mảnh biểu mô 36 4.2 Chất lượng biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 36 Tỷ lệ biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy khó bóc dễ bóc 36 Vị trí đặt mảnh mô liên kết 36 Thời gian đồng nuôi cấy mảnh biểu mô lớp tế bào nuôi 36 Phương pháp tạo lớp tế bào nuôi tỷ lệ khó bóc tách biểu mô 36 4.6 Định danh biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy .36 Hình ảnh vi thể biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 36 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 37 1.Nguyên nhân tượng khó bóc tách biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy khỏi đáy lồng nuôi cấy 37 DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô niêm mạc miệng .31 Bảng 3.2 Đánh giá khả bóc biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy khỏi đáy lồng nuôi cấy 32 Bảng 3.3 Thời điểm tế bào biểu mô niêm mạc miệng bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô 32 Bảng 3.4 Thời điểm tế bào biểu mô niêm mạc miệng mọc kín đáy lồng nuôi cấy 33 Bảng 3.5 Thời điểm nguyên bào sợi bắt đầu mọc 34 Bảng 3.6 Thời điểm nguyên bào sợi mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Quá trình biệt hóa tế bào niêm mạc miệng [11] Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu 22 Hình 2.2 Mô hình nuôi cấy mảnh biểu mô mảnh mô liên kết27 Hình 2.3 Mô hình nuôi cấy mảnh biểu mô lớp dịch treo nguyên bào sợi tự thân 27 Hình 3.1 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy lô (HE, Giemsa, P.A.S, HMMD) .31 Hình 3.2 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy lô (HE, Giemsa, P.A.S, HMMD) .31 Hình 3.3 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy lô 31 (HE, Giemsa, P.A.S, HMMD) .31 Hình 3.4 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy lô (HE, Giemsa, P.A.S, HMMD) .31 Hình 3.5 Cấu trúc siêu vi biểu mô nuôi cấy khó bóc khỏi đáy lồng nuôi cấy 32 Hình 3.6 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô .33 Hình 3.7 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô 33 Hình 3.8 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô 33 Hình 3.9 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô .33 Hình 3.10 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô mọc kín đáy lồng nuôi cấy 33 Hình 3.11 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô mọc kín đáy lồng nuôi cấy 33 Hình 3.12 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô mọc kín đáy lồng nuôi cấy 33 Hình 3.13 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô mọc kín đáy lồng nuôi cấy 33 Hình 3.14 Nguyên bào sợi lô 1bắt đầu mọc .34 Hình 3.15 Nguyên bào sợi lô bắt đầu mọc 34 Hình 3.16 Nguyên bào sợi lô bắt đầu mọc 34 Hình 3.17 Nguyên bào sợi lô bắt đầu mọc 34 Hình 3.18 Nguyên bào sợi lô mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy 35 Hình 3.19 Nguyên bào sợi lô mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy 35 Hình 3.20 Nguyên bào sợi lô mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy 35 Hình 3.21 Nguyên bào sợi lô mọc thành lớp mỏng đáy giếng nuôi cấy 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Bề mặt nhãn cầu toàn vẹn ổn định điều kiện để đảm bảo cho thị lực tốt Sự toàn vẹn trì nhờ sinh sản di cư tế bào gốc vùng rìa Tuy nhiên, tế bào bị tổn thương yếu tố bên (bỏng nhiệt, bỏng hóa chất, nhiễm vi sinh vật, tia cực tím, ), hay bệnh lý thể bao gồm bệnh hệ thống (Hội chứng Stevens Johnson) bệnh lý di truyền (tật không mống mắt) Tùy thuộc vào mức độ tổn thương mà dẫn đến thiếu hụt tế bào gốc vùng rìa (LSCD-limbal stem cell deficiency) hai bên [1] Hậu chứng khô mắt, khó chịu cho bệnh nhân, kết mạc hóa bề mặt nhãn cầu, tăng sinh mạch, theo thời gian tiến triển đến mờ đục giác mạc cuối mù lòa [2] Suy giảm tế bào gốc vùng rìa điều trị nhiều phương pháp khác ghép màng ối, liệu pháp oxy, liệu pháp corticoid, ghép mảnh mô vùng rìa trực tiếp biểu mô nuôi cấy từ vùng rìa, [1] Nhưng biện pháp kể áp dụng cho trường hợp LSCD nhẹ bên mắt Đối với trường hợp LSCD toàn hai bên phải sử dụng mảnh ghép biểu mô vùng rìa có nguồn gốc đồng loại tử thi Để tránh tượng thải bỏ mảnh ghép, bệnh nhân cần điều trị ức chế miễn dịch thời gian dài Các tác dụng phụ thuốc ức chế miễn dịch làm ảnh hưởng đến chất lượng sống bệnh nhân Ngoài ra, biện pháp đòi hỏi chi phí điều trị cao, người ghép có khả nhiễm số bệnh lây truyền từ mảnh ghép đồng loại mà có nguy bị thải bỏ mảnh ghép Vì vậy, việc sử dụng mảnh ghép từ mô tự thân nghiên cứu phát triển Do biểu mô giác mạc loại biểu mô lát tầng không sừng hóa, tương tự cấu trúc biểu mô vùng niêm mạc miệng, mũi, thực quản, trực tràng, âm đạo, nên mảnh mô vị trí có 26 • Đánh tan mảnh mô liên kết phương pháp học Lọc tế bào màng lọc kích thước lỗ 70 µm Nuôi tạo lớp tế bào nuôi dịch treo với mật độ x 105 tế bào/ml 2.2.9 Quy trình nuôi cấy theo dõi  Nuôi cấy mảnh biểu mô Lô 1, 2: Sau mảnh biểu mô dính vào màng ối, đặt lồng nuôi vào giếng nuôi cấy có sẵn mảnh mô bổ sung 1,5ml môi trường vào giếng, 1ml môi trường vào lồng nuôi Nuôi lớp tế bào nuôi mọc kín 1/2 đáy giếng loại bỏ mảnh mô liên kết Lô 3: Nuôi mảnh biểu mô mảnh mô giếng khác Bổ sung 1,5ml môi trường vào giếng Riêng bên có mảnh biểu mô, bổ sung 1ml môi trường vào lồng nuôi cấy Nuôi lớp tế bào nuôi mọc kín 1/2 đáy giếng tiến hành đồng nuôi cấy mảnh biểu mô giếng Lô 4: Nuôi mảnh biểu mô lớp dịch treo tạo từ mô giếng khác Bổ sung môi trường tương tự lô Nuôi lớp tế bào nuôi mọc thành lớp mỏng đáy giếng nuôi cấy tiến hành đồng nuôi cấy mảnh biểu mô giếng • Hộp chứa giếng nuôi cấy đặt tủ ấm 370C, 5% CO2 • Thay môi trường ngày/ lần Thời gian nuôi cấy 14-16 ngày Mảnh mô liên kết 27 Hình 2.2 Mô hình nuôi cấy mảnh biểu mô mảnh mô liên kết Tế bào biểu mô niêm mạc miệng mọc khỏi mảnh biểu mô Lớp dịch treo nguyên bào sợi tự thân Hình 2.3 Mô hình nuôi cấy mảnh biểu mô lớp dịch treo nguyên bào sợi tự thân  Quy trình tạo tầng • Khoảng ngày thứ 12 nuôi cấy, thấy tế bào biểu mô mọc kín đáy lồng nuôi cấy, tiến hành tạo tầng cho biểu mô • Bơm môi trường vào giếng nuôi cấy lồng nuôi cấy • Hút hết môi trường lồng nuôi cấy bỏ đi, tế bào biểu mô tiếp xúc với không khí • Đặt giếng nuôi cấy tủ ấm 37oC, 5% CO2 • Thay môi trường giếng nuôi cấy hàng ngày 2.2.10 Thu hoạch định danh tế bào nuôi cấy 2.2.10.1 Thu hoạch Sau nuôi cấy biểu mô kích thước cm 2, tiến hành thu hoạch biểu mô nuôi cấy theo quy trình sau: 28 • Hút hết toàn môi trường nuôi cấy có bổ sung 10% FBS • Rửa hai lần biểu mô nuôi cấy môi trường không bổ sung FBS • Cắt biểu mô nuôi cấy theo chu vi lồng nuôi • Bóc tách biểu mô khỏi đáy lồng nuôi cấy 2.2.10.2 Định danh tế bào Tế bào biểu mô nuôi cấy định danh kỹ thuật hiển vi điện tử, hiển vi quang học, hóa mô, hóa mô miễn dịch a Nhuộm giemsa Mục đích: quan sát bề mặt biểu mô nuôi cấy • Tấm biểu mô vừa lấy khỏi giếng nuôi cấy trải thẳng lên lam kính • Cố định cồn tuyệt đối phút • Rửa lại nước thường • Chuẩn bị giemsa 10% pha nước cất • Nhuộm giemsa 10 phút • Rửa lam kính vòi nước chảy • Để khô, dán lamella, sau kiểm tra kính b Nhuộm Hematoxylin-Eosin Mục đích: quan sát mặt cắt đứng biểu mô • Tấm biểu mô vừa lấy khỏi giếng cố định dung dịch formol 10% 1-2 • Khử nước cồn 700, 800, 900, 950, 1000 • Làm miếng mô cách ngâm qua ba lọ xylen • Đúc miếng mô khuôn nến • Cắt mẫu thành lát mỏng 5-7µm • Nhuộm màu theo phương pháp HE • Quan sát kính hiển vi quang học c Kỹ thuật hóa mô (nhuộm P.A.S - Periodic acid Shiff) Mục đích: phát có mặt tế bào hình đài tiết nhày biểu mô nuôi cấy • Một phần biểu mô cố định dung dịch carnoy cắt thành lát mỏng 5-7µm • Khử nến • Ngâm tiểu dung dịch acid periodic 1% 15 phút 29 • Rửa vòi nước chảy vòng phút • Rửa lại nước cất • Ngâm tiêu vào dung dịch Shiff 30 phút, để chỗ tối • Cho vào cốc SO2, cốc phút • Nhuộm nhân Hematoxilin phút d Kỹ thuật hóa mô miễn dịch Mục đích: xác định số loại keratin đặc hiệu thấy biểu mô niêm mạc miệng (K4, K13) P63 loại protein nhân tế bào, xuất nhiều tế bào chưa biệt hóa • Tấm biểu mô vừa lấy khỏi giếng đúc block optical • • • • coherence tomography (OCT) Sử dụng máy cắt lạnh cắt mẫu thành lát mỏng 7µm Gắn mẫu lên lam kính gelatin, để khô Rửa lại lần (5 phút/ lần) với PBS nhiệt độ phòng Để hạn chế gắn không đặc hiệu, mẫu ủ với dung dịch chặn BSA (bovine serum albumin) nhiệt độ phòng • Ủ với kháng thể thứ 90 phút, nhiệt độ phòng • Rửa lại PBS lần (5 phút/ lần) • Ủ với kháng thể thứ hai 30 phút, nhiệt độ phòng • Rửa lại PBS lần • Phủ môi trường chống bạc màu có chứa iode • Kiểm tra kính e Kỹ thuật hiển vi điện tử Tấm biểu mô kiểm tra kính hiển vi điện tử quét (SEMscanning electron microscope) Mục đích: quan sát cấu trúc siêu vi biểu mô, tìm cấu trúc liên kết tế bào biểu mô với màng ối (cấu trúc mặt đáy tế bào), cấu trúc liên kết mặt màng ối • Tấm biểu mô vừa lấy khỏi giếng nuôi cấy cố định • • • • dung dịch glutaraldehyde 2,5% pha với PBS Rửa lần 15 phút với PBS Tiếp tục cố định 30 phút dung dịch osmium tetroxide 1% Rửa lại miếng mô lần PBS Chuyển qua cồn để khử nước (500, 700, 800, 900, 950, 1000) 30 Với SEM, miếng mô chuyển qua dung dịch hexamethyldisilazane vòng 10 phút, sau để khô không khí Khi khô, miếng mô phủ mạ vàng, sau kiểm tra kính S-4800-Hitachi 2.3 Chỉ tiêu nghiên cứu Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô Tỷ lệ biểu mô sau nuôi cấy bóc dễ Thời gian nuôi cấy Cấu trúc vi thể lớp tế bào nuôi Cấu trúc vi thể biểu mô nuôi cấy Cấu trúc siêu vi biểu mô nuôi cấy Cấu trúc hóa học biểu mô nuôi cấy 2.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành môn Mô - Phôi trường Đại Học Y Hà Nội Tháng 10/2015 – 10/ 2016 2.5 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu tiến cứu 2.6 Đạo đức nghiên cứu Đề tài thực theo quy trình xây dựng Đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu quy trình sử dụng tế bào gốc để điều trị số bệnh bề mặt nhãn cầu” môn Mô - Phôi, thông qua hội đồng đạo đức Y học, trường Đại Học Y Hà Nội 31 CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 3.1 Kết nuôi tạo biểu mô niêm mạc miệng phương pháp nuôi mảnh biểu mô 3.1.1 Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô niêm mạc miệng Bảng 3.1 Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô niêm mạc miệng Số mẫu nuôi Số mẫu mọc Tỷ lệ mọc Lô Lô Lô Lô N Hình 3.1 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy lô (HE, Giemsa, P.A.S, HMMD) Hình 3.2 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy lô (HE, Giemsa, P.A.S, HMMD) Hình 3.3 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy lô (HE, Giemsa, P.A.S, HMMD) Hình 3.4 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy lô (HE, Giemsa, P.A.S, HMMD) p 32 3.1.2 Chất lượng biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy Bảng 3.2 Đánh giá khả bóc biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy khỏi đáy lồng nuôi cấy Số mẫu nuôi Số mẫu dễ bóc Số mẫu khó bóc p Lô Lô Lô Lô N Hình 3.5 Cấu trúc siêu vi biểu mô nuôi cấy khó bóc khỏi đáy lồng nuôi cấy 3.2 Hình thái tốc độ phát triển tế bào biểu mô niêm mạc miệng Bảng 3.3 Thời điểm tế bào biểu mô niêm mạc miệng bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô Thời điểm (ngày) Lô Lô Lô Lô 33 Hình 3.6 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô Hình 3.7 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô Hình 3.8 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô Hình 3.9 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô bắt đầu mọc khỏi mảnh biểu mô Bảng 3.4 Thời điểm tế bào biểu mô niêm mạc miệng mọc kín đáy lồng nuôi cấy Thời điểm (ngày) Lô Lô Lô Lô Hình 3.10 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô mọc kín đáy lồng nuôi cấy Hình 3.11 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô mọc kín đáy lồng nuôi cấy Hình 3.12 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô mọc kín đáy lồng nuôi cấy Hình 3.13 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng lô mọc kín đáy lồng nuôi cấy 34 3.3 Hình thái tốc độ phát triển lớp nguyên bào sợi Bảng 3.5 Thời điểm nguyên bào sợi bắt đầu mọc Thời điểm (ngày) Lô Lô Lô Lô Hình 3.14 Nguyên bào sợi lô 1bắt đầu mọc Hình 3.15 Nguyên bào sợi lô bắt đầu mọc Hình 3.16 Nguyên bào sợi lô bắt đầu mọc Hình 3.17 Nguyên bào sợi lô bắt đầu mọc Bảng 3.6 Thời điểm nguyên bào sợi mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy Thời điểm (ngày) Lô Lô Lô 35 Hình 3.18 Nguyên bào sợi lô mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy Hình 3.19 Nguyên bào sợi lô mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy Hình 3.20 Nguyên bào sợi lô mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy Hình 3.21 Nguyên bào sợi lô mọc thành lớp mỏng đáy giếng nuôi cấy 36 CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 4.1 Tỷ lệ nuôi tạo thành công biểu mô niêm mạc miệng phương pháp mảnh biểu mô 4.2 Chất lượng biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy  Tỷ lệ biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy khó bóc dễ bóc  Vị trí đặt mảnh mô liên kết  Thời gian đồng nuôi cấy mảnh biểu mô lớp tế bào nuôi  Phương pháp tạo lớp tế bào nuôi tỷ lệ khó bóc tách biểu mô 4.6 Định danh biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy  Hình ảnh vi thể biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy  Hình ảnh siêu vi thể biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 37 DỰ KIẾN KẾT LUẬN Nguyên nhân tượng khó bóc tách biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy khỏi đáy lồng nuôi cấy Phương pháp khắc phục tượng khó bóc tách biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy khỏi đáy lồng nuôi cấy DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO DỰ TOÁN KINH PHÍ ĐỀ TÀI Đề tài: "Nguyên nhân phương pháp khắc phục tượng khó bóc tách biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy" Người thực đề tài: Diêm Thị Yến Đơn vị: Bác sĩ nội trú - Chuyên ngành Mô - Phôi khóa 38, Trường Đại Học Y Hà Nội Thời gian thực đề tài: 10/2015-10/2016 TT Nội dung Công lao động Nhuộm hóa mô miễn dịch Nhuộm Hematoxilin -Eosin Nhuộm PAS Nhuộm Giemsa Nhập số liệu, tổng hợp, phân tích số liệu Động vật thí nghiệm Vật tư, hóa chất DMEM liquid, 1X; Đóng gói: 500ml (20 ml/mẫu) PBS, 1X, liquid; Đóng gói: 500ml (20 ml/mẫu) Đĩa Pettri nhỏ 30mm Pipette Pasteur Màng lọc 70µm Tổng kinh phí Thành Ghi tiền 3000 2000 400 200 400 ĐVT SL Đơn giá Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 20 20 500 20 50 20 Kg 20 150 3000 3000 Chai 1170 1170 Chai 1120 1120 Dây Hộp Cái 1 (Bằng chữ: chín triệu đồng chẵn) 9000 Đơn vị: nghìn đồng KẾ HOẠCH THỰC HIỆN • Thông qua đề cương: tháng 10/2015 • Bắt đầu tiến hành nuôi cấy: tháng 11/2015 • Từ tháng 11-1/2015: nuôi 08 biểu mô niêm mạc miệng Làm mẫu kính hiển vi điện tử • Nghỉ tết: tháng 2/2016 • Từ tháng 3-7/2016: nuôi 12 biểu mô niêm mạc miệng Làm mẫu kính hiển vi điện tử • Kết thúc nuôi cấy: 7/2016 • Bảo vệ đề tài tốt nghiệp: 9-10/2016