Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tình trạng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy (TBMNMMNC) sau ghép tự thân trên thỏ được gây bỏng thực nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 NGHIÊN CỨU GHÉP TẤM BIỂU MÔ NIÊM MẠC MIỆNG NUÔI CẤY TRÊN THỰC NGHIỆM Nguyễn Thị Thu Thuỷ*; Hoàng Thị Minh Châu*; Nguyễn Thị Bình** TĨM TẮT Mục tiêu: đánh giá tình trạng biểu mơ niêm mạc miệng ni cấy (TBMNMMNC) sau ghép tự thân thỏ gây bỏng thực nghiệm Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 15 thỏ gây bỏng giác mạc, sau tuần, sinh thiết biểu mô niêm mạc miệng để nuôi cấy tạo biểu mơ, sau ghép tự thân TBMNMMNC cho thỏ Kết quả: biểu mơ hố hồn tồn sau ghép 30 ngày tất thỏ, sau 60 ngày, thỏ có tân mạch vào chu biên, khơng vào trung tâm giác mạc, tất thỏ lại cho kết tốt, giác mạc trong, biểu mơ áp ngun vẹn, nhẵn bóng, khơng có tân mạch Kết luận: phẫu thuật ghép TBMNMMNC thành công thực nghiệm, cho phép ghi nhận hình ảnh vi thể tồn TBMNMMNC giác mạc sau ghép * Từ khố: Giác mạc; Tấm biểu mơ niêm mạc miệng nuôi cấy; Thực nghiệm; Thỏ CULTURED ORAL MUCOSAL EPITHELIAL TRANSPLANTATION IN EXPERIMENt summary Purpose: evaluate the survival of cultured oral mucosal epithelial sheet after transplantation in rabbit Subjects and methods: 15 rabbit eyes were caused burns, weeks later, the oral mucosal epithelial cells of theses rabbits was cultured on amniotic membrane from biopsy-derived oral mucosal tissues The autologous cultivated oral mucosal epithelial sheet was transplanted into ocular surface of rabbit burned eyes Results: epithelialisation completed at 30 days of follow-up in all of rabbit eyes After postoperative 60 days, there was rabbit eye having moderate result with neovascularization at peripheral cornea, the rest 14 rabbit eyes have good results: the epithelial sheets survive, intact and clear, no neovascularization Conclusion: cultured oral mucosal epithelial transplantation was successfully in experimental, is the scientific basis for the application in human * Key words: Cornea; Oral mucosal epithelial sheet; Experimental; Rabbit * Bệnh viện Mắt Trung ương ** Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Thu Thủy (thuyoph@gmail.com) Ngày nhận bài: 07/03/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 27/03/2014 Ngày báo đăng: 29/04/2014 31 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn bề mặt nhãn cầu nặng suy giảm toàn tế bào gốc (TBG) vùng rìa thách thức bác sỹ nhãn khoa, mức độ khó khăn tiên lượng điều trị Biểu rối loạn xâm lấn biểu mô kết mạc, tổ chức xơ tân mạch vào giác mạc, gây giảm thị lực trầm trọng, kèm theo dấu hiệu kích thích năng, làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống người bệnh Phẫu thuật ghép TBG tự thân từ TBG vùng rìa mắt lành để điều trị rối loạn bề mặt nhãn cầu mắt phương pháp tối ưu áp dụng thành công giới Việt Nam Tuy nhiên, phương pháp không áp dụng cho bệnh nhân (BN) bị bệnh mắt khơng TBG Phương pháp ghép dị thân đòi hỏi phối hợp thuốc ức chế miễn dịch toàn thân kéo dài để chống thải ghép, có nguy cao gây tổn thương chức gan thận, nhiễm trùng toàn thân chỗ, chưa áp dụng rộng rãi Thời gian gần đây, ghép TBMNMMNC giải pháp cho BN bị rối loạn bề mặt nhãn cầu mắt, nghiên cứu thực nghiệm áp dụng thành công người nhiều nước phát triển [1, 2, 4, 5] Từ năm 2009 tới nay, Khoa Kết Giác mạc, Bệnh viện Mắt TW kết hợp với Bộ môn Mô phôi, Đại học Y Hà Nội tiến hành nghiên cứu áp dụng phẫu thuật này, bước đầu cho kết khả quan lâm sàng Để có minh chứng khoa học cho phương pháp ghép biểu mô niêm mạc miệng điều trị bệnh lý rối loạn bề mặt nhãn cầu tổn thương TBG, tiến hành ghép thỏ thực nghiệm để đánh giá khả sống hình ảnh vi thể TBMNMMNC sau ghép kiến tạo bề mặt nhãn cầu ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 15 thỏ khoẻ mạnh, trọng lượng trung bình ± 0,2 kg, ni điều kiện phòng thí nghiệm ngày trước làm thí nghiệm Phƣơng pháp nghiên cứu Gây bỏng giác mạc cho thỏ phương pháp "in dấu" dung dịch NaOH 3% bề mặt giác mạc vùng rìa giây, rửa mắt NaCl 0,9%, sau gây bỏng phút Sau gây bỏng tuần, thỏ sinh thiết mảnh niêm mạc mặt vùng má, kích thước × mm Ni cấy tạo biểu mô niêm mạc miệng theo quy trình tiêu chuẩn Labo ni cấy Mơ, Bộ mơn Mơ phơi, Đại học Y Hà Nội (quy trình phần nội dung Đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu quy trình sử dụng TBG để điều trị số bệnh bề mặt nhãn cầu”, thuộc Bộ môn Mô phôi, Đại học Y Hà Nội, mã số ĐTĐL.2010T/15) Mỗi thỏ thực nghiệm nuôi tạo biểu mô niêm mạc miệng, dùng để ghép tự thân cho thỏ, dùng kỹ thuật định danh kiểm tra chất lượng biểu mô Ghép tự thân TBMNMMNC: gây mê tĩnh mạch tai thỏ thiopental 10 mg/kg sát trùng mắt thỏ dung dịch betadine 5% Đặt vành mi Mở kết mạc rìa 360º Phẫu tích tổ chức màng xơ mạch giác mạc củng mạc Chuẩn bị diện ghép gồm: bề mặt giác mạc, vùng rìa củng mạc quanh rìa, cách rìa giác củng mạc mm Trải biểu mô nuôi cấy bề mặt nhãn cầu Dùng 10/0 khâu cố định biểu mô bề mặt nhãn cầu mũi rời Kiểm tra độ 34 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 toàn vẹn biểu mô test nhuộm fluorescein Tra thuốc mắt phẫu thuật hàng ngày dung dịch kháng sinh (cloroxit 0,4% × lần/ngày), chống viêm (maxitrol × lần/ngày) Đánh giá tồn trạng thỏ sau mổ, tình trạng mắt thỏ thời điểm sau ghép ngày, 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày, 180 ngày Các tiêu chí đánh giá gồm: độ áp biểu mô, toàn vẹn bề mặt nhãn cầu tân mạch giác mạc Kết tốt: biểu mô áp tốt, bề mặt nhãn cầu nhẵn, khơng có tân mạch tân mạch dừng rìa giác mác Kết khá: biểu mô áp, bề mặt nhãn cầu thơ ráp khơng có tổn thương biểu mơ, tân mạch qua rìa vào chu biên giác mạc Kết xấu: biểu mô bong bị tiêu hủy, có tổn thương biểu mơ dai dẳng, tân mạch vào trung tâm giác mạc Giết thỏ theo lô thời điểm theo dõi kiểm tra cấu trúc vi thể giác mạc thỏ ghép TBMNMMNC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết biểu mô nuôi cấy Sau tuần nuôi cấy theo phương pháp mảnh biểu mô, tạo biểu mô niêm mạc miệng thỏ thực nghiệm Tất biểu mơ phẳng, phủ kín đáy giếng nuôi cấy chất mang màng ối, tách dễ dàng nguyên vẹn khỏi đáy giếng ni cấy phẫu thuật Về cấu trúc siêu vi, biểu mô gồm tế bào đa diện nhau, có - hàng tế bào, lớp dẹt dần, lớp có vi nhung mao ngắn, tế bào liên kết cầu bào tương dài Trong bào tương lớp đáy, bào quan phát triển Lớp đáy gắn chặt với màng ối thể bán liên kết Hình 1: Hình ảnh vi thể TBMNMMNC 35 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Khi định danh biểu mơ ni cấy có xuất p63 (dấu ấn nhận biết TBG biểu mô), đặc biệt nhân tế bào lớp đáy Nhuộm phát K3 K12 (thể tế bào biệt hóa) thể yếu tế bào lớp Nhuộm PAS thấy khơng có xuất tế bào tiết nhày biểu mô nuôi cấy Kết thỏ sau ghép Ở tất thời điểm theo dõi, biểu mô áp tốt bề mặt nhãn cầu Trong ngày đầu làm test nhuộm fluorescein, thỏ có giác mạc bắt màu thuốc nhuộm trung tâm khoảng mm xuất tân mạch chu biên Tuy nhiên, sau 15 ngày, diện bắt màu thu gọn mm, tân mạch chu biên rút bớt vùng rìa Sau mổ 30 ngày, biểu mơ hố hồn toàn tất thỏ, test fluorescein (-), tân mạch hết quanh rìa, khơng cương tụ Sau mổ 60 ngày, thỏ tân mạch qua rìa vào chu biên, khơng vào trung tâm giác mạc, tất thỏ lại có kết tốt, giác mạc trong, biểu mô áp tốt, nhẵn bóng khơng có tân mạch giác mạc Ở mức độ vi thể, quan sát mẫu sinh thiết giác mạc thỏ sau ghép thời điểm thấy: sau ghép ngày, biểu mô áp sát nhu mô chưa dán chặt, nên làm tiêu dễ bị bong, lớp nhu mô trương phù, collagen tách xa Từ giai đoạn 15 ngày sau ghép, biểu mô áp dán chặt vào lớp nhu mô, tượng trương phù giảm rõ rệt hết hẳn sau ghép 30 ngày Ở thời điểm lâu hơn, biểu mô áp chặt vào nhu mô, giác mạc hết phù, tế bào xếp đặn Lớp tế bào nhân khơng có tượng sừng hóa Hình 2: Hình ảnh cấu trúc vi thể giác mạc thỏ sau ghép thời điểm 7, 15, 30, 60, 180 ngày 35 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 BÀN LUẬN Về cấu trúc mô học, tế bào biểu mô giác mạc biểu mô niêm mạc miệng biểu mơ lát tầng khơng sừng hóa, có nguồn gốc phơi thai từ ngoại bì da có hình thái tế bào lớp đáy giống Năm 2003, Nakamura CS nuôi cấy thành công biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy màng ối ghép tự thân cho thỏ bị bỏng giác mạc [3] Sau đó, Hayashida CS (2005) tiến hành ghép tự thân TBMNMMNC cho thỏ bị tổn hại TBG Kết nuôi cấy tạo tế bào có hình dạng, cấu trúc siêu vi giống tế bào biểu mô giác mạc Sau ghép cho thỏ, biểu mô gắn chặt với mô giác mạc, dai suốt, hạn chế tân mạch xâm nhập giác mạc [1] Kết nghiên cứu chúng tơi thỏ thực nghiệm cho thấy TBMNMMNC có cấu trúc sinh học tương đồng với biểu mô giác mạc, có khả bám dính tồn tốt mắt thỏ sau ghép Tấm biểu mơ có khả thay lớp biểu mô giác mạc thỏ tổn thương suy giảm TBG, giúp trì ổn định, suốt bề mặt nhãn cầu So với kết nghiên cứu ghép TBMNMMNC để điều trị cho BN bị rối loạn bề mặt nhãn cầu nặng mắt suy giảm TBG [2, 4, 5], kết phẫu thuật thỏ có nhiều thuận lợi thành công so với phẫu thuật BN, q trình gây bỏng thực nghiệm cho thỏ chủ động với mức độ vừa phải, nên gây rối loạn bề mặt nhãn cầu lớp nơng, khơng gây tổn thương sâu, khơng chất gây bỏng nằm sâu tổ chức, khơng có phản ứng viêm dai dẳng sau phẫu thuật Đồng thời, mắt thỏ ln có nếp mí phụ có tác dụng che phủ ni dưỡng tốt cho bề mặt nhãn cầu, lớp kết mạc thỏ, đặc biệt kết mạc mi kết mạc lớp mí phụ ngun vẹn, khơng bị tổn thương sau gây bỏng, nên chế tiết nước mắt giúp không bị ảnh hưởng sau bỏng, lợi lớn giúp cho biểu mô nuôi cấy thỏ bám dính ni dưỡng tốt bề mặt nhãn cầu, không bị xâm nhập tân mạch viêm KẾT LUẬN Kết nghiên cứu thành công thỏ thực nghiệm minh chứng khoa học cho phẫu thuật ghép TBMNMMNC, tạo sở cho việc ứng dụng phương pháp BN TÀI LIỆU THAM KHẢO Hayashida Y et al Ocular suface reconstruction using autologous rabbit oral mucosal epithelial sheets fabricated ex vivo on a temperature responsive culture surface Invest Ophthalmol Vis Sci 2005, 46, pp.1632-1639 Inatomi T, Nakamura T, Koizumi N, Sotozono C, Yokoi N, Kinoshita S Midterm results on ocular surface reconstruction using cultivated autologous oral mucosal epithelial transplantation Am J Ophthalmol 2006, 141 (2), pp.267-275 Nakamura T et al The successful culture and autologous transplantation of rabbit oral mucosal epithelial cells on amniotic membrane Invest Ophthalmol Vis Sci 2003, 44, pp.106-116 Nakamura T, Takeda K, Inatomi T, Sotozono C, Kinoshita S Long-term results of autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation in the scar phase of severe ocular suface disorders Br J Ophthalmol 2011, 95, pp.942-946 Satake Y, Higa K, Tsubota K, Shimazaki J Long-term outcome of cultivated oral mucosal epithelial sheet transplantation in treatment of total limbal stem cell deficiency Ophthalmology 2011, 118 (8), pp.1524-1530 ... nuôi cấy theo phương pháp mảnh biểu mô, tạo biểu mô niêm mạc miệng thỏ thực nghiệm Tất biểu mơ phẳng, phủ kín đáy giếng nuôi cấy chất mang màng ối, tách dễ dàng nguyên vẹn khỏi đáy giếng nuôi cấy. .. thương biểu mô dai dẳng, tân mạch vào trung tâm giác mạc Giết thỏ theo lô thời điểm theo dõi kiểm tra cấu trúc vi thể giác mạc thỏ ghép TBMNMMNC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết biểu mô nuôi cấy Sau tuần nuôi. .. ni cấy tạo tế bào có hình dạng, cấu trúc siêu vi giống tế bào biểu mô giác mạc Sau ghép cho thỏ, biểu mô gắn chặt với mô giác mạc, dai suốt, hạn chế tân mạch xâm nhập giác mạc [1] Kết nghiên cứu