Các kỹ thuật phân tích chuẩn đoán compatibility mode

Kỹ thuật sắc ký Chromatography Technology Các kỹ thuật phân tích Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Nguyên tắc phương pháp sắc ký 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA Sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange chromatography) Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography) Sắc ký lực (Affinity chromatography) Sắc ký đảo pha (Reverse phase chromatography) Sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography) 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí Kỹ thuật sắc ký Các phương pháp sắc ký Sắc ký hấp thục (Adsorption chromatography) Nguyễn Hữu Trí Nguyên tắc phương pháp sắc ký Sự phân tách chất tan dựa vào lực tương đối của: chất tan pha di động chất tan thể Một chất tan có lực pha di động lớn so với lực với thể có xu hướng di chuyển pha so với pha di động Trong dung dịch có n chất tan, chất có lực với pha di động lớn có thời gian lưu nhỏ nhất, khỏi cột sắc khí sớm 31/10/2011 8:58 SA • Mẫu (sample): cần lọc trước chạy sắc ký • Buffer: lọc nhằm loại bỏ tạp nhiễm trước sử dụng • Pha động (mobile phase): Dung môi bơm từ reservoir vào cột (column) sắc ký Nhiều reserovoir, pha động bơm vào Mixer (máy trộn) trước vào cột • Pha tĩnh (stationary phase): Được giữ lại cột môt miếng thủy tinh đáy cột • Các phân tử sinh học tách cột sắc ký • Trong HPLC, Guard column sử dụng nhằm bảo vệ cột sắc ký • Detector: UV bước sóng 280 nm detect hầu hết protein • UV 205 – 220 detect protein hay peptide cấu tử có mạch vòng 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Sắc ký lỏng (liquid chromatography) Thành phần • Partition coefficient: Cs: nồng độ mẫu pha tĩnh (Stationary phase) Cm: nồng độ mẫu pha động (Mobile phase) 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Sắc ký lỏng 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí 10 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Thơng số sắc ký lỏng Thông số sắc ký lỏng • Retention time (tR): thời gian phân tử sinh học khỏi cột sắc ký tính từ lúc nạp mẫu • retention volume(VR): • Resolution (R): Thơng số dùng đánh giá mức độ tách phân tử sinh học mẫu • Rf • W: độ rộng đáy beat 31/10/2011 8:58 SA 11 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 12 Nguyễn Hữu Trí Pha tĩnh (stationary phase) 31/10/2011 8:58 SA 13 Nguyễn Hữu Trí Open column chromatography (low performance liquid chromatography) • Sử dụng áp suất khí quyển, độ phân tách thấp • Đường kính hạt pha tĩnh tương đối lớn • Cột sử dụng vật liệu rẻ tiền Vd: plastic -Độ phân tách thấp 31/10/2011 8:58 SA 15 Nguyễn Hữu Trí Sơ đồ hệ thống HPLC Tách rửa khỏi cột (elution) • Mobile phase: đường chấm, có pH, lực liên kết ion, tính phân cực thay đổi theo dãy Giảm hệ số K • Mỗi phân tử sinh học mẫu có khả lực riêng pha tĩnh 14 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography – HPLC) • Phase động bơm vào hệ thông với tốc độ dòng chảy cao (high flow rate) áp suất cao (55 Mpa) • Đường kính hạt pha tónh nhỏ, chứa lỗ nhỏ li ti giúp phân tử sinh học vào, đặc biệt chòu áp suất cao (các hạt phải rắn hạt dùng open column chromatography) • Việc tách rửa tốt tốc độ pha động ổn đònh • Trong HPLC, pha động thường hỗn hỡp hai phần nhiều -> mixer • Đường ống cột sắc ký làm thép không ró • Dung môi phải khử khí lọc trước sử dụng 31/10/2011 8:58 SA 16 Nguyễn Hữu Trí Sắc ký lọc gel (gel filtration) • Size exclusion chromatography hay gel filtration • Phân tử sinh học giữ pha dung mơi suốt q trình sắc ký • Tách lọc phân tử sinh học dựa kích thước hình dáng 31/10/2011 8:58 SA 17 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 18 Nguyễn Hữu Trí Sắc ký lọc gel (gel filtration) • Protein nhỏ vào hạt bead giữ lại • Cột thủy tinh • Các hạt gel polysaccharide • Các protein lớn bị lọai khỏi hạt khỏi cột sắc ký trước protein nhỏ 19 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Sắc ký lọc gel (gel filtration) 20 Nguyễn Hữu Trí Sắc ký lọc gel (gel filtration) • Ứng dụng: • Xác định khối lượng phân tử • Loại bỏ phân tử có kích thước nhỏ khơng cần thiết Vd: Loại bỏ muối khỏi dung dịch protein trước thực sắc ký trao đổi ion • Tinh protein • Pha tĩnh gồm hạt gel chứa nhiều khoảng không nhỏ (xốp) • Protein nhỏ, dễ vào hạt gel giữ lâu • Protein tách rửa khỏi cột theo thứ tự khối lượng phân tử giảm dần 21 31/10/2011 8:58 SA 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA Sắc ký hấp phụ 22 Nguyễn Hữu Trí Sắc ký trao đổi ion • Trong sắc ký hấp phụ, chất tan pha động tranh vị trí gắn pha tĩnh • Pha tĩnh có cấu trúc mở giúp protein dễ dàng thâm nhập vào hạt tiến vị trí gắn kết (binding site) • Tùy vào kiểu liên kết protein pha tĩnh: – – – – Sắc ký trao đổi ion Sắc ký lực Sắc ký kỵ nước Sắc ký ngược pha 31/10/2011 8:58 SA 23 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 24 Nguyễn Hữu Trí Sắc ký trao đổi ion • Protein thay counterion Na+, Cl− gắn vào pha tĩnh lực hút tĩnh điện • Khi Na+, Cl- gọi Ion exchange group hay ion Exchanger • Sự gắn kết hồn tồn-> trung hòa điện Điện tích protein thay đổi theo pH mơi trường • Điện tích protein điện tích mạch nhánh (R side chain) cấu tử môi trường pH định định • Tại pH acid, hầu hết Protein tích điện dương ngược lại 31/10/2011 8:58 SA 25 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 26 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 27 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 28 Nguyễn Hữu Trí Các nhóm tích điện Ion exchanger • Có loại ion exchanger: • Cation exchanger: có khả gắn kết ion dương • Anion exchanger: có khả gắn kết ion âm • Mạch nhánh tích điện gắn vào: cellulose, Agarose, dextran, hay silica (HPLC) 31/10/2011 8:58 SA 29 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 30 Nguyễn Hữu Trí Tách rửa Một số ion exchanger thông dụng • Gradient nồng độ NaCl KCl dùng để tách rửa protein khỏi cột sắc ký (Cũng dùng gradient pH buffer) 31/10/2011 8:58 SA 31 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 32 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 34 Nguyễn Hữu Trí Sắc ký kỵ nước (hydrophobic chro.) • Non – polar side chain: Ala, • Val, leu, Ile, Trp, Met, Phe, Pro Thường tâp trung lõi protein • Có thể tìm thấy bề mặt protein protein khác có tính kỵ nước bề mặt khác •  sở sắc ký kỵ nước 31/10/2011 8:58 SA 33 Nguyễn Hữu Trí Các loại ligand 31/10/2011 8:58 SA 35 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 36 Nguyễn Hữu Trí Normal phase chromatography Tách rửa • Protein nạp vào cột sắc ký chứa nhóm octyl phenyl với diện 2M (NH4)2SO4 • Tách rửa: dùng gradient nồng độ giảm dần (2M – 0) (NH4)2SO4 37 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí • Pha tĩnh: phân cực • Pha động: gradient nơng độ dung moi phân cực tăng dần • Protein phân cực khỏi cột sau ngược lại 31/10/2011 8:58 SA 38 Nguyễn Hữu Trí Sắc ký ngược phase (reversse phase chro.) Sắc ký ngược pha • Pha tĩnh: nhánh hydrocarbon (C-4, C8, C-18) gắn lên pha tĩnh • Mẫu cho vào dung môi phân cực như: nước, methanol, acetronitrile…hoặc hỗn hợp • Proteins gắn vào pha tĩnh theo tương tác kỵ nước theo mức độ khạc • Tách rửa: sử dung gradient nồng độ tăng dần acetonitrile gradient nồng độ nước giảm dần -> tăng dần tính kỵ nước pha động 31/10/2011 8:58 SA 39 Nguyễn Hữu Trí Sắc ký lực (affinity chro.) 31/10/2011 8:58 SA 40 Nguyễn Hữu Trí Sắc ký lực (affinity chro.) • Enzyme nhận biết gắn với chất dạng lực • -> lý thuyết xây dựng sắc ký lực • Pha tĩnh: Affinity ligand cố pha tĩnh 31/10/2011 8:58 SA 41 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 42 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 43 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 44 Nguyễn Hữu Trí Một số ví dụ sắc ký lực • Antigen ligand -antibody • Protein A cố định pha tĩnh • IgG (immunoglobulin)sẽ gắn với protein A vùng Fc: nồng độ muối cao, Ph cao • Tách rửa: pH 2-4; IgG 1; IgG 2a; IgG 2b… phân tách khỏi cột dựa vào khác vùng Fc 31/10/2011 8:58 SA 45 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 46 Nguyễn Hữu Trí Qui trình ELISA 47 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 S SAC., R L Hodinka and S A Young Clinical Virology Manual, Third Edition ASM Press, 2000 Modified from Specter, 31/10/2011 Figure 5.20: 8:58 HIVSA ELISA test 48 © Hank Morgan/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc Nguyễn Hữu Trí Kỹ thuật ELISA gián tiếp Mẫu xét nghiệm E R Ử A Ủ 37 °C Mẫu XN Cơ chất Ngưng phản ứng Đọc kết Cộng hợp Kỹ thuật ELISA SANDWICH R Ử A E Ủ 37 °C 30 phút, T thường + E R Ử A X Cộng hợp 30 phút/ 37 °C chât Ngưng phản ứng Đọc kết 450nm 30phút/ To phòng 30 phút/ 37 °C Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng theå 49 31/10/2011 8:58 SA R Ử A X KN gắn giếng + Nguyễn Hữu Trí 50 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Kỹ thuật ELISA phát đồng thời Kháng nguyên Kháng thể Kỹ thuật ELISA cạnh tranh Cộng hợp 30 phút, T thường Ủ 37 °C ? Y Cơ chất E Ngưng phản ứng Đọc kết R Ử A Y E Y Mẫu xét nghiệm KN & KT Mẫu XN Bước 1: Ủ 60 phút/ 37 °C R Ử A X + E E Cộng hợp Bước : 30 phút/ To phòng R Ử A X + chât 30phút/ To phòng Phản ứng màu tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng thể 31/10/2011 8:58 SA 51 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA Tách chiết nucleic acid - định tính định lượng Các phương pháp tách chiết nucleic acid  Phương pháp tách chiết DNA  Phương pháp tách chiết RNA toàn phần mRNA  Ly tâm  Phương pháp sắc ký Các phương pháp định tính định lượng thơ nucleic acid  Phương pháp đo quang phổ kế  Phương pháp điện di 31/10/2011 8:58 SA 53 Nguyễn Hữu Trí 52 Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA      Để thu nhận DNA tinh cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng protein Sự tách chiết DNA dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hòa tan (phenol, chloroform/nước) Mục đích thu phân tử nucleic acid trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy tác nhân học hay hóa học Các nucleic acid cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào (DNase RNase) Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh nằm thể tích dung dịch lớn Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dạng cặn tủa dễ bảo quản cần hòa lại nước theo nồng độ mong muốn 31/10/2011 8:58 SA 54 Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA Tách chiết DNA  • Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân • Bước 2: loại protein • Bước 3: thu hồi nucleic acid   55 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô hỗn hợp chất tẩy (SDS) proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA môi trường đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA – Chất tẩy phân tử lưỡng cực, kết hợp với protein màng phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng – Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy khơng ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ Loại protein: lắc mẫu dung dịch phenol:chloroform để biến tính protein đồng thời khơng hòa tan nucleic acid Protein bị biến tính khơng hòa tan pha nước có chứa nucleic acid sau li tâm tủa thành lớp nằm pha nước pha phenol:chloroform Thu hồi nucleic acid pha nước Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi phân hủy enzyme cần hòa lại nước theo nồng độ mong muốn Có thể tủa ethanol isopropanol Sau li tâm để thu nhận lại nucleic acid Cặn tủa rửa ethanol 70% để loại bỏ muối dấu vết isopropanol Tách chiết DNA Ly tâm đẳng tỷ trọng (isopycnic) phân tách phần tử hỗn hợp dựa tỷ trọng chúng Thời gian lực ly tâm chung cho nhóm phần tử Dung dịch ly tâm có tỷ trọng với giá trị từ thấp đến cao tỷ trọng phần tử cần phân tách Ly tâm gradient liên tục CsCl: trình ly tâm, dung dịch CsCl tự động hình thành gradient đẳng tỉ trọng với tỉ trọng tăng dần từ miệng ống xuống đáy ống Dưới tác động lực ly tâm, nucleic acid di chuyển ống đến vị trí có tỉ trọng với tỉ trọng ngừng lại hình thành lớp cố định ống Lớp thu nhận lại sau ly tâm 57 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp sắc ký • Sắc ký lực: poly U-Sepharose hay oligodTcellulose, dùng để tinh mRNA • Sắc ký lọc gel dùng phân tách nucleic acid nucleotic tự sau trình tạo mẫu dò (probe) đánh dấu • Sắc ký trao đổi ion vi cột để thu hồi lượng nhỏ DNA • Sắc ký lỏng hiệu suất cao: có độ phân giải cao, dùng tinh oligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách đoạn DNA 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA Ly tâm phân đoạn (a) phân đoạn vùng (b) phân tách trình tự hỗn hợp dựa khối lượng chúng Thời gian lực ly tâm xác định cho nhóm phần tử Dung dịch ly tâm có tỷ trọng thấp phần tử cần phân tách 31/10/2011 8:58 SA 56 31/10/2011 8:58 SA 59 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 58 Nguyễn Hữu Trí Các phương pháp định tính định lượng thơ nucleic acid • Điện di: - Gel agarose - Gel polyacrylamide • Quang phổ kế: đo mật độ quang (OD – Optical density) 31/10/2011 8:58 SA 60 Nguyễn Hữu Trí 10 Phương pháp điện di • Mục tiêu:  Định tính: diện, cấu hình phân tử, kích thước  Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng  Chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng tạo dòng, …) • Ngun tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc nucleic acid: tích điện âm đồng khắp bề mặt điện trường nên di chuyển cực dương điện trường Tính linh động phân tử di chuyển điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử nồng độ chất cấu thành gel • Kiểu điện di: Agarose, polyacrylamide, điện di trường xung(PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis) 31/10/2011 8:58 SA 61 Nguyễn Hữu Trí Điện di - Electrophoresis • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel 62 31/10/2011 8:58 SA Điện di gel Nguyễn Hữu Trí Chất nhộm gel - Stain • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel 31/10/2011 8:58 SA 63 Nguyễn Hữu Trí • Gel agarose loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tách đoạn có kích thước 0,5-20 kb • Điện di theo phương nằm ngang • Độ phân giải thay đổi nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi • Phát phóng xạ tự ghi, nhuộm ethidium bromide Chất có khả gắn xen vào base nucleic acid phát huỳnh quang tia tử ngoại • Ứng dụng: phát trình tự DNA, phân tích hỗn hợp trình tự DNA (Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu 65 64 Nguyễn Hữu Trí Điện di biến tính (Denaturing electrophoresis) Điện di gel agarose 31/10/2011 8:58 SA 31/10/2011 8:58 SA • SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE): • Gel: polyacrylamide • SDS: Mạch 12 cacbon kỵ nước đầu hiếu nước • -> che phủ phần kỵ nước protein -> protein tích điện âm (-) Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 66 Nguyễn Hữu Trí 11 Điện di gel polyacrylamide • Được dùng để tách đoạn có kích thước nhỏ, 1000 cặp base • Điện di theo phương thẳng đứng • Độ phân giải cao, phân biệt trình tự cách nucleotide • Phương pháp phát hiện: DNA – phóng xạ tự ghi, xanh methylene, ethidium bromide, protein – xanh Coomassie, nhuộm nitrate bạc • Ứng dụng: tinh oligonucleotic tổng hợp, xác định trình tự DNA, tách trình tự DNA có kích thước gần nhau, SDS-PAGE (phân tích protein) 67 31/10/2011 8:58 SA Phương pháp định lượng quang phổ kế • Cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid có mẫu • Ngun tắc: dựa vào hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm base • Giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid mẫu dựa vào mối tương quan: Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ:  50μg/ml cho dung dịch DNA sợi đôi  40 μg/ml cho dung dịch DNA hay RNA sợi đơn Định tính: độ dựa tỉ số OD260/OD280, tính chất nucleic acid (mạch đơi/đơn) (280 nm bước sóng protein có mức độ hấp thụ cao Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 68 Nguyễn Hữu Trí Cơ sở lai phân tử  Các phương pháp lai phân tử   69 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Khi phân tử DNA mạch đơi đun lên nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy (Tm) hai mạch tách rời phá vỡ liên kết H hai mạch Sau hai mạch tách rời, nhiệt độ phản ứng làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng bắt cặp trở lại Hiện tượng gọi lai phân tử Đặc điểm lai phân tử:  Đặc hiệu tuyệt đối: tái bắt cặp xảy hai trình tự hồn tồn bổ sung với  Các trình tự bổ sung DNA hay RNA, dẫn đến hình thành phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay phân tử lai DNA-RNA 31/10/2011 8:58 SA 70 Nguyễn Hữu Trí Các kiểu lai phân tử • Lai pha lỏng • Lai pha rắn • Lai chỗ 31/10/2011 8:58 SA 71 Nguyễn Hữu Trí Lai pha lỏng: Các trình tự cần lai nằm pha lỏng, dung dịch đệm Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm Phương pháp sử dụng để phát trình tự tương đồng (giữa loài hay cá thể) 31/10/2011 8:58 SA 72 Nguyễn Hữu Trí 12 Lai pha rắn: Một hai trình tự cần lai cố định giá thể rắn (màng lai) Phát phân tử lai thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ Ba kĩ thuật lai pha rắn thông dụng Southern blot, Northern blot, Dot blot 31/10/2011 8:58 SA 73 Nguyễn Hữu Trí Lai chỗ: Trình tự nucleic acid cần tìm khơng tách chiết khỏi mơ hay tế bào Q trình lai với mẫu dò đánh dấu phát phân tử lai thực nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô 31/10/2011 8:58 SA Southern blot 75 Nguyễn Hữu Trí Southern blot • Ngun tắc Southern blot màng lai nitrocellulose có khả tiếp nhận DNA biết từ lâu sử dụng nghiên cứu lai axit nucleic khác vào thập niên 1950 1960 • Đầu thập niên 1970, đời phương pháp điện di gel cho phép đoạn DNA cắt enzyme hạn chế phân tách dựa sở kích thước chúng • Từ bước phát triển phương pháp chuyển đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose • Phương pháp E M Southern mơ tả Ðại học Edingburgh vào năm 1975 31/10/2011 8:58 SA 74 Nguyễn Hữu Trí Southern blot bao gồm bước sau: – Cắt DNA enzyme hạn chế thích hợp – Ðiện di sản phẩm cắt gel agarose – Làm biến tính DNA gel, DNA sợi kép tách thành DNA sợi đơn Chỉ DNA sợi đơn chuyển lên màng lai – Chuyển DNA biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose hay màng nylon) Việc chuyển DNA thường tiến hành hoạt tính mao dẫn khoảng vài tiếng dùng thiết bị thấm chân khơng Trong q trình chuyển, vị trí đoạn DNA giữ nguyên không thay đổi – Lai DNA cố định màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu Q trình dựa ngun tắc bổ sung DNA màng lai với mẫu dò Ðể đánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin mẫu dò phát quang sinh học – Ðịnh vị phân tử lai DNA-mẫu dò Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, sử dụng biotin/streptavidin dùng phương pháp so màu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học phát phát quang 31/10/2011 8:58 SA 76 Nguyễn Hữu Trí Northern blot Sơ đồ mơ tả phương pháp Southern blot 31/10/2011 8:58 SA 77 Nguyễn Hữu Trí • Sau E M Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, người ta dùng phương pháp tương tự để xác định đoạn RNA đặc biệt gọi Northern blot • Northern blot bao gồm bước sau: – RNA (RNA tổng số mRNA) phân tách điện di gel agarose – RNA sau phân tách chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên vị trí gel) – RNA cố định màng lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ gắn với enzyme (alkalin phosphatase horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép – Vị trí mẫu dò phát nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi đánh dấu phóng xạ Trong trường hợp mẫu dò gắn với enzyme đem ủ với chất khơng màu Enzyme liên kết với biến đổi thành sản phẩm màu nhìn thấy phát ánh sáng mà phát phim X quang cách trực tiếp 31/10/2011 8:58 SA 78 Nguyễn Hữu Trí 13 Phương pháp PCR • PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymease) phương pháp sử dụng rộng rãi lĩnh vực Sinh học phân tử Phương pháp Kary Mullis phát minh vào năm 1985; giới thiệu lần Hội thảo lần thứ 51 Cold Spring Harbor vào năm 1986 ông nhận giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993 • Nguyên tắc phương pháp PCR: dựa vào đặc tính hoạt động DNA polymerase: cần diện mồi chuyên biệt để hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn Như vậy, ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA, ta tổng hợp đoạn DNA nằm hai mồi • Phương pháp PCR cho phép tổng hợp nhanh xác đoạn DNA riêng biệt Ðây thực phương pháp đại thuận tiện cho việc xác định có mặt gen tế bào với độ xác cao 31/10/2011 8:58 SA Sơ 79 đồ mô tả phương pháp Northern blot Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 80 Nguyễn Hữu Trí Ba giai đoạn chu kỳ phản ứng PCR Giai đoạn biến tính (denaturation) Trong giai đoạn phân tử DNA mẫu bị biến tính nhiệt độ cao (thường từ 94-950C, lớn nhiệt độ nóng chảy phân tử) vòng 30 giây đến phút, tất liên kết hydro hai mạch phân tử bị bẻ gãy tạo thành DNA sợi đơn Giai đoạn lai (hybridization) Nhiệt độ hạ thấp ( thường từ 40-700C, thấp nhiệt độ nóng chảy mồi sử dụng khoảng từ 3-50C) cho phép mồi bám vào phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần khuyếch đại Giai đoạn kéo dài từ 30 giây đến phút Giai đoạn kéo dài (elongation) Nhiệt độ tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt Công việc DNA polymerase di chuyển dọc theo DNA sợi đơn sử dụng làm khn để tổng hợp sợi DNA bổ sung với DNA mẫu cách kéo dài phần đánh dấu mồi Thời gian giai đoạn phụ thuộc vào mẫu, thường kéo 81 kích thước DNA Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA dài từ 30 giây đến nhiều phút Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ thời gian nhiệt 82 ứng PCR độ chu kỳ phản Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA Các thành phần phản ứng PCR Sau chu kỳ, số DNA mẫu lại tăng gấp đôi Ðây nhân theo cấp số nhân Như phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ tạo thành 2n phân tử DNA 31/10/2011 8:58 SA 83 Nguyễn Hữu Trí Primer (mồi):  Mồi đoạn DNA sợi đơn ngắn cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng bắt cặp bổ sung với đầu DNA mẫu tạo vị trí bắt đầu tái Các mồi có chiều ngược nhau, bao gồm mồi xuôi (forward primer) mồi ngược (reverse primer)  Mồi tiêu quan trọng phản ứng PCR để định tính đặc trưng hiệu phản ứng Do việc thiết kế mồi cần tuân thủ số nguyên tắc định: dài khoảng 18-24 base; Tm mồi gần nhau; thành phần nucleotic mồi cần tránh cặp GC lặp lặp lại nhiều lần; mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại; khơng hình thành primer dimer, khơng phải trình tự lặp lại DNA mẫu (DNA template): hàm lượng đủ không cao, tinh – không chứa chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin, …) PCR cho kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay mẫu DNA không bảo quản tốt Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động Taq polymerase, hàm lượng cao tạo nhiều sản phẩm ký sinh, thấp làm giảm hiệu nhân enzyme Nồng độ tối ưu phải xác định cho phản ứng qua nhiều thử nghiệm 31/10/2011 8:58 SA 84 Nguyễn Hữu Trí 14 Các ứng dụng phương pháp PCR Các thành phần phản ứng PCR dNTP: thành phần loại dNTP phải cân bằng, cần làm tăng lỗi chép polymerase; hàm lượng thường khơng đổi thay đổi tùy điều kiện thực tế Enzyme polymerase chịu nhiệt Tag-polymerase DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần bán thị trường Tag-polymerase nhà Vi sinh vật học Thomas Brock phát Thermus aquaticus loài vi khuẩn phát triển mạnh nhiệt độ cao Enzyme chịu nhiệt giúp giải vấn đề enzyme biến tính sau chu kỳ Từ đến nay, số vi sinh vật chịu nhiệt khác khám phá người ta tách chiết thêm DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) Số lượng chu kỳ phản ứng tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu, thông thường số lượng chu kỳ nhỏ 40 cho phản ứng PCR Thời gian chu kỳ phụ thuộc thiết bị kích thước sản phẩm Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR: cần đáp ứng nhu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh xác Những cải tiến máy luân nhiệt quan tâm đến microtiler plate 96 giếng, block nhiệt riêng biệt máy, block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR 31/10/2011 8:58 SA 85 Nguyễn Hữu Trí    Hiện thành tựu PCR mở nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng sinh học, y khoa, nông nghiệp, … Một số ứng dụng có tính tổng qt: Sản xuất mẫu dò: PCR giúp sản xuất nhanh lượng lớn mẫu dò đánh dấu thực phản ứng với cặp mồi chuyên biệt nucleotide đánh dấu Khuyếch đại số lượng RNA: sử dụng kĩ thuật phối hợp RT-PCR (kết hợp enzyme phiên mã ngược Taq polymerase; sử dụng Tth polymerase) RT-PCR cho phép nghiên cứu mRNA thông tin tồn với hàm lượng thấp, phát phương pháp cổ điển Northern blot, … Kĩ thuật in situ RT-PCR cho phép khuyếch đại RNA mô tế bào Định lượng phương pháp PCR: dùng để nghiên cứu trình tự RNA hay DNA có số lượng thấp Trình tự đích khuyếch đại đồng thời với trình tự chứng có nồng độ biết, sau phản ứng so sánh hàm lượng sản phẩm, suy số lượng mẫu ban đầu 31/10/2011 8:58 SA 86 Nguyễn Hữu Trí SYBR Green l, principe The Polymerase Chain Reaction (PCR) 31/10/2011 8:58 SA 87 Nguyễn Hữu Trí Nguyên tắc phát huỳnh quang 31/10/2011 8:58 SA 88 Nguyễn Hữu Trí Molecular Beacons Nguyên tắc: Dùng mồi đặc hiệu với AND đích chuỗi oligonucleotic gắn chất huỳnh quang R đầu đầu chất ức chế phát huỳnh quang Q Khi mồi gắn vào chuỗi AND đích, R Q tách xa cho phát tin hiệu màu SYBR Green I Giai đoạ n ké 31/10/2011 8:58 SAo dài Sondes d‘hybridation 89 Giai đoạn annealing Sondes TaqMan GiaiNguyễn đoạn ké o dà Hữu Tríi 31/10/2011 8:58 SA 90 Nguyễn Hữu Trí 15 RealTime PCR Sondes TaqMan TaqMan Procedure reporter quencher 91 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA Yêu cầu lớn tất trình chế biến thực phẩm cung cấp sản phẩm không chứa vi sinh vật nguy hiểm chất độc vi sinh vật: cible log (F2/F1) • Các tác nhân gây bệnh thực phẩm Listeria, Salmonella Campylobacter • Các nội độc tố vi khuẩn độc tố nấm chất độc chủ yếu cần lưu tâm thực phẩm n Ngày với phát triển công nghệ sinh học sử dụng hệ thống phát kháng thể cơng nghệ mẫu dò DNA, RNA log (nombre de copie) n 31/10/2011 8:58 SA Một loạt quy trình truyền thống, tốn thời gian thơng thường áp dụng để xác định , kiểm soát, làm giảm hay loại bỏ chất nhiễm Crossing Point (Cycles) log (F2/F1) Courbe standard 93 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA Chuẩn đoán nhanh Gần việc sử dụng immunoassay cơng nghiệp thực phẩm phát triển nhanh chóng trở thành cơng cụ phân tích cơng nhận Kĩ thuật ELISA (kĩ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) làm đĩa 96 giếng –là dạng sử dụng rộng rãi nhà khoa học thực phẩm Kĩ thuật ELISA giúp tiết kiệm thời gian, nhân lực vượt trội kĩ thuật thơng thường 95 94 Nguyễn Hữu Trí Ví dụ : Những quy trình rút ngắn thời gian hơn, thường rẻ khơng cần đòi hỏi kĩ cao sẽ tạo nên cải tiến lớn tiêu chuẩn an toàn việc cung cấp thực phẩm 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí Chuẩn đốn nhanh RealTime PCR Echantillon inconnu 92 Nguyễn Hữu Trí • 1/Việc phát Salmonella thực phẩm quy trình phức tạp tốn đến ngày sử dụng quy trình tăng sinh truyền thống Bằng cách sử dụng quy trình immunoassay rút ngắn thời gian ngày • 2/ Các độc tố nấm nấm mốc đòi hỏi nhiều để tách chiết, tinh sạch, đặc để xác định xác hóa chất theo cách truyền thống Tuy nhiên, việc sử dụng cột lực chứa kháng thể đặc hiệu vời độc tố tồn q trình tách chiết, định lượng tiến hành 30 phút 31/10/2011 8:58 SA 96 Nguyễn Hữu Trí 16 Chân thành cảm ơn 31/10/2011 8:58 SA 97 Nguyễn Hữu Trí 17 ... Gel: polyacrylamide • SDS: Mạch 12 cacbon kỵ nước đầu hiếu nước • -> che phủ phần kỵ nước protein -> protein tích điện âm (-) Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 66 Nguyễn Hữu Trí 11 Điện di gel polyacrylamide... dụng: phát trình tự DNA, phân tích hỗn hợp trình tự DNA (Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu 65 64 Nguyễn Hữu Trí Điện di biến tính (Denaturing electrophoresis) Điện di gel agarose 31/10/2011... 31/10/2011 8:58 SA 61 Nguyễn Hữu Trí Điện di - Electrophoresis • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel 62 31/10/2011