Acid Nucleic Các kỹ thuật phân tích ADN pot

1 Acid Nucleic Acid Nucleic C C á á c k c k ỹ ỹ thu thu ậ ậ t phân t t phân t í í ch ADN ch ADN 1. 1. Kỹ Kỹ thu thu ậ ậ t ly t t ly t rí rí ch ADN ch ADN 2. 2. S S ự ự c c ắ ắ t n t n ố ố i ADN i ADN 3. 3. KT đi KT đi ệ ệ n di ADN n di ADN 4. KT PCR 4. KT PCR 2 A A cide cide D D eoxyribo eoxyribo N N ucleic ucleic (ADN) (ADN) Đư Đư ờ ờ ng ng + base + base nitơ nitơ = = Nucleoside Nucleoside Nucleoside Nucleoside + acide P = + acide P = Nucleotide Nucleotide Base Base Purine (2 v Purine (2 v ò ò ng nhân): ng nhân): Adenine Adenine , Guanine , Guanine Base Base Pyrimidine (1 v Pyrimidine (1 v ò ò ng): ng): Thymine, Cytosine Thymine, Cytosine Tóm lược về sự sao chép ADN Sao chép ADN trong TB (in vivo): Mở xoắn mạch kép Tạo con mồi (primer) Kết nối các Nu. tự do Hoàn chỉnh mạch và đóng xoắn Sao chép ADN trong ống nghiệm (in vitro): Mở xoắn mạch kép : nhiệt độ Tạo con mồi (primer) : con mồi tổng hợp Kết nối các Nu. tự do : Taq Polymerase Đóng xoắn : nhiệt độ  Kỹ thuật PCR (công nghệ gien) 3 Kỷ Kỷ thu thu ậ ậ t ly tr t ly tr í í ch ADN ch ADN Ly trích ADN – Phương pháp nào ? Vi Vi ệ ệ c c c c họ họ n l n l ự ự a phương a phương phá phá p ly t p ly t rí rí ch t ch t ù ù y thu y thu ộ ộ c v c v à à o nhi o nhi ề ề u y u y ế ế u t u t ố ố : : – – Ngu Ngu ồ ồ n ADN: n ADN: t t ừ má ừ má u, u, niêm m niêm m ạ ạ c, c, VK, T VK, T V, V, ĐV ĐV – – Mụ Mụ c đ c đ í í ch s ch s ử dụ ử dụ ng c ng c ủ ủ a ADN đ a ADN đ ượ ượ c ly t c ly t rí rí ch: P ch: P CR, CR, c c ắ ắ t b t b ằ ằ ng ng Enz. Enz. c c ắ ắ t gi t gi ớ ớ i h i h ạ ạ n, n, Cloning Cloning – – Loạ Loạ i ADN: i ADN: DNA trong nhân DNA trong nhân (genomic (genomic DNA), ty DNA), ty th th ể ể , l , l ạ ạ p th p th ể ể – – S S ố ố l l ượ ượ ng ADN c ng ADN c ầ ầ n thu đ n thu đ ượ ượ c, c, s s ố ố m m ẫ ẫ u c u c ầ ầ n ly t n ly t rí rí ch ch 4 Các bước cơ bản của qui trình ly trích ADN 1. Phá vở vách TB và màng nguyên sinh chất  phóng thích các thành phần của TB. 2. Ức chế các Enz. phân hủy DNA và ARNm (DNases, RNases). 3. Tách nucleic acid (ADN, ARN) ra khỏi các thành phần khác của TB. • PP Tách ly/kết tủa • PP hấp phụ (Adsorption) • PP ly tâm dựa trên sự khác nhau về tỉ trọng 4. Thu nhận ADN: hòa tan//kết tủa 5. Bảo quản ADN: hòa tan trong H 2 O hay TE 6. Kiểm tra số lượng và chất lượng ADN V V ậ ậ t li t li ệ ệ u u - - hó hó a ch a ch ấ ấ t s t s ử dụ ử dụ ng ng Phá Phá v v ở ở c c ấ ấ u t u t rú rú c TB: c TB: + C + C ố ố i/ch i/ch à à y, y, má má y xay y xay   phương phương phá phá p v p v ậ ậ t l t l ý ý + N + N itơ itơ lỏ lỏ ng ng + C + C á á c enzymes ( c enzymes ( Pectinase, Cellulas Pectinase, Cellulas e, e, Protease) Protease) + N + N aOH + n aOH + n hi hi ệ ệ t đ t đ ộ ộ Loạ Loạ i b i b ỏ cá ỏ cá c m c m ả ả nh v nh v ở ở , c , c á á c t c t hà hà nh ph nh ph ầ ầ n k n k há há c trong TB: c trong TB: + Dishwashing detergent + Dishwashing detergent + Phenol/Chloroform + Phenol/Chloroform Thu nh Thu nh ậ ậ n ADN qua k n ADN qua k ế ế t t t t ủ ủ a a + Isopropyl alcohol + Isopropyl alcohol + Ethanol 100% + Ethanol 100% 5 Phá vở cấu trúc TB bằng cơ học Yêu cầu: - Thao tác nhanh - Không quá ‘thô bạo’ - Có sự hiện diện của buffer ly trích (chất ức chế Dnase) - - Th Th ự ự c hi c hi ệ ệ n trong đi n trong đi ề ề u ki u ki ệ ệ n l n l ạ ạ nh nh ( ( Ứ Ứ c ch c ch ế hoạ ế hoạ t đ t đ ộ ộ ng c ng c ủ ủ a Enz.) a Enz.) Nước tNy (ra bát) có tác dng gì ? • Mi TB ưc bao bc bi màng TB (phospholipid) • ADN nm trong nhân, và cũng ưc bao bc bi màng nhân  Phi phá v màng TB  phóng thích ADN 6  N ưc tNy có tác dng phá v màng TB vì tn công vào lipid (cht béo) và protein trong cu to màng N ưc tNy (ra bát) có tác dng gì ? Không ch có màng TB và màng nhân b phá v, mà màng ca tt c các bào quan (ty th, lp th) cũng b phá v. Vy, thành phn nào còn li ? • Protein • Carbohydrate (ưng) • DN A 7 PP Tách ly/Kt ta N guyên t N guyên t   c: c: d d   a v a v à à o m o m   c  c   hò  hò a tan k a tan k há há c nhau c c nhau c   a a cá cá c phân t c phân t     phân t phân t á á ch ch Hn hp dch trích sau khi phá v màng TB, bao gm acid nucleic và các thành phn khác ca TB Mix thoroughly with an equal volume of organic solvent e.g. phenol, chloroform, or phenol:chloroform Centrifuge Phần ddịch nước chưa các phân t hòa tan trong nưc bao gm c acid nucleic. Phần dung môi hữu cơ cha protein, lipid. N hng thành phn không hòa tan (các mãnh v TB) s nm  phần solid ( gia 2 phn ddch) Perform additional extractions for increased purity Collect aqueous phase Bưc 3: Tách ly bng dung môi hu cơ Organic Aqueous Interphase PP Tách ly/Kt ta 8 • Pellet down nucleic acids. • Wash pellet with 70% ethanol to remove residual salts and other contaminants. • Discard ethanol and allow pellet to dry. After Thêm cn và mui vào  làm kt ta tù ddch nưc thu  bưc 3 Supernatant Pellet 70% EtOH Dissolve pellet (H 2 O, TE, etc.) Bưc 4: Thu nhn ADN (kt ta) Before After Centrifuge Wash Centrifuge PP Tách ly/Kt ta Bưc 5: bo qun ADN Vai trò ca các hóa cht ưc s dung trong phương pháp ly trích 9 Phenol/Chloroform = Tin Phenol/Chloroform = Tin h khi h khi   t DN A t DN A Phenol: làm bin tính protein, các thành phn không hòa tan hình thành  phn solid gia 2 phn ddch Chloroform: có tác dng gia tăng  nht ca phn dung môi hu cơ (+ làm bin tính protein) Isoamyl alcohol: có tác dng ngăn cn s trn ln gia 2 phn ddch Tác dng ca Enz. Protease? - Enz. Protease có tác dng phân hy các protein liên kt vi ADN , òng thi phân hy các Enz. trong TB cht co tác dng làm toornhaji ADN (VD: DN ase). - X ly vi Protease trong quá trình ly trích làm gia tăng hàm hưng ADN nguyên vn thu ưc. 10 Tác dng ca mui trong ddch ly trích ? - Trong ddch m ca protease ã có cha sn thành phn mui. - N a + (trong mui N aCl) liên kt vi gc phosphate ca ADN , làm trung hòa in tích ca phân t ADN . - S hin din ca N aCl giúp các phân t ADN có th nhóm li vi nhau, thay vì Ny nhau ra do in tích ca chúng  s kt ta ADN d dàng hơn khi cn ưc thêm vào. Cn có tác dng tách nưc khi ADN : • Cho phép các cations liên két vi gc phosphat ca ADN • Gim lc Ny nhau gia các phân t ADN • Làm cho các phân t ADN tp trung vi nhau  kt ta Kt ta ADN bng cn [...]... cohesive/blunt ends 17 Kỹ thuật điện di (Electrophoresis) Điện di ADN (DN A Electrophoresis) N guyên tắc • Gốc phosphate của ADN mang điện tích âm phân tử của ADN điệ tí tử ADN sẽ di chuyển về cực dương trong môi trường điện sẽ chuyể về trường điệ • Điện tích âm được phân bố đều dọc phân tử ADN t ốc Điệ tí được bố đều dọ tử độ di chuyển của ADN phụ thuộc vào kích thước của chuyể của ADN phụ thuộ và kích... Kích thước ADN nhỏ hoặc khác biệt về k/thước của các Kích thước nhỏ hoặ khác biệ về k/th ước củ cá phân tử ADN rất nhỏ = gel polyacrylamide ử ấ nhỏ t r Kích thước ADN lớn hoặc khác biệt về k/thước của các Kích thước lớ hoặ khác biệ về k/th ước củ cá phân tử ADN lớn = gel agarose tử lớ 18 Kỹ thuật điện di ADN Phân loại: loạ + Điện di trên gel agarose Điệ + Điện di trên gel Polyacrylamide Điệ Các bước... làm cho các phân tử ADN kết lại thành khối và kết tủa - Phân tử DN A kết tủa dưới dạng chùm sợi như ợi bông gòn - Các bọt khí nhỏ trong ddịch liên kết với nhau, khi ADN kết tủa hình thành các bọt khí lớn, nổi lên, sẽ kéo theo ADN từ phần ddịch nước nổi lên phần dung môi hữu cơ ở phia trên CTAB CTAB: Chất tNy chứa Cation CH3 CH3 N+ CH3 Br- C16H33 (MC 6.61-6.62) (low ionic conditions) 11 Kỹ thuật Cắt... dài đoạn nhận diện ↑ Đô dài oạn nhậ diệ Khoảng cách giữa các điểm cắt ↑ Khoảng cách giữ các điể Số́ lượng điểm cắt ↓ Sô ượng điể 15 Bản đồ cắt bởi Enz giới hạn (Restriction Map) Restriction Map = Bản đồ vị trí cắt của các enz giới hạn trên 1 đoạn ADN cho trước Công cụ hổ trợ để xác định Restriction Map = các chương trình vi tính chuyên dụng cho phân tích ADN (VD: BioEdit, CLC Free Workbech) Ứng dụng... Enz giới hạn trên đoạn ADN khảo sát + Ước lượng số lượng và kích thước của các đoạn ADN sẽ nhận được khi sử dụng 1 hay nhiều Enz giới hạn để cắt 1 đoạn ADN khảo sát Lưu ý !!! Hiệu quả của Enz giới hạn phụ thuộc: + Độ sạch của ADN + Buffer thích hợp + N hiệt độ thích hợp + Tỉ lệ: số lượng ADN /số lượng Enz giới hạn + Tính chất của Enz giới hạn 16 N ối ADN (DN A ligation) N ối ADN (DN A ligation) = hình... dụng các phần mềm để thiết kế mồi như: Biology Workbench, Primer Primer… N hững vướng mắc thường gặp trong PCR • Các chất ức chế P/ứng PCR có trong ADN khuôn (trong quá trình ly trích (protease, phenol, EDTA ) pha loảng ADN • N hiễm các chất ức chế từ những nguồn khác Cách khắc phục: • Làm việc trong điều kiện vô trùng (laminar flow hood, khử trùng bằng UV light 254 nm) • Sử dụng các pipette, các đầu... TB (in vivo): Mở xoắn mạch kép Tạo con mồi (primer) Kết nối các N u tự do Hoàn chỉnh mạch và đóng xoắn Sao chép ADN trong ống nghiệm (in vitro): Mở xoắn mạch kép : nhiệt độ Tạo con mồi (primer) : con mồi tổng hợp Kết nối các N u tự do : Taq Polymerase Đóng xoắn : nhiệt độ Kỹ thuật PCR (công nghệ gien) 25 Các thành phần cần thiết của PCR: 1 ADN khuôn cần tổng hợp (DN A template) 2 Con mồi (Primers):... Electrophoresis Ứng dụng: – Phân tách ADN dựa theo kích thước phân tử – Tinh lọc đoạn ADN cần quan tâm Ưu điểm: điể - PP đơn gỉan (không đòi hỏi nhiều kinh nghiệm và kỷ thuật) gỉan (không đò hỏ nhiề nghiệ và thuậ - ít mất thời gian (TB: 45-60 phút/RUN ) ít mấ thờ (TB: 45 phú - Phương pháp nhuộm mẫu nhanh, có thể chụp ảnh kết quả ngay pháp nhuộ mẫ thể chụp kế quả - Dễ dàng phân lập trở lại ADN từ gel Dễ dàng... Polyacrylamide Mục đích: N huộm màu ADN Hàm lượng ADN ↑ nhân diện Bắt màu càng đậm Các hóa chất nhuộm: N itrat Bạc (AgN O3) Fluorecent dye (IR700, IR800 – LICOR Corp.) Đồng vị phóng xạ P32 Độ nhạy: P32 ~ Fluor dye > AgN O3 Độc hại : P32 > AgN O3 ~ Fluor dye Giá thành: P32 > Fluor dye > AgN O3 24 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chaine Reaction) PCR = T/hợp DN A trong ống nghiệm Sao chép ADN trong TB (in vivo): Mở xoắn... Bước 3: N huộm mẫu ước huộ mẫ Đối tượng ADN điện Đối tượng điệ di và mục tiêu nghiên và mục cứu đọc kết quả đọ kế quả Chọn gel thích hợp Chọn thích hợ PP nhuộm mẫu thích hợp nhuộ mẫ thích hợ 19 (Pulse Field Gel Electrophoresis) ‘Độ phân giải’ của gel Agarose Gel Electrophoresis 20 N huộm gel agarose Mục đích: N huộm màu ADN Hàm lượng ADN ↑ nhân diện Bắt màu càng đậm Các hóa chất nhuộm: Gel Agarose: Ethium . 1 Acid Nucleic Acid Nucleic C C á á c k c k ỹ ỹ thu thu ậ ậ t phân t t phân t í í ch ADN ch ADN 1. 1. Kỹ Kỹ thu thu ậ ậ t ly t t ly t rí rí ch ADN ch. ca ADN , làm trung hòa in tích ca phân t ADN . - S hin din ca N aCl giúp các phân t ADN có th nhóm li vi nhau, thay vì Ny nhau ra do in tích