Các kỹ thuật gen sử dung trong tao sinh vật biến đổi gen

Ca ́c bước chính tạo GMOLựa chọn gen và sinh vật cho Chuyển gen vào tế bào đích Sàng lọc tế bào đạt yêu cầu Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen kháng sâu đục thân cry Promoter

Ca ́c kỹ thuật gen sử

THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GENNguyễn Tiến Thành - HUST

La ̀m thế nào tạo ra GMO

Ca ́c bước chính tạo GMO

Lựa chọn gen

và sinh vật cho

Chuyển gen vào tế bào đích

Sàng lọc tế bào

đạt yêu cầu

Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen

kháng sâu đục thân cry

Promoter-cry-Terminator

hạt vàng

Súng bắn gen vào

ngô Chọn cá thể ngô có

đặc điểm kháng sâu

Ca ́c kỹ thuật cơ bản

u Tách chiết, tinh sạch DNA hệ gen

u Khuếch đại DNA

u Cắt và ghép nối DNA

u Chuyển (Biến nạp) DNA vào tế bào vật chủ

u Các phương pháp đánh giá kết quả chuyển gen

Cho ̣n gen mục tiêu và sinh vật cho gen

u Thường là các gen tạo cho sinh vật nhận các đặc tính mới :

u Kháng sâu đục thân: cry từ Bacillus thurigensis

u Kháng thuốc trừ cỏ: bar từ Streptomyces, espsp từ

Ta ́ch gen từ sinh vật cho

u Phương pháp chủ đạo là ”câu” và nhân gen (khuếch đại gen) từ DNA hệ gen của sinh vật cho gen:

u Tách chiết DNA hệ gen từ sinh vật cho gen Trường hợp sinh

vật cho gen là virus thì cần tạo cDNA từ RNA của virus

u Nhân gen từ DNA hệ gen đã tách chiết được

Phương pháp tách chiết DNA hệ

gen từ sinh vật cho gen

Phương pháp nhân gen

Ph ương pháp tách/tinh sạch DNA

hê ̣ gen

u Mục đích: thu DNA nguyên vẹn (không bị cắt đoạn, gẫy),

không lẫn các thành phần khác (protein…), hiệu suất thu hồi cao

u Nguyên tắc chính:

Ph ương pháp tách chiết/tinh

s ạch DNA

u Phá màng tế bào, màng nhân: kết hợp 2 phương pháp

u Cơ học: nghiền trong Ni tơ lỏng, siêu âm, rung lắc với bi thuỷ tinh

(giãn mạch protein), proteinase (thuỷ phân protein, tách DNA khỏi protein), Rnase (phân giải RNA)

u Tách DNA khỏi thành phần khác: 1 trong 2 phương pháp

u Trích ly bằng phenol – chloroform để thu protein, DNA trong pha nước

u Thu nhận DNA

u Kết tủa bằng isopropanol, ly tâm thu kết tủa

u Rửa giải DNA trên màng silica thu DNA

Tách chi ết DNA

Ph ương pháp nhân gen

u PCR: polymerase chain reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp,

dựa trên đặc tính của DNA và khả năng tổng hợp chuỗi của DNA polymerase trên chuỗi khuôn từ các mồi bổ sung ban đầu (xemtái bản gen)

u Cần có:

u Đoạn DNA gốc cần nhân lên

u Các nucleotide A, T, G, C tự do

u Enzyme DNA polymerase

u Các mồi: 2 mồi: xuôi và ngược ứng với 2 mạch đơn DNA

u Thiết bị luân nhiệt

u Kết quả: từ 1 đoạn DNA kép gốc tạo ra số lượng vô cùng lớn cácđoạn DNA kép giống với DNA gốc

Ph ương pháp nhân gen

Ph ương pháp nhân gen PCR

u Thiết kế mồi:

đoạn gen cần ”câu” và nhân lên từ DNA à cần trình tự của đoạn gen cần “câu” ra

u Mồi cần có chiều dài đủ để sự bắt cặp mồi với DNA đích đúng: 20 -25 nt

u Tỷ lệ GC tốt nhất là 50%.

u Tổng hợp mồi: công ty bên ngoài thực hiện

Ph ương pháp nhân gen PCR

u Thực hiện trong các thiết bị luân nhiệt: ở các nhiệt độ khác nhau (95oC, 60oC, 72oC), trong thời gian khác nhau, lặp lại chu trình nhiều lần

Ph ương pháp nhân gen PCR

u Kiểm tra sản phẩm nhân gen: sử dụng điện di trên agarose

u Sản phẩm nhân gen được đưa vào agarose, đặt trong điện trường, DNA sẽ di chuyển tùy thuộc và kích thước của nó (nhỏ thì nhanh,

lớn thì chậm) à nếu là hỗn hợp nhiều DNA kích thước khác nhau, sau một thời gian sẽ phân tách được chúng

u Quan sát sự phân bố các sản phẩm DNA dưới tia UV với sự hỗ trợ

của ethidium bromide (EtBr)

Ki ểm tra sản phẩm nhân gen bằng

Điện trường Điện tích âm

Điện tích dương

DNA phân tách theo kích thước

Chất hiện màu

Hiện sản phẩm dưới UV

So sánh kích thước

“Ta ́ch dòng” gen

u “Tách dòng”: Là thuật ngữ thể hiện công việc sau khi đã thu

được gen đích, chuyển vào một “phương tiện” để giữ gen, đồng

thời có thể tạo ra số lượng gen lớn khi cần

u “phương tiện” giữ gen thường là các vec tơ trong các vi sinh

vật trung gian giữ vector đó, loại vector phổ biến nhất là cácplasmid

u Plasmid giữ gen thường có kích thước nhỏ, có thể tồn tại ở số

lượng lớn (vài trăm plasmid) trong 1 tế bào giữ plasmid.

u Plasmid cần tương thích (không bị đào thải) với tế bào giữ plasmid

u “Phương tiện” phổ biến: thường là vi khuẩn E.coli, nấm men…và các plasmid tương ứng với nó

“Ta ́ch dòng” gen

u Cấu trúc chung của plasmid dùng để “tách dòng”:

• Gen chọn lọc: gen kháng kháng sinh

• Tín hiệu khởi đầu tái bản: cần phù hợp với tế bào mang plasmid (cho phép

plasmid có thể nhân lên trong tế bào) và quyết định số lượng bản sao

plasmid trong tế bào

• Vùng MCS: cho phép có thể mở vòng plasmid để gắn thêm gen đích vào

Plasmid ta ́ch dòng pJET (E.coli)

C ắt hạn chế DNA (restricted

digestion)

u DNA có thể bị phân giải toàn bộ = enzyme DNAse (cắt thànhcác nucleotit đơn)

u Đôi khi cần chú ý không bị nhiễm tạp từ ngoài vào

u DNA có thể bị cắt “hạn chế” = enzyme RE (restriction enzyme)

tại một số vị trí đặc biệt

u Các enzyme RE có các điểm nhận biết đặc hiệu trên trình tự DNA, có thể cắt tại ví trí nhận biết (loại II), hoặc cách xa vài nucleotit (loại III) hoặc 1000 – 2000 nucleotit (loại I)

u Loại II được sử dụng rộng rãi cho kỹ thuật gen, loại III sử dụng ít

RE c ắt DNA

u Cách gọi tên: EcoRI: chữ cái đầuTên giống - tên loài – chủng

E.coli chủng H thứ I

u Đặc điểm vị trí nhận biết của các RE: đối xứng nghịch đảo

u Cách cắt: tạo đầu bằng (blunt end) hoặc đầu dính (sticky end)

u Điều kiện hoạt động phụ thuộc RE, thông thường là 37oC, pH trung tính, có mặt ion kim loại

Vector ta ́ch dòng pJET

u Có mấy điểm cắt SalI, BamHI trên plasmid bên?

u Nếu cắt plasmid bên bằng các enzyme này thì sản phẩm có mấy đoạn DNA?

Ghe ́p nối DNA (ligation)

u Sử dụng enzyme có tên là ligase: tạo liên kết este giữa đầu 5’ P

và đầu 3’ OH

u Có thể ghép nối đầu 2 đầu bằng hoặc đầu lệch

u Phổ biến là enzyme T4 DNA ligase: từ thực khuẩn thể T4

Thường có sản phẩm thương mại

u Điều kiện cho phản ứng ghép nối: nhiệt độ phòng (25oC), thờigian ngắn (5 -10 phút), hoặc nhiệt độ thấp 4oC, thời gian dài

(qua đêm)