tổng quan về các kỹ thuật phân tích sử dụng trong thiết lập chất chuẩn gốc (primary standard)

Để chủ động hơn trong thiết lập chất chuẩn và trong trường hợp nghiên cứu phát triển thuốc mới, chưa có chất chuẩn nối, khóa luận “Tổng quan về các kỹ thuật phân tích sử dụng trong thiế

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè Đến nay khi khóa luận đã hoàn thành, tôi xin phép được bày

tỏ sự biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và sự kính trọng đến NCS.ThS Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất, người thầy đã trực

tiếp tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn

thành khóa luận Tôi cũng xin cảm ơn HVCH Đào Tú Anh vì đã dành thời gian tra

cứu, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình tìm tài liệu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong Bộ môn Hóa phân tích

& Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua

Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, toàn thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã luôn tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại đây

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè - những người đã luôn đồng hành, cổ vũ và động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Võ Thị Tú Quyên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 KHÁI NIỆM VỀ CHẤT CHUẨN GỐC 2

1.1 Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu 2

1.2 Phân loại chất chuẩn đối chiếu hóa học: 2

1.2.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (primary chemical reference standards -PCRS) 2

1.2.2 Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (secondary chemical reference standards - SCRS) 3

1.3 Hướng dẫn quy trình thiết lập chất chuẩn gốc 4

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU NHẬN DẠNG CHẤT CHUẨN GỐC 10

2.1 Mô tả vật lý 10

2.1.1 Kiểm tra cảm quan 10

2.1.2 Kính hiển vi quang học 10

2.1.3 Xác định điểm chảy 10

2.1.4 Góc quay cực riêng 10

2.2 Bộ phổ nhận dạng về cấu trúc 11

2.2.1 Kỹ thuật quang phổ hồng ngoại (IR) 11

2.2.2 Kỹ thuật quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) 12

2.2.3 Kỹ thuật phổ khối lượng (MS) 13

2.2.4 Kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 15

2.2.5 Phân tích nguyên tố 16

2.2.6 Nhiễu xạ tia X 16

CHƯƠNG 3 TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỘ TINH KHIẾT NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC 17 3.1 Nguồn gốc và phân loại tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc 17

3.1.1 Nguồn gốc tạp chất 17

3.1.2 Phân loại tạp chất 17

3.2 Các kỹ thuật xác định tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc 19

3.2.1 Kỹ thuật xác định gián tiếp: 19

3.2.2 Kỹ thuật xác định độ tinh khiết trực tiếp 37

3.2.3 Kết hợp cả 2 kỹ thuật xác định độ tinh khiết trực tiếp và gián tiếp 39

CHƯƠNG 4 TÌNH HÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 40

4.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc trên thế giới 40

4.2 Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc tại Việt Nam 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43

1.1 Kết luận 43

1.2 Đề xuất 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AAS Atomic Absorption Spectrometry Quang phổ hấp thụ nguyên tử

APCI Atmospheric Pressure Chemical

CE Capillary Electropherosis Điện di mao quản

CEC Capillary Electrochromatography Điện sắc ký mao quản

CIEF Capillary Isoelectric Focusing Điện di mao quản hội tụ đẳng điện CITP Capillary Isotachophoresis Điện di mao quản đẳng tốc

CZE Capillary Zone Electrophoresis Điện di mao quản vùng

DAD Diode Array Detector Detector mảng diod

DMF N,N-dimethylformamide N,N-dimethylformamid

DMI 1,3-dimethyl- 2-imidazolidinone 1,3-dimethyl- 2-imidazolidinon DSC Differential Scanning Calorimetry Quét nhiệt vi sai

EDQM European Directorate for the

Quality of Medicine -HealthCare

Hội đồng Châu Âu về chất lượng thuốc

EOF Electroendosmotic Flow Dòng điện thẩm

EPRS European Pharmacopeia Reference

Substances

Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Châu Âu

ESI Electrospray Ionization Ion hóa bằng tia điện

FAAS Flame Atomic Absorption

Spectrometry

Nguyên tử hóa bằng ngọn lửa

GMP Good Manufacturing Practices Thực hành tốt sản xuất thuốc

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ICH International Conference on

Harmonisation of Technical

Requirements for Registration of

Pharmaceuticals of Human Use

Hội nghị quốc tế về hài hòa các yêu cầu kỹ thuật để đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người

ICP-MS Inductively Coupled Plasma- Mass

Chất chuẩn đối chiếu quốc tế

IP International Pharmacopoeia Dược điển quốc tế

ISO International Organization for

Standardization

Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

MEKC Micellar Electrokinetic

Chromatography

Sắc ký mixen điện động

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hật nhân

NP-HPLC Normal Phase-High Performance

Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc

PDE Permitted daily exposure Liều phơi nhiễm cho phép mỗi

ngày Ph.Eur European Pharmacopoeia Dược điển Châu Âu

qNMR Quantitative Nuclear Magnetic

Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân định lượng

RP-HPLC Reversed Phase-High Performance

Chất chuẩn đối chiếu thứ cấp

TGA Thermogravimetric Analysis Phân tích nhiệt trọng lượng

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

TOF Time- of- Flight Analyser Bộ phân tích thời gian bay

USPRS United States Pharmacopeia

Reference Substances

Chất chuẩn đối chiếu Dược điển

Mỹ UV-VIS Ultraviolet - Visible Spectroscopy Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả

kiến

Ương WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1 So sánh kết quả độ tinh khiết thu được thông qua DSC với kết quả độ tinh khiết thu được thông qua sắc ký và các kỹ thuật phân tích khác 11

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Hình ảnh phân tích MEKC của một mẫu muối natri amoxicillin PL-2

Hình 4.1 Phổ IR của 1,5 mg Indinavir số kiểm soát 105231 ……… PL-3 Hình 4.2 Phổ UV của Indinavir số kiểm soát 105231……… PL-4 Hình 4.3 Sắc ký đồ của Indinavir số 105231 được theo dõi ở bước sóng 220 nm PL-7

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất chuẩn nói chung và chất chuẩn gốc nói riêng có vai trò rất quan trọng trong

lĩnh vực kiểm tra chất lượng, giám sát chất lượng nguyên liệu làm thuốc và chế phẩm

thuốc của ngành Dược Ngoài ra nó còn được dùng để đánh giá thử nghiệm thành thạo

cho các kiểm nghiệm viên của các PTN muốn đăng kí tham gia làm PTN thành viên

trong các chương trình hợp tác thiết lập chất chuẩn của Trung tâm hợp tác về CCĐC của

WHO hay Hội đồng Dược điển Mỹ, Ủy ban đối chiếu của ASEAN, Hội đồng Dược điển

Châu Âu [41]

Hiện nay, các chất chuẩn sử dụng cho công tác kiểm nghiệm và nghiên cứu ở Việt

Nam thường được mua từ các nguồn chất chuẩn nước ngoài như Hội đồng Dược điển

Mỹ, Anh, Châu Âu,… (USPRS, BPCRS, EPCRS, ICRS), các hãng hóa chất lớn (Merck,

Sigma Aldrich,…); chất chuẩn quốc gia được thiết lập trong nước tại VKNTTƯ và Viện

Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, chất chuẩn làm việc do các phòng thử nghiệm tự thiết

lập Nhu cầu sử dụng chất chuẩn trong nước ngày càng lớn, tuy nhiên chất chuẩn được

thiết lập trong nước chủ yếu là chuẩn thứ cấp được nối với chuẩn quốc tế và công tác

thiết lập chất chuẩn gốc trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới và chất chuẩn có nguồn

gốc từ dược liệu trong trường hợp không có chuẩn gốc để nối đang còn rất hạn chế Do

vậy, công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc đặc biệt thuốc có nguồn gốc từ dược

liệu đang gặp khó khăn do thiếu chất chuẩn

Để chủ động hơn trong thiết lập chất chuẩn và trong trường hợp nghiên cứu phát

triển thuốc mới, chưa có chất chuẩn nối, khóa luận “Tổng quan về các kỹ thuật phân

tích sử dụng trong thiết lập chất chuẩn gốc (Primary Standard)” được thực hiện với

mong muốn đem đến một cái nhìn tổng quan về thiết lập chất chuẩn gốc cũng như cung

cấp những hiểu biết cơ bản, khả năng phát triển và ứng dụng của nó trong ngành Dược

tại Việt Nam với ba mục tiêu chính sau:

1 Khái niệm về chất chuẩn gốc và các bước trong quy trình thiết lập chất chuẩn

gốc

2 Tổng quan các kỹ thuật xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc

3 Tổng quan các kỹ thuật xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc

CHƯƠNG 1 KHÁI NIỆM VỀ CHẤT CHUẨN GỐC 1.1 Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu

Nguyên liệu đối chiếu là những nguyên liệu có sự đồng nhất và ổn định về một hoặc một số tính chất, được thiết lập để phù hợp với một quá trình sử dụng hoặc đo lường đã định sẵn [12], [43], [45], [59]

Thuật ngữ “chất chuẩn đối chiếu hóa học” hay còn gọi là “chất chuẩn đối chiếu” hay “chất đối chiếu hóa học” được WHO định nghĩa như sau:

“Chất chuẩn đối chiếu hóa học là nguyên liệu đồng nhất, xác thực, được sử dụng trong các phép thử vật lí, hóa học mà ở đó các tính chất của nó được so sánh với các tính chất của chất cần thử, với độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng” [5], [83]

Trong lĩnh vực kiểm tra chất lượng của ngành Dược, các phương pháp phân tích trong các Dược điển hiện hành có thể yêu cầu CCĐC trong các phép thử sau [14], [69], [73], [80], [85]: Đo phổ IR để định tính, đo phổ UV để định lượng, định lượng bằng các phương pháp so sánh màu, các phương pháp sắc ký để định tính và định lượng, các kỹ thuật tách để định lượng, các phương pháp định lượng vi sinh, các thử nghiệm hóa học

- miễn dịch, hiệu chuẩn thiết bị

1.2 Phân loại chất chuẩn đối chiếu hóa học:

1.2.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (primary chemical reference standards PCRS)

-Khái niệm: “Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc là chất được công nhận rộng rãi,

có các chỉ tiêu chất lượng phù hợp với tài liệu công bố, cụ thể và giá trị ấn định của nó được sử dụng làm tiêu chuẩn phân tích mà không cần phải so sánh với chất hóa học khác” [83], [85]

Theo ICH Guideline Q7 định nghĩa: Chất chuẩn gốc là một chất được đưa ra bởi một loạt các phân tích để trở thành nguyên liệu đáng tin cậy có độ tinh khiết cao Chất chuẩn này có thể:

• Thu được từ nguồn được công nhận chính thức;

• Được bào chế bằng tổng hợp độc lập (independent synthesis);

• Thu được từ nguyên liệu sản xuất có độ tinh khiết cao;

• Được bào chế bằng cách tinh chế tiếp các nguyên liệu sản xuất có sẵn [37]

– Các chuẩn gốc - PCRS chính thức:

Các chất chuẩn gốc chính thức có thể tìm được từ các nguồn sau: Trung tâm hợp tác về chất chuẩn đối chiếu của WHO, Hội đồng Dược điển Châu Âu, các phòng thí nghiệm trực thuộc của Hội đồng Dược điển Anh và Mỹ [21], [67], [81]

Chất chuẩn quốc tế (ICRS) là một chất chuẩn gốc được thiết lập tại Trung tâm

hợp tác về các chất chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) về tiêu chuẩn chất lượng của các chế phẩm dược dụng Các tổ chức tham gia hợp tác đánh giá ICRS do WHO chỉ định ICRS được sử dụng chủ yếu trong các phép thử vật lý, hóa học, định lượng của các chuyên luận dược phẩm được công bố trong IP [40], [85]

Chuẩn theo Dược điển Châu Âu (EPRS): Được thiết lập và cung cấp bởi Ban thư

ký Kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu [26]

Chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS): Được thiết lập và phân phối bởi Hội đồng

chất đối chiếu Dược điển Mỹ [80]

– Các chuẩn gốc-PCRS tiêu chuẩn nhà sản xuất: Trong trường hợp chưa có chất

chuẩn gốc chính thức, nhà sản xuất có thể được xây dựng chất chuẩn gốc của cơ sở (in-house primary reference standard) bao gồm số lô và đầy đủ đặc tính của chất chuẩn gốc

1.2.2 Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (secondary chemical reference

standards - SCRS)

Khái niệm: Chất chuẩn thứ cấp là một chất chuẩn đối chiếu hóa học mà các tính chất hay chỉ tiêu chất lượng của nó được xác định bằng cách so sánh với một chất chuẩn gốc Chuẩn thứ cấp được dùng làm chất chuẩn đối chiếu cho các phân tích thường ngày của phòng thí nghiệm [37], [83], [85]

Phân loại chất chuẩn thứ cấp:

– Chuẩn thứ cấp - SCRS “chính thức” là một chuẩn thứ cấp khu vực hay quốc gia

• Chuẩn thứ cấp - SRCS ASEAN: do các PTN của các HĐDĐ, viện kiểm nghiệm quốc gia thiết lập, trong quá trình thiết lập chuẩn có sử dụng chuẩn gốc PCRS để

so sánh Quá trình thiết lập, phân phối chất chuẩn Dược điển do các HĐDĐ thực hiện và tuân theo các hướng dẫn của ISO guide 35 – 2017 [44]

• Chuẩn quốc gia - VNRS: Được thiết lập tại Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương

- Bộ Y tế hoặc Viện Kiểm Nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh - Bộ Y tế; được đánh giá bởi ít nhất hai khoa thử nghiệm là khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu và một khoa thử nghiệm khác trong Viện; được liên kết với chất chuẩn gốc

– Chuẩn làm việc (Working standard): Là một chuẩn thứ cấp do một nhà sản xuất hoặc

một PTN tự thiết lập [66]

1.3 Hướng dẫn quy trình thiết lập chất chuẩn gốc

Chất chuẩn gốc được công nhận rộng rãi do đó quy trình thiết lập chất chuẩn gốc phải được ban hành bởi các tổ chức có thẩm quyền và tuân thủ nghiêm ngặt

Quy trình thiết lập chất chuẩn gốc gồm 6 bước như sau [20], [83]:

 Bước 1: Đánh giá nhu cầu thiết lập chất chuẩn gốc

Sản xuất, xác nhận, duy trì và phân phối các chất chuẩn gốc là việc tốn nhiều chi phí và thời gian, do đó vấn đề đầu tiên cần được đánh giá là liệu có một quy trình nào

đó có thể thay thế bởi một quy trình khác thỏa mãn yêu cầu tương đương mà không cần phải dùng đến chất chuẩn gốc hay không

 Bước 2: Thu thập nguyên liệu nguồn

Nguyên liệu nguồn có chất lượng đạt yêu cầu có thể được lựa chọn từ lô nguyên liệu sản xuất có chất lượng tốt nhất và được cung cấp bởi các nhà sản xuất dược phẩm Các kỹ thuật tinh chế là cần thiết để nguyên liệu được chấp nhận sử dụng như một chất chuẩn gốc

Các yêu cầu về độ tinh khiết cho một chất chuẩn gốc phụ thuộc vào mục đích sử dụng:

• Một chất chuẩn gốc đề xuất cho một phép thử định tính không đòi hỏi sự tinh khiết quá cao, bởi sự hiện diện của một tỷ lệ nhỏ tạp chất thường không ảnh hưởng đáng chý ý đến phép thử

• Các chất chuẩn gốc được sử dụng trong các phép định lượng nên có độ tinh khiết cao Theo nguyên tắc cơ bản hướng dẫn, độ tinh khiết 99,5% trở lên là cần thiết,

tính trên nguyên liệu dạng khan hoặc không chứa các chất dễ bay hơi

Khi nguyên liệu nguồn sử dụng làm chất chuẩn gốc được lấy từ nhà cung cấp, cần cung cấp các tài liệu sau:

• Chứng chỉ phân tích với đầy đủ thông tin về các phương pháp thử, giá trị được tìm thấy và số lượng bản sao được sử dụng (nếu có), và quang phổ và/hoặc sắc

ký đồ thích hợp;

• Kết quả của bất kỳ nghiên cứu độ ổn định nào;

• Thông tin về điều kiện bảo quản tối ưu cần thiết để đảm bảo độ ổn định (cân nhắc

• Bảng dữ liệu an toàn nguyên liệu cập nhật

 Bước 3: Đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc

Cơ quan ban hành cần phải xem xét tất cả các dữ liệu thu được từ những kiểm tra nguyên liệu thiết lập chuẩn bằng nhiều phương pháp phân tích khác nhau Mức độ và phạm vi phân tích được yêu cầu phụ thuộc vào mục đích sử dụng chất chuẩn gốc

i Sử dụng trong phép thử định tính

Để sử dụng cho phép thử định tính, một lô nguyên liệu có chất lượng tốt (đạt yêu cầu về độ tinh khiết) được lựa chọn từ một quy trình sản xuất Điều quan trọng nhất là kiểm tra được năng lực của nguyên liệu thông qua việc thử nghiệm trên các phép thử dự định Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá từ một phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn [83]

ii Sử dụng trong các phép thử tinh khiết

Yêu cầu về độ tinh khiết của chất chuẩn gốc sử dụng với mục đích thử độ tinh khiết sẽ cao hơn so với mục đích định tính Nếu sử dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC), độ tinh khiết tối thiểu có thể là 90%, tuy nhiên đối với kỹ thuật sắc ký lỏng (LC) hoặc sắc ký khí (GC) thì ít nhất là 95% Thông thường chỉ cần một phòng thí nghiệm

tham gia đánh giá chất chuẩn gốc dùng cho phép thử tinh khiết Nếu chất chuẩn gốc được phân lập lần đầu tiên, phải áp dụng các phép thử hóa học và vật lý thích hợp như cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS) và phân tích nguyên tố để mô tả đặc tính cấu trúc [85]

iii Sử dụng trong các phép định lượng

Nếu chất chuẩn gốc được sử dụng trong một phép định lượng, mức độ và phạm

vi kiểm tra sẽ rộng và nghiêm ngặt hơn Tối thiểu ba phòng thí nghiệm cần hợp tác để đánh giá chất đề xuất, sử dụng nhiều kỹ thuật được thiết lập và thẩm định bao gồm cả phương pháp được quy định trong Dược điển Khi áp dụng phương pháp không đặc hiệu như đo quang phổ UV hay so màu, cần phải kiểm tra đáp ứng tương đối giữa hoạt chất

và tạp chất có mặt Khi sử dụng một phương pháp chọn lọc điều quan trọng là xác định chính xác số lượng tạp chất Trong trường hợp này, tốt nhất nên kiểm tra chất chuẩn đề xuất bằng nhiều phương pháp nhất có thể, bao gồm phương pháp tuyệt đối [83], [85]

iv Sử dụng trong hiệu chuẩn dụng cụ, thiết bị

Mức độ kiểm tra tương tự như đối với chất chuẩn sử dụng trong các phép định lượng Một số phòng thí nghiệm cần hợp tác để đánh giá chất chuẩn được đề xuất bằng cách sử dụng nhiều kỹ thuật phân tích để xác nhận độ tinh khiết của chất chuẩn đề xuất

• Bộ phổ: Nếu chất chuẩn gốc được đề xuất có cấu trúc đã được xác định rõ ràng

thì có thể nhận dạng thông qua bộ dữ liệu phổ IR, NMR, MS, UV bằng cách so sánh Nếu chất chuẩn được đề xuất là chất có cấu trúc mới hoặc thiếu dữ kiện mô

tả về tính chất thì ngoài việc sử dụng bộ phổ (IR, NMR, MS, UV) thì cần phải sử dụng thêm các kỹ thuật phân tích hiện đại dùng để mô tả các hợp chất mới như phân tích nguyên tố, nghiên cứu tinh thể học, phân tích nhóm chức,… để mô tả

đầy đủ đặc tính của chất chuẩn được đề xuất [85]

 Nhóm các kỹ thuật xác định độ tinh khiết:

• Xác định tạp chất liên quan bằng các kỹ thuật: HPLC/DAD, LC/MS, CE

• Xác định tạp chất vô cơ bằng phương pháp: tro toàn phần, tro sulfat, AAS,

• Xác định độ tinh khiết trực tiếp bằng các kỹ thuật: qNMR, DSC

Theo hướng dẫn của USP một số phương pháp phân tích thường được sử dụng [79]:

- Cảm quan;

- Kiểm tra nhận dạng (NMR, IR, UV,…);

- Kiểm tra độ tinh khiết gián tiếp (khoảng nóng chảy, góc quay cực riêng,…);

- Kiểm tra độ tinh khiết trực tiếp (Độ tinh khiết sắc ký, xác định tạp chất vô cơ, xác định tạp chất bay hơi gồm nước và dung môi bay hơi);

- Phân tích nhóm chức (chuẩn độ, UV/VIS, phân tích nguyên tố,…);

- Định lượng dựa vào lô chất chuẩn đặc tính tốt khác trước đó

 Bước 5: Xác định giá trị ấn định

Giá trị ấn định được xác định dựa trên kết quả đánh giá liên phòng trong đó các PTN sử dụng phương pháp phân tích khác nhau Thông thường các giá trị này được tập hợp từ ít nhất 3 PTN độc lập tham gia thiết lập chuẩn gốc Giá trị thực nghiệm thu được này đại diện tốt nhất cho ước tính giá trị thực [83]

Khi tất cả các phép thử độ tinh khiết đã được hoàn thành và các phương pháp đã được thẩm định đầy đủ, độ tinh khiết của chất chuẩn gốc được tính theo công thức sau:

Độ tinh khiết = 100% – % tạp chất hữu cơ - % tạp chất vô cơ - %

nước - % dung môi tồn dư [79], [85]

Hay: Độ tinh khiết = [100% - (nước + dung môi tồn dư + tạp chất vô cơ)

× độ tinh khiết sắc ký/điện di] (%) [75]

Giá trị ấn định được xác lập bằng cách so sánh kết quả phân tích giữa các PTN thông qua việc sử dụng phương pháp kiểm định thống kê ANOVA [7], [42]

 Bước 6: Xử lý và phân phối các CCĐC

Sự nguyên vẹn (về mặt đặc tính) phải được đảm bảo và duy trì trong suốt thời gian sử dụng

Hoạt động đóng gói: Phải tuân thủ các yêu cầu GMP Lọ chứa chất chuẩn gốc

phải tránh độ ẩm, ánh sáng, oxy và phải được kiểm tra tính thấm ẩm Các chất đắt tiền hoặc chỉ có sẵn với lượng rất nhỏ có thể được pha thành dung dịch sau đó đông khô hoặc bay hơi Một số chất chuẩn gốc phải được đóng gói trong khí trơ hoặc trong điều kiện độ ẩm được kiểm soát

Bảo quản: Thông tin về các điều kiện bảo quản thường có thể lấy từ nhà sản xuất

nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc và nên được yêu cầu thường xuyên khi một chất chuẩn mới được thiết lập Lưu trữ ở nhiệt độ khoảng 2℃ - 8℃ với các biện pháp chống hấp thụ độ ẩm thích hợp đã được chứng minh phù hợp cho hầu hết các chất chuẩn [83]

Độ ổn định: Độ ổn định của các chất chuẩn gốc nên được theo dõi bằng cách kiểm

tra lại thường xuyên và nên được thay thế ngay khi xuất hiện một sự thay đổi đáng kể một đặc tính Việc lựa chọn phương pháp phân tích thích hợp để theo dõi sự ổn định phụ thuộc vào tính chất và mục đích sử dụng của chất chuẩn

Thông tin được cung cấp với các chất chuẩn gốc: Trên nhãn của chất chuẩn gốc

cần cung cấp các thông tin sau [41], [83]:

• Tên thích hợp: tên quốc tế (International Nonproprietary Name – INN);

• Tên của cơ quan ban hành;

• Số lượng của nguyên liệu trong bao bì;

• Số lô hoặc số đăng ký

Phân phối và cung cấp: việc phân phối trong cùng một quốc gia thường không

gây ra vấn đề tuy nhiên khi các mẫu được gửi đi các nước khác, cả bên gửi và bên nhận đều có thể gặp khó khăn do sự khác nhau về quy định bưu chính, hải quan Vì vậy cần phải tìm cách giải quyết các rào cản đối với phân phối chất chuẩn gốc

Thời hạn sử dụng: Các chất chuẩn gốc không có “hạn sử dụng” theo nghĩa thông

thường Để tránh việc loại bỏ lãng phí các chất đạt yêu cầu, cơ quan ban hành có thể sử dụng cơ chế kiểm soát chung của mẻ chất chuẩn gốc Nếu đặc biệt cần thiết phải xác

định ngày hết hạn hoặc ngày kiểm tra lại, cần ghi lại trên nhãn và/hoặc trong một số tài liệu kèm theo chất chuẩn gốc và phải lưu lại hồ sơ [83]

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU

NHẬN DẠNG CHẤT CHUẨN GỐC

2.1 Mô tả vật lý

2.1.1 Kiểm tra cảm quan

Các đặc điểm nhìn thấy được như màu sắc, kết cấu (texture), hình thái học (morphology) cũng như sự nhiễm bẩn nhìn thấy được Các chất hầu như sẽ thay đổi màu sắc hoặc kết cấu khi tiếp xúc với các tác nhân như ánh sáng hoặc độ ẩm Do đó, kiểm tra cảm quan là một biện pháp quan trọng để kiểm tra các chất chuẩn [66]

2.1.2 Kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học liên quan đến việc kiểm tra nguyên liệu thiết lập chuẩn

và xác định sự kết tinh dưới kính hiển vi Một đánh giá ban đầu về hình thái chất chuẩn, tính đồng nhất, một khía cạnh định tính của khúc xạ ánh sáng bằng tinh thể có thể dễ dàng quan sát bằng kỹ thuật này Các hạt tinh thể sẽ xuất hiện sự thay đổi từ sáng đến tối (hoặc thay đổi màu sắc), dạng vô định hình sẽ không thay đổi khi xoay bàn soi của kính hiển vi phân cực [71]

2.1.3 Xác định điểm chảy

Điểm chảy của một chất là nhiệt độ đã hiệu chỉnh, tại đó hạt chất rắn cuối cùng của chất thử nghiệm chuyển thành trạng thái lỏng, bắt đầu biến màu, hóa than hoặc sủi bọt Để xác định điểm chảy, tùy theo tính chất lý học của từng chất mà áp dụng phương pháp xác định điểm chảy phù hợp [5] Điểm chảy là một hằng số vật lý biểu thị sự nhận dạng và độ tinh khiết của nguyên liệu [14], [85]

2.1.4 Góc quay cực riêng

Theo Dược điển Việt Nam V- PL 6.4: Góc quay cực là góc của mặt phẳng phân

cực khi bị quay đi khi ánh sáng phân cực đi qua chất đó nếu là chất lỏng hoặc qua dung dịch chất đó nếu là chất rắn Nếu không có hướng dẫn riêng, góc quay cực α được xác định ở nhiệt độ 20℃ và với chùm tia đơn sắc có bước sóng ứng với vạch D (589,3 nm) của đèn natri qua lớp chất lỏng hay dung dịch có bề dày 1 dm Góc quay cực riêng [α]20

𝐷của một chất lỏng là góc quay cực đo được khi chùm ánh sáng D truyền qua lớp chất lỏng ddó có bề dày là 1 dm ở 20℃ chia cho tỷ trọng tương đối của chất ở cùng nhiệt độ

Góc quay cực riêng [α]20𝐷 của một chất rắn là góc quay cực đo được khi chùm ánh sáng

D truyền qua lớp dung dịch có bề dày 1 dm và có nồng độ là 1 g/ml, ở 20℃ (góc quay cực riêng của chất rắn luôn được biểu thị cùng với dung môi và nồng độ dung dịch đo) [5], [14] Góc quay cực riêng được sử dụng để xác nhận chất chuẩn [14], [66]

Để có thông tin cấu trúc chính xác từ phổ IR, cần tìm hiểu các tần số mà tại đó các nhóm chức khác nhau hấp thụ Có thể sử dụng bảng tương quan IR (cung cấp các thông tin về hấp thụ của các nhóm chức khác nhau) [6]

2.2.1.2 Ưu nhược điểm

Ưu điểm: Phổ IR là đặc trưng cho các nhóm chức có trong hợp chất hữu cơ (trừ

trường hợp đồng phân quang học) [6], [85] và phổ IR thường không bị ảnh hưởng nhiều bởi sự có mặt của một lượng nhỏ tạp chất (lên đến vài phần trăm) trong chất thử [85]

Nhược điểm: Ứng dụng về định tính của phổ IR trong trường hợp đồng phân

quang học bị hạn chế [6], [85]

2.2.1.3 Ứng dụng

Phổ IR được sử dụng chủ yếu như một phép xác định cấu trúc và nhận dạng chất phân tích thông qua các đỉnh đặc trưng cho các nhóm chức đặc biệt trong phân tử hợp

chất [3], [85] Bằng cách so sánh phổ IR của hai hợp chất ta có thể xác định chúng có giống nhau hay không [6] Phổ IR là kỹ thuật nhận dạng được sử dụng phổ biến nhất cho các chất chuẩn gốc [66], [85] Có thể nhận dạng chất chuẩn gốc bằng cách so sánh với dữ liệu phổ đã công bố trong nghiên cứu trước đây [14], [26]

Trong các Dược điển, phổ IR thường được sử dụng để xác định cấu trúc các nguyên liệu thuốc như: Trong IP (Allopurinol, Artemisinin, Atenolol, Atropin sulfat, Betamethason, Caffein, Cloramphenicol,… yêu cầu phổ phải phù hợp với phổ chuẩn) [85], trong USP (Abacavir, Acetaminophen, Amikacin, Amitriptylin hydrochlorid, Benzocain,… yêu cầu phải phù hợp với phổ chuẩn) [80], trong Dược điển Việt Nam V (Albendazol, Allopurinol, Ampicilin, Haloperidol,… yêu cầu phải phù hợp với phổ IR chuẩn đối chiếu) [5]

2.2.2 Kỹ thuật quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)

2.2.2.1 Nguyên tắc:

Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) là một trong các phương pháp phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện từ từ 200 - 800 nm [5] Thông thường phổ tử ngoại được đo trong dung môi, với nồng độ xấp xỉ 10-4 mol/l [8] Có thể định tính một số chất bằng cách so sánh vị trí các cực đại và cực tiểu hấp thụ và tỷ lệ mật độ quang giữa các bước sóng đó phải nằm trong một giới hạn cho phép; quang phổ đạo hàm; chồng phổ [3], [66], [85]

2.2.2.2 Ưu nhược điểm

Nhược điểm: Chỉ một số dạng cấu trúc trong các hợp chất hữu cơ mới có sự hấp

thụ như vậy nên trên thực tế việc ứng dụng phổ UV bị giới hạn trong một số hợp chất nhất định, chủ yếu là các hợp chất có cấu trúc nối đôi liên hợp [4]; không áp dụng được khi hợp chất chưa biết rõ cấu trúc, khi hợp chất hấp thụ kém/không hấp thụ UV Tại vùng bước sóng dưới 200 nm xảy ra sự hấp thụ UV không chọn lọc [65]

2.2.2.3 Ứng dụng

Phổ UV-VIS là một kỹ thuật cung cấp thêm thông tin để nhận dạng chất phân tích [80] Bên cạnh đó phổ UV-VIS có thể định tính một số chất bằng cách so sánh vị trí các

cực đại và cực tiểu hấp thụ và tỷ lệ mật độ quang giữa các bước sóng đó phải nằm trong một giới hạn cho phép [3], [66], [85]

Trong các Dược điển đã áp dung quang phổ UV-VIS để định tính được các hợp chất: USP (Albuterol, Atenolol, Budesonid, …) [80], IP (Aciclovir, Stavudin, Zidovudin,…) [85]

2.2.3 Kỹ thuật phổ khối lượng (MS)

2.2.3.1 Nguyên tắc

Chất phân tích được chuyển sang thể khí và ion hóa, tạo thành các ion dương hoặc

âm Phương pháp phổ khối dựa trên việc đo trực tiếp tỷ số m/z, là tỷ số giữa khối lượng

m và điện tích z của ion chất phân tích Tỷ số này được trình bày dưới dạng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 a.m.u = 1/12 khối lượng của 12C) hay Dalton (1Da = khối lượng nguyên tử hydro) [3], [5], [14], [26]

Trong máy phổ khối, các ion được tạo thành trong nguồn ion, được gia tốc rồi được tách trong bộ phận phân tích trước khi đến detector Tất cả các quá trình trên được thực hiện trong một buồng hút chân không đến khoảng 10-3 đến 10-6 Pa Phổ thu được biểu diễn cường độ tương đối của các ion khác nhau phụ thuộc vào tỷ số m/z của các ion đó [3] Tín hiệu tương ứng với một ion là một nhóm các pic tương ứng với phân bố thống kê của các đồng vị khác nhau của ion đó Đó là hình ảnh đồng vị ion và trong đó pic của đồng vị có cường độ lớn nhất của một nguyên tử được gọi là pic đơn đồng vị

Trong phổ MS của các hợp chất hữu cơ, không thể phân loại các phân tử hữu cơ khác nhau như hydrocarbon, alcohol, ester,… nhưng cần phải chú ý đến phân tử nguyên vẹn được ion hóa trước khi phân mảnh mà không phải là nhóm chức đặc trưng bị tách

ra khỏi phần còn lại của phân tử [6]

2.2.3.2 Ưu điểm của kỹ thuật MS

• Có thể dùng MS để xác định thành phần đồng vị của các nguyển tố trong mẫu [3]

• Kỹ thuật bắn phá nhanh bằng nguyên tử (FAB) rất đơn giản, đặc hiệu và độ nhạy cho phép phân tích trong khoảng picogram, thích hợp để ion hóa các chất phân cực và dễ phân hủy nhiệt [3], [65]

• Kỹ thuật ion hóa bằng tia điện (ESI) thích hợp để ion hóa các chất phân cực (khác với kỹ thuật EI) Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) thích hợp

để kết nối HPLC/MS [22] Hai kỹ thuật này cho phép phát hiện các hợp chất hữu

cơ ở mức pictogram [2], [65]

• Chế độ SIM (Single-ion monitoring, chọn tín hiệu của một ion) hoặc chế độ MIM (multiple-ion monitoring, chọn tín hiệu của một số ion đặc trưng của chất phân tích) cho độ nhạy cao hơn, phát hiện hợp chất khi nồng độ dưới ngưỡng pictogram [3], [65]

• Để phân tích trực tiếp các hỗn hợp sinh học phức tạp, kết hợp 2 kỹ thuật sắc ký lỏng và phổ khối lượng cho thấy hiệu quả Ion hóa bằng giải hấp lazer (MALDI) kết hợp với bộ phân tích thời gian bay (TOF) đã chứng tỏ là một công cụ mạnh

và nhạy Kỹ thuật này có khả năng phân tích hỗn hợp của peptid và protein trong một khoảng nồng độ rộng từ picomol (10-12 mol) đến attomol (10-18 mol), đây là một lợi thế của kỹ thuật này với ứng dụng rộng trong hóa hữu cơ, nghiên cứu dược phẩm và công nghệ sinh học

Nhược điểm: Phổ MS không phân biệt được các đồng phân Trong ion hóa bằng

dòng electron (EI), độ nhạy cỡ nanogram [65]; kỹ thuật EI thường tạo ra nhiều mảnh nhỏ, ít hoặc thậm chí không có ion phân tử cho nên đôi khi khó biện giải phổ Trong trường hợp đó người ta dùng kĩ thuật ion hóa “mềm” hơn Mặt khác, kỹ thuật này đòi hỏi phải hóa hơi mẫu nên ít thích hợp với các chất phân cực hoặc dễ bị nhiệt phân hủy [3]

2.2.3.3 Ứng dụng

Phổ khối lượng là công cụ hiệu quả để định tính và định lượng các hợp chất hữu

cơ như protein, peptid, các hoạt chất, các sản phẩm chuyển hóa, tạp chất hay các sản phẩm phân hủy khác [80]

2.2.4 Kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

2.2.4.2 Ưu nhược điểm

Ưu điểm: Phổ NMR cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử rất chi tiết do đó nó

có tính đặc hiệu cao [6], [27] Tính hữu ích của phân tích NMR phát sinh từ quan sát thấy rằng cùng một loại hạt nhân, khi nằm trong các môi trường phân tử khác nhau thì

có tần suất cộng hưởng khác nhau Phổ NMR là một kỹ thuật mạnh để xác định cấu trúc

vì tính đặc hiệu của nó trong việc phát hiện một số hạt nhân nhất định như 1H, 13C, 31P

và 19F Cơ sở xác định là so sánh các tín hiệu từ mẫu thử với các tín hiệu dự kiến từ một tiêu chuẩn tham chiếu đủ tiêu chuẩn Các cấu trúc tương đối đơn giản có thể được xác định bằng cách sử dụng các thay đổi hóa học, mô hình ghép nối và cường độ thu được

từ Phổ 1H và 13C một chiều Đối với các cấu trúc phức tạp hơn, các nhà phổ học có thể phải có được phổ hai chiều từ các thí nghiệm đã được phát triển để xác định kết nối đồng nhất hoặc kết nối hạch nhân [80]

Nhược điểm: Kỹ thuật NMR có độ nhạy tương đối thấp do sự khác biệt nhỏ về

năng lượng giữa các trạng thái liên kết dẫn đến kết quả là sự khác biệt số lượng hạt nhân giữa 2 mức của chỉ có một phần triệu Ngoài ra, tuổi thọ dài của hầu hết các hạt nhân trong trạng thái kích thích ảnh hưởng đến thiết kế của kiểm tra phân tích NMR đặc biệt trong các thí nghiệm xung có tính lặp lại

2.2.4.3 Ứng dụng

Phổ NMR là một kỹ thuật hiệu quả trong xác định cấu trúc hóa học của các phân

tử hữu cơ bằng cách giải phổ Để xác định cấu trúc thường đo phổ 1D NMR là đủ còn trong các trường hợp phức tạp cần sử dụng thêm phổ 2D Phổ NMR có thể được sử dụng

cho mục đích định tính và định lượng [14], [26], trong trường hợp định tính phổ của nguyên liệu chất chuẩn phải luôn được ghi lại dưới cùng một điều kiện với chất phân tích Khi không có sẵn dữ liệu tham chiếu cần bổ sung thêm một kỹ thuật phổ MS [27], [53]

2.2.5 Phân tích nguyên tố

Hàm lượng các nguyên tố carbon, hydro và nitơ của chất chuẩn có thể được xác định bởi phương pháp phân tích đốt cháy (combustion analysis) Phân tích đốt cháy cung cấp thông tin về công thức phân tử và độ tinh khiết của chất chuẩn Sự kém phù hợp giữa thành phần nguyên tố lý thuyết và thực nghiệm thường là dấu hiệu của một tạp chất hoặc sự khác nhau giữa công thức phân tử lý thuyết và thực tế Phân tích nguyên tố cũng

có thể xác định sự có mặt của dung môi và tạp chất vô cơ [66]

2.2.6 Nhiễu xạ tia X

Nguyên tắc: Mỗi pha tinh thể của một chất nhất định tạo ra một mô hình nhiễu xạ

tia X đặc trưng Ba loại thông tin thu được từ nhiễu xạ tia X là vị trí góc cạnh của đường nhiễu xạ, cường độ đường nhiễu xạ và các mặt cắt nhiễu xạ Kết quả về vị trí góc cạnh

và cường độ của các đường có thể sử dụng cho giai đoạn định tính [80]

Khi áp dụng cho các tinh thể đơn, kỹ thuật này gọi là nhiễu xạ tia X đơn tinh thể; khi áp dụng cho bột, kỹ thuật gọi là nhiễu xạ tia X bột (X-ray powder diffraction - XRPD) Nhiễu xạ đơn tinh thể cung cấp thông tin cấu trúc cuối cùng về độ dài và góc liên kết cho chất chuẩn, trong khi XRPD cho thông tin về mức độ kết tinh của nguyên liệu cũng như giúp xác định dạng thù hình [31], [32], [70]

CHƯƠNG 3 TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỘ TINH KHIẾT

NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC

3.1 Nguồn gốc và phân loại tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc

3.1.1 Nguồn gốc tạp chất

Các tạp chất hoặc các sản phẩm phân hủy trong các thuốc có thể sinh ra trong quá trình sản xuất hoặc trong quá tình lưu trữ thuốc Các sản phẩm phân hủy trong các sản phẩm thuốc có thể phát sinh từ các thuốc hoặc các sản phẩm phản ứng của thuốc với môi trường, với một tá dược hoặc với hệ thống bao bì trực tiếp [80]

Tạp chất xác định (specified impurity) là một tạp chất mà được liệt kê riêng biệt

và được giới hạn với một tiêu chuẩn chấp nhận riêng trong một chuyên luận hoặc trong đặc tính một thuốc mới Một tạp chất lý thuyết có thể được nhận biết hoặc chưa được nhận biết

Tạp chất chưa được nhận biết (unidentified impurity) là một tạp chất mà một đặc tính cấu trúc chưa hoàn thành và nó được xác định chỉ bằng các tính chất phân tích định tính (ví dụ thời gian lưu sắc ký)

Tạp chất không xác định (unspecified impurity) là một tạp chất mà được giới hạn bởi một tiêu chuẩn chấp nhận chung nhưng không được liệt kê riêng biệt với tiêu chuẩn chấp nhận riêng của nó [14], [39]

 Tạp chất hữu cơ: Tạp chất hữu cơ có thể phát sinh ra trong quá trình sản xuất và/hoặc

lưu trữ nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Chúng có thể được xác định hoặc không xác định, dễ bay hơi hoặc không bay hơi, và bao gồm:

• Nguyên liệu ban đầu;

• Sản phẩm phụ;

• Sản phẩm trung gian;

và lưu trữ phải được xác định và định lượng [21]

 Tạp chất vô cơ: Tạp chất vô cơ có thể là kết quả của quá trình sản xuất, chúng thường

được biết và nhận diện và bao gồm :

• Thuốc thử, phối tử và các chất xúc tác;

• Kim loại nặng hoặc kim loại còn dư;

• Muối vô cơ;

• Các chất khác (ví dụ: thiết bị lọc, than hoạt) [80]

– Cụ thể nguồn gốc tạp vô cơ có thể xuất phát từ [35], [65]:

• Nguyên liệu, thuốc thử và dung môi sử dụng trong quá trình sản xuất/ tổng hợp Chúng có thể là ion vô cơ: clorua, sunfat, phosphat… Hoặc có thể là các kim loại nặng

• Các kim loại nặng có thể bắt nguồn từ các bình phản ứng và ống dẫn được sử dụng trong quá trình sản xuất [35]

• Bộ lọc, thiết bị lọc và chất hấp phụ được sử dụng trong quá trình tinh chế và kết tinh cũng có thể giải phóng các kim loại nặng và muối của axit vô cơ

• Vết của một số chất phản ứng vô cơ hoặc các sản phẩm biến đổi của chúng cũng

có thể là tạp chất Ví dụ, trong phản ứng các sản phẩm oxy hóa với các chất oxy hóa như selen dioxit, chromium trioxit, muối permanganat và thủy ngân (II) có thể phát hiện được các vết của selen, crom, mangan hoặc thuỷ ngân…vv

• Các chất xúc tác dị thể như palladium và niken có thể tồn tại dưới dạng ion hóa

• Sự phân hủy hoạt chất: ví dụ như muối phosphat từ quá trình thủy phân của este photpho, hydrazin từ sự phân ly hoặc hydrazon thủy phân [65]

 Tạp chất bay hơi:

– Tạp chất bay hơi bao gồm nước và dung môi tồn dư

Dung môi tồn dư là chất lỏng hữu cơ được sử dụng làm phương tiện để pha chế các dung dịch hoặc hỗn dịch trong tổng hợp thuốc Vì chúng thường có độc tính

đã biết nên việc lựa chọn các biện pháp kiểm soát thích hợp được thực hiện dễ dàng [80]

– Nguồn gốc của tạp chất bay hơi:

• Dung môi để kết tinh hoạt chất: thường là dung môi sử dụng trong những giai đoạn tinh chế cuối cùng

• Dung môi chạy sắc ký: Nếu bước cuối cùng hoạt chất được tinh chế bằng sắc ký cột, thì dung môi sắc ký cũng có thể có mặt

• Dung môi do hấp phụ: Nếu hoạt chất là chất dễ hút ẩm nó có thể liên kết các thành phần dễ bay hơi trong không khí bằng cách hấp phụ hay gặp nhất là nước

• Bắt nguồn từ quá trình bào chế thuốc: nước, cồn, 2-propanol, chloroform, dichloromethan và các dung môi khác được sử dụng trong kỹ thuật bào chế Các tạp chất nên được kiểm soát trong suốt quá trình sản xuất Các tạp chất liên quan đến quy trình sản xuất nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc nên được giữ ở mức tối thiểu để tránh sự xuống cấp và tác dụng về dược lý không mong muốn Các hợp chất

dễ bị thủy phân, ví dụ nên được làm khô hoàn toàn để loại bỏ ẩm và sau đó được lưu trữ trong máy sấy hút ẩm Các chất chuẩn đối chiếu có chứa một tỉ lệ cao các tạp chất hữu

cơ dễ bay hơi có thể bị thay đổi độ tinh khiết theo thời gian khi dung môi bay hơi Ví

dụ, tạp chất trong aceton, dung môi loại 3, được cho phép lên tới 5000 ppm hoặc 0,5% [21]

3.2 Các kỹ thuật xác định tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc

Nhìn chung có hai hướng chính để xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc là xác định trực tiếp hoạt chất chính và xác định gián tiếp qua hàm lượng từng loại tạp chất [85], [87]

3.2.1 Kỹ thuật xác định gián tiếp:

Khi thiết lập bất kỳ một chất chuẩn gốc nào nhằm sử dụng trong định lượng thì phải xác định độ tinh khiết Độ tinh khiết được xác định thông qua việc xác định hàm lượng tạp chất bằng cách sử dụng các kỹ thuật phân tích phù hợp [14], [26]

Thử tinh khiết là tập hợp các phép thử nhằm phát hiện những tạp chất nhiễm vào nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Để kiểm tra độ tinh khiết, phải thử xác định sự có mặt của các tạp chất, số lượng và giới hạn của chúng cũng như những yêu cầu khác tùy theo mỗi chuyên luận [5]

Độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn được tính theo công thức [75],[58], [85]:

Độ tinh khiết = (100 - % tạp chất liên quan) × (100 - % tạp bay hơi - % tạp

vô cơ)/100

= Độ tinh khiết sắc ký × (100- % tạp bay hơi - % tạp vô cơ)/100

Trong đó:

• Độ tinh khiết: hàm lượng phần trăm của chất chuẩn đối chiếu (đơn vị %);

• % tạp chất liên quan: phần trăm tổng tạp chất liên quan tính thep phương pháp chuẩn hóa diện tích

3.2.1.1 Các kỹ thuật xác định tạp chất hữu cơ

a Các kỹ thuật xác định tạp chất liên quan

a.1 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần của pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [3]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm cấu tạo của chất cần phân tích và yêu cầu của công việc Có thể thống kê các kỹ thuật sắc ký lỏng theo mức độ phổ biến trong thực tế như sau:

– Sắc ký phân bố hiệu năng cao: sử dụng phổ biến nhất hiện nay là sắc ký pha liên kết

Pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn: silica, alumina… Trong loại này, dựa vào cấu tạo của pha liên kết mà chia ra thành 2 dạng pha tĩnh đó là:

• Sắc ký pha đảo (RP-HPLC): Khi các nhóm –OH của silicagel đã được silan hóa bởi các chuỗi Carbon (C8, C18, phenyl…) tính phân cực của pha tĩnh bị giảm đi hoặc mất hẳn, khi đó dùng pha động phân cực

• Sắc ký pha thuận (NP-HPLC): Các nhóm –OH của silicagel được thay thế bởi các nhóm –NH2, –CN… làm thay đổi độ phân cực của pha tĩnh, dùng pha động không phân cực hoặc ít phân cực hơn so với pha tĩnh

– Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao:

• Pha tĩnh là chất rắn phân cực Chất phân tích tranh chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh Lưu giữ chất phân tích do lực hấp phụ

• Pha tĩnh thường sử dụng là silic oxyd (silica) và nhôm oxyd (alumina) Pha động

có sức rửa giải khác nhau, đặc trưng bởi giá trị εo - thể hiện sức rửa giải của các dung môi đối với chất hấp phụ là alumina và silica Trị số εo càng lớn thì sức rửa giải càng mạnh Nếu pha động gồm nhiều dung môi, dựa vào phân số mol của từng dung môi để tính trị số εo của hệ [3], [46], [82]

Hiện nay, phần lớn các phép thử tạp chất liên quan được thực hiện bằng phương pháp HPLC/DAD (detector mảng diod) do phương pháp có độ nhạy phù hợp để xác định tạp chất dưới dạng vết và tự động hóa cao Một loạt các loại pha tĩnh và chế độ hoạt động khác nhau làm cho HPLC áp dụng cho đa phần các loại hợp chất từ không phân cực đến phân cực trung bình Giới hạn phát hiện điển hình đối với các tạp chất liên quan thường là 0,1% hoặc thấp hơn 0,01%

Có 2 phương pháp chính để định lượng tạp chất bằng HPLC là:

 Phương pháp 1: Chuẩn hóa diện tích

Trong cách tiếp cận này hàm lượng của một tạp chất liên quan riêng lẻ được tính theo phương trình sau:

• ΣSpic: tổng diện tích pic sắc ký của hoạt chất và tất cả các tạp chất có liên quan

Đây là một trong những cách đơn giản nhất để định lượng tạp chất liên quan vì không cần chất chuẩn đối chiếu Phương pháp được áp dụng khi đáp ứng các tiêu chí sau:

• Khoảng nồng độ tuyến tính: Do các hàm lượng các tạp chất liên quan thường dưới 1% và hoạt chất trên 95% do đó điều quan trọng là phải có sự tuyến tính từ ngưỡng nồng độ các chất liên quan (ví dụ 1%) đến nồng độ của hoạt chất (ví dụ 95%) Tuy nhiên, trong một số trường hợp, hình dạng pic sắc ký của hoạt chất có thể không hoàn toàn đối xứng ở nồng độ cao như vậy Do đó, đáp ứng có thể không tuyến tính trong phạm vi nồng độ rộng như vậy, và việc sử dụng tỷ lệ diện tích có thể không còn thích hợp

• Độ nhạy của phương pháp: Trong một số trường hợp, hình dạng pic của hoạt chất

có thể không hoàn toàn đối xứng ở nồng độ cao nên có thể dẫn đến sự mất tuyến tính Do đó, để duy trì tính tuyến tính ở nồng độ của hoạt chất, các nhà khoa học

có thể cố gắng giảm nồng độ mẫu để cải thiện hình dạng pic của hoạt chất Tuy nhiên, nếu nồng độ mẫu quá thấp, nó sẽ ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp,

và khả năng phát hiện các tạp chất liên quan thấp có thể không đầy đủ

• Hệ số đáp ứng: Các hệ số đáp ứng tương đối của các chất liên quan với hoạt chất nên gần với 1 Nếu không, phải xác định hệ số hiệu chỉnh để tính toán Tuy nhiên, khi xác định độ tinh khiết của hoạt chất tự nhiên, bỏ qua sai số xuất phát từ sự chênh lệch về đáp ứng là không thể tránh khỏi do thành phần phức tạp ngăn cản việc xác định và định lượng tất cả các thành phần [19], [75]

 Phương pháp 2: Pha loãng dung dịch thử (Low-high)

Phương pháp này sử dụng có thể khắc phục hạn chế của khoảng tính trong phương pháp chuẩn hóa diện tích Mẫu được chuẩn bị ở cả nồng độ cao và nồng độ thấp Mục đích tiêm mẫu nồng độ cao nhằm phát hiện tất cả các tạp thông qua những pic nhỏ này

có thể phát hiện được, từ đó tăng độ nhạy của phương pháp Tiêm mẫu ở nồng độ thấp được sử dụng để đảm bảo tuyến tính trong đáp ứng của hoạt chất Mặt khác, đáp ứng của hoạt chất trong mẫu nồng độ thấp tương tự như tạp liên quan có trong mẫu nồng độ cao Do đó chỉ cần một khoảng tuyến tính hẹp để định lượng Hạn chế của phương pháp

là tổng thời gian phân tích tăng lên gấp đôi và có thể mắc sai số do pha loãng

 Phương pháp 3: Sử dụng chất chuẩn tạp

So với phương pháp chuẩn hóa diện tích, phương pháp chất chuẩn tạp có một số

ưu điểm như sau:

• Giảm khoảng tuyến tính: Phương pháp chuẩn ngoại sử dụng một đường chuẩn

Do đó, phương pháp này chỉ yêu cầu dải tuyến tính nhỏ

• Cải thiện độ nhạy của phương pháp: Trong cách tiếp cận này, chỉ tính riêng các

đáp ứng của các chất liên quan riêng lẻ Vì diện tích pic hoạt chất trong mẫu tiêm không cần thiết cho việc tính toán nên có thể sử dụng nồng độ mẫu cao mà không cần lo lắng về đáp ứng ngoài khoảng tuyến tính của hoạt chất Cách tiếp cận này đặc biệt hữu ích khi các nhà khoa học muốn cải thiện độ nhạy của phương pháp bằng cách tăng nồng độ mẫu

Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn một số hạn chế nhất định:

• Chất chuẩn tạp: Cần thiết phải có một chất chuẩn tạp tốt Ngoài ra, mỗi phép

phân tích đòi hỏi phải cân chính xác một lượng nhỏ chuẩn tạp Vì vậy, sai số khi cân có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp và độ đúng

Một điểm lưu ý quan trọng khi thu thập dữ liệu là phải có một “ngưỡng”- đó là một giá trị mà khi diện tích pic dưới giá trị này sẽ bị bỏ qua “Ngưỡng” thường bằng 0,1% hoặc 0,05% chất đang phân tích [19], [65]

Trong đa số các chuyên luận nguyên liệu hóa dược của Dược điển Việt Nam V, tạp chất liên quan được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ luc 5.3): Cefdinir, Cefixim, Cefpodoxim proxetil, Ceftriaxon natri, Cefuroxim axetil, Cefuroxim natri,…

a.2 Kỹ thuật sắc kí lỏng khối phổ (LC/MS)

Kết hợp kỹ thuật sắc ký lỏng – khối phổ: vừa khai thác được hiệu lực phân tách

mạnh của kỹ thuật sắc ký vừa khai thác được độ nhạy cao của khối phổ trong việc xác định hợp chất tách ra Ngoài ra, khi kết hợp hai kỹ thuật thì có thể phân biệt được các đồng phân lập thể và đồng phân vị trí của chất [22] Bất lợi của phương pháp tiếp cận này là không chỉ các hợp chất quan tâm mà cả sự nhiễm từ những dung môi được sử dụng cho HPLC cũng sẽ được tích lũy Các hợp chất từ dung môi thậm chí có thể ngăn chặn các hợp chất được phân tích, đặc biệt là trong ion hóa FAB nếu chúng dễ ion hóa hơn Sự ngăn chặn này được khắc phục bằng cách sử dụng dòng chảy liên tục FAB hoặc ESI và ion hóa APCI riêng

Kỹ thuật phối hợp HPLC/MS có độ nhạy cao đến mức pictogram hoặc nanogram

Hiện nay xu hướng kết hợp mới đòi hỏi sự ứng dụng tự động hóa cao các phương pháp khác như GC/MS, LC/MS, CE/MS, CEC/MS,… cũng được khai thác cả về định tính và mô tả đặc tính định tính của hỗn hợp phức tạp [65]

a.3 Kỹ thuật điện di mao quản (CE)

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất trong mao quản silica dài 25-100 cm, đường kính trong 25-100 µm, đường kính ngoài 300-400 µm Điện thế một chiều áp vào hai đầu mao quản 10-30 KV (cường độ điện trường tạo ra có thể lên đến

500 V/cm) tạo ra quá trình chia tách: các chất phân tích được phát hiện khi di chuyển về một đầu mao quản nhờ một detector thích hợp [3]

Việc đo vận tốc điện di động chỉ có ý nghĩa khi điều kiện thí nghiệm được xác định chính xác Sự di chuyển của ion trong điện trường phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, tính chất, kích cỡ, hình dạng và điện tích Nó cũng phụ thuộc vào thành phần của chất dẫn điện, tính chất, nồng độ, độ pH, sự có mặt của dung môi bổ sung và độ nhớt Hướng di chuyển của ion phụ thuốc vào dấu điện tích của hạt khi nó di chuyển về phía điện của dấu đối diện Sự di chuyển điện di được đo trực tiếp hoặc so sánh với chất tham chiếu

Phân loại các kiểu điện di mao quản (Theo Dược điển Việt Nam V-PL158):

– Điện di mao quản vùng (CZE): Quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác nhau

về linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung dịch thử Linh

độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện nhất định của

phương pháp

– Sắc ký mixen điện động (MEKC): Các chất hoạt động bề mặt được thêm vào dung

dịch đệm làm việc ở nồng độ lớn hơn nồng độ mixen tới hạn Các chất phân tích có thể phân bố trong pha tĩnh giả do mixen tạo thành Kỹ thuật này thường được ứng

dụng để tách các chất trung tính và các ion

– Điện di mao quản gel (CGE): Tương tự như lọc gel, sử dụng các mao quản chứa gel

để tách các phân tử, dựa trên cơ sở sự khác nhau tương đối về khối lượng phân tử hay kích thước phân tử

– Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (CIEF): Các chất được tách trên cơ sở sự khác

nhau tương đối về điểm đẳng điện

– Điện di mao quản đẳng tốc (CITP): Sử dụng hai đệm bao quanh các vùng chất phân

tích Cả anion và cation có thể tách thành những vùng rõ rệt Ngoài ra, nồng độ chất phân tích như nhau trong mỗi vùng Như vậy, chiều dài của mỗi vùng sẽ tỉ lệ thuận với lượng chất phân tích

Hai kỹ thuật điện di mao quản thường được sử dụng nhiều nhất là điện di mao quản vùng và sắc ký mixen điện động

Điện sắc ký mao quản (CEC): CEC là một kỹ thuật tách lai tạo của CE và HPLC

nhằm khai thác những ưu điểm kết hợp của độ chọn lọc sắc ký (pha tĩnh và pha động) liên quan đến pha đảo (RP) với hiệu quả cao và tính điện di của CE [65] Trong CEC, mao quản được nhồi một pha tĩnh thật, thường là silica C18 như trong sắc ký lỏng Nhưng nhờ có thế áp vào mao quản nên pha động di chuyển qua mao quản nhờ dòng điện thẩm (EOF) Do không dùng áp suất đẩy pha động qua cột nên không có hiện tượng sụt áp liên quan đến kích thước hạt Có thể nói CEC là một kỹ thuật sắc ký trong đó pha động đi qua cột nhờ EOF nên tạo cho kỹ thuật này tách rất hiệu quả, khắc phục giới hạn

dung lượng pic của HPLC

 Ứng dụng:

• Phân tích dược: dùng phân tích dược chất thuộc nhiều nhóm khác nhau

• Phân tích các phân tử sinh học, các đồng phân quang học Thường kết nối CEC với MS và quang phổ [3]

• Ví dụ: CEC với phát hiện huỳnh quang bằng laze đã được nghiên cứu để phân tích tạp chất có tính acid và trung tính trong heroin [54]

Sau khi tách các thành phần, vị trí của các chất không màu có thể được xác định bằng cách xử lý bằng một phản ứng tạo dẫn chất có màu hoặc huỳnh quang Đối với mục đích định lượng tại chỗ có thể được tách cẩn thận, tách rửa với một dung môi thích hợp và sau đó được xác định bằng một phương pháp đủ độ nhạy chẳng hạn như phương pháp đo quang phổ trực tiếp hoặc sau phản ứng hóa học [65]

Ba cơ chế tách chính được sử dụng là pH thấp (trong phân tích các thuốc cơ bản),

độ pH cao (trong phân tích các thuốc có tính acid) và điện di mao quản micellar Các chất phụ thêm vào khác nhau như methanol hoặc ACN, có thể được thêm vào hệ đệm chính để cải thiện tính chọn lọc bằng cách thay đổi độ nhớt và độ phân cực của đệm Kết quả là dòng chảy điện động và sự di động điện di của chất phân tích có thể bị ảnh hưởng Bổ sung cyclodextrins (CDs) có thể cải thiện độ phân giải [11], [57]

Nguyên tắc định lượng tạp chất tương tự như phương pháp chuẩn hóa diện tích trong HPLC [65]

Ưu điểm: Thời gian phân tích giảm, độ bền được cải thiện, giảm các yêu cầu xử

lý mẫu trước và tiết kiệm dung môi hơn so với phương pháp HPLC [11]

b Xác định tạp phân hủy hữu cơ

Định nghĩa: Sản phẩm phân hủy của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn được coi như là sản phẩm biến đổi hóa học được tạo thành trong quá trình sản xuất, phân lập, tinh chế, bảo quản bởi ảnh hưởng của nhiệt, dung môi (bao gồm cả pH cao và pH thấp), tác nhân oxy hóa, các chất phản ứng hóa học khác, độ ẩm, ánh sáng, bao bì,…[38] [17], [50]

Trên cơ sở định nghĩa này, một sự chồng chéo đáng kể có thể được quan sát giữa tạp chất liên quan và sản phẩm phân hủy: các tạp chất liên quan của loại sản phẩm phân hủy thường được hình thành trong quá trình tổng hợp và phân lập nguyên liệu thiết lập chất chuẩn với số lượng lớn [65]

“Phân hủy bắt buộc” là một quá trình liên quan đến sự phân hủy của các các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn ở điều kiện cấp tốc và do đó tạo ra các sản phẩm phân hủy có thể được nghiên cứu xác định sự ổn định của phân tử nguyên liệu thiết lập chất chuẩn [13], [17]

Kết hợp các kỹ thuật sắc ký và quang phổ đã được chứng minh là công cụ có giá trị cho “phân hủy bắt buộc” và ước lượng cho mô tả tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn [72]

3.2.1.2 Các kỹ thuật định lượng tạp vô cơ

Lý do thiết lập giới hạn tạp chất vô cơ một mặt vì độc tính của một số tạp vô cơ (thủy ngân, arsen, hydrazin…) Mặt khác, mức độ của các tạp chất vô cơ trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cũng là một chỉ số đánh giá cho phương pháp sản xuất/ tinh chế [65]

a Xác định tro toàn phần

Theo Dược điển Việt Nam V- PL 9.8:

Tiến hành: Lấy một chén sứ hoặc chén platin nung tới đỏ trong 30 phút Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân Nếu trong chuyên luận riêng không có hướng dẫn gì khác thì lấy 1 g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1h ở 100℃ đến 105℃ rồi đem nung trong lò nung ở 600℃ ± 25℃ Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân Trong quá trình thao tác không được để tạo thành ngọn lửa Nếu sau khi đã nung lâu mà vẫn chưa loại hết carbon của tro thì dùng nước nóng để lấy cắn

ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung Tập trung dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi [5]

b Phương pháp xác định tro sulfat

 Nguyên tắc: Phương pháp sử dụng một quy trình để đo lượng chất còn lại không bay hơi từ mẫu khi mẫu được nung trong sự có mặt của acid sulfuric theo mô tả biện pháp sau đây [5], [80]

 Biện pháp: Bao gồm 2 phương pháp như sau

Phương pháp 1: (Theo Dược điển Việt Nam-PL 9.9, IP-2.3 Sulfated ash)

Nung một chén sứ hoặc một chén platin tới đỏ trong 10 phút, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân Nếu không có chỉ dẫn gì đặc biệt gì trong chuyên luận riêng thì cho 1 g mẫu thử vào chén nung, làm ẩm với acid sulfuric (TT), đốt cẩn thận rồi làm ẩm với acid sulfuric (TT) và nung ở 800℃ Làm nguội rồi cân Nung lại 15 phút, làm nguội rồi cân nhắc lại Lặp lại quá trình này cho đến khi 2 lần cân liên tiếp, khối lượng không chênh nhau quá 0,5 mg [5],[65], [85]

Phương pháp 2: (Theo Dược điển Việt Nam V-PL 9.9, USP 40 <281> residue

on ignition, IP-2.3 Sulfated ash, Ph.Eur-5.6, JP-2.44)

Phương pháp cắn sau nung/tro sulfat sử dụng một quy trình để đo lượng chất còn lại không bay hơi từ mẫu khi mẫu được nung trong sự có mặt của acid sulfuric theo mô

tả dưới đây Phương pháp này thường được sử dụng để xác định hàm lượng các tạp chất

vô cơ trong một chất hữu cơ [80]

Nung một chén nung sứ hoặc platin ở 600℃ ± 50℃ trong 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân Cho vào chén nung một lượng mẫu thử như chỉ dẫn trong chuyên luận và cân Làm ẩm mẫu bằng một lượng nhỏ acid sulfuric (TT) (khoảng 1ml), đốt