NGHIÊN CỨU SỰ SINH TRƯỞNG - PHÁT TRIỂN CỦA SPIRULINA PLATENSIS TRÊN GIÁ THỂ BACTERRIAL CELLULOSE Nguyễn Thế Hưng - Lê Thi ̣Thanh Nhàn Ở Việt Nam, việc thu sinh khối S platensis chủ yếu dừng lại việc sản xuất thức sinh chăn nuôi thủy sản Bài viết đưa dẫn liệu sinh trưởng phát triển S platensis giá thể Bacterial cellulose (BC) Pha tăng trưởng Spirulina platensis từ ngày nuôi cấy thứ sáu đế n ngày thứ 15 Thời điểm để thu sinh khố i đạt hiê ̣u quả kinh tế là vào ngày nuôi cấ y thứ 12 Nhiê ̣t độ tố i ưu cho sự tăng trưởng của tảo là 350C Sử dụng NaHCO3 (16 g/l – 20 g/l) để tạo môi trường Zarrouk là thích hợp nhấ t cho S platensis Lượng sinh khố i S platensis thu được giá thể BC cao môi trường lỏng , giá thể có bổ sung NaHCO3 cao giá thể BC không bổ sung NaHCO3 Không tìm thấ y độc tính sinh khố i S platensis hàm lượng 250 mg/kg và 500 mg/kg thể trọng Trong sinh khớ i S.platensis có N (%) = 9,31 %; Fe = 92,42 mg/100g ; Ca = 21,88 mg/100g, Na = 510,99 mg/100g, K = 871,97 mg/100g, Mg = 9,75 mg/100g Trên giới, Spirulina platensis biết đến loại thực phẩm giàu dinh dưỡng loại dược liệu quí giá[4] Việc sản xuất sản phẩm từ sinh khối S platensis nhiều quốc gia thực cung cấp sản phẩm đa dạng thị trường Tuy nhiên, Việt Nam, việc thu sinh khối S platensis chủ yếu dừng lại việc sản xuất thức sinh chăn ni thủy sản Vì vậy, việc nghiên cứu sinh trưởng S platensis loại giá thể sạch, sinh khối đảm bào tính an tồn, tinh khiết, nhằm tạo tảng cho việc sản xuất chế phẩm phục vụ cho người nhu cầu cấp bách Bài viết đưa dẫn liệu bước đầu sinh trưởng phát triển S platensis giá thể Bacterial cellulose (BC) nhằm tăng hiệu kinh tế việc nuôi cấy tạo sinh khối Ths - Trường THPT Tây Sơn, thành phố Đà La ̣t - tỉnh Lâm Đồ ng 1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu Spirulina platensis thuộc Vi khuẩn lam (Cyanobacteria) Theo khóa phân loại Bergeig (1974), Spirulina platensis thuộc: Chi Spirulina, họ Oscillatoriaceae, Oscillaloriales (Nostocales), lớp Cyanophytacea (Cyanobacteria), ngành Cyanophyta (Cyanocholophyta ) Tuy nhiên, theo số nghiên cứu gần đây, có người lại xếp chúng vào chi Arthrospira, với tên khoa học Arthrospira platensis Trong cơng trình nghiên cứu này, sử dụng chủng giống S platensis viện Công nghệ sinh học Hà Nội cung cấp, chủng giống Acetobacter xylinum cung cáp phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp nuôi cấy Spirulina platensis Pha môi trường Zarrouk bổ sung agar không bổ sung agar, phân vào ống nghiệm có đường kính 18 mm Hấp khử trùng điều kiện 1210C, atm, 30 phút Dùng que cấy vòng vơ trùng lấy dịch nuối cấy, dàn lớp thạch Sau ngày lấy phiến kính khỏi đĩa petri Dùng giấy thầm lau mặt đáy phiến kính Dùng kính đậy lên mặt thạch Quan sát hình thái S.platensis độ phóng đại x10 x40 2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố lên sinh trưởng Spirulina platensis Nuôi cấy S platensis mơi trường ni cấy Zarrouk có thay thành phần muối NaHCO3 muối Na2CO3 K2CO3 Cấy 1ml giống S platensis vào ống nghiệm có chứa 10ml Zarrouk Nuôi cấy S platensis điều kiện nhiệt độ khác Nuôi cấy S platensis nhiệt độ 350C, với thời điểm nuôi cấy khác Nuôi cấy S platensis môi trường khác nồng độ NaHCO3 so sánh với đối chứng (nồng độ 16.8g/l) 2.3 Khảo sát tạo sinh khối Spirulina platensis môi trường lỏng giá thể Bacterial cellulose điều kiện có bổ sung không bổ sung NaHCO3 Cấy 5ml giống S platensis bình erlen có chứa 50ml mơi trường Zarrouk Nuôi cấy nhiệt độ 35 oC 12 ngày Bổ sung 10ml chủng giống hộp nhựa có đựng BC thêm môi trường Zarrouk tủ cấy vô trùng Nuôi cấy tĩnh 32oC 12 ngày, chiếu sáng 10 giờ/ngày Đo pH ban đầu pH thu sinh khối S platensis 2.4 Phương pháp tạo giá thể Bacterial cellulose (BC) Hoạt hoá chủng giống Acetobacteria xylinum cách dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng sang ống nghiệm có chứa 5ml mơi trường nhân chủng Acetobacter xylinum Ni cấy lắc nhiệt độ 32 oC 24 Chuyển giống từ môi trường nhân giống cấp II sang hộp nhựa kích thước 17.5 x 12 x cm để sản xuất BC Nuôi cấy tĩnh nhiệt độ 32 oC Cấy 5ml giống Acetobacter xylinum lên miếng BC Nuôi cấy nhiệt độ 32 oC 12 ngày Cân lượng sinh khối khô thu 2.5 Thu sinh khối S platensis môi trường nuôi cấy lỏng Cấy 5ml giống S platensis bình erlen có chứa 50ml môi trường Zarrouk Nuôi cấy nhiệt độ 35 oC 12 ngày 2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng việc bổ sung NaHCO3 vào môi trường nuôi cấy Bổ sung thường xuyên NaHCO3 vào môi trường nuôi cấy Nuôi cấy lắc S platensis bình erlen chứa 50ml mơi trường Zarrouk nhiệt độ 35oC 24 Bổ sung 10ml chủng giống hộp nhựa có đựng BC thêm môi trường Zarrouk tủ cấy vô trùng Nuôi cấy tĩnh 32oC 12 ngày, chiếu sáng 10 giờ/ngày Đo pH ban đầu pH thu sinh khối S platensis Xác định hàm lượng chất sinh khối S platensis: Hàm lượng đạm tổng số (phương pháp Keljdan), hàm lượng Fe (phương pháp lên màu với sunfo xyanua), hàm lượng Kali, Natri, Magie, Canxi (phương pháp sắc kí ion) 2.7 Kiểm tra độc tính cấp diễn sinh khối Spirulina platensis Chọn chuột nhắt trắng (khoẻ mạnh, không bệnh, lông mượt, nhanh nhẹn), có khối lượng từ 16 - 18g Cho chuột nhịn ăn từ chiều hôm trước Bơm thẳng vào dày chuột 1ml sinh khối S platensis Theo dõi chuột sau 24h 2.8 Phương pháp xử lí kết Các bố trí thí nghiệm lặp lại lần sử dụng phép thử: Phân tích thống kê ANOVA – yếu tố Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Sự tạo thành giá thể BC sau ngày nuôi cấy BC tươi thu có độ ngậm nước cao Trong BC có lượng lớn mơi trường lên men sản phẩm q trình trao đổi chất Do đó, cần phải tiến hành xử lí mẫu sau thu hoạch, nhằm giữ loại bỏ hoàn toàn tạp chất 3.2 Hình thái tế bào sinh sản Spirulina platensis Hình thái S platensis mơi trường Zarrouk có bổ sung agar sau ngày ni cấy: Sợi có kích thước lớn, phân nhánh li ti rễ cây, có màu xanh đậm Trong mơi trường lỏng, kính hiển vi độ phóng đại 10x 40x quan sát thấy sợi mọc lơ lửng, đồng nhất, có màu xanh nhạt Ở độ phóng đại 10x, S platensis có dạng xoắn, ngắn, kích thước khoảng 10-20mm Còn độ phóng đại 40x, tế bào chất có màu đậm hơn, phân biệt rõ tế bào trichome Trên tiêu buồng ấm, sau ngày nuôi cấy, độ phóng đại 40x, thấy trichome có tế bào necridium chuyên biệt (giữ vai trò khởi đầu cho phân đơi trichome) có màu nhạt so với tế bào khác 3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy điều kiện khác lên sinh trưởng S.platensis Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng S.platensis Khi pha mơi trường Zarrouk có thay thành phần muối NaHCO muối Na2CO3 K2CO3, mật độ sinh khối S platensis có biến động Sau 12 ngày nuôi cấy, môi trường sử dụng dung dịch muối NaHCO 3, S platensis có mật độ sinh khối cao (2,87mg/l) Ở môi trường dùng muối Na2CO3, mật độ sinh khối S platensis giảm (2,374 mg/l) Trong môi trường thay muối NaHCO3 K2CO3, S platensis có sinh khối giảm mạnh (1,450 mg/l) (Bảng 1) Bảng 1: Mật độ sinh khối S platensis môi trường Zarrouk, với loại muối khác Mật độ sinh khối Spirulina (mg/l) Muối Lần Lần Lần Trung bình Na2CO3 1,215 2.525 3.382 2,374 K2CO3 1150 1,375 1,820 1,450 NaHCO3 2,725 2,5 2,875 2,7 Ảnh hưởng của nhiê ̣t độ nuôi cấy lên sinh trưởng S platensis Khi nuôi cấy S platensis điều kiện nhiệt độ biến thiên từ nhiệt độ phòng (23 – 25oC) đến 37OC, xác định nhiệt độ thích hợp cho phát triển S platensis 35oC - 37oC (Bảng 2) Bảng Sự phát triển Spirulina platensis điều kiện nhiệt độ khác Mật độ sinh khối Spirulina platensis (mg/l) Nhiệt độ Lần Lần Lần Trung bình Nhiệt độ phòng (23 – 250C) 1,365 1,412 1,39 0,389 28 0C 1,745 2,016 2,275 2,012 32 0C 2,32 2,413 2,392 2,375 35 0C 2,706 2,914 2,81 2,810 37 0C 2,512 2,49 2,606 2,536 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng S platensis Tính từ nuôi cấy, S platensis tăng trưởng từ ngày thứ đến ngày thứ Từ ngày thứ đến ngày thứ 12, S platensis tăng trưởng nhanh Ở ngày, thứ 12, mật độ sinh khối S platensis đạt cao (2.524 mg/l) Pha tăng trưởng S platensis xác định từ ngày nuôi cấy thứ đến ngày 15 Tuy nhiên, để đạt hiệu kinh tế, nên bắt đầu thu sinh khối S platensis vào ngày thứ 12 (Bảng 3) Bảng 3: Sự sinh trưởng Spirulina platensis theo thời gian nuôi cấy Thời gian (Ngày) 01 03 06 09 12 15 Mật độ sinh khối Spirulina platensis (mg/l) Lần Lần Lần Trung bình 0,846 1,120 1,055 1,007 1,324 1,432 1,411 1,389 1,817 1,905 1,771 1,831 2,074 1,931 2,040 2,015 2,476 2,605 2,491 2,524 2,514 2,528 2,518 2,520 Ảnh hưởng nồng độ NaHCO3 lên sinh trưởng S platensis Sau 12 ngày nuôi cấy, S platensis phát triển tốt mơi trường có nồng độ NaHCO3 từ 16g/l đến 32g/l Ở mơi trường có nồng độ NaHCO3 12g/l, S platensis phát triển yếu (Mật độ sinh khối 0,982 - 1,872 mg/l) Mặc dù nồng độ muối NaHCO3 mơi trường có độ biến thiên lớn, giá trị pH đo không thay đổi nhiều (pH: 8,0 – 8,6) Điều có nghĩa là, mật độ sinh khối S platensis thu phụ thuộc vào nồng độ NaHCO3 Giá trị pH môi trường tỉ lệ hai muối HCO3- CO32- định Bảng 4: Ảnh hưởng nồng độ NaHCO3 đến sinh trưởng S platensis Mật độ sinh khối Spirulina platensis (mg/l) Trung Lần Lần Lần pH bình 0,977 0,992 0,977 0,982 8,0 1,312 1,246 1,309 1,289 8,0 1,831 1,344 1,246 1,507 8,1 12 1,989 1,785 1,842 1,872 8,2 16 2,206 2,403 2,387 2,332 8,3 16,8 2,376 2,42 2,446 2,414 8,3 20 2,238 2,49 2,474 2,326 8,3 24 2,211 2,198 2,191 2,200 8,5 28 2,175 2,065 2,102 2,114 8,6 32 2,088 2,104 2,814 2,002 8,6 Sự tạo thành số lượng khối S platensis giá thể Bactenial cellulose Nồng độ NaHCO3 (g/l) Hình 1: Sinh khối Spirulina platensis tạo giá thể BC Bảng : Kết tạo sinh khối Spirulina platensis giá thể BC Nghiệm thức I II III Lượng sinh khối Spirulina platensis (mg/l ) Trung Lần Lần Lần bình 107,36 111,41 119,33 112,7 131,1 126,4 127,7 128,4 88,73 90,7 91,17 90,2 pH môi trường Khi thu Ban đầu sinh khối 8,5 8,6 8,5 9,1 8,5 8,7 Lượng sinh khối S platensis thu giá thể BC cao môi trường lỏng Trong nghiệm thức, mơi trường BC có bổ sung NaHCO3, lượng sinh khối S platensis cao (128,4mg/l) Trong môi trường nuôi cấy lỏng, bề mặt tiếp xúc với ánh sáng hẹp, nên có S platensis nằm gần bề mặt có điều kiện tiếp xúc với ánh sáng để quang hợp Trên giá thể BC, có bề mặt rộng, S.platensis có điều kiện nhận nhiều ánh sáng để phát triển mạnh Ngoài ra, giá thể BC có khả giữ nước tốt thành phần khoáng chất dinh dưỡng thấm BC đảm bảo cung cấp chất dinh dưỡng, cho S platensis Hình 2: Sinh khối Spirulina platensis tạo môi trường nuôi cấy lỏng (phải) đối chứng (trái) Hàm lượng Nitơ tổng số có sinh khối Spirulina platensis Sau thực phân tích mẫu S.platensis thu phương pháp Kjedahl Ta có: Nitơ tồn phần (g/100g) = (0.0014.n.100) / P Trong đó, n: Số mol H2SO4 0.1N P: Trọng lượng mẫu thử (g) Trọng lượng mẫu thử 0,1503 g → Nitơ toàn phần (g/100g) = (0.0014.n.100) / P = (0.0014.0,1.100 )/ 0,1503 = 9,31 % Hàm lượng Fe tổng số có sinh khối Spirulina platensis: Hình 3: Biểu đồ hàm lượng Fe sinh khối S platensis Hàm lượng Ca, Na, K, Mg tổng số sinh khối Spirulina platensis thống kê Bảng Bảng 6: Hàm lượng Ca, Na, K, Mg tổng số sinh khối Spirulina platensis TT Chỉ tiêu Hàm lượng mg/100g PP thử Natri (Na) 510,99 Sắ c kí ion Kali (K) 871,97 Sắ c kí ion Magie (Mg) 9,75 Sắ c kí ion Calci(Ca) 21,88 Sắ c kí ion Kết kiểm tra độc tính cấp diễn có sinh khối S platensis Kiểm tra độc tính cấp diễn có sinh khối S platensis cách bơm thẳng vào dày chuột 1ml sinh khối S platensis, theo dõi chuột sau 24h Kết cho thấy, không tim ̀ thấ y đô ̣c tiń h ở hàm lươ ̣ng 250 mg/kg và 500 mg/kg thể tro ̣ng sinh khố i S platensis thu đươ ̣c (Bảng 7) Bảng 7: Kết kiểm tra độc tính cấp diễn có sinh khối S platensis Liều lượng (mg/kg) Số chuột sống Số chuột chết 250 500 Kết luận 1) Khoảng thời gian Spirulina platensis đa ̣t pha tăng trưởng từ ngày thứ sáu đế n ngày thứ 15 Thời điể m để thu sinh khố i đa ̣t hiê ̣u quả kinh tế vào ngày nuôi cấy thứ 12 Nhiê ̣t đô ̣ tố i ưu cho sự tăng trưởng của tảo là 350C NaHCO3 dùng pha môi trường Zarrouk là thić h hơ ̣p nhấ t cho sự sinh trưởng của S platensis, với nồ ng đô ̣ từ 16 g/l – 20 g/l Lươ ̣ng sinh khố i S platensis thu đươ ̣c giá thể BC cao môi trường lỏng, giá thể có bổ sung NaHCO cao giá thể BC không bổ sung NaHCO3 2) Không tìm thấ y đô ̣c tính ở hàm lươ ̣ng 250 mg/kg và 500 mg/kg thể tro ̣ng sinh khố i S platensis thu đươ ̣c - Hàm lượng đạm tổng số có sinh khố i S.platensis 9,31 % - Hàm lượng chất khoáng Fe; Ca; Na; K; Mg tương ứng có sinh khối S platensis 92,42; 21,88; 510,99; 871,97; 9,75 (mg/100g) Tài liệu tham khảo Nguyễn Hữu Thước (1988), Tảo Spirulina nguồn dinh dưỡng dược liệu quý, NXB Khoa học Kỹ thuật, H Nguyễn Thúy Hương, Phạm Thành Hổ (2003), ―Chọn lọc dòng Acetorbacter xylinum thich hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn”, Tạp chí di truyền ứng dụng, số 3,Tr 49 Bonnin G., 1991 — The development of Micro-Algae (Spirulina) Production in Bangladesh — Terminal statement prepared for the Ministry of Education Sciences and Technology of the People's Republic of Bangladesh US6698134 : Method of cultivating fresh spirulina at home and device thereof – Phương pháp nuôi cấy tảo Spirulina nhà dụng cụ Summary RESEARCH ON THE GROWTH AND DEVELOPMENT OF SPIRULINA PLATENNIS ON THE BACTERIAL CELLULOSE In Vietnam, collecting the biomass of S platennis mainly stop at producing food used for marine animals This paper offers some details about the growth and developmant of S platennis on Bacterial Cellulose (BC) Growth phase of S platennis is between the sixth and fifteenth day of feeding The time for effective collection of biomass is the twelfth day The ideal temperature for the growth of Algae is 35oC Using NaHCO3 (16g/l – 20g/l) for creating the Zarrouk environment is most suitable for S platennis The biomass of S platennis collected on BC is higher than that on liquid environment, on NaHCO3-complemented host higher than on non-NaHCO3 environment No toxication was found in case of 250mg and 500mg of S platennis collected per 1kg of host In the biomass of S.platennis we found the percentage of N is 9,31 %; Fe = 92,42 mg/100g ; Ca = 21,88 mg/100g, Na = 510,99 mg/100g, K = 871,97 mg/100g, Mg = 9,75 mg/100g Keywords: Cyanobacteria, Spirulina platensis, biomass, Bacterial Cellulose 10 ... Sự tạo thành số lượng khối S platensis giá thể Bactenial cellulose Nồng độ NaHCO3 (g/l) Hình 1: Sinh khối Spirulina platensis tạo giá thể BC Bảng : Kết tạo sinh khối Spirulina platensis giá. .. lên sinh trưởng S platensis Tính từ ni cấy, S platensis tăng trưởng từ ngày thứ đến ngày thứ Từ ngày thứ đến ngày thứ 12, S platensis tăng trưởng nhanh Ở ngày, thứ 12, mật độ sinh khối S platensis. .. NaHCO3 lên sinh trưởng S platensis Sau 12 ngày nuôi cấy, S platensis phát triển tốt mơi trường có nồng độ NaHCO3 từ 16g/l đến 32g/l Ở mơi trường có nồng độ NaHCO3 12g/l, S platensis phát triển yếu