TAP CHÍ K H O A H Ọ C OHQGHN KHTN &CN T XX sỏ' 2PT 2004 N G H I Ê N C Ứ U Đ Ặ C T Í N H C Ủ A C Á C IS O Z Y M P H O T P H A T A Z A A X IT T R O N G T I N H D Ị C H N G Ư Ờ I, Ứ N G D Ụ N G C H O X É T N G H I Ệ M P H Á P LÝ L ê T rọ n g V ă n , N ghiêm X u â n D ũ n g Cục K ỹ th u ậ t Hóa sinh tài liệu nghiệp vụ, Bộ C ông An Đ ỗ N gọc L iên K hoa S in h học, Trường Đại học Khoa học T ự n hiên, Đ H Q G H N M đ ầ u Trong khoa học pháp lý, việc xác định xác nguồn gô’c m ột số loại dấu vết sinh học cỏ ý nghĩa đặc biệt quan trọng Công việc đòi hỏi phải có phương pháp xác dịnh chuẩn xác, độ tin cậy cao thòi gian xác định n h an h chóng đê tìm chứng khoa học cho vụ án hình Hiện nước ta, công việc nghiên cửu vể đặc tính hóa sinh tinh dịch người dấu vết tinh dịch phục vụ cho ng àn h khoa học pháp lý gặp khỏ khăn Isozym photphataza axit (ACP, EC 3.1.3.2) có nguồn gốc từ tuyến tiền liệt đặc trưng cho tinh dịch, có hàm lượng hoạt độ rấ t cao, h o ạt tính khó phát huyết th an h người khỏe trưởng thành [3,4,5] Do đó, ngồi kháng ngun PSA (Prostatic specific Antigen) tiế t từ tuyến tiền liệt, isozym ACP có thè coi chi thị hóa sinh đặc trư ng cho tinh dịch người [2,8], Xuất p h át từ yêu cầu thực tế, tiến hành nghiên cứu biểu đặc tinh isQzym photphataza ax it từ tinh dịch người ỏ điểu kiện môi trường khác kỹ th u ậ t điện di isozym photphataza ax it gel polyacrylam it m ột số kỹ th u ậ t hóa sinh khác N g u y ê n liệ u v p h n g p h p 42 mầu tinh dịch lấy từ bệnh viện c , khoa T ế bào học, trường Đại học Y Hà Nội số người khỏe tình nguyện khác Thể tích m ẫu từ 1,8 - 2,5 ml, mẫu lấy từ người khỏe có độ tuổi từ 23 đến 30, 22 mẫu từ người có độ tuổi từ 31 đến 40 11 m ẫu từ người có độ tuổi từ 41 đến 48 tuổi M âu huyết th an h m ột s ố bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt đă xét nghiệm lảm sàng lấy từ Bệnh viện U ng th T rung ương (Viện K Hà Nội), mẫu huyết th an h ngưòi khỏe trưỏng thành lấy từ Viện H uyết học T ruyền máu T rung ương T ất m ẫu tinh dịch huyết dược ph ân tích sau láy mẫu, dược báo quán dông lạnh - 70°c sử dụng Xác định hoat độ photphataza ax it m ẫu tin h dịch vả hu y ết th an h theo phương pháp B odansky mô tả tài liệu [1,2,4] Điện di phân tích biểu isozym photphataza ax it từ tinh dịch huyết theo phương pháp M anchenko mó 196 Nghicn cứu tlãc linh cua isOẠin pholphataza axil 197 tá [6] Các th iết bị máy điện di, nguồn hóa chất m ua hãng có uy tín BIORAD SIGMA K ế t q u a v t h ả o lu ậ n 3.1 Định lượng hoạt độ h a ta za a xit m ẫu tin h d ịch huyết Kết xác định hoạt dộ photphataza ax it từ tinh dịch người cho thấy, hoạt độ trung bình m ẫu tinh dịch người ỏ nhóm tuổi từ 23 • 30 658,09, đơn vị Bodansky (U.B), ỏ nhóm tuổi từ 31 - 40 546,95 U.B â nhóm tuổi từ 41 đến 48 663,50 U,B Nhìn chung, hoạt độ photphataza axit từ tinh dịch ngưòi nhóm tuổi nam giới nghiên cứu cho thấy có biến động tương đối rộng từ 79,4 U.B đến 1.371 U.B H oạt độ trung bình ACP nhóm tuổi 538,6 U.B Tuy nhiên nhóm tuổi chênh lệch hoạt độ trung bình ACP khơng th ể rõ rệt Mặc dù nhóm tuổi hoạt độ ACP số cá thổ biểu thấp, cụ th ể khoảng 200 Ư.B chiếm 11,9% tổng sơ' cá ba nhóm T uy nhiên hoạt độ ACP tinh dịch ngưòi dù mức độ th ấp n h ấ t cao gấp 200 lần so với hoạt độ ACP huyết th an h người khỏe binh thường Diều chứng tỏ hoạt độ photphataza axit tinh dịch người dấu hiệu dễ p h át mô tế bào người Đặc tính nhác tối cơng trình nghiên cửu trước tác giả Closkey cộng [2], Schiff [7] (xem biểu dồ cột) Hình Biểu đồ so sánh hoạt độ ACP cùa tinh dịch (1,2,3) huyết (4) cùa người khoẻ trường thành Giải thích đồ thị ỏ 3.2 Biêu p h ố điện d i isozym photphataza axit tin h dịch huyết C húng tiến hàn h lựa chọn điều kiện chạy điện di gel polyacrylam it ỏ nồng độ gel pH khác nh au isozym photphataza ax it từ tinh dịch huyết người khỏe trưởng thành Kết phân tích cho thấy, nồng độ gel polyacrylam it 7,5%, pH 8,6, băng isozym photphataza axit biểu rõ riêng băng isozym ACP chạy chậm không thấy rõ Trái lại hai băng isozym ACP chạy nhanh (dược Lé Trọng Văn Nghiém Xuân Dũng Đ ổ Ngọc Liôn đánh sỗ' A pl Ap2 theo quy ước quốc tê) gần nh biểu rõ trê n điện di đồ, tăng lượng m ẫu phân tích (hình 2, ảnh điện di đồ 1) Khi thay đổi điều kiện điện di pH 7,8, nồng đồ gel polyacrylam it 8,5%, phát bảng isozym ACP từ tinh dịch người đánh sô' Ap 1, Ap 2, Ap 3, Ap 4, Ap băng Ap 3, 4, chạy chậm hơn, băng Ap 1, chạy nh an h Điều đáng ý băng chạy n h an h Ap Ap có hoạt độ rấ t cao, ln ln biểu rấ t rõ tinh dịch người tấ t m ẫu phân tích (hình 3, ảnh điện di đổ 2) Hình Ánh điện di đổ mẫu tinh dịch ngưòi dược điện di gel polyacrylamit 7,5%; pH 8,6 (giếng 1,2,3,4,5 thể tách tra mẫu, riêng giếng lượng thể tích tra mẫu tăng gấp đơi) I Hình Anh diện di đồ phân tích isozym ACP từ mẫu tinh dịch ngưòi gel polyacrylamit 8,5%, pH 7,8 (giải thích bài) Kết trê n cho thấy rằng, isozym ACP từ tinh dịch người rấ t dễ p h át kỹ th u ậ t điện di isozym ACP, nồng động gel polyacrylam it 7,5 + 8,5% điểu kiện pH từ tru n g tính đến kiềm Do phương pháp điện di isozym ACP kỹ th u ậ t cho phép phát dặc hiệu, nhanh chóng nhậy đơì vối băng isozym ACP tinh dịch người Nghiên cứu dặc tính cùa isozvm pholphataza axil 199 Khi so sánh phổ điện di isozym ACP từ tinh dịch, hu y ết th a n h người bình thường huyết th an h bệnh nhân ung th tuyến tiền liệt, n h ận th isozym ACP huyết th an h người bình thường bệnh nh ân un g thư tuyến tiền liệt luôn biểu băng chạy nh an h Ap Ap Thêm vào nghiên cứu King - Am strong [4] cho biết hoạt độ p h otphata 2a ax it :ổng số từ huyết th an h ngưòi bình thường từ - đơn vị King - Am strong (U.K.A)/100 ml huyết th an h v tăn g lên từ 50 - 250 lần bệnh nh ân ung th tuyến tiền liệt di căn, 90% h o ạt độ biểu photphataza axit với axit xitric Nhờ kỹ th u ậ t điện diện di isozym ACP p h t băng isozym ACP chạy nhanh từ huyết th an h người bình thưòng bệnh lý củng không p h t rõ băn g isozym ACP chạy chậm T rong tin h dịch người điện di so sánh luôn x u ất từ - băng isozym ACP đặc b iệt biểu rõ băng Ap 1, Ap (hình ảnh điện di đồ 3) Ap5 Ap4 Ap3 Ap2 A pl Hình Ánh điện di đổ gel polyacrylamit 8,5%; pH 7,8 cho biết phố điện di mẫu tinh dịch (1,2,3) mẫu huyết người bình thường (4) huyết bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt (5) (giải thích bài) 3.3 M ột sơ' tín h c h ấ t củ a isozym p h o h a ta za a x it từ tin h d ịch Hình Đồ thị biểu diễn hoạt độ ACP bị giảm rấ t nhanh xử lý tinh dịch nhiệt độ 55°c thòi gian từ ■phút Lẽ Trọng Vãn Nghiém Xuũn Dũng D ỏ Ngọc Liên C húng tiến hàn h khảo s t hoạt độ isozym ACP â diều kiện 55°c (là mơ hình nhiệt độ tinh dịch có th ể bị phơi ngồi tròi nắng gắt dễ gặp thực tê th u thập m ẫu phân tích), m ẫu tinh dịch thấm vải vài ngày ỏ n h iệt độ phòng (30 - 35°C) Kết phân tích cho thấy m ẫu tinh dịch bị xủ lý ỏ nhiệt độ 55", hoạt độ ACP bị giảm r ấ t nhanh sau phút thí nghiệm (còn lại 39 - 40% hoạt độ) sau phút hoạt độ chì lại õ - 6% (hình 5, đồ thị 1) Khi phân tích điện di isozym ACP diều kiện lựa chọn tin h dịch thấm vải sau ngày để ỏ nhiệt độ phòng, chúng tơi phát đuợc băng isozym ACP chạy nhanh Ap 1, Ap m ẫu vải th í nghiệm Phân tích so sánh với mẫu tinh dịch tươi điểu kiện điện (hình 6, ảnh điện di đồ 4) Hình Ảnh điện di đồ isozym ACP từ tinh dịch (1) từ tinh dịch thấm vải người bình thường (2) huyết bệnh nhân ung thư tuyết tiền Hệt sau (3) K ết lu ậ n Hoạt độ isozym ACP từ tinh dịch người có biến động tương đôi rộng từ 79,4 Ư.B đến 1.351 U.B đuợc phản tích 42 cá th ể thuộc vể nhóm tuổi khác vã có trị sơ trung bình 538,6 U.B số cá th ể có trị sơ' 200 U.B chiếm 11,9% tổng số cá thê phân tích Phổ điện isozym ACP từ tinh dịch người cá th ể khác nh au đểu biểu rõ từ - băng isozym ACP đặc biệt băng isozym chạy nhanh Ap Ap tiến hành phản tích kỹ th u ậ t điện di gel polyacrylam it 8,5%, pH 7,8 Các isozym ACP r ấ t bền nhiệt độ cao ỏ pH kiềm , có th ể p h át dễ dàng hoạt tính băng isozym chạy nh an h Ap Ap từ tinh dịch thấm vải sau ngày kỷ th u ậ t điện di gel polyacrylam it kỹ th u ật hóa sinh định lượng định tính khác Nghiên cứu dặc lính iso/ym phoiphataza axil 201 TÀILIỆUTHAMKHẢO Nguyền Vãn Mùi, Xác định hoạt độ enzym, NXB Khoa học kỹ th u ật Hà Nội, 2001, tr 304 Closkey MC., Muscillo KL., Noordewier B., Prostatic acid phophatase activity in postcoiltal vagina Journal o f forensic science, Vol 20 1975, pp 630 - 636 Goldsberg A F., Takakura K., Rosenthal R L., Electrophoretic separation of serum acid phosphatase isozyme in Gaucher's disease, prostatic carcinoma and multiple myeloma, Clin Chem, Vol 19, (10) 1973, pp 316 - 318 King, E J., Jegatheesan X A A method for the determ ination of tartrate labile, prostatic acid phosphatase in serum Journal o f Clinical Pathology, (12) 1959, pp 85 - 87 Lam, K w , Li, 0-, Li, CY., Yam, L.T Biochemical properties of hum an prostatic acid phosphatase Clinical Chemistry, Vol 19, (5) 1973 pp 20 - 22 Manchenko GP., Handbook o f detection o f enzymes on Electrophoresis, CRC Press, 1994 Mary - Elen c s., Michol L c , Robert J s s High sensitivity of Phenolphatalein monophosphate in detecting acid phosphatase isozymes, Analytical Biochemistry 64, 1975, pp 316 - 318 Schiff, A F., Reliability of acid phosphatase test for the identification of seminal fluid Journal o f forensic science, Vol 23, 4, 1978, pp 833 - 844 VNU JOURNAL OF SCIENCE Nat., Sci., A Tech T.xx N„2AP., 2004 S T U D Y O N P R O P E R T I E S O F A C ID P H O S P H A T A S E IS O Z Y M E S FR O M H U M A N S E M E N F O R U S IN G T O F O R E N S IC A N L Y S IS L e T ro n g V an, N g h iem X u a n D u n g M inistry o f Public Security Do N goc L ie n D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U Some properties of acid phosphatase isozymes from hu m an sem en were studied by gel polyacrylam ide electrophoresis technique and by qu an titativ e analysis R esults obtained showed that: - Activity of ACP from hum an semen was varied widely from 79.4 U.B to 1351 U.B and has average value to be 538.6 U.B analyzed from th e sem ens of 42 subjects belonging to three different age groups The subjects having ACP activity value sm aller th an 200 U.B were 11.9% - S pectrum of ACP isozymes from hum an sem en analyzed by polyacrylam ide gel electrophoresis w as showed to be five ACP isozyme bands, especially p id running isozymes Ap 1, Ap R esults showed th a t ACP isozymes from hum an sem en is not stable a t high tem perature (55"C), b u t ACP activity after for th ree days a t 30 - 35°c room tem perature was still revealed by polyacrylam ide gel electrophoresis and by other specific biochemical analysis, ... tru n g tính đến kiềm Do phương pháp điện di isozym ACP kỹ th u ậ t cho phép phát dặc hiệu, nhanh chóng nhậy đơì vối băng isozym ACP tinh dịch người Nghiên cứu dặc tính cùa isozvm pholphataza... phân tích isozym ACP từ mẫu tinh dịch ngưòi gel polyacrylamit 8,5%, pH 7,8 (giải thích bài) Kết trê n cho thấy rằng, isozym ACP từ tinh dịch người rấ t dễ p h át kỹ th u ậ t điện di isozym ACP,... Hình Ảnh điện di đồ isozym ACP từ tinh dịch (1) từ tinh dịch thấm vải người bình thường (2) huyết bệnh nhân ung thư tuyết tiền Hệt sau (3) K ết lu ậ n Hoạt độ isozym ACP từ tinh dịch người có biến