DSpace at VNU: Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc kí

DSpace at VNU: Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc kí tài liệu, giáo án, bài giảng...

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ THỊ HƯƠNG QUỲNH

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI

RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ THỊ HƯƠNG QUỲNH

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang đã giao đề tài, chỉ dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm

An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia , các anh chị trong Khoa chất lượng phụ gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm - Viê ̣n Kiểm nghiê ̣m an toàn vê ̣ sinh thực phẩm Quốc gia đã quan tâm , giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình , bạn bè đã luôn bên cạnh chia sẻ khó khăn , đô ̣ng viên và giúp đỡ tôi trong ho ̣c tâ ̣p cũng như trong cuộc sống

Do thời gian thực hiê ̣n đề tài có ha ̣n nên không tránh những thiếu sót , rất mong nhâ ̣n được ý kiến đóng góp của thầy cô và các ba ̣n để luận văn này được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015

Học viên

Vũ Thị Hương Quỳnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 1.1 Giới thiệu chung về anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.1 Cấu trúc hóa học của anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.2 Tính chất của anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.3 Tác dụng của anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.4 Sự phân bố của anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.2 Một số phương pháp xác định anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.2.1 Phương pháp pH vi sai Error! Bookmark not defined 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 2.1 Mục tiêu Error! Bookmark not defined 2.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị Error! Bookmark not defined 2.4.1 Chất chuẩn Error! Bookmark not defined 2.4.2 Hoá chất Error! Bookmark not defined 2.4.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.5 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.6 Thẩm định phương pháp Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT

DEFINED

3.1 Tối ưu các điều kiện xác định anthocyanin trên hệ thống HPLC Error!

Bookmark not defined

3.1.1 Chọn detector Error! Bookmark not defined 3.1.2 Chọn bước sóng phát hiện Error! Bookmark not defined 3.1.3 Chọn cột tách Error! Bookmark not defined

3.1.4 Chọn thể tích bơm mẫu Error! Bookmark not defined 3.1.5 Khảo sát thành phần pha động Error! Bookmark not defined 3.1.6 Khảo sát nồng độ axit trong pha động Error! Bookmark not defined 3.1.7 Khảo sát chương trình rửa giải Error! Bookmark not defined 3.1.8 Khảo sát tốc độ pha động Error! Bookmark not defined 3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân Error! Bookmark not defined

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân Error! Bookmark not defined

3.2.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu Error! Bookmark not defined 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc Error! Bookmark not defined 3.3.2 Khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined 3.3.3 Độ lặp lại Error! Bookmark not defined 3.3.4 Độ thu hồi Error! Bookmark not defined 3.4 Ứng dụng phương pháp xác định anthocyanin trong một số rau củ Error!

Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO 9 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin Error! Bookmark not defined

Bảng 1.2: Thông tin chung về 3 chất nghiên cứu Error! Bookmark not defined

Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng có trong một số mẫu thực vật tại Việt Nam

[7] Error! Bookmark not defined

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của cột tách đến độ rộng đáy pic (W) và thời gian lưu (tR)

Error! Bookmark not defined

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) của del, cya, pel Error! Bookmark not defined Bảng 3.3: Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng Error! Bookmark not defined

Bảng 3.4: Chương trình gradient 1 Error! Bookmark not defined Bảng 3.5: Chương trình gradient 2 Error! Bookmark not defined Bảng 3.6: Chương trình gradient 3 Error! Bookmark not defined Bảng 3.7: Chương trình gradient 4 Error! Bookmark not defined Bảng 3.8: Ảnh hưởng của chương trình gradient đến hệ số đối xứng pic Error! Bookmark not defined

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thơi gian lưu và chiều cao pic Error! Bookmark not defined

Bảng 3.10: Hàm lượng các chất theo thời gian thủy phân Error! Bookmark not defined

Bảng 3.11: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau Error! Bookmark not defined

Bảng 3.12: Hàm lượng các chất tại các tỷ lệ dung môi chiết khác nhau Error! Bookmark not defined

Bảng 3.13: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất Error! Bookmark not defined

Bảng 3.14: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường chuẩn

của 3 anthocyanin Error! Bookmark not defined Bảng 3.15: Độ lặp lại trên nền mẫu bắp cải tím Error! Bookmark not defined Bảng 3.16: Độ lặp lại trên nền mẫu khoai lang tím Error! Bookmark not defined Bảng 3.17: Độ thu hồi trên nền mẫu rau dền đỏ Error! Bookmark not defined

Bảng 3.18: Độ thu hồi trên nền mẫu củ dền Error! Bookmark not defined Bảng 3.19: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất phân tích Error! Bookmark not defined

Bảng 3.20: Kết quả phân tích một số mẫu rau củ Error! Bookmark not defined

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin Error! Bookmark not defined Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH Error! Bookmark not defined.

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Error! Bookmark not defined Hình 3.1: Phổ hấp thụ của delphinidin Error! Bookmark not defined Hình 3.2: Phổ hấp thụ của cyanidin Error! Bookmark not defined Hình 3.3: Phổ hấp thụ của pelargonidin Error! Bookmark not defined Hình 3.4: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với cột sắc kí 1 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.5: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với cột sắc kí 2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.6: Sắc ký đồ rửa giải các anthocyanin với thành phần pha động là nước và

ACN Error! Bookmark not defined Hình 3.7: Sắc ký đồ del, cya tại các nồng độ axit trifloaxetic khác nhau Error! Bookmark not defined.

Hình 3.8: Sắc ký đồ của hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 1

Error! Bookmark not defined Hình 3.9: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.10: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 3 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.11: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 4 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.12: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau (60, 90,

120, 150 phút) Error! Bookmark not defined Hình 3.13: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau Error! Bookmark not defined.

Hình 3.14: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2 N trong dung môi chiết mẫu

Error! Bookmark not defined Hình 3.15: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp Error! Bookmark not defined.

Hình 3.16: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin Error! Bookmark not defined.

Hình 3.17: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin được thêm chuẩn hỗn

hợp Error! Bookmark not defined.

Hình 3.18: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

delphinidin Error! Bookmark not defined.

Hình 3.19: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

cyanidin Error! Bookmark not defined.

Hình 3.20: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

pelargonidin Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức

HPLC High performance liquid

HPTLC High performance thin layer

chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

ppm Parts per million Phần triệu

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

nhiễu

MỞ ĐẦU

Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng

ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y Những nghiên cứu tìm hiểu

về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe con người đang ngày càng phát triển

Chất chống oxy hóa là những “chiến binh tốt” chống lại các chất độc hại - các gốc tự do Chúng được hình thành một cách tự nhiên như là một sản phẩm phụ của quá trình sống liên quan tới oxy Các chất chống oxy hóa có khả năng giải phóng ra những điện tử, chúng vô hiệu hóa khả năng oxy hóa của các gốc tự do và ngăn chặn chúng tấn công các tế bào khỏe mạnh Để bảo vệ chính mình, cơ thể luôn tự sản sinh ra các cơ chế chống oxy hóa thiết yếu, nhưng với thời gian chúng dần trở nên kém hiệu quả theo tuổi tác Đây là lý do tại sao mà việc sử dụng các chất chống oxy hóa cũng như các thực phẩm chứa chất chống oxy hóa là rất quan trọng [3], [11] Ngày nay, thức ăn không chỉ đảm bảo đủ calo, ngon, sạch, mà còn phải chứa các hoạt chất sinh học tự nhiên cần cho sức khoẻ và sắc đẹp, không chỉ điều khiển được các chức năng hoạt động của từng bộ phận trong cơ thể, tạo cho con người khả năng miễn dịch cao, chống sự lão hoá, tăng tuổi thọ, mà còn giúp phòng chống được một số bệnh, kể cả ung thư Theo các nghiên cứu thì các hợp chất anthocyanin

có các hoạt tính rất tốt như: chống viêm, chống xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung thư, thúc đẩy hình thành cytokin điều hòa phản ứng miễn dịch,

có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh [21], [22], [28]

Trên thế giới đã có nhiều quy trình xác định hàm lượng tổng anthocyanin hay hoạt chất nhóm anthocyanin bằng các kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS, HPTLC,

LC-MS [17], [24], [31] Tại Việt Nam cũng công bố một số nghiên cứu xác định hàm lượng anthocyanin trong thực vật hay thực phẩm [2], [7] Hầu hết các phương pháp

phân tích này xác định anthocyanin tổng bằng phương pháp UV-VIS có độ chính xác không cao Việc phân tích riêng lẻ từng hợp chất trong nhóm anthocyanin trong đối tượng mẫu thực vật là cơ sở để đánh giá hoạt tính chống oxy hoá của từng chất trong nhóm, đề xuất nguồn nguyên liệu cho chế biến thực phẩm chức năng Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đề tài:

“Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc ký”

Với các mục tiêu sau đây:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

2 Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng phân tích một số mẫu rau trên thị trường

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1 Trần Tử An (2007), Hóa phân tích - tập 2 - Phân tích dụng cụ, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội

2 Huỳnh Thị Kim Cúc, và cộng sự (2004), "Xác định hàm lượng Anthocyanin

trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai", Tạp Chí Khoa

Học và Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 3(7), 47-54

3 Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư (2009), "Stress oxy hóa và các chất chống oxy

hóa tự nhiên", Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(5), 667-677

4 Trần Từ Hiếu và cộng sự (2003), Hoá học phân tích, Nhà xuất bản đại học quốc

gia Hà Nội, Hà Nội

5 Nguyễn Thị Hiển, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Loan (2012), “Nghiên cứu chiết tách Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus sabdariffa” - Ứng dụng để sản

xuất giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm, Tạp chí Khoa học và

phát triển 2012, 10(5), 738-746

6 Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên (2006), "Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng chiết tách chất màu Anthocyanin có độ màu cao từ quả

dâu Hội An", Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 44, 71-76

7 Phạm Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Hữu Cường và Lê Trần Bình (2011), "Tách

chiết và phân tích hàm lượng Anthocyanin trong các mẫu thực vật khác nhau",

Tạp chí Sinh Học, 33(4), 79-85

8 Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Bài giảng Đại học Khoa học Tự

Nhiên – ĐHQGHN

9 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi

sinh vật, Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật

Tiếng Anh

10 Antonieta Ruiz (2013), "Anthocyanin profiles in south Patagonian wild berries

by HPLC-DAD-ESI-MS/MS", Food Research International, 51, 706–713

11 Betteridge D J (February, 2000), "What is oxidative stress?", Metabolism,

49(2), 3-8

12 Bhornchai Harakotr., et al (2014), "Anthocyanins and antioxidant acitivity in

coloured waxy corn at different maturation stages", Journal of functional foods,

9, 109-118

13 Bridle P and Timberlake C.F (1996), "Anthocyanins as natural food

colors-selected aspects", Food Chemistry, 58, 103-109

14 Cheynier V., Gómez C and Ageorges A (2012), "Flavonoids: Anthocyanins",

In Fidel Toldra Leo M.L Nollet, editor, Handbook of Analysis of Active

Compounds in Functional Foods, 379-397

15 Cretu G.C and Morlock G.E (1 March 2014), "Analysis of Anthocyanins in powdered berry extracts by planar chromatography linked with bioassay and

mass spectrometry", Food Chemistry, 146, 104-112

16 Korte G Dreiseitel A., Schreier P., et al (2009), "Berry Anthocyanins and their

aglycons inhibit monoamine oxidases A and B", Pharmacol Res, 59(5), 306-311

17 Durst R.W and Wrolstad R.E (2001), "Separation and Characterization of

Anthocyanins by HPLC", Current Protocols in Food Analytical Chemistry,

F1.3.1-F1.3.13

18 Francesca Leri., et al, (2012), "Simultaneous determination of Anthocyanins, coumarins and phenolicaxits in fruits, kernels and liqueur of Prunus mahaleb

L", Food Chemistry, 135, 2157-2162

19 Fossen T and Andersen M (2000), "Anthocyanins from tubers and shoots of

the purple potato, Solanum tuberosum", J Ilort Sci Biotech, 75, 360-363

20 Hybertson B.M., et al (2011), "Oxidative stress in health and disease: The

therapeutic potential of Nrf2 activation", Molecular Aspects of Medicine, 32,

234–246

21 Lakshmi S.V.V., Padmaja G and Kutala V K., Kuppusamy P (December,

2009), "Oxidative Stress in Cardiovascular Disease", Indian Journal of

Biochemistry & Biophysics, 46, 421-440