DSpace at VNU: Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc kí

DSpace at VNU: Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc kí tài liệu, giáo án, bài giảng...

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho phép tơi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang giao đề tài, dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình làm luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia , anh chị Khoa chất lượng phụ gia chất hỗ trợ chế biến thực phẩm - Viê ̣n Kiể m nghiê ̣m an toàn vê ̣ sinh thực phẩ m Quố c gia đã quan tâm , giúp đỡ, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu mơi trường đại Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giảng dạy khoa Hố, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích cho tơi kiến thức q giá trình học tập thực đề tài Cuố i cùng , xin gửi lời biế t ơn sâu sắ c tới gia đình , bạn bè bên cạnh chia sẻ khó khăn , đô ̣ng viên và giúp đỡ ho ̣c tâ ̣p cũng số ng Do thời gian thực hiê ̣n đề tài có ̣n nên không tránh những thiế u sót , rấ t mong nhâ ̣n đươ ̣c ý kiế n đóng góp của thầ y cô và các ba ̣n để luận văn hoàn thiện Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015 Học viên Vũ Thị Hƣơng Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 1.1.Giới thiệu chung anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.1 Cấu trúc hóa học anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.2 Tính chất anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.3 Tác dụng anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.4 Sự phân bố anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.2.Một số phƣơng pháp xác định anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.2.1 Phương pháp pH vi sai Error! Bookmark not defined 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Error! Bookmark not defined CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 2.1 Mục tiêu Error! Bookmark not defined 2.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị Error! Bookmark not defined 2.4.1 Chất chuẩn Error! Bookmark not defined 2.4.2 Hoá chất Error! Bookmark not defined 2.4.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.6 Thẩm định phƣơng pháp Error! Bookmark not defined CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 3.1 Tối ƣu điều kiện xác định anthocyanin hệ thống HPLC Error! Bookmark not defined 3.1.1 Chọn detector Error! Bookmark not defined 3.1.2 Chọn bước sóng phát Error! Bookmark not defined 3.1.3 Chọn cột tách Error! Bookmark not defined 3.1.4 Chọn thể tích bơm mẫu Error! Bookmark not defined 3.1.5 Khảo sát thành phần pha động Error! Bookmark not defined 3.1.6 Khảo sát nồng độ axit pha động Error! Bookmark not defined 3.1.7 Khảo sát chương trình rửa giải Error! Bookmark not defined 3.1.8 Khảo sát tốc độ pha động Error! Bookmark not defined 3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân Error! Bookmark not defined 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân Error! Bookmark not defined 3.2.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu Error! Bookmark not defined 3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc Error! Bookmark not defined 3.3.2 Khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined 3.3.3 Độ lặp lại Error! Bookmark not defined 3.3.4 Độ thu hồi Error! Bookmark not defined 3.4 Ứng dụng phƣơng pháp xác định anthocyanin số rau củ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Cấu trúc chất phổ biến nhóm anthocyanin Error! Bookmark not defined Bảng 1.2: Thông tin chung chất nghiên cứu Error! Bookmark not defined Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng có số mẫu thực vật Việt Nam [7] Error! Bookmark not defined Bảng 3.1: Ảnh hưởng cột tách đến độ rộng đáy pic (W) thời gian lưu (tR) Error! Bookmark not defined Bảng 3.2: Ảnh hưởng thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) del, cya, pel Error! Bookmark not defined Bảng 3.3: Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined Bảng 3.5: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined Bảng 3.6: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined Bảng 3.7: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined Bảng 3.8: Ảnh hưởng chương trình gradient đến hệ số đối xứng pic Error! Bookmark not defined Bảng 3.9: Ảnh hưởng tốc độ dòng đến thơi gian lưu chiều cao pic Error! Bookmark not defined Bảng 3.10: Hàm lượng chất theo thời gian thủy phân Error! Bookmark not defined Bảng 3.11: Hàm lượng chất nhiệt độ thủy phân khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.12: Hàm lượng chất tỷ lệ dung môi chiết khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.13: Nồng độ diện tích pic trung bình chất Error! Bookmark not defined Bảng 3.14: Kết so sánh giá trị a với giá trị phương trình đường chuẩn anthocyanin Error! Bookmark not defined Bảng 3.15: Độ lặp lại mẫu bắp cải tím Error! Bookmark not defined Bảng 3.16: Độ lặp lại mẫu khoai lang tím Error! Bookmark not defined Bảng 3.17: Độ thu hồi mẫu rau dền đỏ Error! Bookmark not defined Bảng 3.18: Độ thu hồi mẫu củ dền Error! Bookmark not defined Bảng 3.19: Giới hạn phát giới hạn định lượng chất phân tích Error! Bookmark not defined Bảng 3.20: Kết phân tích số mẫu rau củ Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc aglycon anthocyanin Error! Bookmark not defined Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH Error! Bookmark not defined Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Error! Bookmark not defined Hình 3.1: Phổ hấp thụ delphinidin Error! Bookmark not defined Hình 3.2: Phổ hấp thụ cyanidin Error! Bookmark not defined Hình 3.3: Phổ hấp thụ pelargonidin Error! Bookmark not defined Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn chất với cột sắc kí Error! Bookmark not defined Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn chất với cột sắc kí Error! Bookmark not defined Hình 3.6: Sắc ký đồ rửa giải anthocyanin với thành phần pha động nước ACN Error! Bookmark not defined Hình 3.7: Sắc ký đồ del, cya nồng độ axit trifloaxetic khác Error! Bookmark not defined Hình 3.8: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient Error! Bookmark not defined Hình 3.9: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient Error! Bookmark not defined Hình 3.10: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient Error! Bookmark not defined Hình 3.11: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient Error! Bookmark not defined Hình 3.12: Hàm lượng chất thủy phân thời gian khác (60, 90, 120, 150 phút) Error! Bookmark not defined Hình 3.13: Hàm lượng chất nhiệt độ thủy phân khác Error! Bookmark not defined Hình 3.14: Hàm lượng chất theo phần trăm HCl N dung môi chiết mẫu Error! Bookmark not defined Hình 3.15: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp Error! Bookmark not defined Hình 3.16: Sắc ký đồ mẫu rau khơng chứa anthocyanin Error! Bookmark not defined Hình 3.17: Sắc ký đồ mẫu rau không chứa anthocyanin thêm chuẩn hỗn hợp Error! Bookmark not defined Hình 3.18: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic nồng độ delphinidin Error! Bookmark not defined Hình 3.19: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic nồng độ cyanidin Error! Bookmark not defined Hình 3.20: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic nồng độ pelargonidin Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ACN Tiếng Anh Tiếng Việt Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân Community tích thức CYA Cyanidin Cyanidin DEL Delphinidin Delphinidin AOAC HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao High performance thin layer Sắc ký lớp mỏng hiệu chromatography cao LC- Liquid chromatography tandem mass Sắc ký lỏng ghép khối phổ MS/MS spectrometry hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MeOH Methanol Metanol PDA Photodiod array Detector mảng đi-ốt quang PEL Pelargonidin Pelargonidin HPTLC ppm Parts per million Phần triệu R Relative coefficient Hệ số tương quan RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn S/N Signal to noise ratio TFA Trifloroacetic acid Axit Trifloaxetic UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại khả kiến Tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu MỞ ĐẦU Ngày nay, ảnh hưởng điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau gia tăng dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho thể nguyên nhân nhiều bệnh nan y Những nghiên cứu tìm hiểu chất có khả chống oxy hóa mang lại tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe người ngày phát triển Chất chống oxy hóa “chiến binh tốt” chống lại chất độc hại - gốc tự Chúng hình thành cách tự nhiên sản phẩm phụ trình sống liên quan tới oxy Các chất chống oxy hóa có khả giải phóng điện tử, chúng vơ hiệu hóa khả oxy hóa gốc tự ngăn chặn chúng công tế bào khỏe mạnh Để bảo vệ mình, thể ln tự sản sinh chế chống oxy hóa thiết yếu, với thời gian chúng dần trở nên hiệu theo tuổi tác Đây lý mà việc sử dụng chất chống oxy hóa thực phẩm chứa chất chống oxy hóa quan trọng [3], [11] Ngày nay, thức ăn không đảm bảo đủ calo, ngon, sạch, mà phải chứa hoạt chất sinh học tự nhiên cần cho sức khoẻ sắc đẹp, không điều khiển chức hoạt động phận thể, tạo cho người khả miễn dịch cao, chống lão hố, tăng tuổi thọ, mà giúp phòng chống số bệnh, kể ung thư Theo nghiên cứu hợp chất anthocyanin có hoạt tính tốt như: chống viêm, chống xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung thư, thúc đẩy hình thành cytokin điều hòa phản ứng miễn dịch, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh [21], [22], [28] Trên giới có nhiều quy trình xác định hàm lượng tổng anthocyanin hay hoạt chất nhóm anthocyanin kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS, HPTLC, LCMS [17], [24], [31] Tại Việt Nam công bố số nghiên cứu xác định hàm lượng anthocyanin thực vật hay thực phẩm [2], [7] Hầu hết phương pháp phân tích xác định anthocyanin tổng phương pháp UV-VIS có độ xác khơng cao Việc phân tích riêng lẻ hợp chất nhóm anthocyanin đối tượng mẫu thực vật sở để đánh giá hoạt tính chống oxy hố chất nhóm, đề xuất nguồn nguyên liệu cho chế biến thực phẩm chức Xuất phát từ thực tiễn trên, đặt vấn đề nghiên cứu đề tài: “Xác định hàm lượng Anthocyanin số loại rau phương pháp sắc ký” Với mục tiêu sau đây: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin số loại rau phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Áp dụng quy trình kỹ thuật xây dựng phân tích số mẫu rau thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích - tập - Phân tích dụng cụ, Nhà xuất Y học, Hà Nội Huỳnh Thị Kim Cúc, cộng (2004), "Xác định hàm lượng Anthocyanin số nguyên liệu rau phương pháp pH vi sai", Tạp Chí Khoa Học Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 3(7), 47-54 Lại Thị Ngọc Hà Vũ Thị Thư (2009), "Stress oxy hóa chất chống oxy hóa tự nhiên", Tạp chí Khoa học Phát triển, 7(5), 667-677 Trần Từ Hiếu cộng (2003), Hố học phân tích, Nhà xuất đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thị Hiển, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Loan (2012), “Nghiên cứu chiết tách Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus sabdariffa” - Ứng dụng để sản xuất giấy thị phát nhanh hàn the thực phẩm, Tạp chí Khoa học phát triển 2012, 10(5), 738-746 Nguyễn Thị Lan Lê Thị Lạc Quyên (2006), "Nghiên cứu ảnh hưởng hệ dung môi đến khả chiết tách chất màu Anthocyanin có độ màu cao từ dâu Hội An", Tạp Chí Khoa Học Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 44, 71-76 Phạm Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Hữu Cường Lê Trần Bình (2011), "Tách chiết phân tích hàm lượng Anthocyanin mẫu thực vật khác nhau", Tạp chí Sinh Học, 33(4), 79-85 Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Bài giảng Đại học Khoa học Tự Nhiên – ĐHQGHN Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, Nxb Khoa Học Kỹ Thuật Tiếng Anh 10 Antonieta Ruiz (2013), "Anthocyanin profiles in south Patagonian wild berries by HPLC-DAD-ESI-MS/MS", Food Research International, 51, 706–713 11 Betteridge D J (February, 2000), "What is oxidative stress?", Metabolism, 49(2), 3-8 12 Bhornchai Harakotr., et al (2014), "Anthocyanins and antioxidant acitivity in coloured waxy corn at different maturation stages", Journal of functional foods, 9, 109-118 13 Bridle P and Timberlake C.F (1996), "Anthocyanins as natural food colorsselected aspects", Food Chemistry, 58, 103-109 14 Cheynier V., Gómez C and Ageorges A (2012), "Flavonoids: Anthocyanins", In Fidel Toldra Leo M.L Nollet, editor, Handbook of Analysis of Active Compounds in Functional Foods, 379-397 15 Cretu G.C and Morlock G.E (1 March 2014), "Analysis of Anthocyanins in powdered berry extracts by planar chromatography linked with bioassay and mass spectrometry", Food Chemistry, 146, 104-112 16 Korte G Dreiseitel A., Schreier P., et al (2009), "Berry Anthocyanins and their aglycons inhibit monoamine oxidases A and B", Pharmacol Res, 59(5), 306-311 17 Durst R.W and Wrolstad R.E (2001), "Separation and Characterization of Anthocyanins by HPLC", Current Protocols in Food Analytical Chemistry, F1.3.1-F1.3.13 18 Francesca Leri., et al, (2012), "Simultaneous determination of Anthocyanins, coumarins and phenolicaxits in fruits, kernels and liqueur of Prunus mahaleb L", Food Chemistry, 135, 2157-2162 19 Fossen T and Andersen M (2000), "Anthocyanins from tubers and shoots of the purple potato, Solanum tuberosum", J Ilort Sci Biotech, 75, 360-363 20 Hybertson B.M., et al (2011), "Oxidative stress in health and disease: The therapeutic potential of Nrf2 activation", Molecular Aspects of Medicine, 32, 234–246 21 Lakshmi S.V.V., Padmaja G and Kutala V K., Kuppusamy P (December, 2009), "Oxidative Stress in Cardiovascular Disease", Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 46, 421-440 22 Lila M.A (2004), "Anthocyanins and Human Health: An In Vitro Investigative Approach", Journal of Biomedicine and Biotechnology, 5, 306-313 23 Longo L and Vasapollo G (2006), "Extraction and identification of Anthocyanins from Smilax aspera L berries", Food Chemistry, 94, 226-231 24 Marco P.H and Scarminio I.S (2007), "Q-mode curve resolution of UV–vis spectra for structural transformation studies of Anthocyanins inaxitic solutions", Analytica Chimica Acta, 583, 138-146 25 Meng L Lozano Y., Bombarda I., Gaydou E and Li B (2006), "Anthocyanin and flavonoid production from Perilla frutescens: Pilot plant scale processing including cross-flow microfiltration and reverse osmosis", J Agric Food Chem, 54, 4297-4303 26 Merken H.M and G.R Beecher (2000), "Liquid chromatographic method for the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones", Journal of Chromatography A, 897, 177-184 27 Miguel M G (2011), "Anthocyanins: Antioxidant and/or anti-inflammatory activities", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 01(06), 07-15 28 Nantz M.P Percival S.S., Rowe C.A and Nieves Jr C (2006), "Immunity and Antioxidant Capacity in Humans Is Enhanced by Consumption of a Dried, Encapsulated Fruit and Vegetable Juice Concentrate", The Journal of Nutrition, 136, 2606-2610 29 Nafiz Oncu Can., et al (2012), "Rapid determination of free Anthocyanins in foodstuff using high performance liquid chromatography" Food Chemistry, 130, 1082-1089 30 Ovando A.C., et al (2009), "Chemical studies of Anthocyanins: A review", Food Chemistry, 113, 859 - 871 31 Rosso V.V., et al (2008), "Determination of Anthocyanins from acerola (Malpighia emarginata DC.) and acai (Euterpe oleracea Mart.) by HPLC– PDA–MS/MS", Journal of Food Composition and Analysis, 21, 291-299 32 Tatsuzawa F., et al (2012), "Flower Colors and their Anthocyanins in Matthiola incana Cultivars (Brassicaceae)", J Japan Soc Hort Sci, 81(1), 91-100 33 Timberlake C F and Bridle P (1982), "Distribution of Anthocyanins in Food Plants", In Pericles Markakis, editor, Anthocyanins as Food Colors, Academic Press 34 Truong V.D Deighton N., Thompson R.T., et al (2010), "Characterization of Anthocyanins and Anthocyanidins in Purple-Fleshed Sweetpotatoes by HPLCDAD/ESI-MS/MS", J Agric Food Chem, 58, 404-410 35 Wu X (2005), "Identification and characterization of Anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States: Vegetables, nuts, and grains", J Agric Food Chem, 53(8), 3101-3113 36 Xu Z and Howard L.R (2012), "Analysis Methods of Anthocyanins", Analysis of Antioxidant-RichPhytochemicals, 5, 945-978 37 Yafang Shao., et al (2014), "Phenolicaxits, Anthocyanins, and antioxidant capacity in rice (Oryzasativa L.) grains at four stages of development after flowering", Food Chemistry, 143, 90–96 38 Zhang Z et al (2004), "Comparison of HPLC Methods for Determination of Anthocyanins and Anthocyanidins in Bilberry Extracts", J Agric Food Chem, 52, 688 - 691  ... cứu đề tài: Xác định hàm lượng Anthocyanin số loại rau phương pháp sắc ký” Với mục tiêu sau đây: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin số loại rau phương pháp sắc ký lỏng... HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI... trình xác định hàm lượng tổng anthocyanin hay hoạt chất nhóm anthocyanin kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS, HPTLC, LCMS [17], [24], [31] Tại Việt Nam công bố số nghiên cứu xác định hàm lượng anthocyanin