Sự tái sinh in vitro Hypericum preforatum L sử dụng thidiazunron phân tích ổn định gene tái sinh Trong nghiên cứa ngày nay, phương pháp tái sinh in vitro Hypericum preforatum L sử dụng phần khác điều hòa q trình phát triển Mơ sẹo kích tạo từ trục hạ diệp môi trường MS sử dụng 0,5 mg/l 2,4-D 1mg/l kinetin Chồi phát triển môi trường bao gồm 1mg/l thidiazunron rễ đạt với mg/l IAA Kĩ thuật nhân ngẫu nhiên đa hình DNA (RAPD) kĩ thuật đa hình độ dài đoạn (RFLP) định ổn định gen tái sinh thực vật Giữa số lớn tái sinh, 10 lấy ngẫu nhiên cho phân tích phân tử 15 RAPD đoạn mồi cho dạng khuôn băng mẹ tái sinh Hình dạng PCR-RFLP ribosom nhân chép đoạn đệm phiên mã (nrITS) vùng EcoRV, ClaI HpaII vài biến dị (biến đổi) mẫu băng Bờ trơn vùng ITS mẹ , lấy ngẫu nhiên tái sinh, dòng phân tử xếp theo trình tự thể nghi ngờ mức độ (query coverage) 99% phân tích CLUSTAL W Những phân tử phân tích thể tái sinh thực vật kết giống mẹ đặc điểm vềkiểu hình kiểu gen Giới thiệu Hypericum preforatum L, thường biết St.John, có giá trị giới khả chống vi rút, chống bị nhiễm, chống ung thư, chống suy nhược cho người ( vật sở hữu) Cây tự nhiên Euro, phía bắc nước Mỹ Đơng nam Ở Ấn độ, có vùng có độ cao 1000 – 2500 m Sự nhân giống thực vật mang lại phần lớn hạt giống thân bò Từ hạt sẵn sàng để dùng bị hạn chế đồng điều kiện khí hậu khơng ảnh hưởng vị trí cao lớn lên hoa tốt đẹp, tái sinh nuôi cấy in vitro phương pháp phù hợp nhân giống H preforatum Thực vật tái sinh từ nuôi cấy phần tách xuất phát sinh quan và/hoặc phát sinh phôi soma trực tiếp hay gián tiếp qua can thiệp mơ sẹo Có vài báo cáo tái sinh H preforatum nhiên phát sinh quan, sử dụng khác phần tách từ giống nhau, đoạn nút, trụ hạ diệp đoạn rễ Sự phát sinh quan từ mơ sẹo theo dõi mơi trường MS bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật ( PGRs) BAP, IAA, Kn, 2,4D, theo tưng chất riêng hay kết hợp Sự phát sinh quan trực tiếp H preforatum sử dụng thidiazunron (TDZ) theo dõi Murch cộng Trong mô thực vật lớn lên, PGRs tổng hợp thỉng thoảng kết thay đổi vài vùng hệ gen thực vật Sự thay đổi methy hóa DNA khuếch đại , chuyển vị yếu tố hoạt hóa, chép số lượng thay đổi, điểm đột biến xếp lại DNA Phân tử marker RAPD, ÍT, RELP ISSR, sử dụng thành công nghiên cứu ổn định gen mô nuôi cấy từ thực vật, chuối, hạt dẻ, Foeniculum sp phong lan lai tạo Trước nghiên cứu trình bày phenylurea dựa cytokinin có khả gây biến đổi gen mô cấy thưc vật Sau đó, phân tích phân tử quan trọng TDZ sử dụng nghiên cứu tái sinh Hiện thử nghiệm (sự điều tra) dẫn đường (kiểm soát) tới nhận biết kết (sự ảnh hưởng) PGR phối hợp để sử dụng phát sinh quan H preforatum đánh giá ổn định gen tái sinh phát triển có diện TDZ sử dụng RAPD PCRPFLP ribosom nhân chép đoạn đệm phiên mã (nrITS) làm phân tử marker Vật liệu phương pháp Sự thành lập mô cấy, tái sinh thực vạt làm tăng tính chịu đựng Hạt giống H preforatum lấy từ Himachal Pradesh, Ấn độ Hạt khử trùng bề mặt với cồn 70% phút, dung dịch sodium hypochlorite 10% ( chất tẩy trắng thương mại : nước cất lần theo tỉ lệ 1:9) 20 phút Chúng sau rửa lại nước cất lần cho nảy mầm môi trường agar (0,9% w/v) ( SRL Pvt Ltd, Mumbai, India) sucrose (3% w/v) ( SRL Pvt Ltd, Mumbai, India) Calli tạo từ vùng trụ hạ diệp môi trường MS ( Hi-Media, Mumbai, India) với 3% sucrose khác nồng độ PGRs Nồng độ 0.5, 1.0 mg/l 2,4-D (Sigma,St.Louis, USA) NAA (Sigma,St.Louis, USA), 0.5 1.0 mg/l Kn (Sigma,St.Louis, USA) or BAP (Sigma,St.Louis, USA) Mơi trường hóa cứng với 0,9% agar Mỗi cách kết hợp lần lặp lại tồn thí nghiệm làm lần Sau lần cấy chuyền, khối mô sẹo ( kết phát triển từ trục hạ diệp) chuyển sang tái sinh môi trường tạo chồi với mg/l TDZ (Sigma,St.Louis, USA) or BAP hay kết hợp với 1mg/l IAA Tái sinh chồi xong chuyển qua môi trường tái sinh rễ giới hạn khác nồng độ (1.0, 2.0 or mg/l) IAA hay NAA Trong tất trường hợp, nuôi cấy đặt ổn định phòng nhiệt độ 25+_ 2oC, đọ ẩm 55+_2% ánh sáng cường độ 326108 mol/sm, chiếu 16/8h sáng/ tối Tái sinh với khoảng 3-4 cm chồi chuyển sang PGR môi trường MS/2 lỏng, sau 21 ngày, chuyển tiếp sang mơi trường đất:cát (1:2) Cây không che chắn ánh sáng mặt trời Sau 30 ngày, thích nghi với thời tiết chuyển vào nhà kính chúng hoa tạo hạt Cơ lập DNA phân tích phân tử Hệ gen DNA từ mơ (500 mg) lập từ phần ngẫu nhiên mẹ 10 tái sinh môi trường MS bổ sung mg/l TDZ sử dụng phương pháp Doyle and Doyle phản ánh biến đổi Đặc tính DNA kiểm tra phương pháp điện di (eletrophoretically) RADP phản ứng khuếch đại thực nhiệt độ theo chu kì với 25µl phản ứng hỗn hợp gồm 1x PCR phản ứng đệm, mM MgCl2, 0,2 mM hỗn hợp dNTP, 0,2 mM RADP primer 0,5 U Taq DNA polymerase 25 ng mẫu H preforatum DNA Hỗn hợp khuếch đại làm biến tính 94 oC phút, sau chạy 45 chu kì biến tính ( 94oC/1 phút), ủ primer (36oC/1 phút) kéo dài (72oC/2 phút) Phản ứng hoàn thành phần phụ thêm vào cuối 72 oC phút Sau khuyếch đại, DNA analyze điện di 1.5 % agarose gel x TAE đệm 100 cặp base thang DNA sử dụng marker Gel đổi màu ethidium bromide phát quang sánh sáng UV (254 nm) Phân tích ITS, làm khuyếch đại 25 µl phản ứng hỗn hợp đệm gồm 1x PCR phản ứng đệm, mM MgCl2, 0,1 mM hỗn hợp dNTP, mM primer 1.0 U Taq DNA polymerase 25 ng mẫu DNA PCR hỗn hợp theo bước sau: ban đầu làm biến tính 98 oC phút, sau chạy 35 chu kì biến tính ( 94oC/1 phút), ủ primer (58oC/30s ) kéo dài (72oC/1 phút) Phản ứng hoàn thành phần phụ thêm vào cuối 72 oC phút Vùng ITS1 IT2 mang 5,8S gen khuếch đại 17SE tiến phía trước (5’ ACG ÂT TCA TGG TCC GGT GÂ GTG TTC G 3’) 26SE ngược lại (5’ TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C 3’) primer RFLP, PCR khuếch đại sản phẩm tinh chế băng PCR-Clean up kit, phân hủy (cắt) enzyme (REs) EcoRV, ClaI HpaII Phân loại sản phẩm điện di gel Agarose 2% với dòng điện 65V, phẩm màu ethidium bromide chụp ảnh lại Nhân dòngvà trình tự vùngITS ChọnvùngITS mẹ vàchọn ngẫu nhiên câytáisinhtừ cảm ứng với mg/L TDZđãđượcnhân lêngắnvàovector pTZ57R / T cách sử dụng Ins T/AcloneTMPCR Cloning Kit (Fermentas, Hanover, USA)biếnnạpvàoE.coli (chủng) XL1-Blue Chọndòngnhânlênvà tiếnhànhtáchchiếtDNA plasmidbằng phươngpháptáchchiếtDNA plasmid kit(Qiagen plasmid Mini Kit, Qiagen Khoa học,Maryland, USA) Xácđịnhtrình tự cách sử dụng máyphân tích trìnhtựtự động ABI3130 (ABI, USA) mồiM13 (Forward Reverse) Các trình tự DNA ITS củacây mẹ câytáisinh(GQ868706 vàGU596502, tương ứng) cótrongNCBI GenBank Phân tích liệu Đối với thí nghiệm nicấyin vitro,số lượng câyđược thể hiện:sốcónghĩa ± sai số chuẩn PCR khuyếch đại vàtiêu hóa hạn chế lặp lại hai lần khithu dc mộtsốlượnglớn Tìm kiếm trình tự tương đồngcủa người mẹ vàcâynuôicấybằng cách sử dụng BLAST(Http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Trung tâm Quốc giaThông tin Cơng nghệ sinh học (NCBI) vớichương trình BLASTN.So sánhcáctrìnhtựDNA sửdụngphầnmềm CLUSTAL W 1,83 Kết Cây tái sinh in Vitro Cấy trụ hạ diệp để tạo mô sẹo thi nghiệm tiết phát triển thực vật, tỷ lệ cytokinin / auxin cao ảnh hưởng đến tăng trưởng mô sẹo Mô sẹo tăng trưởng cao quan sát mơi trường có chứa0,5 mg/ L 2,4-D mg/L Kn (Hình 1a) Các mơ sẹo ban đầu có dạng khối đặc màu nâu, sau đoạn rời rạc đậm màu Đối với cảm ứng chồi, môi trường có hiệu TDZ BAP áp dụng riêng lẻ (1 mg/l ) cho kết tốt hơn(47 (TDP) 25 (BAP) chồi / cấy) so với kết hợp với mg/l IAA (Hình 1b) Do đó, chúng tơi nghiên cứu, mg/l TDZ chứng minh PGR tốt số nồng độ để tạo chồi Tạo rể chồi tái sinh cách sử dụng IAA NAA 1, mg/l, mg/l IAA nồng độ hiệu nhất, theo sau mg/l IAA (Hình 1c) Tăng nồng độ IAA làm chồi tái sinh có màu nâu gâychết Tất tái sinh(Không phân biệt môi trường sinh trưởng ban đầu ) chuyển qua mơi trường MS lỏng có nồng độ trung bình, hỗn hợp đất pha, cho thấy tỉ lệ tương tự Tỷ lệ sống ngồi tự nhiên khoảng 80% Các tái sinh có hình thái tương tự mẹ (Hình 2a-d) Nghiên cứu tính ổn định di truyền Trong 19 mồi RAPD, 15 sản phẩm sạch, lặp lại scorable Mồi RAPD khuếch đại 68 băng mẹ chọn ngẫu nhiên tái sinhtừ môi trường bổ sung mg/l TDZ, sản phẩm gần 4,5 băng mồi (Bảng 1) Khơng bang đa hình tìm thấy mẹ tái sinh cho thấy gen chúng tương tự (Hình 3a) Tồn vùng NrITS, bao gồm ITS1, 5.8S ITS2, khuếch đại cách sử dụng mồi 17SE 26SE, đoạn có kích thước khoảng 930 bp Chiều dài vùng nrITS mẹ tái sinh so sánh không khác (Hình 3b) Trong phân tích hạn chế, EcoRV cho sản phẩm đoạn(470, 390 & 180 bp) vùng ITS, HpaII cho sản phẩm đoạn (570 & 180 bp) ClaI cho sản phẩm đoạn (480 & 460 bp) (Bảng 2).Những đoạn RFLP vùng nrITS khuếch đại PCR giống từ mẹ đến tái sinh(Hình 3c-e) 930 bp vùng ITS nhân lên giải trình tự cho mẹ tái sinh lựa chọn ngẫu nhiên BLAST cho thấy tương đồng hai trình tự 99%, giá trị giảm tối đa 98% giá trị E0,0 Nucleotides từ hai mẫu cho thấy tương đồng gần hoàn hảo vùng ITS1 ITS2 q trình phân tích trình tự CLUSTAL W (Hình 4a & b) Thảo luận: Trong nghiên cứu gần đây, môi trường nuôi cấy trụ hạ diệp có chứa 2,4-D Kn theo TDZ đem lại hiệu tái sinh chồi in vitro thong qua phát sinh quan qua trung gian mô sẹo Khối mô tăng trưởng tối ưu theo dõi 0.5 mg L -1 2,4-D mg L-1Kn Nó có khác biệt nhỏ từ thay đổi Pretto Santerem nơi mà họ cho thấy 1.0 mg L-1 2,4-D 1.0 mg L-1 BAP phối hợp chất điều hồ tăng trưởng thực vật có ảnh hưởng đến phát triển mô sẹo H.Perforatum Sự ứng dụng cytokinin ngoại sinh BAP, Kn, TDZ trở nên bắt buộc cho cảm ứng chồi số thực vật TDZ xem có hiệu nghiệm điều hoà sinh học phát sinh hình thái in vitro Nó đẩy mạnh phát sinh quan ột số chống lại thực vật Nét đặc trưng cho tính chất đạc biệt TDZđể đáp ưng khả phả ứng lại auxin cytokinin số lồi thực vật Tuy nhiên biết chất gây thay đổi nọi sinh mức độ hormone thực vật tín hiệu tế bào.Plasqua et al báo cáo 0.6 mg L -1 (3µM) tập trung TDZ tốt cho cảm ứng mô Cho đến bậy giờ, tác dụng TDZ BAP tái sinh chồi quan tâm, nhận thấy gần gấp lần lớn lên chồi nuôi môi trường bổ sung mg L-1 TDZ so với chồi ni mơi trường có mg L-1 BAP Mok et al có ý kiến phenyl urea dẫn xuất TDZ có hiệu adenine dẫn xuất BAP hay Kn Giống với theo dõi mạnh TDZ so với BAP báo cáo Artemisia vugaris lai A.vandarum x V.stangeana Do đó, TDZ với nồng độ mg L-1 có ãnh hưởng mạnh đến tái sinh chồi tăng nồng độ lên mức cao ( mg L -1) không làm thay đổi đáng kể đáp ứng điều hồ Sứ điều hồ in vitro thực vật dẫn đến sinh sản vơ tính đồng với kiểu hình kiệu gen mẹ Tuy nhiên, số trường hợp chất điều hoà thực vật tỏ lệch hướng so với mẹ gọi biến thể soma Một số nhà nhà khoa học báo cáo biến dị gen mô thực vật số lúa, bắp, tỏi số khác TDZ có vai trò tổng hợp polyphenyl urea cytokinin mạnh.Dưới ảnh hưởng cùa PGR có số khả kế thừa biến dị di truyền chất điều hoà thực vật Do đó, cần thiết phải thiết lập gen bền chất điều hồ thực vật TDZ Vì nghiên cứu gần đây, DNA mẹ tốt cho tái sinh thực vật cách dụng phân tự đánh dấu RAPD, nrITS PCR-RFLP RADP marker nghiên cứu biến dị DNA kô nuôi cấy tăng trưởng thực vật Haluscova et al nhận thấy không co khác biệt RADP vòng soma H.perforatum cho thấy chúng tương đối bền Tương tự, Goel et al tìm thấy 84-99% gen giống nuôi cấy invitro sử dụng markers RADP Trong nghiên cứu Khơng có nhiều hình thái tìm thấy mẹ tái sinh cho thấy tương đồng en Hơn nữa, vùng nrITS ( bao gồm vùng ITS1, 5.8S ITS2) vùng gen dung cho phân loại cấp loài chi loài cấp độ cao biến dị vùng rDNA Do vậy,nó sử dụng rộng rãi nghiên cứu mức độ biến dị chí lồi gần Trong nghiên cứu nay, khuếch đại vùng nrITS PCR-RFLP mẹ tái sinh với Res EcoRV, ClaI HpaII, tạo chuỗi mẫu (hình 3c-e) CLUSTAL W chuỗi liên kết phức tạp mẹ tái sinh cho thấy tính tương đồng vùng ITS1 ITS2 Tất kết chứng minh bền DNA tái sinh ... đó, phân tích phân tử quan trọng TDZ sử dụng nghiên cứu tái sinh Hiện thử nghiệm (sự điều tra) dẫn đường (kiểm soát) tới nhận biết kết (sự ảnh hưởng) PGR phối hợp để sử dụng phát sinh quan H preforatum. .. tái sinh cách sử dụng IAA NAA 1, mg/l, mg/l IAA nồng độ hiệu nhất, theo sau mg/l IAA (Hình 1c) Tăng nồng độ IAA làm chồi tái sinh có màu nâu gâychết Tất tái sinh( Không phân biệt môi trường sinh. .. H.Perforatum Sự ứng dụng cytokinin ngoại sinh BAP, Kn, TDZ trở nên bắt buộc cho cảm ứng chồi số thực vật TDZ xem có hiệu nghiệm điều hồ sinh học phát sinh hình thái in vitro Nó đẩy mạnh phát sinh quan