LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ TÁC ĐỘNG ĐẾN HIỆU LỰC VACXIN DỊCH TẢ HEO TRÊN HEO CON Ở CÁC TỈNH PHÍA NAM

189 431 0
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ TÁC ĐỘNG ĐẾN HIỆU LỰC VACXIN DỊCH TẢ HEO TRÊN HEO CON Ở CÁC TỈNH PHÍA NAM

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. TRẦN ĐÌNH TỪ PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan những kết quả trình bày trong luận án này là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng 3 LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS. TS. Trần đình Từ PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này.  Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, cùng toàn thể quý thầy cô trong khoa chăn nuôi thú y đã giúp đỡ và khích lệ tôi thực hiện luận án tốt nghiệp này.  Tôi xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Tổng Giám Đốc công ty Thuốc Thú Y TW NAVETCO, Ban Giám Đốc Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y, Phòng Đảm Bảo Chất Lượng, bộ môn Hóa Sinh Miễn Dịch và đặc biệt là tất cả thành viên của bộ môn nghiên cứu Siêu Vi Trùng nơi tôi làm việc, đã tạo điều kiện, hỗ trợ và chung sức giúp tôi hoàn thành luận án này.  Tôi chân thành cảm ơn TS. Peter Daniels – Phó Viện truởng và ông Chris Morrissy – Trưởng phòng dự án và tập thể thành viên thuộc phòng chẩn đoán của Australian Animal Health Laboratory – CSIRO đã thực hiện giúp tôi một số thí nghiệm trong luận án này.  Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám Đốc cùng các cán bộ phòng kỹ thuật của công ty cổ phần chăn nuôi Phú Sơn đã tạo thuận lợi cho tôi triển khai các thí nghiệm trong luận án tiến sĩ.  Tôi xin được tri ân gia đình và người thân đã dành cho tôi tình yêu thương cùng với sự động viên khích lệ để tôi an tâm hoàn thành chương trình tiến sĩ. 4 TÓM TẮT Luận án “Nghiên cứu một số yếu tố tác động đến hiệu lực vacxin dịch tả heo trên heo con ở các tỉnh phía Nam” được thực hiện nhằm xác định ảnh hưởng của sự khác biệt phân nhóm di truyền virut dịch tả heo (DTH), đáp ứng miễn dịch của vài lịch tiêm vacxin và sự nhiễm PCV2 đến hiệu quả tiêm phòng vacxin DTH. Các kết quả nghiên cứu được trình bày sau: 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự khác biệt phân nhóm di truyền virut DTH đối với hiệu lực vacxin DTH. Dựa vào giải trình tự ba đoạn gien 5’NTR, E1E2 và NS5B, 37 phân lập virut DTH ở 14 tỉnh thành phía Nam Việt Nam từ năm 2000 2009 được xếp vào nhóm 2.1 và 2.2. Gây bệnh thực nghiệm cho heo với hai phân lập virut DTH nhóm 2.1. Tiêm virut DTH chủng CanTho32009 cho hai heo với liều 107,5TCID50heo và virut DTH chủng DongNai42009 cho hai heo với liều 106,0TCID50heo. Hai chủng virut này có tiến trình gây bệnh chậm với các dấu hiệu lâm sàng và virut huyết đặc trưng của DTH; và tất cả heo bị chết trong vòng 20 ngày. Tiêm virut DTH chủng CanTho320092 (được phân lập từ heo bị chết do tiêm virut DTH chủng CanTho32009) cho ba heo đã được miễn dịch bằng vacxin DTH tế bào NAVETCO; tất cả heo vacxin đều khỏe mạnh và không có virut huyết mặc dù đã được công độc với liều 107,3TCID50 của virut DTH thuộc nhóm 2.1. Điều này cho thấy hiệu quả của vacxin DTH hiện đang sử dụng tại Việt Nam không bị tác động bởi virut DTH thực địa thuộc nhóm 2.1. 2. Nghiên cứu hiệu quả miễn dịch khi áp dụng một số lịch tiêm vacxin DTH thông qua sử dụng phương pháp NPLA và thử nghiệm công cường độc. (1) Đáp ứng miễn dịch trên heo con được tiêm vacxin DTH NAVETCO trước khi bú sữa đầu: Kết quả cho thấy kháng thể đo được trên heo tiêm và không tiêm vacxin cho đến 30 ngày tuổi vẫn là kháng thể thụ động (KTTĐ) do mẹ truyền sang qua sữa đầu. Tất cả heo tiêm vacxin mặc dù không có kháng thể (hiệu giá kháng thể (HGKT) trung hòa < 3log2), hoặc có kháng thể (HGKT trung hòa ≥ 3log2) tại thời điểm công cường độc (30 ngày tuổi), đã được bảo hộ hoàn toàn; 5 ngược lại các heo đối chứng có cùng HGKT đều bị mắc bệnh và chết sau công cường độc. Điều đó chứng tỏ mũi tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu đã bảo hộ heo chống lại công cường độc. (2) Đáp ứng miễn dịch trong thử nghiệm tiêm vacxin DTH NAVETCO hai lần, lúc trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi: So sánh lượng kháng thể tạo thành giữa hai lô heo cùng quy trình tiêm này dựa theo HGKT mẹ truyền trước khi tiêm mũi hai, lần lượt là 2,8 ± 0,9log2 (gồm 12 heo) và 5,8 ± 0,8log2 (gồm 11 heo). Sau khi tiêm vacxin lúc 21 ngày, trung bình HGKT lúc 180 ngày tuổi hầu như tương đương nhau giữa hai lô heo vacxin, lần lượt là 4,3 ± 2,2log2 và 4,8 ± 2,3log2. Tất cả năm heo từ hai lô vacxin được bảo hộ hoàn toàn khi công cường độc lúc 120 ngày tuổi, ba heo đối chứng có dấu hiệu điển hình của DTH và chết trong vòng 7 ngày sau công cường độc. Điều này chứng tỏ lịch tiêm vacxin này có hiệu quả miễn dịch trên cả hai lô heo, không tùy thuộc lượng KTTĐ hiện diện khi tiêm vacxin lần hai lúc 21 ngày. Ngoài ra, kết quả đáp ứng hình thành kháng thể trên heo tiêm vacxin DTH NAVETCO hai lần ở một quy trình khác (trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi), tương tự như diễn biến kháng thể của lịch tiêm vacxin trước khi bú sữa đầu và 21 ngày. (3) Đáp ứng miễn dịch khi áp dụng lịch tiêm vacxin DTH hai lần, lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi: So sánh kháng thể tạo thành trên heo tiêm vacxin DTH NAVETCO (46 heo) và vacxin Pestvac (42 con). Trung bình HGKT lúc 110 ngày và 170 ngày tuổi hầu như tương đương nhau giữa hai lô vacxin (P>0,05). Tất cả tám heo tiêm vacxin đều sống sót khi công cường độc lúc 130 ngày tuổi, trong khi hai heo đối chứng có dấu hiệu điển hình của DTH và một heo chết sau 7 ngày công cường độc, chứng tỏ lịch tiêm phòng này có hiệu quả. (4) Đáp ứng miễn dịch trong lịch tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO một lần: Thực hiện trên bốn heo 6 tuần tuổi không còn kháng thể thụ động, những heo này đã tạo đáp ứng kháng thể trong vòng 4 tuần đầu sau khi tiêm và ổn định với hiệu giá ≥ 5log2 cho đến 38 tuần tuổi. 6 (5) Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu trên đàn heo nuôi thực địa. Dựa vào phân bố HGKT mẹ truyền trên 1363 heo con từ 1 đến 5 tuần tuổi ở tỉnh Đồng Nai, Long An và Đồng Tháp, cho thấy tỷ lệ heo được bảo hộ (HGKT ≥ 5log2) lúc 3 tuần tuổi chỉ còn là 42,85%, 42,11% và 24,33%. Điều này cho thấy thời điểm thích hợp để tiêm vacxin lần đầu là 3 tuần tuổi. 3. Xác định ảnh hưởng của việc nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH. Thực hiện trên hai đàn heo ở trại. Đàn một gồm bốn ổ heo được xem như đối chứng để xác định heo nhiễm PCV2. Đàn hai gồm mười ổ heo được xác định HGKT kháng virut DTH lúc 20, 50, 110 và 170 ngày tuổi sau khi đã tiêm vacxin DTH NAVETCO lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi. Ngoài ra, từ đàn heo hai này, tách muời heo trước khi tiêm vacxin, chuyển về nuôi cách ly ở NAVETCO và tiêm vacxin cho tám heo vào cùng thời điểm với đàn heo hai tại trại (lúc 21 và 51 ngày tuổi); hai heo đối chứng còn lại không tiêm vacxin DTH. Mười heo chuyển về NAVETCO đã không còn kháng thể kháng PCV2 trong quá trình theo dõi. Kết quả cho thấy trung bình HGKT kháng virut DTH tương đương nhau trên heo nhiễm PCV2 (đàn hai ở trại) và heo không nhiễm PCV2 (heo ở NAVETCO). Nghiên cứu này minh họa rằng PCV2 không ảnh hưởng đến đáp ứng kháng thể sau tiêm phòng vaccine DTH. Tóm lại, chủng virut DTH thực địa thuộc nhóm di truyền 2.1 đang lưu hành và việc nhiễm PCV2 không ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng bệnh DTH; đồng thời, hiệu quả của một số lịch tiêm phòng vacxin cho heo con đã được khẳng định. 7 SUMMARY The study “TO EXAMINE FACTORS INFLUENCING THE EFFICACY OF CLASSICAL SWINE FEVER VACCINATION TO YOUNG PIG IN PROVINCES OF SOUTHERN VIETNAM” was conducted with the aim to determine the effects of classical swine fever virus (CSFV) genotype, vaccination programs and infection of porcine circovirus type 2 (PCV2) on CSF vaccine efficacy. The results were followed as: 1. The influence of CSFV genotype on CSF vaccine efficacy Based on the sequence of three regions 5’NTR, E1E2 and NS5B in the CSFV genome, 37 isolates from 14 provinces during 2000 2009 were clustered in two subgroups (2.1 and 2.2). Pigs were challenged by injecting two isolates of the 2.1 genotype, of which two pigs exposed to CanTho32009 at the dose of 107,5TCID50 and two pigs to DongNai42009 at the dose of 106,0TCID50. The challenged pigs showed a delayed course of sickness with typical CSFV clinical signs and viremia, and all pigs died with severe signs in 20 postinfection days. The isolate CanTho320092 from the dead pig was used to challenge three pigs that were injected cell culture CSFV vaccine (C strain). The pigs remained healthy and had no viremia although the challenge dose was 107,3TCID50 of CSFV genotype 2.1, indicating CSFV genotype 2.1 did not influence the efficacy of the current CSF vaccine. 2. The immune response of pigs in different CSF vaccination programs, being determined by neutralization peroxidase link assay (NPLA) and challengeexposure (1) Immune response of piglets to CSF vaccine injected prior to colostrum intake: The results showed that the antibodies of vaccinated and unvaccinated pigs up 30 days of age were still derived from their vaccinated dams. All vaccinated pigs even with neutralizing antibody titer < 3log2 at the time of challenge (30 days of age) were fully protected, while the unvaccinated control pigs with the same antibody titers got sick and died after virulent challenge. It indicates the vaccination 8 for newly born piglets prior to colostrum suckling could provide a good protection against virulent challenge. (2) Efficacy of the twodose CSF vaccination program prior to colostrum suckling and at 21 days of age: The serological conversion was observed in the two groups of vaccinated pigs, of which maternalderived antibody (MDA) titers were of 2.8 ± 0.9log2 (12 pigs) and 5.8 ± 0.8log2 (11 pigs), respectively, before the second shot. The average antibody titers at 180 days of age were almost similar between the two groups of vaccinated pigs (4.3 ± 2.2log2 and 4.8 ± 2.3log2, respectively) after the injection at 21 days old. Five vaccinated pigs from the two groups were completely protected from a virulent CSFV challenge at 130 days of age, while three control pigs showed typically clinical signs of CSF and died at day 7 after challenge, indicating the twodose vaccination schedule was effective in both groups irrespective of MDA titer. Besides that, antibody response of pigs in another twodose CSF vaccination program prior to colostrum suckling (Day 0) and at 30 days of age, had the same pattern as that of pigs vaccinated at Day 0 and Day 21 of age. (3) Efficacy of the twodose CSF vaccination program 21 and 51 days of age: A comparison of serological conversion was conducted in pigs vaccinated with NAVETCO vaccine (46 pigs) and with Pestvac vaccine (42 pigs). The average antibody titers at 110 and 170 days old were similar between the two groups of vaccinated pigs. All of eight vaccinated pigs were completely protected from a virulent CSFV challenge at 130 days of age, while two control pigs showed typically clinical signs of CSF, of which one died at day 7 after challenge, indicating this vaccination schedule was effective. (4) Efficacy of the onedose CSF vaccination program: The program was applied for four pigs of six weeks old when MDA completely decreased. Antibody response was observed in the first 4 weeks after injection and lasted at titers ≥ 5log2 till 38 weeks of age. 9 (5) Determining the age for the first shot of vaccine against CSF in pigs in field: Based on the distribution of CSF colostrum antibody in 1 to 5 week old pigs in Đong Nai, Long An and Đong Thap provinces, about 42.85%, 42.11% and 24.33% of piglets, respectively, had an average antibody titer ≥ 5log2 at 3 weeks of age. This result indicated the appropriate time for the first shot is 3 weeks of age. 3. The effect of PCV2 infection on the immune response to CSF vaccination Two groups of pigs from a farm were used in this experiment. The first group of 4 litters was a control to monitor PCV2 antibody. The second group of 10 litters of pigs whose serum was taken at 20, 50, 110 and 170 days old to examine antibody against CSF virus after injecting CSF vaccine at 21 and 51 days old. From the second group of pigs, 10 pigs were chosen before vaccination and transferred to the experimental station of NAVETCO, of which eight pigs were vaccinated at the same age as the second group on farm, 21 and 51 days old; other two pigs were not vaccinated as the control. The results showed the similarity in titers of antibody against CSF virus in the pigs with (the second group on farm) and without PCV2 infection (pigs at NAVETCO), demonstrating the PCV2 infection does not influence the antibody response to CSF vaccination. These results indicated the genotype 2.1 of the field CSFV and PCV2 infection had no effect on the immune response to CSF vaccination; and the efficiency of some CSF vaccination programs was confirmed. 10 MỤC LỤC Chương .............................................................................................................. Trang Trang tựa ...................................................................................................................... i Lời cam đoan .............................................................................................................. ii Cảm ơn ...................................................................................................................... iii Tóm tắt ....................................................................................................................... iv Summary .................................................................................................................. vii Mục lục........................................................................................................................ x Danh sách chữ viết tắt .............................................................................................. xvi Danh sách các bảng ............................................................................................... xviii Danh sách các hình .................................................................................................... xx Danh sách các biểu đồ .............................................................................................. xxi Danh sách các sơ đồ ................................................................................................. xxi MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 4 1.1 Tình hình bệnh DTH ........................................................................................ 4 1.1.1 Trên thế giới ................................................................................................. 4 1.1.2 Ở Việt Nam ................................................................................................... 5 1.2 Đặc điểm sinh học của virut DTH ................................................................... 6 1.2.1 Hình thái và phân loại virut DTH ................................................................ 6 1.2.2 Hệ gien của virut và kháng nguyên đích ...................................................... 6 1.2.3 Dịch tễ phân tử của virut DTH ..................................................................... 8 1.3 Các thể bệnh DTH ......................................................................................... 13 1.3.1 Cơ chế sinh bệnh ........................................................................................ 13 1.3.2 Thể cấp tính ................................................................................................ 14 1.3.3 Thể mãn tính ............................................................................................... 15 1.3.4 Thể phát bệnh muộn ................................................................................... 16 1.4 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh DTH ............................................................. 17 11 1.4.1 Miễn dịch thụ động ..................................................................................... 18 1.4.2 Miễn dịch chủ động .................................................................................... 20 1.4.2.1 Miễn dịch dịch thể ................................................................................... 21 1.4.2.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào .............................................................. 23 1.4.3 Miễn dịch niêm mạc ................................................................................... 24 1.4.4 Hiện tượng dung nạp miễn dịch trên heo con ........................................... 24 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch DTH sau khi tiêm vacxin DTH .............................................................................................................. 25 1.5.1 Tính đa dạng di truyền của virut DTH thực địa ......................................... 27 1.5.2 Quy trình tiêm phòng vacxin DTH ............................................................. 29 1.5.2.1 Kháng thể thụ động (Kháng thể mẹ truyền) ............................................ 29 1.5.2.2 Thời điểm tiêm vacxin DTH lần đầu ....................................................... 34 1.5.2.3 Số lần tiêm vacxin ................................................................................... 35 1.5.3 PCV2 gây ức chế miễn dịch ....................................................................... 37 1.5.3.1 Tình hình nhiễm PCV2 ............................................................................ 37 1.5.3.2 Cơ chế sinh bệnh của PCV2 .................................................................... 38 1.5.3.3 Đặc tính sinh miễn dịch của PCV2 .......................................................... 38 1.5.3.4 Tác động PCV2 đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm vacxin của một số bệnh ....................................................................................................... 40 1.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh DTH........................................................ 42 1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng .................................................................................... 42 1.6.2 Chẩn đoán phi lâm sàng.............................................................................. 43 1.6.2.1 Chẩn đoán virut ....................................................................................... 43 1.6.2.2 Chẩn đoán huyết thanh ............................................................................ 45 1.6.2.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật phân tử (Phương pháp PCR) .......................... 45 1.7 Vacxin DTH và chương trình kiểm soát bệnh DTH ..................................... 47 1.7.1 Vacxin DTH ............................................................................................... 47 1.7.2 Kiểm soát bệnh DTH .................................................................................. 48 12 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 50 2.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................... 50 2.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................ 50 2.2.1 Các sinh phẩm ............................................................................................ 50 2.2.2 Các bộ kit và hóa chất................................................................................. 51 2.2.3 Heo .............................................................................................................. 51 2.3 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 51 2.4 Bố trí thí nghiệm ............................................................................................ 56 2.4.1 Đánh giá ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH phân lập đối với hiệu lực vacxin DTH ..................................................................... 56 2.4.1.1 Khảo sát phân nhóm của các phân lập virut DTH thực địa ở một số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 đến 2009 .................................................. 56 2.4.1.2 Khảo sát đặc điểm bệnh lý do virut DTH phân nhóm 2.1 gây ra trên heo ................................................................................................ 58 2.4.1.3 Đánh giá hiệu lực vacxin DTH tế bào phân nhóm 1.1 khi công cường độc với một virut DTH chủng thực địa phân nhóm 2.1 .......................... 59 2.4.2 Đánh giá hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm phòng vacxin DTH..... 60 2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch tạo thành đến 30 ngày tuổi trên heo tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu........................................................................ 60 2.4.2.2 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi ........................................................................... 62 2.4.2.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi .......................................................................... 62 2.4.2.4 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ............................................................................................. 63 2.4.2.5 Đánh giá đáp ứng kháng thể sau một lần tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO .............................................................................................. 64 2.4.2.6 Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu dựa vào hiệu giá kháng thể thụ động trên đàn heo nuôi ở thực địa ............................................................ 65 13 2.4.3 Khảo sát đáp ứng kháng thể khi tiêm vacxin DTH NAVETCO trên heo con nhiễm PCV2 ......................................................................................... 65 2.4.3.1 Xác định heo nhiễm PCV2 thực địa dựa trên kháng thể kháng PCV2.... 65 2.4.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể kháng virut DTH sau tiêm vacxin DTH NAVETCO lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ................................................................................................... 66 2.5 Kỹ thuật xét nghiệm ...................................................................................... 66 2.5.1 Quy trình thử nghiệm công cường độc ....................................................... 66 2.5.2 Phương pháp trung hòa nối kết enzym (NPLA) – Định lượng HGKT trung hòa ..................................................................................................... 66 2.5.3 Phát hiện virut DTH trong tế bào bằng phương pháp nhuộm miễn dịch kết nối với peroxidase (Ipx) ............................................................................. 67 2.5.4 Phương pháp chuẩn độ virut DTH trên tế bào dòng PK15 ........................ 68 2.5.5 Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên ........................................... 68 2.5.6 Kỹ thuật RTPCR ....................................................................................... 68 2.5.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide .................................................. 68 2.5.8 Phương pháp IPMA (Immuno Peroxidase Monolayer Assay) .................. 69 2.5.9 Phương pháp đếm số lượng bạch cầu ......................................................... 70 2.6 Xử lý thống kê ............................................................................................... 70 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 71 3.1 Ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH phân lập đối với hiệu lực vacxin DTH .................................................................................. 71 3.1.1 Phân nhóm di truyền của các phân lập virut DTH thực địa ở một số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 đến 2009 ..................................................... 71 3.1.1.1 Phân bố địa lý của các virut DTH thuộc phân nhóm 2.1 và 2.2 ............. 76 3.1.1.2 Tính ổn định về nhóm di truyền của virut DTH thực địa ....................... 78 3.1.2 Diễn biến bệnh trên heo khi tiêm hai chủng virut DTH phân nhóm 2.1 gây ra ......................................................................................... 81 3.1.2.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh tích ............................................................... 81 14 3.1.2.2 Virut huyết, virut trong dịch mũi và số lượng bạch cầu ......................... 83 3.1.3 Hiệu lực vacxin DTH đối với virut DTH chủng CanTho320092 ............ 87 3.1.3.1 Đặc điểm bệnh lý ..................................................................................... 88 3.1.3.2 Số lượng bạch cầu, virut huyết và kháng thể kháng virut DTH .............. 93 3.2 Hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm vacxin DTH ................................. 96 3.2.1 Đáp ứng miễn dịch tạo thành trên heo con được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu .................................................................................. 96 3.2.1.1 Diễn biến hiệu giá kháng thể kháng virut DTH trên heo sơ sinh được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu ..................................................... 96 3.2.1.2 Khả năng bảo hộ heo vào thời điểm 30 ngày sau khi tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu .................................................................................. 98 3.2.2 Đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi .............................................................................................. 102 3.2.2.1 Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi ........................................................................ 102 3.2.2.2 Khả năng bảo hộ heo được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi ............................................................................................. 104 3.2.3 Đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi ............................................................................................. 106 3.2.4 Đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ............................................................................................ 109 3.2.4.1 Diễn biến kháng thể trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi tại trại)............................................................................ 109 3.2.4.2 Diễn biến kháng thể trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi cách ly tại NAVETCO) ................................................ 112 3.2.4.3 Khả năng bảo hộ heo được tiêm vacxin DTH lúc 21ngày và 51 ngày tuổi......................................................................................................... 113 3.2.5 Đáp ứng kháng thể sau một lần tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO .... 116 15 3.2.6 Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu đối với đàn heo nuôi ở thực địa .................................................................................................... 118 3.2.7 Khuyến cáo về các lịch tiêm vacxin DTH ................................................ 122 3.3 Đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH trên heo con nhiễm PCV2 ......... 124 3.3.1 Xác định heo nhiễm PCV2 thực địa dựa trên kháng thể kháng PCV2 hình thành từ 50 ngày tuổi................................................................................ 124 3.3.2 Ảnh hưởng PCV2 đến đáp ứng kháng thể kháng virut DTH sau tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ............................................. 129 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 133 4.1 Kết luận........................................................................................................ 133 4.1.1 Ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH đến hiệu lực vacxin DTH .............................................................................................. 133 4.1.2 Hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm vacxin DTH ........................... 133 4.1.3 Đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH trên heo con nhiễm PCV2 ...... 134 4.2 Đề nghị ........................................................................................................ 134 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ......... 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 137 PHỤ LỤC ......................................................................................................... 159 Phụ lục 1 ....................................................................................................... 159 Phụ lục 2 ....................................................................................................... 160 Phụ lục 3 ....................................................................................................... 160 Phụ lục 4 ....................................................................................................... 161 Phụ lục 5 ....................................................................................................... 164 Phụ lục 6 ....................................................................................................... 166 Phụ lục 7 ....................................................................................................... 167 Phụ lục 8 ....................................................................................................... 168 16 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AAHL Australian Animal Health Laboratory Phòng thí nghiệm thú y Úc AEC Amino Ethyl Carbazol BC Bạch cầu BDV Border disease virus Virut gây bệnh biên giới ở cừu BVDV Bovine viral diarrhoea virus Virut gây bệnh tiêu chảy bò Chủng C Chinese strain Chủng Trung Quốc CPE Cytopathic effect Tác động bệnh lý tế bào CSFV Classical swine fever virus Virut dịch tả heo DC Dendritic cell Tế bào tua DIVA Differentiating infected from vaccinated animals Phân biệt thú chủng vacxin và thú nhiễm DNA Deoxyrionucleic acid DNMD Dung nạp miễn dịch DTH Dịch tả heo EMEM Minimum essential medium with Earles salts Môi trường nuôi cấy EMEM cần thiết tối thiểu ELISA Enzymelinked immunosorbent assay Phản ứng miễn dịch hấp phụ nối kết enzym END Exaltation of Newcastle disease Tăng cường bệnh Newcastle EVL Efficient vaccination level Ngưỡng tiêm phòng hiệu quả FAT Fluorescent antibody test Xét nghiệm kháng thể huỳnh quang FAVN Fluorescent antibody virus neutralising Trung hòa virut với kháng thể huỳnh quang GPE Guinea pig embryo Phôi chuột lang FCS Fetal calf serum Huyết thanh bào thai bê HCLV Hog cholera lapinized virus Virut dịch tả heo thỏ hóa HGKT Hiệu giá kháng thể HGKTTĐ Hiệu giá kháng thể thụ động HPR Horseradish peroxidase IgA Immunoglobulin A Globulin miễn dịch lớp A IgM Immunoglobulin M Globulin miễn dịch lớp M IgG Immunoglobulin G Globulin miễn dịch lớp G IFN Interferon Chất cản nhiễm IHA Indirect haemagglutination assay Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp IHC Immunohistochemistry Hóa mô miễn dịch IPMA Immunoperoxidase monolayer assay Phản ứng miễn dịch peroxidase đơn lớp 17 IPX Immunoperoxidase test Kỹ thuật nhuộm miễn dịch nối kết enzyme Peroxidase KTTĐ Kháng thể thụ động Mab Monoclonal antibody Kháng thể đơn dòng MDCĐ Miễn dịch chủ động NAVETCO National Veterinery Company Công ty thuốc thú y trung ương NI Neutralising index Chỉ số trung hòa NPLA Neutralising peroxidaselinked assay Phản ứng trung hòa nối kết enzym peroxidase OIE Organisation international des épizooties Tổ chức Thú y thế giới PBS Phosphate buffer saline Dung dịch đệm PBS PCR Polymerase chain reaction Phản ứng tạo chuỗi do polymerase PCVAD Porcine circovirus associated disease Bệnh liên quan circovirut ở heo PCV2 Porcine circovirus type 2 PD Protective dose Liều bảo hộ PID Pig infective dose Liều gây nhiễm heo PDNS Porcine dermatitis nephropathy syndrome Hội chứng bệnh lý thận và viêm da ở heo PK Pig kidney Thận heo PMWS Porcine multisystemic wasting syndrome Hội chứng còi sau cai sữa ở heo PPL Passive protective dose Ngưỡng bảo hộ thụ động PPV Porcine Parvovirus của Porcine Parvovirus PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome Hội chứng hô hấp và rối loạn sinh sản trên heo RNA Ribonucleic acid RTPCR Reversetranscriptase PCR PCR phiên mã ngược TCID Tissue culture infectious dose Liều gây nhiễm tế bào VNT Virus neutralising test Xét nghiệm trung hòa virut 18 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang 1.1. Tổng đàn heo và số ổ dịch DTH từ năm 2001 2005 ở Việt Nam ....................... 5 1.2. Tóm tắt các phân nhóm virut dịch tả heo ở Châu Á .......................................... 13 1.3. Mối liên quan giữa hiệu giá kháng thể và khả năng bảo hộ ............................... 22 2.1. Danh sách các chủng virut DTH đã sử dụng để lập cây di truyền ..................... 57 2.2. Danh sách các chủng virut DTH tham khảo ở Việt Nam .................................. 58 3.1. Phân nhóm di truyền của các chủng virut DTH thực địa ................................... 72 3.2. Diễn biến thân nhiệt, số lượng bạch cầu, virut huyết và virut dịch ngoáy mũi trên heo sau khi tiêm virut DTH chủng CanTho32009 và chủng Dongnai42009 ....................................................................................... 84 3.3. Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự nucleotide của chuỗi gien E1E2 giữa vacxin DTH tế bào NAVETCO đối với các virut DTH thực địa ..................... 87 3.4. Tình trạng virut huyết, số lượng bạch cầu và kháng thể trên heo sau công cường độc với virut DTH chủng CanTho320092 ........................................... 94 3.5. Biến thiên kháng thể của heo con có và không tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu đến 30 ngày tuổi ở thí nghiệm1 ................................................. 96 3.6. Diễn biến hiệu giá kháng thể của 70 heo con được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu ở thí nghiệm 2 ............................................................................ 98 3.7. Diễn biến kháng thể và bệnh lý vào lúc trước và sau khi công cường độc lúc 30 ngày tuổi trên heo đã tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu (Thí nghiệm 1) ................................................................................................... 99 3.8. Diễn biến kháng thể và bệnh lý vào lúc trước và sau khi công cường độc lúc 30 ngày tuổi trên heo đã tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu (Thí nghiệm 2) ................................................................................................. 100 3.9. Đáp ứng kháng thể trên heo con được tiêm vacxin theo lịch tiêm trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi .............................................................................. 103 19 3.10. Diễn biến kháng thể và bệnh lý sau khi công cường độc lúc 120 ngày tuổi trên heo tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi ................. 105 3.11. Đáp ứng kháng thể đến 30 ngày tuổi trên heo sau khi tiêm vacxin DTH vào thời điểm trước khi bú sữa đầu ................................................................ 107 3.12. Đáp ứng kháng thể trên heo khi tiêm vacxin DTH vào thời điểm trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi ........................................................................... 108 3.13. Phân bố hiệu giá kháng thể thụ động của heo con 21 ngày tuổi .................... 109 3.14. Trung bình hiệu giá kháng thể trên heo trước và sau khi tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi tại trại) ............................................. 110 3.15. Diễn biến HGKT trên heo sau khi tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi tại NAVETCO) ........................................... 112 3.16. Dấu hiệu lâm sàng, phát hiện virut và tỷ lệ bảo hộ trên heo sau công cường độc DTH lúc 130 ngày tuổi ................................................................ 114 3.17. Diễn biến kháng thể thụ động kháng DTH trên heo con từ 1 5 tuần tuổi ở tỉnh Đồng Nai, Long An và Đồng Tháp .................................................... 119 3.18. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 trên bốn ổ heo .......................................... 124 3.19. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 trên mười ổ heo ....................................... 126 3.20. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 trên 10 heo nuôi ở khu thí nghiệm .......... 129 3.21. Diễn biến kháng thể kháng DTH và PCV2 trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ................................................................................. 130 20 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang 1.1. Cấu trúc các vùng trên bộ gien mã hóa protein tương ứng của Pestivirus........... 7 1.2. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ giữa 3 nhóm chính và các phân nhóm của virut DTH dựa trên gen E2 (190nt) .................................................................. 10 1.3. Tiến trình của bệnh DTH thể cấp tính ................................................................ 15 1.4. Tiến trình của bệnh DTH thể mãn tính .............................................................. 16 1.5. Tiến trình của bệnh DTH thể trước khi sinh ...................................................... 17 1.6. Các nguyên nhân dẫn đến thất bại sau tiêm phòng vacxin ............................... 26 1.7. Sự hiện diện của KTTĐ làm chậm sự đáp ứng miễn dịch chủ động ............................ 30 1.8. Hình thành đáp ứng miễn dịch sơ cấp và miễn dịch thứ cấp ............................. 35 1.9. Mức độ bảo hộ hình thành tương ứng với số lần tiêm vacxin ........................... 36 2.1. Tế bào PK 15 bị nhiễm virut DTH ..................................................................... 67 2.2. Đĩa NPLA chuẩn ................................................................................................ 67 2.3. Tế bào PK15 không nhiễm PCV2 ...................................................................... 69 2.4. Tế bào PK15 nhiễm PCV2 ................................................................................ 69 3.1. Cây di truyền dựa trên vùng 433 nucleotide của gien 5’NTR ........................... 73 3.2. Cây di truyền dựa trên vùng 671 nucleotide của vùng gien E1E2.................... 74 3.3. Cây di truyền dựa trên vùng 449 nucleotide của gien NS5B ............................. 75 3.4. Phân bố địa lý của các virut DTH thực địa nhóm 2.1và 2.2 .............................. 77 3.5. Heo 19: Xuất huyết da ........................................................................................ 90 3.6. Heo 19: Xuất huyết hạch bẹn nông .................................................................... 90 3.7. Heo 19: Xuất huyết các hạch vùng đầu.............................................................. 91 3.8. Heo 14: Ruột già chứa phân táo bón .................................................................. 91 3.9. Heo 14: Loét van hồi manh tràng ....................................................................... 92 3.10. Heo 14: Sưng đầu xương sườn ......................................................................... 92 21 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Trang 1.1. Miễn dịch thụ động và chủ động trên heo con sau tiêm vacxin ......................... 40 3.1. Thân nhiệt heo sau khi tiêm virut dịch tả heo chủng CanTho32009 (heo 2 và heo 7) và chủng DongNai42009 (heo 4 và heo 5) ..................................... 82 3.2. Thân nhiệt heo sau khi công cường độc bằng virut dịch tả heo chủng CanTho320092 .............................................................................................. 89 3.3. Diễn biến kháng thể sau tiêm vacxin DTH lúc 6 tuần tuổi ............................. 116 3.4. Phân bố heo có kháng thể DTH và kháng thể có hiệu giá ≥ 5log2 trên heo con từ 1 – 5 tuần tuổi ở tỉnh Đồng Nai, Long An và Đồng Tháp .................... 120 3.5. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 của bốn ổ heo ............................................ 125 3.6. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 của mười ổ heo .......................................... 127 3.7. Diễn biến kháng thể kháng DTH và PCV2 trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ....................................................................................... 131 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ Trang 2.1. Các bước thực hiện thí nghiệm về ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH đến hiệu lực vacxin DTH ..................................................... 53 2.2. Các bước thực hiện thí nghiệm về hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm vacxin DTH ....................................................................................................... 54 2.3. Các bước khảo sát ảnh hưởng của nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ................................................. 55

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ***************** NGUYỄN THỊ THU HỒNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ TÁC ĐỘNG ĐẾN HIỆU LỰC VACXIN DỊCH TẢ HEO TRÊN HEO CON CÁC TỈNH PHÍA NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.6250.01 LUẬN ÁN TIẾN NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN ĐÌNH TỪ PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan kết trình bày luận án cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình Tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng LỜI CẢM ƠN  Tơi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: - PGS TS Trần đình Từ - PGS TS Nguyễn Ngọc Hải Đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận án  Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, tồn thể q thầy khoa chăn ni thú y giúp đỡ khích lệ tơi thực luận án tốt nghiệp  Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Tổng Giám Đốc công ty Thuốc Thú Y TW NAVETCO, Ban Giám Đốc Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y, Phòng Đảm Bảo Chất Lượng, mơn Hóa Sinh Miễn Dịch đặc biệt tất thành viên môn nghiên cứu Siêu Vi Trùng nơi làm việc, tạo điều kiện, hỗ trợ chung sức giúp tơi hồn thành luận án  Tôi chân thành cảm ơn TS Peter Daniels – Phó Viện truởng ơng Chris Morrissy – Trưởng phòng dự án tập thể thành viên thuộc phòng chẩn đốn Australian Animal Health Laboratory – CSIRO thực giúp tơi số thí nghiệm luận án  Tôi xin cảm ơn Ban Giám Đốc cán phòng kỹ thuật công ty cổ phần chăn nuôi Phú Sơn tạo thuận lợi cho tơi triển khai thí nghiệm luận án tiến  Tôi xin tri ân gia đình người thân dành cho tơi tình u thương với động viên khích lệ để tơi an tâm hồn thành chương trình tiến TÓM TẮT Luận án “Nghiên cứu số yếu tố tác động đến hiệu lực vacxin dịch tả heo heo tỉnh phía Nam” thực nhằm xác định ảnh hưởng khác biệt phân nhóm di truyền virut dịch tả heo (DTH), đáp ứng miễn dịch vài lịch tiêm vacxin nhiễm PCV2 đến hiệu tiêm phòng vacxin DTH Các kết nghiên cứu trình bày sau: Nghiên cứu ảnh hưởng khác biệt phân nhóm di truyền virut DTH hiệu lực vacxin DTH Dựa vào giải trình tự ba đoạn gien 5’NTR, E1/E2 NS5B, 37 phân lập virut DTH 14 tỉnh thành phía Nam Việt Nam từ năm 2000 - 2009 xếp vào nhóm 2.1 2.2 Gây bệnh thực nghiệm cho heo với hai phân lập virut DTH nhóm 2.1 Tiêm virut DTH chủng CanTho3/2009 cho hai heo với liều 107,5TCID50/heo virut DTH chủng DongNai4/2009 cho hai heo với liều 106,0TCID50/heo Hai chủng virut có tiến trình gây bệnh chậm với dấu hiệu lâm sàng virut huyết đặc trưng DTH; tất heo bị chết vòng 20 ngày Tiêm virut DTH chủng CanTho3/2009-2 (được phân lập từ heo bị chết tiêm virut DTH chủng CanTho3/2009) cho ba heo miễn dịch vacxin DTH tế bào NAVETCO; tất heo vacxin khỏe mạnh khơng có virut huyết công độc với liều 107,3TCID50 virut DTH thuộc nhóm 2.1 Điều cho thấy hiệu vacxin DTH sử dụng Việt Nam không bị tác động virut DTH thực địa thuộc nhóm 2.1 Nghiên cứu hiệu miễn dịch áp dụng số lịch tiêm vacxin DTH thông qua sử dụng phương pháp NPLA thử nghiệm công cường độc (1) Đáp ứng miễn dịch heo tiêm vacxin DTH NAVETCO trước bú sữa đầu: Kết cho thấy kháng thể đo heo tiêm không tiêm vacxin 30 ngày tuổi kháng thể thụ động (KTTĐ) mẹ truyền sang qua sữa đầu Tất heo tiêm vacxin khơng có kháng thể (hiệu giá kháng thể (HGKT) trung hòa < 3log2), có kháng thể (HGKT trung hòa ≥ 3log2) thời điểm cơng cường độc (30 ngày tuổi), bảo hộ hoàn toàn; ngược lại heo đối chứng có HGKT bị mắc bệnh chết sau cơng cường độc Điều chứng tỏ mũi tiêm vacxin DTH trước bú sữa đầu bảo hộ heo chống lại công cường độc (2) Đáp ứng miễn dịch thử nghiệm tiêm vacxin DTH NAVETCO hai lần, lúc trước bú sữa đầu 21 ngày tuổi: So sánh lượng kháng thể tạo thành hai lơ heo quy trình tiêm dựa theo HGKT mẹ truyền trước tiêm mũi hai, 2,8 ± 0,9log2 (gồm 12 heo) 5,8 ± 0,8log2 (gồm 11 heo) Sau tiêm vacxin lúc 21 ngày, trung bình HGKT lúc 180 ngày tuổi tương đương hai lô heo vacxin, 4,3 ± 2,2log2 4,8 ± 2,3log2 Tất năm heo từ hai lô vacxin bảo hộ hồn tồn cơng cường độc lúc 120 ngày tuổi, ba heo đối chứng có dấu hiệu điển hình DTH chết vòng ngày sau cơng cường độc Điều chứng tỏ lịch tiêm vacxinhiệu miễn dịch hai lơ heo, không tùy thuộc lượng KTTĐ diện tiêm vacxin lần hai lúc 21 ngày Ngoài ra, kết đáp ứng hình thành kháng thể heo tiêm vacxin DTH NAVETCO hai lần quy trình khác (trước bú sữa đầu 30 ngày tuổi), tương tự diễn biến kháng thể lịch tiêm vacxin trước bú sữa đầu 21 ngày (3) Đáp ứng miễn dịch áp dụng lịch tiêm vacxin DTH hai lần, lúc 21 ngày 51 ngày tuổi: So sánh kháng thể tạo thành heo tiêm vacxin DTH NAVETCO (46 heo) vacxin Pestvac (42 con) Trung bình HGKT lúc 110 ngày 170 ngày tuổi tương đương hai lô vacxin (P>0,05) Tất tám heo tiêm vacxin sống sót cơng cường độc lúc 130 ngày tuổi, hai heo đối chứng có dấu hiệu điển hình DTH heo chết sau ngày công cường độc, chứng tỏ lịch tiêm phòng có hiệu (4) Đáp ứng miễn dịch lịch tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO lần: Thực bốn heo tuần tuổi khơng kháng thể thụ động, heo tạo đáp ứng kháng thể vòng tuần đầu sau tiêm ổn định với hiệu giá ≥ 5log2 38 tuần tuổi (5) Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu đàn heo nuôi thực địa Dựa vào phân bố HGKT mẹ truyền 1363 heo từ đến tuần tuổi tỉnh Đồng Nai, Long An Đồng Tháp, cho thấy tỷ lệ heo bảo hộ (HGKT ≥ 5log2) lúc tuần tuổi 42,85%, 42,11% 24,33% Điều cho thấy thời điểm thích hợp để tiêm vacxin lần đầu tuần tuổi Xác định ảnh hưởng việc nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH Thực hai đàn heo trại Đàn gồm bốn heo xem đối chứng để xác định heo nhiễm PCV2 Đàn hai gồm mười heo xác định HGKT kháng virut DTH lúc 20, 50, 110 170 ngày tuổi sau tiêm vacxin DTH NAVETCO lúc 21 ngày 51 ngày tuổi Ngoài ra, từ đàn heo hai này, tách muời heo trước tiêm vacxin, chuyển nuôi cách ly NAVETCO tiêm vacxin cho tám heo vào thời điểm với đàn heo hai trại (lúc 21 51 ngày tuổi); hai heo đối chứng lại khơng tiêm vacxin DTH Mười heo chuyển NAVETCO khơng kháng thể kháng PCV2 trình theo dõi Kết cho thấy trung bình HGKT kháng virut DTH tương đương heo nhiễm PCV2 (đàn hai trại) heo không nhiễm PCV2 (heo NAVETCO) Nghiên cứu minh họa PCV2 không ảnh hưởng đến đáp ứng kháng thể sau tiêm phòng vaccine DTH Tóm lại, chủng virut DTH thực địa thuộc nhóm di truyền 2.1 lưu hành việc nhiễm PCV2 không ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng bệnh DTH; đồng thời, hiệu số lịch tiêm phòng vacxin cho heo khẳng định SUMMARY The study “TO EXAMINE FACTORS INFLUENCING THE EFFICACY OF CLASSICAL SWINE FEVER VACCINATION TO YOUNG PIG IN PROVINCES OF SOUTHERN VIETNAM” was conducted with the aim to determine the effects of classical swine fever virus (CSFV) genotype, vaccination programs and infection of porcine circovirus type (PCV2) on CSF vaccine efficacy The results were followed as: The influence of CSFV genotype on CSF vaccine efficacy Based on the sequence of three regions 5’NTR, E1/E2 and NS5B in the CSFV genome, 37 isolates from 14 provinces during 2000 - 2009 were clustered in two subgroups (2.1 and 2.2) Pigs were challenged by injecting two isolates of the 2.1 genotype, of which two pigs exposed to CanTho3/2009 at the dose of 107,5TCID50 and two pigs to DongNai4/2009 at the dose of 106,0TCID50 The challenged pigs showed a delayed course of sickness with typical CSFV clinical signs and viremia, and all pigs died with severe signs in 20 post-infection days The isolate CanTho3/2009-2 from the dead pig was used to challenge three pigs that were injected cell culture CSFV vaccine (C strain) The pigs remained healthy and had no viremia although the challenge dose was 107,3TCID50 of CSFV genotype 2.1, indicating CSFV genotype 2.1 did not influence the efficacy of the current CSF vaccine The immune response of pigs in different CSF vaccination programs, being determined by neutralization peroxidase link assay (NPLA) and challenge-exposure (1) Immune response of piglets to CSF vaccine injected prior to colostrum intake: The results showed that the antibodies of vaccinated and unvaccinated pigs up 30 days of age were still derived from their vaccinated dams All vaccinated pigs even with neutralizing antibody titer < 3log2 at the time of challenge (30 days of age) were fully protected, while the unvaccinated control pigs with the same antibody titers got sick and died after virulent challenge It indicates the vaccination for newly born piglets prior to colostrum suckling could provide a good protection against virulent challenge (2) Efficacy of the two-dose CSF vaccination program - prior to colostrum suckling and at 21 days of age: The serological conversion was observed in the two groups of vaccinated pigs, of which maternal-derived antibody (MDA) titers were of 2.8 ± 0.9log2 (12 pigs) and 5.8 ± 0.8log2 (11 pigs), respectively, before the second shot The average antibody titers at 180 days of age were almost similar between the two groups of vaccinated pigs (4.3 ± 2.2log2 and 4.8 ± 2.3log2, respectively) after the injection at 21 days old Five vaccinated pigs from the two groups were completely protected from a virulent CSFV challenge at 130 days of age, while three control pigs showed typically clinical signs of CSF and died at day after challenge, indicating the two-dose vaccination schedule was effective in both groups irrespective of MDA titer Besides that, antibody response of pigs in another two-dose CSF vaccination program - prior to colostrum suckling (Day 0) and at 30 days of age, had the same pattern as that of pigs vaccinated at Day and Day 21 of age (3) Efficacy of the two-dose CSF vaccination program - 21 and 51 days of age: A comparison of serological conversion was conducted in pigs vaccinated with NAVETCO vaccine (46 pigs) and with Pestvac vaccine (42 pigs) The average antibody titers at 110 and 170 days old were similar between the two groups of vaccinated pigs All of eight vaccinated pigs were completely protected from a virulent CSFV challenge at 130 days of age, while two control pigs showed typically clinical signs of CSF, of which one died at day after challenge, indicating this vaccination schedule was effective (4) Efficacy of the one-dose CSF vaccination program: The program was applied for four pigs of six weeks old when MDA completely decreased Antibody response was observed in the first weeks after injection and lasted at titers ≥ 5log2 till 38 weeks of age (5) Determining the age for the first shot of vaccine against CSF in pigs in field: Based on the distribution of CSF colostrum antibody in to week - old pigs in Đong Nai, Long An and Đong Thap provinces, about 42.85%, 42.11% and 24.33% of piglets, respectively, had an average antibody titer ≥ 5log2 at weeks of age This result indicated the appropriate time for the first shot is weeks of age The effect of PCV2 infection on the immune response to CSF vaccination Two groups of pigs from a farm were used in this experiment The first group of litters was a control to monitor PCV2 antibody The second group of 10 litters of pigs whose serum was taken at 20, 50, 110 and 170 days old to examine antibody against CSF virus after injecting CSF vaccine at 21 and 51 days old From the second group of pigs, 10 pigs were chosen before vaccination and transferred to the experimental station of NAVETCO, of which eight pigs were vaccinated at the same age as the second group on farm, 21 and 51 days old; other two pigs were not vaccinated as the control The results showed the similarity in titers of antibody against CSF virus in the pigs with (the second group on farm) and without PCV2 infection (pigs at NAVETCO), demonstrating the PCV2 infection does not influence the antibody response to CSF vaccination These results indicated the genotype 2.1 of the field CSFV and PCV2 infection had no effect on the immune response to CSF vaccination; and the efficiency of some CSF vaccination programs was confirmed 10 MỤC LỤC Chương Trang Trang tựa i Lời cam đoan ii Cảm ơn iii Tóm tắt .iv Summary vii Mục lục x Danh sách chữ viết tắt xvi Danh sách bảng xviii Danh sách hình xx Danh sách biểu đồ xxi Danh sách đồ xxi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tình hình bệnh DTH 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Việt Nam 1.2 Đặc điểm sinh học virut DTH 1.2.1 Hình thái phân loại virut DTH 1.2.2 Hệ gien virut kháng nguyên đích 1.2.3 Dịch tễ phân tử virut DTH 1.3 Các thể bệnh DTH 13 1.3.1 Cơ chế sinh bệnh 13 1.3.2 Thể cấp tính 14 1.3.3 Thể mãn tính 15 1.3.4 Thể phát bệnh muộn 16 1.4 Đáp ứng miễn dịch bệnh DTH 17 175 147 Shanyi, N li, C Zhang, Y Zhang, W Wan, J (2000) Monitoring CSF antibody levels in vaccinated swine ACIAR proceedings N94 – Canbera, 70-72 148 Sibila M., Calsamiglia M., Segales J., Blanchard P., Badiella L., Le Dima M., Domingo M., 2004 Use of polymerase chain reaction assay and an ELISA to monitor porcine circovirus type infection in pigs from farms with and without postweaning multisystemic wasting syndrome American Journal of Veterinary Research 65:88-92 149 Sinkora J., Rehakova Z., Sinkora M., Cukrowska B and Tlaskalova-Hogienova H., 2002 Early development of immune system in pig Veterinary Immunology and Immunopathology 87:301-306 150 Smit A D., Giennip H G P., Miedema G K W., Rijn P A., Terpstra C., Moormann R J M., 2000 Recombination classical swine fever (CSF) virus derived the Chinese vaccine strain (C-strain) of CSF virus retain their avirulant and immunogienic characteristics Vaccine 18: 2351-2358 151 Steiner E., Balmelli C., Geiber H., Summerfield A., McCullough K C., 2009 Cellular adaptive immune response against porcine circovirus type in subclinically infected pigs BMC Vet Res 5:45 152 Stuart D.B., Khounsy S., Boyle D.B., Greiser-Wilke I., Gleeson L.J., Westbury H.A., Mackenzie J.S., 2004 Phylogenetic analysis of E2 gene of classical swine fever viruses from Lao PDR Virus Research 104: 87-92 153 Stuart D.B., Khounsy S., Boyle D.B., Gleeson L.J., Westbury H.A., Mackenzie J.S., 2005 Genetic typing of classical swine fever viruses from Lao PDR by analysis of the 5’ non-coding region Virus Gene 31: 349-355 154 Stuart Blacksell, 2008 The molecular epidemiology of classical swine fever viruses from Lao PDR and Asia: A brief review In: Management of classical swine fever and foot and mouth disease in Lao PDR (Eds: J V Colan, S D Blacksell, C J Morrissy and A Colling) Aciar Proceedings, No 128 p.61-64 176 155 Suradhat S., Intrakamhaeng M., Sudarat D., 2001 The correlation of virus specific interferon-gamma production and protection against classical swine fever virus infection Veterinary Immunology and Immunopathology 83: 177- 189 156 Suradhat S and Damrongwatanapokin S., 2003 The influence of maternal immunity on the efficacy of a classical swine fever vaccine against classical swine fever virus, genogroup 2.2, infection Vet Microbiol 92:177-184 157 Suradhat S., Kesdangsakouwut S., Safa W., Buranapradikun S., Wongsawang S., Thanawongnuwech R., 2006 Negative impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection on the efficacy of classical swine fever vaccine Vaccine 24:2634-2642 158 Suradhat S., Damrongwatanapokin S., Thanawongnuwech R., 2007 Factors critical for successful vaccination against classical swine fever in endemic areas Vet Microbiol 119:1-9 159 Susa M., Konig M., Saalmuller A., Reddehase M.J and Thiel H.J., 1992 Pathogenesis of classical swine fever: B-lymphocyte deficiency caused by hog cholera virus J Virol 66, 1171-1175 160 Suvintrakorn K., Hanveeraphon A and Pariyakanok V., 1993 Efficacy of lappinized swine fever vaccine in piglets born from immune sows J Thai Vet Med Assoc 23:93-103 161 Terpstra C., 1977 The immunity against challenge with swine fever virus of piglets from sows vaccinated with C-strain virus Tijdschr Voor Diergieneeskunde (Amsterdam) 102:1293-1298 162 Terpstra C., Bloemraad M., Grelkens A., 1984 The neutralising peroxidase-linked assay for detection of antibody against swine fever virus Vet Microbiol 9:113-120 163 Terpstra C and Wensvoort G., 1987 Influence of the vaccination regime on the herd immune response for swine fever Vet Microbiol 13:143-151 177 164 Terpstra C and Wensvoort G., 1988 The protective value of vaccine-induced neutralising antibody titers in swine fever Vet Microbiol 16: 123-128 165 Terpstra C, Woortmeyer R, Barteling S J., 1990 Development and porperties of a cell culture produced vaccine for hog cholera based on the Chinese strain Dutsch Tieratzl Wschr 97:2:77-79 166 Terpstra C., 1991 Hog cholera: an update of present knowledge Br Vet J 147: 397- 406 167 Terzic S, Ballin-Perhaic A, Jemersic L., 1998 Evaluation of the protection of piglets originating from vaccinated sows after vaccination with classical swine fever virus strain China, Proceedings 15th Int Vet Pig Soc Congr 357 168 Terzic S, Jemersic L., lojkie M., Madie J., Grom J., Toplak I., Sver L., Valpotic I., 2003 Comparison of antibody values in sera of pigs vaccinated with a subunit or an attenuated vaccine against classical swine fever Veterinary Research Communication 27:329-339 169 Theerapol S., Worawidh W., Preeda L., Wilairat S., Kitcha U., Suwitcha K., Concurrent infection of porcine circovirus and ckassical swine fever virus http://www.vet.ku.ac.th/vet-eng/path/theerapon.htm 170 Tischer I., Gelderblom H., Vettermann W., Koch M., 1982 A very small porcine virus with circular single stranded DNA Nature 295:64-66 171 Tizard R I., 2009 Verterinary Immunology – An introduction 8th edition SAUDERS ELSEVIER Publishing 172 Tu C., Lu Z., Li H., Yu X., Liu X., Li Y., Zhang H., Yin Z., 2001 Phylogenetic comparison of classical swine fever virus in China Virus Res 81 (1-2): 29-37 173 Torlone V., Tiloti F., Gialetti L., 1967 Efficacy of a lapinized hog cholera vaccine (Chine virus strain) Vet Ital 1-17 174 Van Bekkum J G., 1966 Serological aspects of the vaccination against hog cholera with crystal violet vaccine Tijdschr Diergieneeskd 91:149-170 178 175 Vandeputte J., Too H L., Ng F K., Chen C., Chai K K., Liao G A., 2001 Absorption of colostral antibodies against classical swine fever, persistence of maternal antibodies, and effect on response to vaccination in baby pigs AJVR., 62 (11): 1805-1811 176 Vanderhallen H., Mittelholzer C., Hofmann M., Koenen P., 1999 Classical swine fever virus is genitically stable in vitro and in vivo Arch Viro., 144:1669-1672 177 Van der Molen E J And Van Oirschot J T., 1981 Congenital persistent swine fever (hog cholera) I Pathological lessions in lymphoid tissues, kidney and adrenal Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B, 28:89-101 178 Van Oirschot, J.T and Terpstra, C.A., 1977 A congenital persistant swine fever infection I Clinical and virological observations II Immune response to swine fever and unrelated antigens Vet Microbiol., 2, p 121 – 142 179 Van Oirschot, J.T., 2003, Vaccinology of classical swine fever: from lab to field Vet Microbiol., 96:367-384 180 Vilcek S., Stadejek T., Ballagi-Pordany A., Lowings P., Panton D., Belak S., 1996 Genetic variability of classical swine fever virus Virus Res., 43:137-147 181 Vinccent I E., Balmelli C., Meehan B., Allan G., Summerfield A., McCullough K C., 2007 Silencing of natural interferon producing cell activation by porcine circovirus type DNA Immunology, 120: 47-56 182 Wang Q., Ning Y B., 2003 Major factors leading to failed immunization against classical swine fever Pig World, 7:7-9 (in Chinese) 183 Weiland E., Ahl R., Stark R., Weiland F., Theil H J., 1992 A second envelope glycoprotein mediates neutralization of a pestivirus, hog cholera virus J Virol., 66:3677-3682 184 Zhu Y., Shi Z., Drew W T., Wang Q., Qiu H., Guo H., Tu C., 2009 Antigenic differentiation of classical swine fever in China by monoclonal antibodies Virus Research 142:169-174 179 185 http://www.navetco.com.vn/vn/p35d17d=Dich-ta-heo-te-bao-nhuoc-doc-dong , truy cập năm 2010 186 http://www.asifac.com.vn/sanpham/viewsp.php?Pro=1, truy cập năm 2010 187 http://www.viphavet.com/html/vac-xin-heo.html#PESTIFFA, truy cập năm 2010 180 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp trung hòa nối kết enzym – NPLA Các bước chuẩn bị - Xử lý mẫu: Lấy huyết đem ly tâm từ 2500 - 3000 vòng/10 phút Sau loại bỏ phần cặn, chiết lấy huyết cho vào ống eppendorf vô trùng Tất mẫu huyết bất hoạt 560C/30 phút nồi hấp cách thủy Sau đem mẫu bảo quản -200C để thực phản ứng trung hòa - Mơi trường: * Dung dịch pha lỗng mẫu gồm: EMEM + Penicilline + Streptomycine + Kanamycine + Fungizone + 1% FCS * Dung dịch pha loãng virut gồm: EMEM + Penicilline + Streptomycine + Kanamycine + Fungizone + 10% FCS * Dung dịch nuôi cấy tế bào gồm: EMEM + Penicilline + Streptomycine + Kanamycine + Fungizone + 10% FCS Các bước tiến hành (1) Các mẫu huyết thử nghiệm mẫu đối chứng (đối chứng âm, dương) pha loãng nhiều nồng độ nồng độ bắt đầu 1/4 * Cho 50l dung dịch pha loãng mẫu vào tất giếng trừ giếng để chuẩn độ virut * Cho thêm 25l huyết bất hoạt vào giếng thứ dãy pha loãng pha loãng huyết theo số * Cho 50l dung dịch pha loãng mẫu vào giếng tế bào đối chứng (2) Pha loãng virut dung dịch pha loãng mẫu tới nồng độ hoạt động cho 50l vào tất giếng trừ giếng chuẩn độ virut tế bào đối chứng 181 (3) Chuẩn độ virut: virut nồng độ hoạt động (Working Dilution: WD), pha loãng 1/2 tiếp đến pha loãng 1/10, 1/100, 1/1000 Cho 50l/độ pha loãng/4 giếng (4) Ủ đĩa 370C tủ ấm 5% CO2 (5) Thêm 100l huyễn dịch tế bào PK15 vào tất giếng (6) Ủ đĩa ngày 370C tủ ấm 5% CO2 (7) Kiểm tra đĩa kính hiển vi đảo để tìm tế bào bị toxic khác thường, đánh dấu trước nhuộm IPX Phụ lục 2: Phương pháp nhuộm IPX (1) Rút bỏ mơi trường trì rửa tế bào lần với dung dịch PBSA (2) Cố định tế bào dung dịch PBSA 10% formaldehyde 0,1% NP40, cho 200l/ giếng, để nhiệt độ phòng /20 phút (3) Rửa lần dung dịch PBSA (4) Cho vào giếng 50l Mab CSFV 26/10 (pha lỗng 1/200 dung dịch PBSA 1% sữa khơng kem) đem ủ 370C/1 (5) Rửa lần dung dịch PBST (6) Cho vào giếng 50l conjugate kháng thể kháng chuột (pha loãng 1/500 dung dịch đệm PBSA) đem ủ 370C /1 tủ CO2 (7) Rửa lần dung dịch PBST (8) Nhỏ giếng 200l dung dịch đệm substrate, để 15 phút nhiệt độ phòng (9) Đem rửa nước để làm ngưng phản ứng (10) Đọc kết kính hiển vi đảo Phụ lục 3: Phương pháp chuẩn độ virut DTH tế bào dòng PK15 Xử lý mẫu: - Mẫu máu kháng đông mẫu dịch tế bào pha loãng từ nồng độ 10-1 đến 10-6 Chuẩn độ virut tế bào PK15 đĩa 96 giếng 182 Cách thực (1) Rửa tế bào PK15 phát triển lớp (monolayer) bề mặt đĩa nhựa 100µl dung dịch PBS /giếng (2) Hút hết PBS ra, cho vào giếng 100µl huyễn dịch virut độ pha loãng tương ứng (Đối với độ pha loãng huyễn dịch bệnh phẩm, thực giếng) (3) Đối với giếng đối chứng, mẫu đối chứng dương (+VE) virut chuẩn chủng Weybridge (độ pha loãng 1/10), mẫu đối chứng âm (-VE) thay dung dịch MEM (4) Ủ 370C / 60 phút tủ ấm 5% CO2 (5) Hút huyễn dịch giếng ra, cho vào giếng 100µl dung dịch MEM Ủ 370C / 96 tủ ấm 5% CO2 (5) Kiểm tra phát triển tế bào sau 24 (7) Khi cần thiết điều chỉnh pH mơi trường NaHCO3 Phụ lục 4: Phương pháp ELISA phát kháng nguyên P125 Phương pháp gồm hai bước: trước hết liên kết KN KT đơn dòng Mab đĩa chuyển (transfer plate), sau chuyển hỗn hợp KN/Mab liên kết sang đĩa ELISA phủ KT đa dòng kháng Pestivirus trước Các liên kết KN KT phát hệ thống chất tiếp hợp (conjugate) KT kháng IgG chuột liên kết với biotin streptavidin peroxidase Sau cho chất enzyme H2O2 TMB Màu xanh xuất mẫu dương tính Phản ứng làm ngưng sau 10 phút dung dịch H2SO4 1M Đọc mật độ quang (OD) phản ứng kính lọc 450nm Cách đọc kết quả: Đọc mật độ quang kính lọc 450nm OD trung bình -HCV Tỷ lệ = OD trung bình Control Mab - >2 dương tính, từ 1,5 – 1,9 nghi ngờ (nên làm lại),

Ngày đăng: 06/12/2017, 17:55

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan