Luận văn Tiến Sĩ: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Thành Phố

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và trân trọng đến PGS Tiến sĩ Trần Văn Minh và PGS Tiến sĩ Bùi Cách Tuyến đã nhận hướng dẫn khoa học cho luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn GS Tiến sĩ Bùi Chí Bửu và GS Tiến sĩ Nguyễn Thị Lang đã giúp đỡ trong việc áp dụng phương pháp khảo sát đa dạng di truyền. Tôi xin trân trọng cám ơn Viện Công Nghệ sinh học và Môi trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long trong việc giúp đỡ và tạo điều kiện cho việc tiến hành các thí nghiệm. Xin trân trọng cảm ơn Vườn Quốc gia Phú Quốc, Chi cục Kiểm Lâm Quảng Nam, Ủy Ban Dân tộc Miền núi, Trung tâm Khảo sát Thiết kế Nông nghiệp tỉnh Khánh Hòa, Chi cục Kiểm Lâm An Giang và Thảo Cầm Viên TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ trong các cuộc khảo sát thực tế. TP. HCM, ngày 15 tháng 3 năm 2010 Đinh Trung Chánh v TÓM TẮT Trong Luận án này, chúng tôi trình bày: (1) kết quả khảo sát trên hiện trường và các thí nghiệm trong phòng cũng như trên thực địa nhằm tìm hiểu đặc điểm của những cây Dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) đang có trầm; (2) ứng dụng di truyền học phân tử để khảo sát đa dạng dưới loài; (3) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, phát sinh phôi soma và tạo hạt giống nhân tạo để nhân nhanh giống cây Dó bầu từ các cá thể cây mẹ có trầm; (4) thăm dò khả năng kích thích tạo trầm bằng các biện pháp vi sinh và hóa học. Phần tổng quan đã dựa vào nhiều nguồn tài liệu tham khảo, nhấn mạnh rằng giá trị cao của gỗ trầm là một động lực dẫn tới sự khai thác quá mức và sự cạn kiệt của các loài cây này trong rừng tự nhiên. Nhưng nông dân các tỉnh được khảo sát từ Quảng Nam trở vào cho đến đảo Phú Quốc đã đáp ứng với tình hình khan hiếm các sản phẩm trầm bằng các kỹ thuật trồng, quản lý, kích thích tạo trầm và khai thác trầm một cách đa dạng. Một số kỹ thuật dân gian để kích thích sự tạo trầm đã được ghi nhận. Nghiên cứu đa dạng dưới loài được thực hiện với hai phương pháp sinh học phân tử: phản ứng PCRRAPD và giải trình tự chuỗi DNA. Sử dụng phản ứng PCRRAPD trên 12 mẫu cá thể cây Dó bầu thí nghiệm từ các xuất xứ gần nhau và trong quần thể cho thấy các mẫu được chia thành 5 nhóm chính, phản ánh sự đa dạng dưới loài của các mẫu Dó bầu được khảo sát. Kết quả nghiên cứu trình tự DNA của bốn xuất xứ Dó bầu khác nhau cũng đã củng cố cho kết luận về đa dạng dưới loài từ phương pháp PCR. Mẫu vật thu thập từ những cây Dó bầu có dấu hiệu tạo trầm được sử dụng cho các thí nghiệm nuôi cấy mô qua hai bước chính: (1) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và (2) nuôi cấy phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo. Các thí nghiệm nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tập trung vào việc xác định môi trường thích hợp, tác dụng của sự bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng cũng như các điều kiện vật lý ảnh hưởng lên sự vi nhân giống invitro từ đỉnh sinh trưởng. Môi trường WPM tỏ ra tốt hơn môi trường MS cho việc nuôi cấy. So sánh các vật liệu nguồn từ Bắc đảo Phú Quốc vi (BD1 và BD2) và từ Nam đảo Phú Quốc (ND1 và ND2) cho thấy xuất xứ này có ảnh hưởng lên sự hình thành và phát triển chồi invitro. Các thí nghiệm nuôi cấy tế bào soma được thiết kế liên hoàn nhằm dẫn tới việc sản xuất hạt giống nhân tạo có thể sử dụng thuận tiện trong việc nhân nuôi cây con thay cho hạt giống thực sinh. Việc nuôi cấy phát sinh tế bào phôi soma từ các mẫu lá và rễ trên môi trường cơ bản MS bổ sung BA, kinetin, NAA, IBA, 2,4D, vitamin B5 cho thấy tỷ lệ phát sinh tế bào soma cao với mẫu nuôi cấy là rễ (dòng ND, nam đảo Phú Quốc). Sau khi có phôi soma, thí nghiệm nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma được tiến hành trên môi trường nuôi cấy có agar, nhân sinh khối trên môi trường lỏng và sau đó tái sinh phôi soma. Thể giả phôi (PLB), một dạng thuận lợi cho sự vi nhân giống, được chuyên hóa bằng cách bổ sung kích thích tố. Hạt giống nhân tạo được thực hiện với natri alginat và calci clorua trên môi trường WPM bổ sung sucrose. Natri alginat 4% cho một độ đông đặc thỏa đáng và không ảnh hưởng bất lợi lên sự tái sinh. Sinh trưởng của cây con sau nuôi cấy trong ống nghiệm được theo dõi ở vườn ươm trong 12 tháng. Sự khác biệt về sinh trưởng của cây con từ bốn xuất xứ ND1, ND2, BD1, BD2 là không có ý nghĩa, nhưng bề rộng lá từ ND1 và ND2 nhỏ hơn từ BD1, BD2. Sự phân lập nấm trên các mô có dấu hiệu hình thành trầm đã cho phép xác định một tập đoàn gồm 10 loài nấm khác nhau hiện diện trong các mô gỗ được khảo sát. Một số chi nấm được xác định tương đồng với một số công trình gần đây. Từ đó, thí nghiệm thăm dò kích thích tạo trầm với bảy nghiệm thức (vi sinh và hóa học) trên ba địa điểm: Đại Lãnh (Nha Trang), Thảo Cầm Viên (TP. Hồ Chí Minh) và Vĩnh Long đã được thực hiện. Kết quả không hoàn toàn đồng nhất ở ba địa điểm này mặc dù xử lý bằng clorua (Cl) mang lại tác dụng cao ở hai trong ba địa điểm và cũng được xếp hạng cao nhất. Xử lý bằng nấm đen và nitrat (NO 3) cho kết quả đứng thứ hai ở Đại Lãnh và Thảo Cầm Viên và thứ nhất ở Vĩnh Long. vii SUMMARY This thesis presents findings from field studies, laboratory and in situ experiments on the characteristics of Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte (eaglewood) and the application of plant cell technologies to propagate specific clones of this endangered species of Vietnam. Besides, explorative experiments on the inducement of eaglewood formation from planted trees of this species were also performed. A review of litteratures was performed, focusing on the characteristics of the species and a wide range of utilization and market value of eaglewood and its derivatives in Asia. The studies on formation of eaglewood in the nature and in controlled experiments were also reviewed. The high value of eaglewood and its products has been the main motivation of its overexploitation, and leading to depletion of the species in natural forests. However, field studies conducted in various provinces in the natural area of the species from Quảng Nam to Phú Quốc shown a positive trend of planting Aquilaria and inducing eaglewood formation initiated by farmers. PCRRAPD and DNA sequencing were used to explore the intraspecific diversity. High similarity values (0.751.0) were obtained from a test with 18 samples, which can be grouped into 5 clusters, relecting the provenances of the samples. DNA sequencing was also performed on 4 samples and chains of both DNA and proteins were elaborated. Distance analyses shown the possibility of grouping the samples based on DNA chain was better than those based on protein sequences. Materials collected during the field visits in North and South Phú Quốc Island from Aquilaria trees having indications of eaglewood formation were used in micropropagation experiments. Two set of experiments were conducted, meristematic and somatic cell cultures, to find appropriate techniques and conditions. The meristematic culture experiments aim to determine suitable medium, the addition of growth regulators and the physical condition affecting in viii vitro propagation and development of plantets. The somatic cell culture experiments were designed according to a schemee that leads to the production of artificial seeds, i.e. a form of culture embedding in organic polymers to be conveniently used as natural seed substitues. In meristematic culture, WPM was found better than MS medium. The addition of BA (0.1 mgl) and NAA (0.1 mgl) was found suitable for protocorm formation, while the supplementation of CW was found giving a high rate of differentiation. A combination of BA (0.1 mgl) and BA (0.1 mgl) + NAA (0.1 mgl) gave better shoot elongation of the plantets invitro. Besides, a high light intensity (54.72 μmolm2s), combined with good aeration is required for the growth and development of the cultures. A comparison of the stocks, including two from North Phu Quoc Island (BD1 and BD2) and two from South Phu Quoc Island (ND1 and ND2), shown that provenances influences the variations of shoot formation and growth invitro. Somatic cell cultures were performed with leaf and root tissues on MS medium with the supplementation of BA, Ki, NAA, IBA, 2,4D, and vitamine B5. Root tissues from ND stock gave good results. Somatic cells developed rapidly in media supplemented with 2,4D, while in media with BA + NAA + Ki + vitamine B5 the somatic cells had a milky white color. Somatic cell suspensions were multiplied in liquid media or in media gelatinized with agaragar and somatic embryos were regenerated. PLB, a convenient form for micropropagation, can be differentiated by the supplementation of BA (5mgl) + NAA (0.2 mgl) or Ki (3 mgl) + NAA (0.2 mgl) and the results were better than BA or Ki alone. Artificial seed production experiments were performed with sodium alginat and the seeds were regenerated with sodium chloride on WPM with the addition of sucrose. Sodium alginate at 4% was found giving an adequate consistency, but a higher concentration can give harmful effect on regeneration. The growth of the seedlings from micropropagated plantets were monitored up to 12 months. The differences of growth performances of plantets from 4 stocks ix ND1, ND2, BD1, BD2 were found nonsignificant but leaf widths of the plantet from ND1 and ND2 stocks were smaller than from BD1, BD2. Ten (10) fungi species were isolated and identified in the samples of infected wood. Certain similarity between our results and fungi recorded by previous authors were recognized. Based on results of the isolation experiments and the field study, an explorative experiement was carriedout with seven treatments: (1) Control, (2) White fungi, (3) Black fungi, (4) Chlorinebased (Cl) , (5) Oilbased, (6) Sulfate (SO4 2) , (7) Nitrate (NO3 ), on three sites: Đại Lãnh, The HCMC Zoo and Vĩnh Long. The results were not totally consistent in three sites, although the effect of chlorinebased treatment was high in two of three sites and was assessed as highest in the total score. Black fungi and nitratebased treatments were ranked second of seven treatments. x MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................iii TÓM TẮT ............................................................................................................................ v SUMMARY ........................................................................................................................ vii MỤC LỤC ........................................................................................................................... x BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................................xiiiii DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................................ xv DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ .......................................................................... xviii Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1.1. Lý do thực hiện đề tài ................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................. 3 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................................. 3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................... 4 1.4.1. Về mặt khoa học ................................................................................................. 4 1.4.2. Về mặt thực tiễn .................................................................................................. 4 1.5. Những đóng góp mới của luận án .............................................................................. 4 Chương 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ......................................................................... 6 2.1. Cây Dó bầu và sản phẩm trầm hương ........................................................................ 6 2.1.1. Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Dó bầu ............................................ 6 2.1.2. Công dụng và phân loại trầm hương ................................................................... 8 2.2. Cơ sở lý thuyết của đề tài ......................................................................................... 10 2.2.1. Đánh giá đa dạng di truyền ............................................................................... 10 2.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy phát sinh phôi soma .............. 12 2.2.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ......................................................................... 12 2.2.2.2. Nuôi cấy phát sinh phôi soma ..................................................................... 14 2.2.3. Sự hình thành trầm hương ................................................................................ 17 Chương 3 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 23 3.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 23 3.1.1. Điều tra thực trạng, sưu tầm và lấy mẫu khảo sát ............................................ 23 3.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền ở cấp độ dưới loài ................................................. 23 3.1.3. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và sản xuất hạt giống nhân tạo từ các cây Dó bầu đã cho trầm ........................................................................................ 24 xi 3.1.4. Nghiên cứu bước đầu gây tạo trầm (agarwood) trên cây Dó bầu bằng phương pháp vi sinh và hoá học. .............................................................................................. 24 3.2. Địa điểm và vật liệu thí nghiệm ............................................................................... 24 3.2.1. Địa điểm khảo sát thực địa................................................................................ 24 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 25 3.2.2.1. Vật liệu đánh giá đa dạng di truyền cấp dưới loài: ..................................... 25 3.2.2.2. Vật liệu nuôi cấy mô và tạo hạt nhân tạo:................................................... 26 3.2.2.3. Vật liệu thí nghiệm tạo trầm: ...................................................................... 27 3.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 28 3.3.1. Phương pháp điều tra thực địa và sưu tập mẫu vật ........................................ 28 3.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền cấp dưới loài ................................. 29 3.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nuôi cấy phôi soma và tạo hạt nhân tạo ............. 36 3.3.4. Phân lập các loài vi sinh và kích thích sự tạo trầm ........................................ 40 Chương 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............................................. 43 4.1. Kết quả điều tra thực địa .......................................................................................... 43 4.1.1. Hiện trạng gây trồng cây Dó bầu ở các địa điểm điều tra ................................. 43 4.1.2. Phân loại và phân cấp sản phẩm trầm hương ở các địa phương ....................... 45 4.1.3. Kỹ thuật kích thích tạo trầm ở các địa điểm điều tra ........................................ 46 4.2. Kết quả phân tích đa dạng dưới loài của các dòng Dó bầu...................................... 48 4.2.1. Sản phẩm phản ứng PCR với các chất mồi (primers) ....................................... 48 4.2.2. Phân tích trình tự đoạn nucleotid được dòng hóa trong plasmid ..................... 54 4.3. Kết quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và sản xuất hạt giống nhân tạo từ các cây Dó bầu đã cho trầm ........................................................................................ 58 4.3.1. Nuôi cấy chồi đỉnh sinh trưởng cây Dó bầu in vitro ......................................... 58 4.3.2. Nuôi cấy phát sinh phôi soma ........................................................................... 67 4.3.3. Nuôi cấy tế bào soma và tạo hạt nhân tạo cây Dó bầu ..................................... 75 4.3.4. Thuần hóa và ươm nuôi cây Dó bầu cấy mô .................................................... 97 4.4. Kết quả phân lập các loài vi sinh và thí nghiệm kích thích sự tạo trầm ................ 104 4.4.1. Kết quả phân lập và định danh vi sinh vật trong các mô gỗ có trầm .............. 104 4.4.2. Thí nghiệm thăm dò sự lây nhiễm và kích thích tạo trầm .............................. 105 4.4.3. Sự biến đổi của mô gỗ sau khi kích thích tạo trầm ......................................... 109 4.4.4. Thành phần hoá học của tinh dầu trầm do thí nghiệm lây nhiễm ................... 114 xii Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 117 5.1. Kết luận .................................................................................................................. 117 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 119 TIẾNG VIỆT ............................................................................................................... 119 TIẾNG NƯỚC NGOÀI .............................................................................................. 121 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 124 PHỤ LỤC 1. KHẢO SÁT THỰC ĐỊA 124 Phụ lục 1.1.Bảng tổng hợp phỏng vấn các hộ có tham gia khai thác và sản xuất trầm hương Phụ lục 1.2: Hình ảnh phỏng vấn các hộ có tham gia khai thác và sản xuất trầm PHỤ LỤC 2. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN................................................125 Phụ lục 2.1. Tiến trình lấy mẫu và thiết bị khảo sát đa dạng di truyền Phụ lục 2.2 Sản phẩm PCR Phụ lục 2.3: Giải trình tự DNA của 4 dòng Dó bầu có xuất xứ địa lý khác nhau PHỤ LỤC 3. THÍ NGHIỆM NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY DÓ BẦU.................125 Phụ lục 3. 1. Sơ đồ rút gọn nuôi cấy phôi soma và tạo hạt nhân tạo cây Dó bầu Phụ lục 3.2. Sơ đồ vị trí lấy mẫu Dó bầu có trầm để thí nghiệm nuôi cấy Phụ lục 3.3. Hình ảnh lấy mẫu và thí nghiệm nhân giống vô tính Phụ lục 3.4. Môi trường cơ bản dùng trong các thí nghiệm nuôi cấy PHỤ LỤC 4. KHẢO SÁT SỰ LÂY NHIỄM TẠO TRẦM VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TRẦM HƯƠNG................168 Phụ lục 4.1 Hình ảnh lây nhiễm tạo trầm, sơ chế và phân loại trầm hương Phụ lục 4.2. Phiếu Giám định nấm trên các mẫu gỗ Dó bầu có trầm ở các vùng khảo sát Phụ lục 4.3. Thành phần hóa học của trầm hương nguyên liệu mua ở Khánh Hòa Phụ lục 4.4. Thành phần hóa học của trầm hương lấy từ thí nghiệm lây nhiễm xiii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4dichorophenoxyacetic acid ABA acetyl butyric acid ADP adenosin diphosphat AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình Khuếch đại Độ dài Đoạn) AMP adenosin monophosphat APPCR Arbitrary primed PCR (PCR với chất mồi bất kỳ) ATP adenosin triphosphat BA 6benzyl aminopurin BD Bắc đảo Phú Quốc CAD cinnamil alcol dehydrogenase CORR Correlation (Tương quan) CRD Complete Random Design (Kiểu thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên) CTAB Cetyltrimetilammonium bromur CV% Coefficient of variation (Hệ số biến động) CW Coconut water (nước dừa) DAF DNA amplified fingerprinting (Phương pháp dấu ấn DNA khuếch đại) DAP Day after planting (ngày sau nuôi cấy) DMSO Hóa chất dimetil sulphoxid DNA Desoxyribonucleic acid ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long EC Embryogenic clump (cụm sinh phôi) EDTA Etylen diamine tetra acetat EN Endangered (cấp nguy cơ) GCMS Gas Chromatography Mass Spectrophotometry (sắc ký khí khối phổ) IAA βIndol acetic acid IBA βIndol butyric acid Ki Kinetin (6furfuryl aminopurine) LSD Least significant difference (hiệu số hay số sai biệt có nghĩa nhỏ nhất, hoặc còn gọi là khoảng sai dị tối thiểu) MS Môi trường MurashigeSkoog (1962) MSStat Phần mềm thống kê NAA αNaptalen acetic acid ND Nam đảo Phú Quốc NST Nhiễm sắc thể NTSYS Numerical Taxonomy System (hệ thống phân loại số) xiv PAC Paclobutrazol (chất kìm hảm sinh trưởng phát triển thân lá) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) PDA PotatoDextrose Agar (môi trường khoai tây, đường dextroz và agar) PLB Protocormlike body (thể sinh cụm chồi hay thể giả phôi) RAPD Randomirized Amplified Polymorphism DNA (đa hình DNA khuếch đại ngẫu nhiên) RCBD Randomized Complete Block Design (kiểu thí nghiệm khối đầy đủ) SAHN Sequential agglomerative hierachic nonoverlapping SDS Sodium dodecyl sulfate (natri dodecyl sulfat) SSR Simple sequence repeat (Loạt lặp lại đơn) SYSTAT Phần mềm thống kê TAE Tris base, Acetic acid và EDTA TE TrisEDTA (Dung dịch đệm) UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (khoảng cách bắt cặp không gia quyền với trung bình cộng) UV Ultra Violet (tia cực tím) WinDis Phần mềm thống kê WPM Woody Plant Medium (môi trường cho cây gỗ) của Loyd và McCown, 1981

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

**************

ĐINH TRUNG CHÁNH

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU

(Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC

Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Thành Phố Hồ Chí Minh - Năm 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

**************

ĐINH TRUNG CHÁNH

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU

(Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Đinh Trung Chánh

Ủy Ban Dân tộc Miền núi, Trung tâm Khảo sát Thiết kế Nông nghiệp tỉnh Khánh Hòa, Chi cục Kiểm Lâm An Giang và Thảo Cầm Viên TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ trong các cuộc khảo sát thực tế

TP HCM, ngày 15 tháng 3 năm 2010

Đinh Trung Chánh

TÓM TẮT

Trong Luận án này, chúng tôi trình bày: (1) kết quả khảo sát trên hiện trường

và các thí nghiệm trong phòng cũng như trên thực địa nhằm tìm hiểu đặc điểm của

những cây Dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) đang có trầm; (2) ứng

dụng di truyền học phân tử để khảo sát đa dạng dưới loài; (3) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, phát sinh phôi soma và tạo hạt giống nhân tạo để nhân nhanh giống cây Dó bầu từ các cá thể cây mẹ có trầm; (4) thăm dò khả năng kích thích tạo trầm bằng các biện pháp vi sinh và hóa học

Phần tổng quan đã dựa vào nhiều nguồn tài liệu tham khảo, nhấn mạnh rằng giá trị cao của gỗ trầm là một động lực dẫn tới sự khai thác quá mức và sự cạn kiệt của các loài cây này trong rừng tự nhiên Nhưng nông dân các tỉnh được khảo sát từ Quảng Nam trở vào cho đến đảo Phú Quốc đã đáp ứng với tình hình khan hiếm các sản phẩm trầm bằng các kỹ thuật trồng, quản lý, kích thích tạo trầm và khai thác trầm một cách đa dạng Một số kỹ thuật dân gian để kích thích sự tạo trầm đã được ghi nhận

Nghiên cứu đa dạng dưới loài được thực hiện với hai phương pháp sinh học phân tử: phản ứng PCR-RAPD và giải trình tự chuỗi DNA Sử dụng phản ứng PCR-RAPD trên 12 mẫu cá thể cây Dó bầu thí nghiệm từ các xuất xứ gần nhau và trong quần thể cho thấy các mẫu được chia thành 5 nhóm chính, phản ánh sự đa dạng dưới loài của các mẫu Dó bầu được khảo sát Kết quả nghiên cứu trình tự DNA của bốn xuất xứ Dó bầu khác nhau cũng đã củng cố cho kết luận về đa dạng dưới loài từ phương pháp PCR

Mẫu vật thu thập từ những cây Dó bầu có dấu hiệu tạo trầm được sử dụng cho các thí nghiệm nuôi cấy mô qua hai bước chính: (1) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và (2) nuôi cấy phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo Các thí nghiệm nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tập trung vào việc xác định môi trường thích hợp, tác dụng của sự bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng cũng như các điều kiện vật lý ảnh hưởng lên sự

vi nhân giống in-vitro từ đỉnh sinh trưởng Môi trường WPM tỏ ra tốt hơn môi

trường MS cho việc nuôi cấy So sánh các vật liệu nguồn từ Bắc đảo Phú Quốc

(BD1 và BD2) và từ Nam đảo Phú Quốc (ND1 và ND2) cho thấy xuất xứ này có

ảnh hưởng lên sự hình thành và phát triển chồi in-vitro

Các thí nghiệm nuôi cấy tế bào soma được thiết kế liên hoàn nhằm dẫn tới việc sản xuất "hạt giống nhân tạo" có thể sử dụng thuận tiện trong việc nhân nuôi cây con thay cho hạt giống thực sinh Việc nuôi cấy phát sinh tế bào phôi soma từ các mẫu lá và rễ trên môi trường cơ bản MS bổ sung BA, kinetin, NAA, IBA, 2,4D, vitamin B5 cho thấy tỷ lệ phát sinh tế bào soma cao với mẫu nuôi cấy là rễ (dòng

ND, nam đảo Phú Quốc) Sau khi có phôi soma, thí nghiệm nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma được tiến hành trên môi trường nuôi cấy có agar, nhân sinh khối trên môi trường lỏng và sau đó tái sinh phôi soma Thể giả phôi (PLB), một dạng thuận lợi cho sự vi nhân giống, được chuyên hóa bằng cách bổ sung kích thích

tố "Hạt giống nhân tạo" được thực hiện với natri alginat và calci clorua trên môi trường WPM bổ sung sucrose Natri alginat 4% cho một độ đông đặc thỏa đáng và không ảnh hưởng bất lợi lên sự tái sinh

Sinh trưởng của cây con sau nuôi cấy trong ống nghiệm được theo dõi ở vườn ươm trong 12 tháng Sự khác biệt về sinh trưởng của cây con từ bốn xuất xứ ND1, ND2, BD1, BD2 là không có ý nghĩa, nhưng bề rộng lá từ ND1 và ND2 nhỏ hơn từ BD1, BD2

Sự phân lập nấm trên các mô có dấu hiệu hình thành trầm đã cho phép xác định một tập đoàn gồm 10 loài nấm khác nhau hiện diện trong các mô gỗ được khảo sát Một số chi nấm được xác định tương đồng với một số công trình gần đây Từ đó, thí nghiệm thăm dò kích thích tạo trầm với bảy nghiệm thức (vi sinh và hóa học) trên ba địa điểm: Đại Lãnh (Nha Trang), Thảo Cầm Viên (TP Hồ Chí Minh) và Vĩnh Long đã được thực hiện Kết quả không hoàn toàn đồng nhất ở ba địa điểm này mặc dù xử lý bằng clorua (Cl-) mang lại tác dụng cao ở hai trong ba địa điểm

và cũng được xếp hạng cao nhất Xử lý bằng nấm đen và nitrat (NO-3) cho kết quả đứng thứ hai ở Đại Lãnh và Thảo Cầm Viên và thứ nhất ở Vĩnh Long

A review of litteratures was performed, focusing on the characteristics of the species and a wide range of utilization and market value of eagle-wood and its derivatives in Asia The studies on formation of eagle-wood in the nature and in controlled experiments were also reviewed The high value of eagle-wood and its products has been the main motivation of its over-exploitation, and leading to depletion of the species in natural forests However, field studies conducted in various provinces in the natural area of the species from Quảng Nam to Phú Quốc

shown a positive trend of planting Aquilaria and inducing eagle-wood formation

initiated by farmers

PCR-RAPD and DNA sequencing were used to explore the intraspecific diversity High similarity values (0.75-1.0) were obtained from a test with 18 samples, which can be grouped into 5 clusters, relecting the provenances of the samples DNA sequencing was also performed on 4 samples and chains of both DNA and proteins were elaborated Distance analyses shown the possibility of grouping the samples based on DNA chain was better than those based on protein sequences

Materials collected during the field visits in North and South Phú Quốc Island

from Aquilaria trees having indications of eaglewood formation were used in

micro-propagation experiments Two set of experiments were conducted, meristematic and somatic cell cultures, to find appropriate techniques and conditions The meristematic culture experiments aim to determine suitable

medium, the addition of growth regulators and the physical condition affecting in

vitro propagation and development of plantets The somatic cell culture

experiments were designed according to a schemee that leads to the production of

"artificial seeds", i.e a form of culture embedding in organic polymers to be conveniently used as natural seed substitues

In meristematic culture, WPM was found better than MS medium The addition

of BA (0.1 mg/l) and NAA (0.1 mg/l) was found suitable for protocorm formation, while the supplementation of CW was found giving a high rate of differentiation A combination of BA (0.1 mg/l) and BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) gave better

shoot elongation of the plantets in-vitro Besides, a high light intensity (54.72

μmol/m2/s), combined with good aeration is required for the growth and development of the cultures A comparison of the stocks, including two from North Phu Quoc Island (BD1 and BD2) and two from South Phu Quoc Island (ND1 and ND2), shown that provenances influences the variations of shoot formation and

growth in-vitro

Somatic cell cultures were performed with leaf and root tissues on MS medium with the supplementation of BA, Ki, NAA, IBA, 2,4D, and vitamine B5 Root tissues from ND stock gave good results Somatic cells developed rapidly in media supplemented with 2,4-D, while in media with BA + NAA + Ki + vitamine B5 the somatic cells had a milky white color Somatic cell suspensions were multiplied in liquid media or in media gelatinized with agar-agar and somatic embryos were regenerated PLB, a convenient form for micropropagation, can be differentiated by the supplementation of BA (5mg/l) + NAA (0.2 mg/l) or Ki (3 mg/l) + NAA (0.2 mg/l) and the results were better than BA or Ki alone Artificial seed production experiments were performed with sodium alginat and the "seeds" were regenerated with sodium chloride on WPM with the addition of sucrose Sodium alginate at 4% was found giving an adequate consistency, but a higher concentration can give harmful effect on regeneration

The growth of the seedlings from micropropagated plantets were monitored up

to 12 months The differences of growth performances of plantets from 4 stocks

ND1, ND2, BD1, BD2 were found non-significant but leaf widths of the plantet from ND1 and ND2 stocks were smaller than from BD1, BD2

Ten (10) fungi species were isolated and identified in the samples of infected wood Certain similarity between our results and fungi recorded by previous authors were recognized Based on results of the isolation experiments and the field study, an explorative experiement was carried-out with seven treatments: (1) Control, (2) White fungi, (3) Black fungi, (4) Chlorine-based (Cl-) , (5) Oil-based, (6) Sulfate (SO42-) , (7) Nitrate (NO3-), on three sites: Đại Lãnh, The HCMC Zoo and Vĩnh Long The results were not totally consistent in three sites, although the effect of chlorine-based treatment was high in two of three sites and was assessed

as highest in the total score Black fungi and nitrate-based treatments were ranked second of seven treatments

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii 

TÓM TẮT v 

SUMMARY vii 

MỤC LỤC x 

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT xiii ii  DANH SÁCH CÁC BẢNG xv 

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ xviii 

Chương 1 MỞ ĐẦU 1 

1.1 Lý do thực hiện đề tài 1  

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3  

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3  

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4  

1.4.1 Về mặt khoa học 4  

1.4.2 Về mặt thực tiễn 4  

1.5 Những đóng góp mới của luận án 4  

Chương 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 6 

2.1 Cây Dó bầu và sản phẩm trầm hương 6  

2.1.1 Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Dó bầu 6  

2.1.2 Công dụng và phân loại trầm hương 8  

2.2 Cơ sở lý thuyết của đề tài 10  

2.2.1 Đánh giá đa dạng di truyền 10  

2.2.2 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy phát sinh phôi soma 12  

2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 12  

2.2.2.2 Nuôi cấy phát sinh phôi soma 14  

2.2.3 Sự hình thành trầm hương 17  

Chương 3 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 

3.1 Nội dung nghiên cứu 23  

3.1.1 Điều tra thực trạng, sưu tầm và lấy mẫu khảo sát 23  

3.1.2 Đánh giá đa dạng di truyền ở cấp độ dưới loài 23  

3.1.3 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và sản xuất hạt giống nhân tạo từ các cây Dó bầu đã cho trầm 24  

3.1.4 Nghiên cứu bước đầu gây tạo trầm (agarwood) trên cây Dó bầu bằng phương

pháp vi sinh và hoá học 24  

3.2 Địa điểm và vật liệu thí nghiệm 24  

3.2.1 Địa điểm khảo sát thực địa 24  

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu 25  

3.2.2.1 Vật liệu đánh giá đa dạng di truyền cấp dưới loài: 25  

3.2.2.2 Vật liệu nuôi cấy mô và tạo hạt nhân tạo: 26  

3.2.2.3 Vật liệu thí nghiệm tạo trầm: 27  

3.3 Phương pháp nghiên cứu 28  

3.3.1 Phương pháp điều tra thực địa và sưu tập mẫu vật 28  

3.3.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền cấp dưới loài 29  

3.3.3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nuôi cấy phôi soma và tạo hạt nhân tạo 36  

3.3.4 Phân lập các loài vi sinh và kích thích sự tạo trầm 40  

Chương 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43 

4.1 Kết quả điều tra thực địa 43  

4.1.1 Hiện trạng gây trồng cây Dó bầu ở các địa điểm điều tra 43  

4.1.2 Phân loại và phân cấp sản phẩm trầm hương ở các địa phương 45  

4.1.3 Kỹ thuật kích thích tạo trầm ở các địa điểm điều tra 46  

4.2 Kết quả phân tích đa dạng dưới loài của các dòng Dó bầu 48  

4.2.1 Sản phẩm phản ứng PCR với các chất mồi (primers) 48  

4.2.2 Phân tích trình tự đoạn nucleotid được dòng hóa trong plasmid 54  

4.3 Kết quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và sản xuất hạt giống nhân tạo từ các cây Dó bầu đã cho trầm 58  

4.3.1 Nuôi cấy chồi đỉnh sinh trưởng cây Dó bầu in vitro 58 

4.3.2 Nuôi cấy phát sinh phôi soma 67  

4.3.3 Nuôi cấy tế bào soma và tạo hạt nhân tạo cây Dó bầu 75  

4.3.4 Thuần hóa và ươm nuôi cây Dó bầu cấy mô 97  

4.4 Kết quả phân lập các loài vi sinh và thí nghiệm kích thích sự tạo trầm 104  

4.4.1 Kết quả phân lập và định danh vi sinh vật trong các mô gỗ có trầm 104  

4.4.2 Thí nghiệm thăm dò sự lây nhiễm và kích thích tạo trầm 105  

4.4.3 Sự biến đổi của mô gỗ sau khi kích thích tạo trầm 109  

4.4.4 Thành phần hoá học của tinh dầu trầm do thí nghiệm lây nhiễm 114  

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 117 

5.1 Kết luận 117  

5.2 Đề nghị 118  

TÀI LIỆU THAM KHẢO 119 

TIẾNG VIỆT 119 

TIẾNG NƯỚC NGOÀI 121 

PHỤ LỤC 124 

PHỤ LỤC 1 KHẢO SÁT THỰC ĐỊA 124

Phụ lục 1.1.Bảng tổng hợp phỏng vấn các hộ có tham gia khai thác và sản xuất trầm hương

Phụ lục 1.2: Hình ảnh phỏng vấn các hộ có tham gia khai thác và sản xuất trầm   PHỤ LỤC 2 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN 125

Phụ lục 2.1 Tiến trình lấy mẫu và thiết bị khảo sát đa dạng di truyền Phụ lục 2.2 Sản phẩm PCR Phụ lục 2.3: Giải trình tự DNA của 4 dòng Dó bầu có xuất xứ địa lý khác nhau PHỤ LỤC 3 THÍ NGHIỆM NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY DÓ BẦU 125  

Phụ lục 3 1 Sơ đồ rút gọn nuôi cấy phôi soma và tạo hạt nhân tạo cây Dó bầu   Phụ lục 3.2 Sơ đồ vị trí lấy mẫu Dó bầu có trầm để thí nghiệm nuôi cấy Phụ lục 3.3 Hình ảnh lấy mẫu và thí nghiệm nhân giống vô tính

Phụ lục 3.4 Môi trường cơ bản dùng trong các thí nghiệm nuôi cấy PHỤ LỤC 4 KHẢO SÁT SỰ LÂY NHIỄM TẠO TRẦM VÀ

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TRẦM HƯƠNG 168

Phụ lục 4.1 Hình ảnh lây nhiễm tạo trầm, sơ chế và phân loại trầm hương

Phụ lục 4.2 Phiếu Giám định nấm trên các mẫu gỗ Dó bầu có trầm

ở các vùng khảo sát

Phụ lục 4.3 Thành phần hóa học của trầm hương nguyên liệu

mua ở Khánh Hòa

Phụ lục 4.4 Thành phần hóa học của trầm hương lấy từ thí nghiệm lây nhiễm

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D 2,4-dichorophenoxyacetic acid

ABA acetyl butyric acid

ADP adenosin diphosphat

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình Khuếch đại Độ dài Đoạn)AMP adenosin monophosphat

AP-PCR Arbitrary primed PCR (PCR với chất mồi bất kỳ)

ATP adenosin triphosphat

CAD cinnamil alcol dehydrogenase

CORR Correlation (Tương quan)

CRD Complete Random Design (Kiểu thí nghiệm hoàn toàn ngẫu

nhiên) CTAB Cetyl-trimetil-ammonium bromur

CV% Coefficient of variation (Hệ số biến động)

CW Coconut water (nước dừa)

DAF DNA amplified fingerprinting (Phương pháp dấu ấn DNA

khuếch đại) DAP Day after planting (ngày sau nuôi cấy)

DMSO Hóa chất dimetil sulphoxid

DNA Desoxyribonucleic acid

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

EC Embryogenic clump (cụm sinh phôi)

EDTA Etylen diamine tetra acetat

EN Endangered (cấp nguy cơ)

GCMS Gas Chromatography Mass Spectrophotometry (sắc ký khí khối

phổ) IAA β-Indol acetic acid

IBA β-Indol butyric acid

Ki Kinetin (6-furfuryl aminopurine)

LSD Least significant difference (hiệu số hay số sai biệt có nghĩa nhỏ

nhất, hoặc còn gọi là khoảng sai dị tối thiểu)

MS Môi trường Murashige-Skoog (1962)

MSStat Phần mềm thống kê

NAA α-Naptalen acetic acid

NTSYS Numerical Taxonomy System (hệ thống phân loại số)

PAC Paclobutrazol (chất kìm hảm sinh trưởng phát triển thân lá) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) PDA Potato-Dextrose Agar (môi trường khoai tây, đường dextroz và agar) PLB Protocorm-like body (thể sinh cụm chồi hay thể giả phôi)

RAPD Randomirized Amplified Polymorphism DNA (đa hình DNA

khuếch đại ngẫu nhiên)RCBD Randomized Complete Block Design (kiểu thí nghiệm khối đầy

đủ) SAHN Sequential agglomerative hierachic non-overlapping

SDS Sodium dodecyl sulfate (natri dodecyl sulfat)

SSR Simple sequence repeat (Loạt lặp lại đơn)

SYSTAT Phần mềm thống kê

TAE Tris base, Acetic acid và EDTA

TE Tris-EDTA (Dung dịch đệm)

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (khoảng

cách bắt cặp không gia quyền với trung bình cộng)

UV Ultra Violet (tia cực tím)

WinDis Phần mềm thống kê

WPM Woody Plant Medium (môi trường cho cây gỗ) của Loyd và

McCown, 1981

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu trong 26

Bảng 3.2: Các địa điểm thí nghiệm lây nhiễm và kích thích tạo trầm 27

Bảng 3.3: Thành phần các dung dịch sử dụng tách chiết DNA 3131

Bảng 3.4: Các hóa chất dùng để điện di DNA 32

Bảng 3.5: Thành phần dung dịch đệm PCR 10X 33

Bảng 3.6: Thành phần hỗn hợp dung dịch chạy PCR 34

Bảng 3.7: Chương trình chạy PCR cho RAPD chất đánh dấu ( Lang, 2002) 34

Bảng 3.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm kích thích tạo trầm 41

Bảng 4.1 Hiện trạng kỹ thuật gây trồng Dó bầu ở các địa phương được khảo sát 43

Bảng 4.2 Phân loại trầm ở Phú Quốc và Nha Trang theo thông tin từ những người khai thác trầm địa phương 46

Bảng 4.3: Các đoạn mồi sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền của Dó bầu 49 Bảng 4.4 Kết quả phân tích nhóm của 18 dòng Dó Bầu 53

Bảng 4.5 Số lượng nucleotid trong các xuất xứ Dó bầu 55

Bảng 4.6 Nuôi cấy chồi đỉnh cây Dó bầu in vitro 59

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự tạo cụm chồi in vitro60 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến nhân nhanh cụm chồi cây Dó bầu in vitro 61

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nước dừa (CW) đến sự nhân nhanh cụm chồi in vitro 62 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của sự trao đổi khí đến nhân nhanh cụm chồi in vitro 62

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng và sự trao đổi khí đến nhân nhanh cụm chồi Dó bầu in vitro 64

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của các dòng Dó bầu có nguồn gốc khác nhau đến nhân nhanh cụm chồi in vitro 65

Bảng 4.13 Sinh trưởng cây Dó bầu in vitro 66

Bảng 4.14 Nuôi cấy phát sinh rễ cây Dó bầu in vitro 66

Bảng 4.15 Nuôi cấy phát sinh tế bào soma 68

Bảng 4.16 Nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma trên môi trường agar 69

Bảng 4.17 Nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma trên môi trường lỏng 71

Bảng 4.18 Theo dõi trải dịch huyền phù phôi soma trên môi trường agar 72

Bảng 4.19 Tái sinh phôi soma 73

Bảng 4.20 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nuôi cấy tạo tế bào phôi soma 76

Bảng 4.21 Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy đến khả năng tạo tế bào soma 77

Bảng 4.22 Cấy truyền tế bào soma 78

Bảng 4.23 Nuôi cấy phát sinh phôi soma trên môi trường lỏng 79

Bảng 4.24 Nhân sinh khối phôi soma 80

Bảng 4.25 Ảnh hưởng của trọng lượng tươi ban đầu đến sự nhân sinh khối phôi soma 81

Bảng 4.26 Trải phôi soma trên môi trường agar 82

Bảng 4.27 Tái sinh phôi soma 82

Bảng 4.28 Nuôi cấy tạo thể giả phôi (PLB) 83

Bảng 4.29 Ảnh hưởng của BA và Ki đến khả năng nuôi cấy phát sinh thể giả phôi Dó bầu in vitro 86

Bảng 4.30 Ảnh hưởng của BA/NAA và Ki/NAA đến khả năng nuôi cấy phát sinh thể giả phôi Dó bầu in vitro 87

Bảng 4.31 Ảnh hưởng của BA/Ki/NAA đến khả năng nuôi cấy phát sinh thể giả phôi 87

Bảng 4.32 Nhân nhanh thể giả phôi Dó bầu in vitro 89

Bảng 4.33 Tái sinh thể giả phôi Dó bầu in vitro 90

Bảng 4.34 Ảnh hưởng của alginat natri đến khả năng tái sinh hạt nhân tạo 91

Bảng 4.35 Ảnh hưởng của calci clorua đến khả năng tái sinh hạt nhân tạo 91

Bảng 4.36 Ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh hạt nhân tạo 93

Bảng 4.37 Ảnh hưởng của các mức IBA đến khả năng tái sinh hạt nhân tạo (với BA không đổi (0,1 mg/l) 94

Bảng 4.38 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến bảo quản hạt nhân tạo (sau 2 tháng) 94

Bảng 4.39 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ (20 o C) bảo quản hạt nhân tạo 95

Bảng 4.40 Ảnh hưởng của hóa chất bảo quản đến bảo quản hạt nhân tạo 95

Bảng 4.41 Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng tái sinh hạt nhân tạo 96

Bảng 4.42 Ảnh hưởng của độ che sáng đến khả năng tái sinh hạt nhân tạo 96

Bảng 4.43 Thuần hóa cây Dó bầu cấy mô 98

Bảng 4.44 Sinh truởng và phát triển cây Dó bầu cấy mô ở 8 tháng tuổi 100 Bảng 4.45 Sinh trưởng và phát triển cây Dó bầu cấy mô ở 12 tháng tuổi 100 Bảng 4.46 Sinh trưởng và phát triển cây Dó bầu cấy mô trong điều kiện có và

không che nắng (6 - 12 tháng tuổi) 102

Bảng 4.47 Sinh trưởng và phát triển cây Dó bầu cấy mô và từ hạt thực sinh 102 Bảng 4.48 Nấm phân lập được định danh và đối chiếu với một số tác giả khác 104 Bảng 4.49 Các loài nấm, tuyến trùng hiện diện trên các nghiệm thức ở địa điểm

trung bình của ba người đánh giá 112

Bảng 4.53 Thành phần cấu tử (tính bằng %) ghi nhận qua sắc ký của 4 mẫu có

hiện tượng có trầm từ thí nghiệm kích thích lấy từ cây A ở điểm Vĩnh Long 114

Bảng 4.54 Thành phần cấu tử (tính bằng %) của trầm hương nguyên liệu chiết

bằng CH2Cl2 115

Bảng 4.55 Thành phần cấu tử (tính bằng %) của trầm hương nguyên liệu chiết

bằng Etanol 116

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu 23

Hình 3.2 Khảo sát trên hiện trường và thu thập vật liệu để nuôi cấy 27

Hình 3.3 Mẫu được đưa vào nuôi cấy in vitro 36

Hình 3.4 Gỗ cây Dó bầu có dấu hiệu hình thành trầm 42

Hình 4.1 Một cây Dó bầu 120 tuổi ở Phú Quốc 44

Hình 4.2 Một cây Dó bầu được người dân kích thích bằng nhiều biện pháp cơ giới và hóa học (Quảng Nam) 47

Hình 4.3 So sánh ảnh chụp kết quả PCR với các đoạn mồi (primer) RALP 4, 50

Hình 4.4 So sánh các băng với đoạn mồi AC 14, RAPD 5 và OPD 03 51

Hình 4.5 Kết quả phân nhóm di truyền các mẫu Dó bầu 52

Hình 4.6.Trình tự chuỗi nucleotid của bốn xuất xứ Dó bầu: (a) Quảng Nam, (b) Bắc đảo Phú Quốc, (c) Nam đảo Phú Quốc và (d) Quảng Bình 56

Hình 4.7 So sánh trình tự DNA của bốn xuất xứ Dó bầu: (a) Quảng Nam, (b) Bắc đảo Phú Quốc, (c) Nam đảo Phú Quốc và (d) Quảng Bình 57

Hình 4.8: Phân tích nhóm di truyền trên cơ sở so sánh các trình tự DNA của bốn mẫu giống Dó bầu dùng phương pháp ClustalW-UPMGA 57

Hình 4.9: Phân tích nhóm di truyền trên cơ sở so sánh các trình tự protein của 4 mẫu giống Dó bầu bằng phương pháp ClustalW-UPMGA 58

Hình 4.10 Mẫu nuôi cấy tái sinh chồi: (a) sau 7 ngày, (b) sau 30 ngày 61

Hình 4.11 Nuôi cấy tạo cụm chồi in vitro 63

Hình 4.12 Nhân nhanh cây Dó bầu in vitro 63

Hình 4.13 Nuôi cấy phát sinh tế bào soma từ lá (sau 15 ngày nuôi cấy) 69

Hình 4.14 Nuôi cấy phát sinh tế bào soma từ lá (sau 30 ngày nuôi cấy) 70

Hình 4.15 Nuôi cấy phát sinh tế bào soma từ rễ (sau 15 ngày nuôi cấy) 70

Hình 4.16 Dịch huyền phù tế bào soma (sau 21 ngày nuôi cấy) 71

Hình 4.17 Trải dịch huyền phù tế bào soma (sau 10 ngày nuôi cấy) 72

Hình 4.18 Nuôi cấy phát sinh phôi (sau 15 ngày nuôi cấy) 73

Hình 4.19 Phôi soma biệt hóa phát sinh chồi (sau 95 ngày nuôi cấy) 74

Hình 4.20 Nuôi cấy tái sinh (a) tái sinh đỉnh sinh trưởng (sau 30 ngày); (b) Tái sinh cụm

chồi in vitro (chuẩn bị nuôi cấy phát sinh rễ) 74

Hình 4.21 Nuôi cấy phát sinh rễ (a) sau 30 ngày; (b) sau 45 ngày 75

Hình 4.22 Sự hình thành tế bào soma (sau 20 ngày nuôi cấy) 78

Hình 4.23 Tái sinh phôi soma (sau 95 ngày nuôi cấy) 83

Hình 4.24 Nuôi cấy tạo thể giả phôi (PLB) 84

Hình 4.25 Phôi soma biệt hóa lá tiền sinh (sau 110 ngày nuôi cấy) 85

Hình 4.26 Tái sinh phôi soma và thể giả phôi (a) Tái sinh phôi soma; (b) Sự hình thành thể giả phôi (PLB) sau 20 ngày nuôi cấy 85

Hình 4.27 Sự hình thành thể giả phôi (PLB) hoàn chỉnh sau 45 ngày nuôi cấy 88

Hình 4.28 Phát sinh thể giả phôi (PLB) đồng loạt sau 30 ngày nuôi cấy 88

Hình 4.29 Nhân nhanh thể giả phôi (PLB) in vitro 89

Hình 4.30 Tái sinh thể giả phôi (PLB) sau 15 ngày 90

Hình 4.31 Thể giả phôi được sử dụng trong sản xuất hạt nhân tạo 92

Hình 4.32 Tạo hạt nhân tạo bằng bao alginat 92

Hình 4.33 Tái sinh hạt nhân tạo (trên đĩa petri) sau 30 ngày 93

Hình 4.34 Thuần hóa cây Dó bầu cấy mô (sau 30 ngày) 98

Hình 4.35 Thuần hóa cây Dó bầu sau 4 tháng 99

Hình 4.36 Cây Dó bầu cấy mô 1 năm tuổi (Thủ Đức) 99

Hình 4.37 Vườn ươm cây Dó bầu cấy mô ở Thủ Đức (sau 5 tháng tuổi) 101

Hình 4.38 Bào tử nấm Macrophoma sp 106

Hình 4.39 Bào tử Botryodiplodia sp phân lập từ mẫu gỗ tượng trầm 106

Hình 4.40.Sơ đồ tương đồng giữa các nghiệm thức về nấm 109

Hình 4.41 Sơ đồ tương đồng giữa các của các cây Dó bầu có sự hình thành mùi trầm khi khảo sát cảm quan 113

Hình 4.42 Sơ đồ tương đồng về thành phần hóa học của mô gỗ có trầm sau thí nghiệm giữa các nghiệm thức 115

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Lý do thực hiện đề tài

Cây Dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) thuộc họ

Thymelaeaceae là một loài cây đặc sản quý, mọc tự nhiên trong nhiều vùng rừng

ẩm ở Việt Nam (Vũ Văn Cần và Vũ Văn Dũng 1987) [5] Loài cây này được quan tâm vì khả năng hình thành một chất dầu nhựa (oleoresin) dẻo có màu đen, chứa trong phần gỗ của thân và đôi khi cả trong cành, gốc và rễ lớn của những cây lâu năm làm cho nó có giá trị hương liệu và dược liệu (Nobuchi và Siripatanadilok 1991; Đổ Tất Lợi 2003) [55, 22] Phần gỗ tích lũy nhựa này được gọi là trầm hương hay kỳ nam Mặc dù có phạm vi phân bố rộng ở Việt Nam nhưng số lượng

cá thể trong các lâm phần thường rất nhỏ (Vũ Văn Cần và Vũ Văn Dũng 1987; Lê Văn Ký 1996) [5, 18] Trước tình trạng khai thác trầm bừa bãi trong nhiều năm qua, loài cây này đang ngày càng cạn kiệt và đã được xếp vào danh mục những loài có nguy cơ bị tuyệt chủng trong tự nhiên Ở Việt Nam, nó đã được xếp vào nhóm cây gỗ quý hiếm (nhóm 1A) theo Nghị định số 18-HĐBT ngày 17/01/1992 quy định danh mục thực vật rừng quý hiếm (HĐBT 1992) [14] và được xếp vào cấp nguy cấp (EN-endangered) trong Sách đỏ Việt Nam (phần Thực vật) (1996) [1] Tình hình tương tự cũng được ghi nhận ở nhiều nước khác, với các loài tương cận cũng đã được xếp vào sách đỏ ở cấp thế giới (IUCN 1998; IUCN 2000) [43, 44], và quốc gia cũng như đã được đưa vào Phụ Lục II của Công ước Mua bán Quốc tế Các Loài Có Nguy cơ (CITES 1994) [35]

Trước áp lực khai thác quá mức sản phẩm trầm hương và nguy cơ bị tuyệt chủng của loài Dó bầu trong hoang dã, việc bảo vệ, duy trì và nhân giống cây Dó bầu đã được đặt ra qua nhiều hội thảo trong nước và trong khu vực (Parman và Mulyaningsih 2002; TRF 2003; TRF 2007) [ 57, 63, 64] Giá trị kinh tế lớn của sản phẩm này là động lực thu hút người dân ở nhiều địa phương trong việc gây trồng cây Dó bầu Từ những năm cuối thập niên 1980 đã có những nghiên cứu

bước đầu về việc gây trồng và sau đó là các biện pháp kích thích tạo trầm bằng các biện pháp khác nhau Phong trào trồng Dó bầu đã phát triển khắp cả nước và loài Dó bầu không còn có tên trong Sách đỏ Việt Nam năm 2007

Tuy nhiên, có hai vấn đề quan trọng cần chú trọng để phát triển các động lực này: Thứ nhất, đảm bảo chất lượng di truyền của cây Dó bầu có khả năng cho nhựa trầm nhiều là một tiền đề quan trọng thúc đẩy việc trồng có hiệu quả cao loài cây đặc sản quý hiếm này Thứ hai là tìm kiếm các biện pháp kỹ thuật phù hợp để kích thích sự hình thành trầm trên các cá thể được nuôi trồng

Cả hai vấn đề này đặt ra những thử thách trong công tác bảo tồn nguồn gen

và nhân giống cũng như kích thích tạo trầm Do đó trong khuôn khổ của một đề tài nghiên cứu sinh chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu phát triển các dòng Dó bầu

(Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) đặc sắc ở một số tình phía Nam” với mục

đích ứng dụng công nghệ tế bào thực vật vào công tác giống để nhân nhanh và phát triển các dòng cho trầm

Khái niệm dòng Dó bầu đặc sắc trong luận án xin được hiểu theo nghĩa thông thường là dòng Dó bầu đã có hình thành trầm, được chọn lọc làm cây đầu dòng để nhân giống với mong muốn là tính trạng cho trầm của các dòng này sẽ được di truyền cho đời sau theo lý thuyết về nhân giống vô tính (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) [4] Trong tự nhiên, không phải cây từ hạt nào cũng cho trầm (TRF 1997; WCMC 2001) [28, 66] Hiện tại, Mạng lưới Tài nguyên Di

truyền thực vật đã đưa chi Aquilaria vào danh mục của mình (GRIN 2008) [37]

Do đó, cần chọn lọc các dòng có khả năng cho trầm cao để nhân giống bằng con đường vô tính nhằm duy trì tính trạng của chúng trong cây con được nhân giống

và đảm bảo sự thành công Một sự xác nhận khả năng di truyền của một tính trạng đòi hỏi sự đánh giá đời sau, tuy nhiên, đây là một vấn đề khó đối với thời gian giới hạn của đề tài Do đó, nghiên cứu này chỉ là bước đầu của công tác chọn giống đối với loài cây này Chúng tôi đã giới hạn vào việc thực hiện các đợt khảo sát thực tế, qua đó lựa chọn các cá thể đã tích tụ nhựa trầm tương đối nhiều một cách tự nhiên trong vùng phân bố của loài này để dùng làm vật liệu ban đầu, tiếp theo đó, áp

dụng một số phương pháp di truyền phân tử để phân nhóm và đánh giá mức độ đa dạng của đối tượng thực vật được nghiên cứu Tiếp theo đó, một loạt thí nghiệm được thực hiện nhằm thích ứng công nghệ tế bào thực vật trong việc nhân giống các dòng Dó bầu có triển vọng và kích thích sự tạo trầm

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm các mục tiêu:

(1) Đánh giá hiện trạng gây trồng và phát hiện các cá thể Dó bầu (Aquilaria

crassna Pierre ex Lecomte) đã có trầm được chọn lọc ở một số tỉnh phía

nam được ghi nhận là vùng sinh quán tự nhiên của loài cây này;

(2) Bước đầu khảo sát sự khác biệt di truyền dưới loài của một số cá thể chọn lọc trong một quần thể và ở các xuất xứ khác nhau, nhằm góp phần đánh giá sự đa dạng di truyền dưới loài

(3) Thử nghiệm ứng dụng công nghệ tế bào thực vật vào công tác giống nhằm mục đích bảo tồn, nhân nhanh và phát triển các dòng Dó bầu cho trầm dựa

trên kỹ thuật phát sinh phôi soma và hạt giống nhân tạo

(4) Thăm dò các phương pháp kích thích tạo trầm

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào loài Dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) là một trong các loài thuộc chi Aquilaria mọc tự nhiên trong rừng dày

ẩm ở các tỉnh phía Nam Việt Nam được ghi nhận là đã cho trầm hương trong tự nhiên Nghiên cứu được bắt đầu bằng một cuộc điều tra thực địa được tiến hành trên diện rộng trong các tỉnh từ Quảng Nam trở vào, và tập trung chú ý ở đảo Phú Quốc và Khánh Hòa, nơi các mẫu vật nghiên cứu được thu thập Các thí nghiệm đánh giá sự khác biệt di truyền được thực hiện ở Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long Các thí nghiệm nhân giống được thực hiện ở Viện Sinh học Nhiệt đới và Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Các cuộc khảo nghiệm sự tạo trầm trên thực địa được thực hiện ở ba địa điểm: Đại Lãnh tỉnh Khánh Hòa (rừng tự nhiên và rừng trồng), Thảo Cầm Viên Thành Phố Hồ Chí Minh (cây trồng) và

Vĩnh Long (cây trồng)

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Về mặt khoa học

Đề tài đóng góp vào việc tăng cường hiểu biết về công nghệ tế bào thực vật

áp dụng cho việc nhân giống cây Dó bầu Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte,

một đối tượng cây gỗ mới chưa được quan tâm đúng mức về công tác giống Chúng tôi đã khảo nghiệm các kỹ thuật tạo phôi soma và hạt giống nhân tạo để hoàn thiện một sơ đồ nhân giống dựa trên công nghệ tế bào thực vật, trên các dòng đặc sắc được chọn từ các quần thể tự nhiên có khả năng cho trầm

1.4.2 Về mặt thực tiễn

Việc gây trồng cây Dó bầu và kích thích tạo trầm đã được chú ý trong thời gian qua, nhưng chủ yếu mang tính tự phát Trong thực tế, để phát triển nhanh và bền vững việc gây trồng cây Dó bầu và sản xuất các sản phẩm trầm hương, cần bắt đầu bằng nguồn giống có chất lượng di truyền và sinh lý tốt Dó bầu không phải là một loài khó gây trồng nhưng để có thể tạo trầm cần quan tâm đến tính trạng di truyền của cây mẹ Đề tài này có mục đích góp phần vào các nhu cầu thực

tế này bằng cách xác định các yếu tố công nghệ chính của việc nhân giống Sự lựa chọn những cây Dó bầu có khả năng cho nhựa trầm nhiều trong tự nhiên làm vật liệu ban đầu cho tiến trình nuôi cấy phát sinh phôi soma là hướng đi của đề tài này Có nhiều vấn đề cần tiếp tục làm sáng tỏ liên quan đến sự đánh giá tính trạng

di truyền; nhưng trong phạm vi đề tài này chúng tôi đã khảo sát đa dạng dưới loài

để cũng cố cho một hướng nghiên cứu nhằm đáp ứng nhu cầu giống cây Dó bầu

có đặc điểm di truyền được biết rõ Chúng tôi cũng thăm dò các biện pháp kích thích tạo trầm, một vấn đề còn cần được tiếp tục hoàn thiện

1.5 Những đóng góp mới của luận án

- Sưu tập các cá thể Dó bầu đang có dấu hiệu hình thành trầm ở các tỉnh phía nam, phân tích và chứng minh tính đa dạng di truyền dưới loài của các mẫu nghiên cứu nhằm đóng góp bước đầu cho việc xác định các nguồn giống có triển vọng phục vụ cho công tác nhân giống cây Dó bầu

- Áp dụng, thích ứng và hoàn thiện công nghệ tế bào thực vật trong việc

nhân giống các dòng Dó bầu đã có trầm dựa trên phương pháp nuôi cấy phát sinh phôi sôma và sản xuất hạt giống nhân tạo cho cây Dó bầu

- Góp phần giải thích và so sánh sự tương đồng về thành phần hóa học chính của các loại trầm hình thành từ cây Dó bầu dưới các biện pháp xử lý khác nhau trong điều kiện thí nghiệm trên thực địa

Chương 2

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1 Cây Dó bầu và sản phẩm trầm hương

2.1.1 Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Dó bầu

Cây Dó bầu còn có các tên gọi khác dựa vào sản phẩm của nó như cây Tóc, cây Trầm, cây Trầm hương, cây Kỳ nam Theo Nguyễn Hiền và Vỏ Văn Chi (1991) [13], cây Dó bầu được chính thức đặt tên khoa học và công bố dựa vào những mẫu vật do một nhà thực vật người Pháp là Pierre thu thập tại đảo Phú Quốc (Việt Nam) và núi Aral, tỉnh Samrongtong (Cambodia) vào tháng 5 - 1870

Pierre đã dựa vào tên Cambodia là Krasna để đặt cho cây Dó bầu là Aquilaria

crassna nhưng đó chỉ là tên trần (nomen nudum) chưa có bảng mô tả và việc công

bố chưa được xem là hợp thức Sau đó, Henri Lecomte lần đầu tiên mô tả các loài

thuộc chi Aquilaria ở Đông Dương và công bố chính thức trong tạp chí Thực vật

học của Pháp năm 1914 và xếp chi này vào họ Trầm (Thymelaeaceae) (Lecomte 1917) trong Thực Vật Chí Đông Dương (Flore génerale de L’Indochine) [47]

Chi Aquilaria có khoảng 25 loài (GRIN 2008) [37], trong đó có 15 loài đã

được khảo sát là có thể cho trầm hương (Blanchette 2003) [32] Những loại này thường phân bố ở Nam Á và Đông Nam Á (Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Lào, Campuchia, Việt Nam v.v.) Phạm Hoàng Hộ trong các công trình gần đây nhất

(Phạm Hoàng Hộ 1985; 1992) [15, 16] xác nhận ở Việt Nam, chi Aquilaria thuộc

họ Trầm Hương (Thymelaeaceae) có ba loài được định danh là:

- Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte: Dó bầu, trầm; ghi nhận ở Phú Yên,

Khánh Hòa, Bảo Lộc (Lâm Đồng) và Phú Quốc (Kiên Giang)

- Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte: Dó baillon (hay Dó gạch) ghi nhận

ở vùng rừng dày ẩm Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam và Đà Nẵng

- Aquilaria banaensae Phạm Hoàng: Dó Bà Na; ghi nhận ở rừng dày ẩm

Quảng Nam, và Đà Nẵng

Một loài mới được phát hiện năm 2005:

- Aquilaria rugosa (Lê Công Kiệt, 2005) [49]

Ở các tỉnh phía Bắc giáp Trung Quốc, một số ít cá thể của loài Aquilaria

sinensis cũng được ghi nhận khuếch tán vào Việt Nam

Như vậy, hiện tại Việt Nam có tất cả năm loài Aquilaria Ngoài ra, một tên khác, Aquilaria agallocha Roxb., đã được một số tác giả đề cập, như các tác giả

của “Cây Gỗ rừng Việt Nam” (1981) [29], “Những loài thực vật quý hiếm cần được bảo vệ của Việt Nam" của Đoàn Điều tra Quy hoạch Rừng (1987) [30] và Giáo trình Thực vật Rừng của Lê Văn Ký (1996) [18] Tuy nhiên, theo Vũ Văn

Chuyên (1976) [11], Aquilaria agallocha Roxb chỉ có ở Ấn Độ, không có ở Việt

Nam, không được ghi trong bộ sách “Thực vật chí Đông Dương” của Henri

Lecomte (1917) [47], nên chỉ được xem là đồng danh với Aquilaria crassna Pierre

(Đổ Tất Lợi, 2003) [22] Tất cả những điều này cho thấy sự cần thiết phải xác định một cách chính xác tên loài của cây Dó bầu ở các địa phương khác nhau và các biến thiên dưới loài của chúng (nếu có)

Dựa vào bản mô tả chính thức của Henri Lecomte (1917) [47], những đặc điểm thực vật học quan trọng của cây Dó bầu có thể tóm tắt như sau: Cây gỗ lớn, tán thưa, cao khoảng 20 m (có thể đạt đến 40 m), đường kính ngang ngực 40 - 50

cm (có thể đạt 80 cm) Vỏ mỏng (dày 2 - 4 mm), có nhiều sợi dài, bền, có thể bóc thành lớp mỏng và có thể dùng làm giấy Dó theo phương pháp cổ truyền Lá đơn, mọc cách, hình ngọn giáo, dài 6 - 15 cm, rộng 2 - 3 cm, đầu mũi nhọn, gốc hình nêm Hoa tự hình tán, màu trắng Xuất hiện khoảng tháng 5-6 Quả nang hình trứng ngược dài 3 - 5 cm, rộng 2 - 3 cm, có lông xám dầy Khi chín khai thành hai mảnh, có từ 1 đến 2 hạt màu đen Thu hoạch trái vào khoảng tháng 7 - 8 Gỗ màu trắng hoặc vàng nhạt, không phân biệt giác-lỏi, gỗ mềm, nhẹ (tỷ trọng d = 0,395),

có cấu tạo đặc biệt là hiện tượng libe xen gỗ (included phloem), đôi khi do nấm, trên thớ gỗ có những tuyến nhựa ngưng kết màu đen, khi đốt có mùi thơm gọi là trầm hương, dùng đóng đồ quý, đốt trầm, lấy hương liệu, dược liệu

Theo Vũ Văn Cần và Vũ Văn Dũng (1987) [5]; cũng như ý kiến của Lê Văn Ký [18] cho biết Dó bầu phân bố nhiều nơi trên lãnh thổ Việt Nam và nhiều nước Châu Á nhiệt đới khác như Lào, Cambodia, Ấn Độ v.v Ở Việt Nam cây Dó bầu mọc rãi rác ở nhiều tỉnh từ bắc chí nam như Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tuyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tỉnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên và hầu hết các tỉnh phía nam cho đến đảo Phú Quốc, nhưng tập trung nhiều ở các tỉnh miền trung, từ Quảng Bình đến Thuận Hải và huyện đảo Phú Quốc

Nhìn chung, Dó bầu là cây trung tính thiên về ưa sáng, mọc rãi rác trong các khu rừng thuộc kiểu ẩm nhiệt đới nguyên sinh hoặc thứ sinh có độ tàn che 0,5-0,6; phân bố ở độ cao 50 – 1.000 m (có khi lên đến 1.200 m), nơi cao nhất là sườn núi Chu Jang Sinh ở Đắc Lắc (Vũ Văn Cần và Vũ Văn Dũng, 1987)[5] Cây Dó bầu thường mọc riêng lẻ, nhưng có khi cũng mọc thành từng đám 5-6 cây (Nguyễn Hiền và Võ Văn Chi, 1991) [13]

Theo Lê Mộng Chân và ctv (1995) [10], Dó bầu là loài cây mọc nhanh, tăng trưởng được ghi nhận là 1 - 1,2 m/ năm về chiều cao và 1,5 - 2,5 cm/ năm về đường kính Cây 8 tuổi trở lên có thể ra hoa kết quả Dưới tán rừng thứ sinh, cây

Dó bầu tái sinh kém, hầu như không gặp cây mạ, thường chỉ gặp cây Dó bầu tái sinh trong các trảng trống trong rừng, bìa rừng hoặc ven đường Theo quan sát thực tế, Dó bầu cũng có khả năng tái sinh chồi tốt với điều kiện gốc cây còn được giữ nguyên vẹn Nhưng trong điều kiện khai thác khó kiểm soát và có tính chất hủy diệt như đã từng xẩy ra, khả năng tái sinh tự nhiên của cây Dó bầu là rất thấp

2.1.2 Công dụng và phân loại trầm hương

Giá trị quan trọng nhất của phần lớn các loài Dó là trầm hương, do một số

mô gỗ bị biến đổi với sự tích tụ nhựa Sản phẩm này đã được chú ý, săn tìm và dẫn tới nguy cơ tuyệt chủng (Oldfield, Lusty và ctv 1998) [56] Phần gỗ có nhựa thơm này có tên là trầm hương hay kỳ nam (với các tên thương mãi là agarwood, gaharu, eagle wood, aloes wood, agila wood, aguru, agar, oud, ude, ud, ood, oode, jinkoh, jinko, Ch’ing Kuei Hsiang, Ch’En Hsiang, Huang Shu Hsiang, kalambak,

và grindsanah (Wikipedia 2005) [67]

Hiện có nhiều tài liệu đề cập đến các công dụng của trầm hương nhưng không phải tất cả đều cung cấp những cơ sở khoa học vững chắc Việc sử dụng trầm hương trong y học, hương liệu và làm nhang đã được ghi nhận từ hàng ngàn năm qua và cho đến nay vẫn mang tính truyền thống, dựa trên tri thức và nền văn hóa của các địa phương Vì gỗ trầm hương là một sản phẩm có giá trị cao và rất hiếm, với một thị trường tiêu thụ rộng lớn từ nhiều nước Trung Đông, Nam Á, Đông Á và Đông Nam Á một khu vực với dân số chiếm gần một nửa dân số thế giới, thị trường này có ý nghĩa rất quan trọng (Compton 2003; Pheng, Meling và ctv 2004) [36, 59] Singapore là nước có khối lượng và giá trị trầm hương tái xuất cao nhất, lên tới hơn 1,2 tỷ USD trong năm 2000, nhưng các nước vùng Vịnh là khu vực tiêu thụ mạnh nhất (Hansen 2000) [38]

Việc sử dụng gỗ trầm hương đã được ghi nhận từ hơn 3000 năm nay ở vùng Trung Đông, Trung Quốc, Nhật Bản, cũng ghi nhận trong một số tài liệu ở

Ấn Độ và thậm chí trong Kinh Cựu Ước (Hansen 2000; Blanchette 2002) [38, 31] Trong quá khứ, trầm hương là loại phẩm vật dùng để cống nộp và là tặng phẩm của các bậc Vua chúa Ở nhiều nước Phương Đông, Ấn Độ, Ai Cập, I Ran, I Rắc, các miền Tây Phi, Nam Phi, Nam Mỹ cho đến các nước La Mã, Hy Lạp cổ đại, trầm hương có mặt trong các nghi lễ tôn giáo để cúng tổ tiên, trời đất mà những người theo đạo Hồi, đạo Phật, đạo Bà La Môn, đạo Ky Tô v.v đều tôn sùng trầm hương trong cúng lễ như là vật giao lưu truyền cảm của con người, của thế giới thực tại với thế giới thần linh

Ở Việt Nam, cây Dó bầu và sản phẩm chính của nó là trầm hương đã có lịch sử rất lâu đời và thường xuyên có mặt trong nền văn học Việt Nam Nguyễn Hiền và Vỏ Văn Chi (1991) [13] đã dựa vào tài liệu khảo cổ học cho biết từ xa xưa, người Việt cổ đã biết khai thác, sử dụng và mua bán trầm hương, ít nhất là từ năm 206 trước Công nguyên (TCN) Thế kỷ XVIII, trong “Phủ biên tạp lục” Lê Quý Đôn [12] đã cho rằng: "Trầm hương xuất xứ từ đầu núi các xã thuộc hai phủ Bình Khang và Diên Khánh xứ Khánh Hòa là tốt nhất, xuất từ Phú Yên và Quy Nhơn là thứ hai Hương ấy là do ruột cây Dó kết thành"

Hình dạng và kích thước của mãnh trầm có ý nghĩa trong việc phân loại giá trị thương phẩm Theo Pheng Y.C., Meling L và ctv (2004) [59], các dạng trầm

và sản phẩm của trầm được ghi nhận trên thị trường là: Trầm mãnh (chips and segments), trầm bóng (polished), trầm vụn và bột trầm (powder and small chips), trầm bánh (Marmool), tinh dầu trầm (dùng làm hương liệu và dược liệu) Các khối trầm hương có hình dạng đặc biệt, dáng chạm trổ tự nhiên, được xem như tác phẩm nghệ thuật của tự nhiên thường có giá rất cao Các dạng khác nhau này đã tạo điều kiện cho việc tận dụng triệt để các phần gỗ có trầm

Theo Vũ Văn Cần và Vũ Văn Dũng (1987) [5], có thể phân biệt theo nguồn gốc hai loại trầm là trầm sinh (lấy từ cây còn sống) và trầm rục (lấy ở cây bị đốn hay ngã đổ đã lâu ngày) Trầm sinh ở cây còn sống thường có màu sáng bóng; ngược lại trầm rục có màu cánh dán, hay đen xỉn, không bóng Tuy nhiên, sự khác biệt này là do sự biến đổi hóa học về sau, trong khi sự tạo trầm xẩy ra khi cây còn sống Giá trầm sinh cao hơn trầm rục 2-3 lần và trên mỗi cây có trầm có thể thu được 5 - 10 kg trầm Thường người ta lấy trầm rục ở phần gốc và rễ Ngoài ra, phần gỗ chung quanh khối trầm cũng bị biến đổi ít nhiều với sự xuất hiện rải rác

các ống chứa nhựa, được gọi là tóc theo chữ Tok trong tiếng Khmer Tóc khi cháy

cho mùi thơm và được dùng làm nhang trầm

2.2 Cơ sở lý thuyết của đề tài

2.2.1 Đánh giá đa dạng di truyền

Mặc dù sự đánh giá kiểu hình đã giúp cho các nhà chọn giống có một cách nhìn tổng quan về đối tượng nghiên cứu, sự đánh giá đa dạng di truyền qua kiểu gen

là cần thiết và hiện nay trở thành khả thi nhờ sự phát triển của sinh học phân tử Lý

do của sự đánh giá kiểu gen là vì sự phát sinh kiểu hình chịu ảnh hưởng tổng hợp bởi kiểu gen và môi trường nên sự tương đồng hay khác biệt trong phân nhóm theo kiểu hình có thể gây ra bởi những tác động khác nhau và khó kiểm soát được của môi trường Hiện tại, sự phát triển của sinh học phân tử cho phép thực hiện sự đánh giá kiểu gen một cách thuận tiện Theo nguyên tắc, thông tin di truyền trong tế bào

đi từ DNA sang RNA và cuối cùng sang protein với ba tiến trình quan trọng: sao

chép, chuyển mã và giải mã Bộ gen của các loài với tế bào có nhân thực, đặc biệt

là ở thực vật bậc cao, có nhiều đoạn DNA lặp lại Các đoạn DNA lặp lại này có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ theo loài, và giống DNA hình thành từ bốn nucleotid khác nhau, có 64 bộ ba nucleotid khác nhau (43 = 64), nhưng các phân

tử protein chỉ gồm 20 amino acid khác nhau, do đó một amino acid nhất định có thể được xác định bởi hơn một bộ ba nucleotid Một bộ ba nucleotid được gọi là một codon vì nó mã hóa thông tin di truyền cho sự tổng hợp protein Ngoài sự xác định amino acid, một số bộ ba này chỉ định sự dừng phản ứng tổng hợp protein (Kuen, Harikrishna và ctv 2002)[50] Điều này được biết khá rõ với các hoa màu nông nghiệp, nhiều loài cây một lá mầm như (ngô, lúa ) lặp lại đoạn CGG/GCC (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang 2004) [3] Các đoạn DNA lặp lại thường nằm gần tâm động hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể (NST), có vai trò giữ ổn định bộ NST trong quá trình phân bào (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang 2003)[2]

Các đoạn DNA lặp lại có thể được kiểm tra bằng cách sử dụng các cặp mồi, đó là các đoạn oligo-nucleotid (mỗi đoạn gồm 17-30 nucleotid) được đưa vào phản ứng Sau đó, dựa vào kết quả thu được về số lượng và độ dài của các đoạn DNA lặp lại khác nhau, có thể xác định được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu bằng cách so sánh Đó là nguyên tắc cơ bản của phương pháp chuỗi polymeraz (PCR), một phản ứng có ý nghĩa rất quan trọng trong các ứng dụng của công nghệ sinh học (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang 2004)[3] Để thực hiện phản ứng này, trước hết cần phải biến tính DNA bằng nhiệt để tách các chuỗi xoắn kép, sau đó các đoạn oligo-nucleotid mồi (primer) được gắn với đoạn đối diện nhờ

sự làm nguội Các cặp mồi (primer) này được gắn bên sườn chuỗi DNA cần được khuếch đại nhờ phản ứng chuỗi với enzym polymerase (PCR) Một enzym

polymerase bền nhiệt trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus được ký hiệu là taq

DNA thường được dùng trong PCR vì khả năng chịu được nhiệt độ tương đối cao Sản phẩm được điện di trên gel agarose và các băng do sự điện di được dùng để đánh giá kết quả (Kuen, Harikrishna và ctv 2002)[50]

Song song với phương pháp PCR, trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng sử dụng các plasmids trong việc xác định chuỗi DNA Plasmid là các phân tử DNA

mạch đôi dạng vòng nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể, có kích thước được xác định bằng số cặp base khoảng từ 1 đến hơn 400 kbp (kilobase pairs) Trong cùng một tế bào có thể hiện diện từ một bản sao, đối với plasmid lớn, cho tới vài trăm bản sao

2.2.2 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy phát sinh phôi soma

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (Plant cell and tissue culture) là một ngành khoa học trẻ, nằm trong sinh lý thực vật Mặc dù đã phôi thai từ đầu thế kỷ XX, nhưng khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc chọn giống và nhân giống cây trồng chỉ rõ nét vào khoảng 40 năm gần đây, do phát hiện về tính toàn thể (Totipotency) của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời; khả năng bảo quản các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm và khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài ở nhiệt độ thấp mà không mất tính

toàn thể của tế bào

2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Đỉnh sinh trưởng là một mô phân sinh trong thực vật gồm các tế bào không chuyên hóa và có khả năng phân sinh mạnh Tính chất này làm cho chúng được chú ý trong công nghệ nuôi cấy tế bào Trong điều kiện bình thường, các tế bào phân hóa không thể phân chia thành một loại tế bào khác Do đó, đỉnh sinh trưởng

là nguồn cung cấp các tế bào chuyên hóa của cơ thể thực vật Khi sử dụng đỉnh sinh trưởng, có một lợi điểm là quá trình sinh tổng hợp DNA của virus không xẩy

ra và làm cho nó trở thành mô duy nhất sạch virus Sự chuyên hóa từ tế bào khởi sinh chịu tác động của một loạt các chất điều hòa sinh trưởng cũng giúp tiến trình không tạo ra đột biến

- Trên thế giới:

Có rất ít tài liệu về vi nhân giống các loài cây rừng nhiệt đới Ở Malaysia, Mahmood (1995) nhận định rằng việc nghiên cứu về vi nhân giống các loài cây rừng còn quá ít so với cây nông nghiệp Tác giả có nêu các công trình tiên phong

về việc vi nhân giống Acacia mangium và Gmelina arborea và một số loài song mây (Calamus spp.) Ở Philippines, Belarmino (1995) có nêu những kết quả bước đầu về vi nhân giống các loài song mây (Calamus spp.), tre (Dendrocalamus

latifloras cv Machiku), Albizzia falcataria Bach và Eucalyptus camaldulensis Ở

Ấn Độ, Sita (1995) có nêu sự thành công của kỹ thuật nhân giống áp dụng cho cây

gỗ trầm Ấn Độ (Santalum album) (không phải là cây dó bầu), Dalbergia latifolia,

Eucalyptus citriodora, E grandis, E tereticormis, Tectona grandis, Leucaena leucocephala, Pterocarpus santalinus và một số loài tre

Các thành tựu trên diện rộng ở Trung Quốc về việc vi nhân giống các loài

Eucalyptus spp, Populus spp Và Pawlonia spp cũng rất đáng được chú ý Đó là

chưa nói đến các loài thực vật đặc sản có trong rừng tự nhiên như phong lan, các

loài cây dược liệu, các loài song mây (rattan) và tre (Bamboo) là những chứng

minh cho khả năng ứng dụng của vi nhân giống trong lâm nghiệp

Ở Việt Nam:

Việc nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam chỉ mới bắt đầu từ năm

1975 Ý thức được triển vọng to lớn của ngành công nghệ sinh học trong chọn giống và nhân giống cây trồng nông lâm nghiệp, nhiều cơ quan làm công tác giống cây trồng đã ứng dụng công nghệ này Theo báo cáo của Hội thảo khoa học

về ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô và giâm hom trong lâm nghiệp (TP Hồ Chí Minh, tháng 11-1997) thì các đơn vị sau đây đã có những kết quả đáng chú ý: Xí nghiệp giống và phục vụ trồng rừng tại TP Hồ Chí Minh, Lâm Nông trường thực nghiệm Yên Lập (Quảng Ninh), Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng Việt Nam (Viện Khoa học Lâm nghiệp), Trường Đại học Lâm nghiệp (Xuân Mai, Hà Tây), Trung tâm nghiên cứu nguyên liệu giấy FRC (Phú Ninh, Vĩnh Phú) Các loài cây lâm nghiệp đã được nuôi cấy mô thành công là:

- Bạch đàn: Eucalyptus urophylla, với các xuất xứ Congo, Leizhou;

E.grandis x urophylla (xuất xứ Trung Quốc) và nhiều dòng E tereticornis và E camaldulensis

- Phi lao: Casuarina equisetifolia với 5 dòng từ Trung Quốc và nhiều dòng của Việt Nam; Giá tỵ: Tectona grandis xuất xứ Định Quán

- Tràm cừ: Melaleuca leucadendron xuất xứ Tân Tạo

- Các loài keo : Acacia auriculiformis, Acacia mangium và dòng lai

Acacia auriculiformis x mangium

- Sa Mộc : Cunningamia (Ở Lâm nông trường thực nghiệm Yên Lập)

- Lát: Chukrasia tabularis

- Song mật: Calamus rudentum

Ngoài ra, nhiều cơ quan nghiên cứu ngoài ngành lâm nghiệp cũng đã có nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào các loài cây thân gỗ và qua đó cũng giúp phát triển kỹ thuật nuôi cấy sang các loài cây gỗ lá rộng khác Trần Văn Minh (1997) đã tổng hợp kết quả nuôi cấy nhiều loài cây ăn quả thân gỗ như: Bơ

(Persea gratissima), Cam quít (Citrus sp.), Măng cụt (Garcinia mangostana), Mít (Artocarpus heterophyllus), Sapoche (Manilkana zabota), Vú sữa (Chrysophyllum

cainito), Nhãn (Euphoria longan), Cà phê (Coffea spp.) Trong hướng nghiên cứu

vi nhân giống các loài cây gỗ bản địa quý hiếm, Trương Mai Hồng (1997) đã

nghiên cứu nuôi cấy mô Cẩm lai Bà Rịa (Dalbergia bariensis)

Đối với cây Dó bầu, các nghiên cứu về vi nhân giống cũng đã được thực hiện, nhưng nguồn vật liệu ban đầu là từ cây hạt, chưa thấy có tài liệu nào đề cập đến việc nuôi cấy mô tế bào từ cây mẹ đã cho trầm hương

2.2.2.2 Nuôi cấy phát sinh phôi soma

Trong công nghệ vi nhân giống, có hai giai đoạn quan trọng là sự hình thành mô sẹo và sự hình thành phôi (Trần Văn Minh 2003)[24] Trong thực vật, sự thụ tinh thúc đẩy sự sinh sản của tế bào noãn và hình thành phôi thực Tuy nhiên,

sự thụ tinh không nhất thiết là điều kiện bắt buộc, như đã được chứng minh qua hiện tượng trinh sản (parthenogenesis) Công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật thực hiện sự hình thành phôi bằng các chất điều hòa sinh trưởng (Harikrishna và Wah 2002) [40] Sự tạo thành phôi từ tế bào soma đã được ghi nhận trên nhiều loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau; các phôi này được gọi là phôi phụ (accessory embryo), phôi bất định (adventive embryo), hay phôi giả (embryoid) Để có một

sự phân loại chính xác, có thể dựa trên các đặc trưng sau đây (Harikrishna và Wah 2002)[40]:

(1) Phôi từ hợp tử (Zygotic embryo), nghĩa là từ noãn thụ tinh,

(2) Phôi phi hợp tử (Non-zygotic embryo), từ các tế bào không phải noãn,

a Phôi soma (Somatic embryo), từ các tế bào soma,

b Phôi bất định (Adventive embryo), nghĩa là phôi soma phát sinh trực tiếp từ các phôi hay cơ quan khác,

c Phôi trinh sản (Parthenogenetic embryo) từ các noãn bất thụ,

d Phôi từ giao tử đực, ví dụ từ sự nuôi cấy hạt phấn

Quá trình hình thành và phát triển phôi soma phụ thuộc rất lớn vào các chất điều hòa sinh trưởng và thường có thể chia thành hai giai đoạn Trong giai đoạn đầu, cần kích thích sự hình thành và phát triển của mô sẹo trong một môi trường giàu auxin như 2,4-D (nồng độ 0,5-1 mg/l) Các cụm sinh phôi (embryogenic clumps, ECs) có thể hình thành nhưng không có phôi hoàn chỉnh Nhưng nếu các cụm sinh phôi này được chuyển sang một môi trường ít auxin (0,01-0,1 mg/l) hay không có auxin, chúng sẽ phát triển thành phôi thành thục Thay vì 2,4-D, các hệ khác sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng khác Vai trò của auxin được làm sáng

tỏ từ nhờ nhiều nghiên cứu với IAA (vốn là một auxin tự nhiên yếu hơn 2,4-D) và kinetin Chiếu xạ cũng được sử dụng như một phương tiện phân hủy auxin và do

đó kiểm soát nồng độ của nó (Harikrishna và Wah 2002)[40]

Bên cạnh mức auxin, từ lâu, nitrogen trong môi trường đã được chứng minh là có ảnh hưởng quan trọng trong sự phát triển phôi (Trần Văn Minh, Đinh Trung Chánh và ctv 2002)[23] Mô sẹo được kích thích phát triển trong môi trường có KNO3 là nguồn nitrogen duy nhất, nhưng một lượng nhỏ NH4Cl với sự hiện diện của KNO3 sẽ kích thích sự hình thành phôi (Harikrishna và Wah 2002)[40] Ngoài ra, hàm lượng kali cao và mức oxy hòa tan thỏa đáng trong môi trường cũng là những điều kiện thiết yếu (Kessel và ctv., 1977 dẫn trong Harikrishna và Wah 2002)[40]

Có những loài thực vật tái sinh tương đối dễ dàng và trong thời gian ngắn; tuy nhiên, có những loài thực vật tái sinh chậm và cần thời gian dài, đôi khi phải nuôi cấy tái sinh qua nhiều giai đoạn (Zimmerman và Brome 1980)[68] Để nâng cao hiệu quả tái sinh, chồi tái sinh xuất hiện được đưa vào nuôi cấy vi nhân giống hay nuôi cấy tăng sinh phôi soma hay phôi giả, nhằm mục tiêu nâng cao quá trình tái sinh và nâng cao hệ số nhân giống (Mantell và ctv 1985)[51]

Việc tạo phôi vô tính từ các tế bào soma đã được ứng dụng có kết quả trên

nhiều loài cây gỗ, đặc biệt là cây gỗ lá kim (Conifer) Trong sự phát triển hiện nay, kỹ thuật này đã cho phép sản xuất "hạt giống nhân tạo" từ vật liệu nuôi cấy, cung cấp một nguồn vật liệu thay cho hạt giống thực sinh Đây là một trong những

kỹ thuật hiện đại nhằm sản xuất “hạt giống” có trạng thái tương tự như hạt thực sinh và có khả năng tái sinh trong điều kiện tự nhiên (Trần Văn Minh, Đinh Trung Chánh và ctv 2002)[23] Nguyên liệu được sử dụng là phôi, thể giả phôi, đỉnh sinh trưởng, hay đốt thân, v.v., được bao bọc bằng một gel thường có nguồn gốc polyme hữu cơ Các kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng nguyên liệu phôi thì thời gian tái sinh phôi rất chậm trên hai đối tượng này phải mất 5 - 6 tháng phôi mới tái sinh, nên sử dụng nguyên liệu làm hạt nhân tạo không thuận lợi so với các con đường khác, như thể giả phôi (Đinh Trung Chánh và Trần Văn Minh 2005)[7]

Những kết quả hấp dẫn được nói tới phôi soma nhiều nhất là ở các loài

Pseudotsuga menziesii (Douglas-fir) và Picea sitchensis (Sitka spruce) ở Canada,

Mỹ và một số nước châu Âu, Pinus radiata (Radiata pine) ở Tân Tây Lan, là

những nơi mà ngày nay các hệ thống gieo ươm và sản xuất cây con được tự động hóa cao độ, với những tinh dòng (clone) được kiểm tra Nhìn chung, việc nhân giống cây thân thảo thì được tiến hành hầu như ở rất nhiều loài, riêng đối với cây thân gỗ thì các nước có nền công nghệ sinh học phát triển như Mỹ, Đài Loan, Philippines… cũng đã thành công trên nhiều loài có giá trị cao như Gỏ đỏ, Dầu, Sồi, Dẽ, Thông, Bạch Đàn v.v…

Sản xuất hạt giống nhân tạo được xem là một phương án có triển vọng để lưu giữ lâu dài tài nguyên di truyền của các loài thực vật rừng, đặc biệt đối với các loài khó tính Mặc dù đã được Murashige nói đến từ năm 1977 (Harikrishna và Hoe, 2002)[39], các áp dụng của nó chỉ đã được thực sự được bắt đầu vào cuối thập niên 1980 với ba cách thức: (1) hạt tổng hợp được làm khô bằng cách bao kín trong gel alginat hay một chất nhựa tổng hợp tan trong nước, (2) hạt tổng hợp bao kín trong gel thủy hợp, và (3) hạt tổng hợp bao kín trong một chất không ưa nước Tiến trình bao gồm các kỹ thuật tạo phôi soma, hay nuôi cấy chồi ngọn hay chồi bên và bao kín vật liệu nuôi cấy trong một thể gel bảo vệ như alginat, ethylen glycol, và các chất khác (Lapitan 2002)[46] Lớp bảo vệ này mô phỏng vai trò của

vỏ hạt và phôi nhũ của hạt giống tự nhiên, nghĩa là giữ cho phôi không bị khô hay

hư hỏng khi bảo quản ở nhiệt độ thấp, cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho hạt nhân tạo và tránh sự xâm nhiễm của nấm bệnh Vật liệu sau đó được giải đông và

nuôi cấy bình thường (Chin 1994)[34]

2.2.3 Sự hình thành trầm hương

Theo một tài liệu của Trung tâm Giám sát Bảo tồn Tài nguyên thiên nhiên (WCMC 2001) [66] trong tự nhiên, tỷ lệ số cá thể cây Dó bầu có trầm hương chỉ vào khoảng 10% tổng số cá thể trong một quần thể Như vậy, không phải cá thể

Aquilaria nào cũng cho trầm trong tự nhiên và việc đánh giá biến thiên về khả

năng tạo trầm của các nguồn vật liệu di truyền khác nhau là cần thiết

Hiện tại nguồn gốc hình thành trầm hương được giải thích dựa trên các giả thuyết: gây thương tích bệnh học và phi bệnh học Trong cách giải thích bệnh học, vai trò của các loại nấm được nhấn mạnh, và điều nầy được xác nhận bằng cách cho những cây Dó bầu lành mạnh nhiễm nấm Sau một thời gian, vùng bị xâm nhiễm trở nên sẩm màu, trở thành "tóc" rõ rệt và khi đốt cũng tỏa ra mùi trầm Tuy nhiên, các tác giả đi theo hướng này đã không thống nhất một tác nhân chính Ví

dụ, Julaluddin (Dẫn trong Phạm Hoàng Hộ,1985) [15] nhận thấy rằng vùng tóc

chứa một loại nấm được xác định là Cryptosphaeria mangifera, trong khi một tài

liệu của Cơ quan Nông nghiệp, Thực phẩm và Thú y của Singapore ghi nhận loài

nấm xâm nhiễm là Phialophora parasitica (Hansen 2000) [38]  Dựa vào các nguồn thông tin khác nhau, các loại nấm như đã được đề cập bao gồm các ngành phụ: nấm bất toàn (Deuteromyota), nấm nang hay nấm túi (Ascomyota) và nấm

đảm (Basidiomyota) Các loài đã được đề cập bao gồm: Phialophora parasitica,

Torula sp., Aspergilus sp., Pennicilium sp., Fusarium sp., Cladosporium sp., Epicoccum sp., Cylimudrocladium sp., Sphaeropsis sp., Botryodiplodia Theobromac, Trichoderma sp., Phomopsis sp và Cunninghamella echinulata

Parman và Tri Mulyaningsih (2002) [57] thuộc Đại học Mataram

Indonesia đưa ra cách tạo trầm (gaharu) trên các loài cây Aquilaria spp 5 – 6 tuổi

Các tác giả cho rằng đây là thời điểm thuận lợi, sẵn sàng để lây nhiễm tạo trầm

hương Tiến trình xử lý bao gồm tạo vết thương (bằng cách dùng cưa tạo thành vết cắt vào khoảng 1/3 đường kính thân cây với các vị trí xoắn ốc, hay khoan lỗ đường kính khoảng 10 mm vào khoảng ½ thân cây, các lỗ cách nhau chừng 10cm Chú ý, nơi đặt lỗ (vết thương) để lây nhiễm thấp nhất phải cách mặt đất khoảng 10 cm; các dụng cụ đều được khử trùng bằng cồn 70% (hay cồn thuốc) Sau đó một

loài nấm Fusarium lateritium, nuôi dưỡng trong một môi trường đặc biệt được

đưa vào vết thương Nếu thân cây có đường kính 20 cm, thì cần một muỗng cà phê cho mỗi lỗ khoan và hai muỗng canh cho một lỗ cưa (sao cho đầy lỗ) Sau đó, cần phải phủ bên ngoài lỗ một lớp màng mỏng bằng paraffin hay bằng sáp ong Hai năm sau, có thể thu hoạch trầm hương bằng cách đốn cây xuống và tìm những chỗ

có nhựa Phần rễ cũng có thể thu hoạch nếu phần tạo trầm lan rộng xuống rễ Đồng thời có thể thu hoạch thêm vài lần sau 2 – 3 năm nữa

Oldfield (1998) [56] cho rằng việc sản xuất nhựa là phản ứng của cây trước

sự xâm nhiễm và lan truyền của nấm Cũng có thể giải thích thêm là sự gia tăng của nhựa được xem như một phản ứng của ký chủ chống lại sự thiệt hại tăng do phát triển của nấm Tuy nhiên, khi quan sát các mô đang biến đổi để hình thành trầm, không thấy có dấu hiệu phân hủy cellulose và lignin, ngược lại sự tích luỹ tinh dầu làm cho gỗ biến đổi – có khối lượng riêng cao hơn bình thường

Blanchette (2002) [31] đã đi theo hướng phi bệnh học khi đưa ra phương pháp tạo trầm trên cây Dó bầu trồng từ 3 – 12 tuổi bằng cách cưa cắt, đục, khoan hay đóng đinh để tạo ra vết thương cơ giới trong phần gỗ (xylem) của cây Dó bầu

(Aquilaria sp.) Các vết thương phải vào sâu trong gỗ từ 4 – 6 cm, thường được bố

trí theo đường xoắn ốc trên thân cây và cách nhau khoảng 5 cm Tuy nhiên, điểm đặc biệt trong sáng chế này là thực hiện sự thông khí cho vết thương bằng cách gắn dụng cụ thông khí như: đinh, ống típ (tube) hay ống dẫn (pipe) hoặc có những rãnh ở mặt ngoài Dụng cụ có thể làm bằng chất dẻo, tre, gỗ hay các vật liệu hữu

cơ khác hoặc bằng kim loại Nó có đường kính khoảng 2 cm, và sau khi gắn có thể nhô ra khỏi bề mặt thân cây khoảng 2 – 15 cm Sự thông khí này có thể kiểm tra định kỳ mỗi tháng một lần, có thể thực hiện bằng cách loại bỏ phần tượng tầng

(cambium) chung quanh vết thương một hay nhiều lần Tác giả cũng nhận định rằng sự làm chết các tế bào nhu mô ở phần gỗ chung quanh vết thương là tác nhân kích thích sự hình thành nhựa cho các tế bào chung quanh vết thương (Blanchette 2002) [31] Nếu nhận định này là đúng thì sự thông gió cho vết thương cung cấp oxygen cho sự tổng hợp thứ cấp là cơ chế chính Tác nhân hoá học có thể làm chết các tế bào cục bộ, là một trong các hoá chất sau: natri- bisulfit, muối ăn (NaCl), clorua sắt tam, clorua sắt nhị, chitin, acid formic, cellobiose, acid salicyclic, bột sắt, dịch nấm men và hỗn hợp natri bi – sulfit, dịch nấm men Difco và bột sắt theo

tỉ lệ 1:1:3

Siripatanadilok (1991) [61] ở khoa Lâm nghiệp, Đại học Kasetsart, Thái

Lan đã làm các thí nghiệm tạo trầm hương trên 20 cây Dó bầu (Aquilaria

crassna), ở Vườn Quốc gia Khao Yai (cách Bangkok 150 km về phía đông bắc)

Thí nghiệm thúc đẩy xúc tiến tạo trầm bằng các phương pháp: cơ học, vật lí, hoá học và sinh học Sau hai tháng nghiên cứu sự hình thành các mẫu về khả năng tụ trầm Ông đã có một số nhận xét ban đầu như sau:

(1) Biện pháp cơ học: Cắt những lỗ hình chữ V và những lỗ thẳng góc có kích thước 1 inch x 1 inch x ½ inch ở giữa có phần gỗ nhô lên như cái đảo đứng

tách riêng, lập lại 10 lần trên 2 cây Aquilaria crassna và chất Sautar – một loại

thuốc diệt nấm) được bôi lên bề mặt vết thương

Kết quả cho thấy xung quanh phần lỗ chữ V (tế bào gỗ còn sống) thì gỗ có phần sậm, màu xám đậm của gỗ tích luỹ trầm hương, trong khi phần ốc đảo (tế bào gỗ bị chết) thì không thấy dấu hiệu tích tụ trầm Như vậy, phần trầm hương có thể chỉ được tạo ở phần gỗ còn sống

(2) Biện pháp vật lí: Dùng ngọn lửa nhẹ đốt xuyên qua vết cắt chữ V để so sánh với vết cắt đối chứng không bị đốt Bề mặt cả hai vết (nốt, lỗ) cắt được quét chất chống nấm Sautar – A

Thí nghiệm được thực hiện trên 3 thân cây Aquilaria crassna với 5 vết cắt

mỗi cây Sau 1 tháng 10 ngày tác động xử lí, phần trên và dưới của vết đốt được

quan sát – thì thấy phần gỗ có màu nâu sậm, chứng tỏ có dấu hiệu tích tụ trầm.Tuy nhiên, phần đệm trung gian giữa chỗ cắt và nơi tích tụ nhựa trầm của vết cắt bị đốt rộng hơn nốt không bị đốt Nốt được xử lí nhiệt có phần trung gian phía trên rộng hơn phần phía dưới và sự xuất hiện của vòng tụ nhựa trầm phía trên cũng rất nhạt, chứng tỏ là sự phá huỷ của nhiệt đối với phần tế bào phía trên nhiều hơn

(3) Biện pháp hoá chất: Sử dụng các chất acid, các hormon tăng trưởng của thực vật và thuốc diệt cỏ mạnh để xử lí vào các vết thương trong phần gỗ cây

Aquilaria crassna để kích thích gây sự tích tụ nhựa trầm

- Các loại acid: Ba loại acid hữu cơ là: Acetic acid, Formic acid, Pyruvic acid được sử dụng ở các nồng độ 0,5%, 1% và 3% Hydrochloric acid đươc sử dụng ở mức độ đậm đặc 1N, 3N và 5N

Tất cả các mức độ acid đều phá huỷ mô gỗ sống, ngay cả mức nồng độ 0,5%, nhưng kết quả cho thấy là có rất ít sự tích tụ tinh dầu trầm ở giữa đường biên của các mô gỗ chết Đối với acid hữu cơ thì acid formic phá huỷ mô gỗ nhiều hơn các loại acid khác, vết phá có thể chạy dài đến 30 cm, tuy nhiên chỉ có một lớp mỏng trầm hương được thành lập giữa hai phần mô gỗ sống và mô gỗ chết

Các chất kích thích sinh trưởng (Auxin): Napthalene acetic acid (NAA), indole butyric acid (IBA), 2,4 – dichloro acetic (2,4 D), Ethylene được sử dụng với 3 nồng độ 500 ppm, 1.000 ppm và 2.000 ppm được dùng để gia tăng sự tích tụ

nhựa trầm trên cây Aquilaria crassna từ kết quả ứng dụng trên cây cao su đã đạt

mức gia tăng nhủ dịch tốt Hầu hết các nghiệm thức này, ngay cả khi xử lí ở nồng

độ 500 ppm thì phần gỗ bị phá huỷ vẫn có diện tích rộng dọc theo sớ gỗ và chỉ xuất hiện một lớp mỏng gỗ trầm vòng theo phần mô gỗ bị chết Đối với nghiệm thức xử lí bằng Ethrel (ethylene) với cách xử lí bằng chỉ cotton len thấm Ethrel có

thể cho số lớn tinh dầu tích tụ hơn, ngay cả cây Aquilaria crassna 4 tuổi có thể

cho vòng tụ trầm trong 3 – 5 ngày

- Chất diệt cỏ mạnh: Paraquat đã được sử dụng để làm gia tăng năng suất

tích tụ nhựa ở cây thông (Pine) Do đó, cây Dó bầu cũng tham gia thí nghiệm với các dung dịch paraquat trong nước là theo tỷ lệ 1:5, 1:10 và được thấm bằng cotton len nhét vào các nốt gỗ đã bị phá bằng khoan hay đục Sau ba tháng xử lí, các tác giả nhận thấy phần gỗ phía dưới bị phá hủy nhiều và kéo dài theo sớ gỗ, nhưng ở giữa đường biên của các tế bào sống và tế bào chết thì không thấy tích tụ nhựa trầm

- Biện pháp sinh học: Bốn loại nấm của gỗ, gồm ba loại Basidismycetes

(đảm khuẩn): Phellinus rimosus (Berk.) Pil., Phellinus ferreus (Pers.) Bourd.& Galz., Lentinus edodes (Berk.) Sing và một loại nấm bất toàn (fungi imperfecti)

Botryodiplodia theobromae Pat được dùng để tiêm tác động vào cây

Những loại nấm được nuôi dưỡng trong môi trường khoai tây, đường dextrose và agar (PDA) trong các dĩa peti ở nhiệt độ 250C trong 1 tuần rồi mang đi thí nghiệm trên các cây Dó bầu tại Vườn Quốc gia Khao – Yai (Thái Lan) Có ba nghiệm thức (cách thức thí nghiệm): một – không cho nấm vào (đối chứng), hai – cho nấm vào lỗ và bịt kín, ba – cho nấm vào lỗ để hở Kết quả sau 2 tháng cho thấy, phần nhựa trầm tích tụ ít và có màu nâu nhạt, có lẽ chỉ mới lây nhiễm trong thời gian ngắn (2 tháng) cho nên hầu hết các loại nấm chưa hoạt động tốt Tuy nhiên số lượng tinh dầu trầm tích tụ được cải thiện hơn so với các lỗ chỉ khoan và trét chất chống nấm

Từ năm 1996, Quỹ Rừng Mưa nhiệt đới Châu Âu kết hợp với trường Đại học Khoa học Tự nhiên và hai tỉnh An Giang và Kiên Giang đã nghiên cứu việc gây tạo trầm của cây Dó bầu trồng từ hạt ở Phú Quốc và Bảy Núi (TRF 1997)[28] Nghiên cứu này đã làm sáng tỏ một số vấn đề về sự hình thành trầm và thúc đẩy

sự tham gia của người dân trong việc gây trồng cây Dó ở hai tỉnh này Những nơi khác, như ở Tiên Phước (Quảng Nam), nông dân đã tự nghiên cứu mày mò cách thức xử lý kỹ thuật để làm cho cây Dó bầu trên 10 tuổi kết trầm theo mong muốn (Huỳnh Văn Mỷ 1997) [27]

Cũng theo hướng kích thích cơ giới, hóa học và vi sinh, Nguyễn Hồng Lam (2003) [20] đã thí nghiệm trên các cá thể có độ tuổi và hoàn cảnh sống khác nhau