NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ************** ĐINH TRUNG CHÁNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DỊNG DĨ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Thành Phố Hồ Chí Minh - Năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ************** ĐINH TRUNG CHÁNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DỊNG DĨ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Chuyên ngành: Kỹ thuật Lâm sinh Mã số: 62 62 60 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Văn Minh PGS TS Bùi Cách Tuyến Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 03/2010 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Đinh Trung Chánh iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành trân trọng đến PGS Tiến sĩ Trần Văn Minh PGS Tiến sĩ Bùi Cách Tuyến nhận hướng dẫn khoa học cho luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn GS Tiến sĩ Bùi Chí Bửu GS Tiến sĩ Nguyễn Thị Lang giúp đỡ việc áp dụng phương pháp khảo sát đa dạng di truyền Tôi xin trân trọng cám ơn Viện Công Nghệ sinh học Môi trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long việc giúp đỡ tạo điều kiện cho việc tiến hành thí nghiệm Xin trân trọng cảm ơn Vườn Quốc gia Phú Quốc, Chi cục Kiểm Lâm Quảng Nam, Ủy Ban Dân tộc Miền núi, Trung tâm Khảo sát Thiết kế Nơng nghiệp tỉnh Khánh Hòa, Chi cục Kiểm Lâm An Giang Thảo Cầm Viên TP Hồ Chí Minh giúp đỡ khảo sát thực tế TP HCM, ngày 15 tháng năm 2010 Đinh Trung Chánh iv TĨM TẮT Trong Luận án này, chúng tơi trình bày: (1) kết khảo sát trường thí nghiệm phòng thực địa nhằm tìm hiểu đặc điểm Dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) có trầm; (2) ứng dụng di truyền học phân tử để khảo sát đa dạng lồi; (3) ứng dụng kỹ thuật ni cấy đỉnh sinh trưởng, phát sinh phôi soma tạo hạt giống nhân tạo để nhân nhanh giống Dó bầu từ cá thể mẹ có trầm; (4) thăm dò khả kích thích tạo trầm biện pháp vi sinh hóa học Phần tổng quan dựa vào nhiều nguồn tài liệu tham khảo, nhấn mạnh giá trị cao gỗ trầm động lực dẫn tới khai thác mức cạn kiệt loài rừng tự nhiên Nhưng nông dân tỉnh khảo sát từ Quảng Nam trở vào đảo Phú Quốc đáp ứng với tình hình khan sản phẩm trầm kỹ thuật trồng, quản lý, kích thích tạo trầm khai thác trầm cách đa dạng Một số kỹ thuật dân gian để kích thích tạo trầm ghi nhận Nghiên cứu đa dạng loài thực với hai phương pháp sinh học phân tử: phản ứng PCR-RAPD giải trình tự chuỗi DNA Sử dụng phản ứng PCR-RAPD 12 mẫu cá thể Dó bầu thí nghiệm từ xuất xứ gần quần thể cho thấy mẫu chia thành nhóm chính, phản ánh đa dạng lồi mẫu Dó bầu khảo sát Kết nghiên cứu trình tự DNA bốn xuất xứ Dó bầu khác củng cố cho kết luận đa dạng loài từ phương pháp PCR Mẫu vật thu thập từ Dó bầu có dấu hiệu tạo trầm sử dụng cho thí nghiệm ni cấy mơ qua hai bước chính: (1) ni cấy đỉnh sinh trưởng (2) ni cấy phát sinh phôi soma tạo hạt nhân tạo Các thí nghiệm ni cấy đỉnh sinh trưởng tập trung vào việc xác định mơi trường thích hợp, tác dụng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng điều kiện vật lý ảnh hưởng lên vi nhân giống in-vitro từ đỉnh sinh trưởng Môi trường WPM tỏ tốt môi trường MS cho việc nuôi cấy So sánh vật liệu nguồn từ Bắc đảo Phú Quốc v (BD1 BD2) từ Nam đảo Phú Quốc (ND1 ND2) cho thấy xuất xứ có ảnh hưởng lên hình thành phát triển chồi in-vitro Các thí nghiệm ni cấy tế bào soma thiết kế liên hoàn nhằm dẫn tới việc sản xuất "hạt giống nhân tạo" sử dụng thuận tiện việc nhân nuôi thay cho hạt giống thực sinh Việc nuôi cấy phát sinh tế bào phôi soma từ mẫu rễ môi trường MS bổ sung BA, kinetin, NAA, IBA, 2,4D, vitamin B5 cho thấy tỷ lệ phát sinh tế bào soma cao với mẫu nuôi cấy rễ (dòng ND, nam đảo Phú Quốc) Sau có phơi soma, thí nghiệm nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma tiến hành môi trường nuôi cấy có agar, nhân sinh khối mơi trường lỏng sau tái sinh phơi soma Thể giả phơi (PLB), dạng thuận lợi cho vi nhân giống, chun hóa cách bổ sung kích thích tố "Hạt giống nhân tạo" thực với natri alginat calci clorua môi trường WPM bổ sung sucrose Natri alginat 4% cho độ đông đặc thỏa đáng không ảnh hưởng bất lợi lên tái sinh Sinh trưởng sau nuôi cấy ống nghiệm theo dõi vườn ươm 12 tháng Sự khác biệt sinh trưởng từ bốn xuất xứ ND1, ND2, BD1, BD2 khơng có ý nghĩa, bề rộng từ ND1 ND2 nhỏ từ BD1, BD2 Sự phân lập nấm mơ có dấu hiệu hình thành trầm cho phép xác định tập đoàn gồm 10 loài nấm khác diện mô gỗ khảo sát Một số chi nấm xác định tương đồng với số cơng trình gần Từ đó, thí nghiệm thăm dò kích thích tạo trầm với bảy nghiệm thức (vi sinh hóa học) ba địa điểm: Đại Lãnh (Nha Trang), Thảo Cầm Viên (TP Hồ Chí Minh) Vĩnh Long thực Kết không hoàn toàn đồng ba địa điểm xử lý clorua (Cl-) mang lại tác dụng cao hai ba địa điểm xếp hạng cao Xử lý nấm đen nitrat (NO-3) cho kết đứng thứ hai Đại Lãnh Thảo Cầm Viên thứ Vĩnh Long vi SUMMARY This thesis presents findings from field studies, laboratory and in situ experiments on the characteristics of Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte (eaglewood) and the application of plant cell technologies to propagate specific clones of this endangered species of Vietnam Besides, explorative experiments on the inducement of eagle-wood formation from planted trees of this species were also performed A review of litteratures was performed, focusing on the characteristics of the species and a wide range of utilization and market value of eagle-wood and its derivatives in Asia The studies on formation of eagle-wood in the nature and in controlled experiments were also reviewed The high value of eagle-wood and its products has been the main motivation of its over-exploitation, and leading to depletion of the species in natural forests However, field studies conducted in various provinces in the natural area of the species from Quảng Nam to Phú Quốc shown a positive trend of planting Aquilaria and inducing eagle-wood formation initiated by farmers PCR-RAPD and DNA sequencing were used to explore the intraspecific diversity High similarity values (0.75-1.0) were obtained from a test with 18 samples, which can be grouped into clusters, relecting the provenances of the samples DNA sequencing was also performed on samples and chains of both DNA and proteins were elaborated Distance analyses shown the possibility of grouping the samples based on DNA chain was better than those based on protein sequences Materials collected during the field visits in North and South Phú Quốc Island from Aquilaria trees having indications of eaglewood formation were used in micro-propagation experiments Two set of experiments were conducted, meristematic and somatic cell cultures, to find appropriate techniques and conditions The meristematic culture experiments aim to determine suitable medium, the addition of growth regulators and the physical condition affecting in vii vitro propagation and development of plantets The somatic cell culture experiments were designed according to a schemee that leads to the production of "artificial seeds", i.e a form of culture embedding in organic polymers to be conveniently used as natural seed substitues In meristematic culture, WPM was found better than MS medium The addition of BA (0.1 mg/l) and NAA (0.1 mg/l) was found suitable for protocorm formation, while the supplementation of CW was found giving a high rate of differentiation A combination of BA (0.1 mg/l) and BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) gave better shoot elongation of the plantets in-vitro Besides, a high light intensity (54.72 μmol/m2/s), combined with good aeration is required for the growth and development of the cultures A comparison of the stocks, including two from North Phu Quoc Island (BD1 and BD2) and two from South Phu Quoc Island (ND1 and ND2), shown that provenances influences the variations of shoot formation and growth in-vitro Somatic cell cultures were performed with leaf and root tissues on MS medium with the supplementation of BA, Ki, NAA, IBA, 2,4D, and vitamine B5 Root tissues from ND stock gave good results Somatic cells developed rapidly in media supplemented with 2,4-D, while in media with BA + NAA + Ki + vitamine B5 the somatic cells had a milky white color Somatic cell suspensions were multiplied in liquid media or in media gelatinized with agar-agar and somatic embryos were regenerated PLB, a convenient form for micropropagation, can be differentiated by the supplementation of BA (5mg/l) + NAA (0.2 mg/l) or Ki (3 mg/l) + NAA (0.2 mg/l) and the results were better than BA or Ki alone Artificial seed production experiments were performed with sodium alginat and the "seeds" were regenerated with sodium chloride on WPM with the addition of sucrose Sodium alginate at 4% was found giving an adequate consistency, but a higher concentration can give harmful effect on regeneration The growth of the seedlings from micropropagated plantets were monitored up to 12 months The differences of growth performances of plantets from stocks viii ND1, ND2, BD1, BD2 were found non-significant but leaf widths of the plantet from ND1 and ND2 stocks were smaller than from BD1, BD2 Ten (10) fungi species were isolated and identified in the samples of infected wood Certain similarity between our results and fungi recorded by previous authors were recognized Based on results of the isolation experiments and the field study, an explorative experiement was carried-out with seven treatments: (1) Control, (2) White fungi, (3) Black fungi, (4) Chlorine-based (Cl-) , (5) Oil-based, (6) Sulfate (SO42-) , (7) Nitrate (NO3-), on three sites: Đại Lãnh, The HCMC Zoo and Vĩnh Long The results were not totally consistent in three sites, although the effect of chlorine-based treatment was high in two of three sites and was assessed as highest in the total score Black fungi and nitrate-based treatments were ranked second of seven treatments ix MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii  TÓM TẮT v  SUMMARY vii  MỤC LỤC x  BẢNG CHỮ VIẾT TẮT xiiiii  DANH SÁCH CÁC BẢNG xv  DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ xviii  Chương MỞ ĐẦU 1  1.1 Lý thực đề tài 1  1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3  1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3  1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4  1.4.1 Về mặt khoa học 4  1.4.2 Về mặt thực tiễn 4  1.5 Những đóng góp luận án 4  Chương TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 6  2.1 Cây Dó bầu sản phẩm trầm hương 6  2.1.1 Đặc điểm thực vật học phân bố Dó bầu 6  2.1.2 Công dụng phân loại trầm hương 8  2.2 Cơ sở lý thuyết đề tài 10  2.2.1 Đánh giá đa dạng di truyền 10  2.2.2 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nuôi cấy phát sinh phôi soma 12  2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 12  2.2.2.2 Nuôi cấy phát sinh phôi soma 14  2.2.3 Sự hình thành trầm hương 17  Chương NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23  3.1 Nội dung nghiên cứu 23  3.1.1 Điều tra thực trạng, sưu tầm lấy mẫu khảo sát 23  3.1.2 Đánh giá đa dạng di truyền cấp độ loài 23  3.1.3 Nhân giống phương pháp nuôi cấy mô sản xuất hạt giống nhân tạo từ Dó bầu cho trầm 24  x Electropherogram mẫu Dó bầu xuất xứ Bắc đảo Phú Quốc – Kiên Giang 159 Mẫu 4: Nam đảo Phú Quốc – Kiên Giang Chi tiết mẫu Dó bầu xuất xứ Nam đảo Phú Quốc – Kiên Giang 160 Đồ thị EPT mẫu Dó bầu xuất xứ Nam đảo Phú Quốc – Kiên Giang 161 Đồ thị Raw mẫu Dó bầu xuất xứ Nam đảo Phú Quốc – Kiên Giang 162 Electropherogram mẫu Dó bầu xuất xứ Nam đảo Phú Quốc – Kiên Giang 163 PHỤ LỤC THÍ NGHIỆM NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY DĨ BẦU Phụ lục Sơ đồ rút gọn nuôi cấy phôi soma tạo hạt nhân tạo cho Dó Lấy mẩu đỉnh sinh trưởng từ dòng chọn lọc bầu Ni cấy chồi đỉnh sinh trưởng Môi trường WPM +BA 0,1mg/l + CW (10%) Vật nuôiWPM cấy: Lá lấy từ vitro Môiliệu trường Bổ sung BA (0,1mg/l) + CW (10%) Nuôi cấy phôi soma Môi trường: MS + nước dừa 10 % + saccaroz 30 g/l Bổ sung: BA 1mg/l + Ki mg/l + NAA 0,5 mg/l BA 7mg/l + Ki mg/l + IBA 0,5 Tạo tế bào phôi soma Tăng sinh khối Môi trường lỏng O2 Trãi phôi soma Môi trường C3 tăng nhanh sinh khối tế bào phôi soma Tạo thể giả phôi Môi trường WPM + BA/NAA hay Ki/NAA Tái sinh thể giả phôi Môi trường WPM + IBA (0,7 mg/l) Chiều cao chồi 65 mm Thời gian phát sinh rễ 45 ngày sau nuôi cấy Môi trường WPM + Saccaroz (2 g/l) + alginat natri (4 %) + CaCl2 (2 %) + BA (0,1 mg/l) + IBA (0 ,1 mg/l) Tạo hạt nhân tạo Nhiệt độ 10-30oC Thời gian tháng Bảo quản hạt nhân tạo IBA (0,1 mg/l) kích thích hạt nảy mầm rễ sau 28 ngày Tái sinh hạt nhân tạo Bắt đầu chiều cao thân đạt 40 – 50 mm Cơ chất: xơ dừa Phun sương 15 phút nghỉ 30 phút Duy trì 10 ngày Thuần hóa 164 Phụ lục 3.2 Sơ đồ vị trí lấy mẫu Dó bầu có trầm để thí nghiệm ni cấy 165 Phụ lục 3.3 Hình ảnh lấy mẫu thí nghiệm nhân giống vơ tính Lấy mẫu đỉnh sinh trưởng Dó bầu có dấu hiệu hình thành trầm ngồi thực địa Cây Dó bầu cấy mơ từ đỉnh sinh trưởng hoa in vitro 166 Phụ lục 3.4 Môi trường dùng thí nghiệm ni cấy tế bào Dó bầu in vitro 167 PHỤ LỤC KHẢO SÁT SỰ LÂY NHIỄM TẠO TRẦM VÀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA TRẦM HƯƠNG Phụ lục 4.1 Hình ảnh lây nhiễm tạo trầm, sơ chế phân loại trầm hương Sơ chế làm mảnh trầm hương (sủi trầm) Quảng Nam Cây Dó bầu lây nhiễm tạo trầm hương Tiên Phước, Quảng Nam Phân loại trầm hương Quảng Nam 168 Phụ lục 4.2 Phiếu Giám định nấm mẫu gỗ Dó bầu có trầm vùng khảo sát 169 Phụ lục 4.3 Thành phần hóa học trầm hương nguyên liệu mua tỉnh Khánh Hòa 170 Phụ lục 4.3 Thành phần hóa học trầm hương nguyên liệu mua Khánh Hòa (tiếp theo) 171 Phụ lục 4.4 Thành phân hóa học trầm hương lấy từ thí nghiệm lây nhiễm 172 Phụ lục 4.4 Thành phân hóa học trầm hương lấy từ thí nghiệm lây nhiễm (tiếp theo) 173 ... experiement was carried-out with seven treatments: (1) Control, (2) White fungi, (3) Black fungi, (4) Chlorine-based (Cl-) , (5) Oil-based, (6) Sulfate (SO4 2-) , (7) Nitrate (NO 3-) , on three sites:... xii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D ABA ADP AFLP AMP AP-PCR ATP BA BD CAD CORR CRD CTAB CV% CW DAF DAP DMSO DNA ĐBSCL EC EDTA EN GCMS IAA IBA Ki LSD MS MSStat NAA ND NST NTSYS 2,4-dichorophenoxyacetic acid... Murashige-Skoog (1962) Phần mềm thống kê α-Naptalen acetic acid Nam đảo Phú Quốc Nhiễm sắc thể Numerical Taxonomy System (hệ thống phân loại số) xiii PAC PCR PDA PLB RAPD RCBD SAHN SDS SSR SYSTAT