BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP KHẢO SÁT TỶ LỆ HUYẾT THANH DƯƠNG TÍNH VỚI LEPTOSPIRA TRÊN CHÓ TẠI TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHÓ GIỐNG PHÚ QUỐC – CỬU LONG Họ và tên sinh viên : NGUYỄN THỊ KIM NGỌC Ngành : Thú Y Niên khóa : 20022007 Tháng 112007 i KHẢO SÁT TỶ LỆ HUYẾT THANH DƯƠNG TÍNH VỚI LEPTOSPIRA TRÊN CHÓ TẠI TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHÓ GIỐNG PHÚ QUỐC – CỬU LONG Tác giả NGUYỄN THỊ KIM NGỌC Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ ngành Thú y Giáo viên hướng dẫn: ThS. NGUYỄN VĂN PHÁT ThS. BÙI NGỌC THÚY LINH Tháng 11 năm 2007 ii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi Thú y, cùng quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báo cho em. Lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Văn Phát Th.S Bùi Ngọc Thúy Linh Đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp và bảo vệ luận văn. Xin cảm ơn BSTY Lê Thị Hà BSTY Nguyễn Thị Minh Hòa Tập thể nhân viên Bệnh viện Thú y trường Đại học Nông Lâm và toàn bộ anh chị em của trại chó giống Phú Quốc Cửu Long. Đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Cảm ơn các bạn lớp Thú y 19 đã cùng tôi thực tập, động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong suốt quãng đời sinh viên. Nguyễn Thị Kim Ngọc iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Khảo sát tỷ lệ huyết thanh dương tính với Leptospira trên chó tại Trung tâm nghiên cứu và sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long” được thực hiện từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2007 tại Bệnh viện Thú y trường Đại học Nông Lâm và trung tâm nghiên cứu và sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long. Bằng phản ứng MAT (Microscopic Agglutination Test), với bộ kháng nguyên sống gồm 23 serovar thuộc 23 serogroup do viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh cung cấp, chúng tôi đã tiến hành thu thập 105 mẫu huyết thanh trên giống chó Phú Quốc của trại chó giống Phú Quốc – Cửu Long. Cho thấy tỷ lệ dương tính với Leptospira ở hiệu giá từ 1100 trở lên là 36,19%. Với sự hiện diện của 13 serovar khác nhau cho phản ứng dương tính. Trong đó, tỷ lệ huyết thanh dương tính cao nhất là với serovar canicola Chiffon (46%) và hardjo Hardjo Bovis (26%). Hiệu giá kháng thể ở mức 1100 chiếm 50%, 1200 chiếm 30%, 1400 chiếm 12%, 1800 và 11600 chiếm 4%. Mặt khác, qua xét nghiệm cũng cho thấy 81,58% chó nhiễm 1 serovar, 2 serovar là 10,53%, 3 serovar là 2,63%, 4 serovar là 5,26% và không có trường hợp nào dương tính nhiều hơn 4 serovar trên một cá thể. iv MỤC LỤC Trang Trang tựa........................................................................................................................... i Lời cảm ơn ....................................................................................................................... ii Tóm tắt ........................................................................................................................... iii Mục lục ........................................................................................................................... iv Danh sách các hình và sơ đồ ....................................................................................... viii Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix Danh sách các biểu đồ ..................................................................................................... x Chương 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1 1.2. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU......................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ................................................................................................................ 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................................. 2 Chương 2. TỔNG QUAN .............................................................................................. 3 2.1. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ TRẠI CHÓ PHÚ QUỐC CỬU LONG ................... 3 2.1.1. Về địa lý................................................................................................................. 3 2.1.2. Lịch sử hình thành ................................................................................................. 3 2.1.3. Nhân sự .................................................................................................................. 3 2.1.4. Cơ cấu đàn ............................................................................................................. 3 2.2. Điều kiện nuôi dưỡng và chăm sóc thú .................................................................... 4 2.2.1. Chuồng trại ............................................................................................................ 4 2.2.2. Thức ăn và nước uống ........................................................................................... 4 2.2.3. Vệ sinh thú y .......................................................................................................... 4 2.2.4. Phòng bệnh ............................................................................................................ 4 2.3. KHÁI NIỆM BỆNH DO LEPTOSPIRA .................................................................. 4 2.4. LỊCH SỬ VÀ PHÂN BỐ ĐỊA LÝ CỦA BỆNH DO LEPTOSPIRA ....................... 5 2.4.1. Lịch sử bệnh .......................................................................................................... 5 2.4.2. Phân bố địa lý ........................................................................................................ 6 2.5. CĂN BỆNH HỌC .................................................................................................... 9 2.5.1. Phân loại ................................................................................................................ 9 v 2.5.2. Hình thái học ......................................................................................................... 9 2.5.3. Đặc điểm nuôi cấy ............................................................................................... 10 2.5.4. Sức đề kháng ....................................................................................................... 11 2.5.5. Cấu trúc kháng nguyên ........................................................................................ 11 2.6. TRUYỀN NHIỄM HỌC ........................................................................................ 12 2.6.1. Loài mắc bệnh ..................................................................................................... 12 2.6.2. Chất chứa căn bệnh .............................................................................................. 12 2.6.3. Đường xâm nhập ................................................................................................. 13 2.6.4. Cách sinh bệnh .................................................................................................... 13 2.6.5. Cách lây lan ......................................................................................................... 14 2.6.6. Miễn dịch học ...................................................................................................... 15 2.7. TRIỆU CHỨNG ..................................................................................................... 16 2.7.1. Dạng cấp tính ....................................................................................................... 16 2.7.2. Dạng bán cấp tính và mãn tính ............................................................................ 17 2.8. BỆNH TÍCH ........................................................................................................... 17 2.8.1. Thể cấp tính ......................................................................................................... 17 2.8.2. Thể bán, mãn tính ................................................................................................ 17 2.9. CHẨN ĐOÁN ........................................................................................................ 17 2.9.1. Chẩn đoán lâm sàng ............................................................................................. 17 2.9.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm............................................................................... 17 2.9.3. Phương pháp huyết thanh học ............................................................................. 18 2.10. VỆ SINH PHÒNG BỆNH .................................................................................... 19 2.10.1. Phòng bệnh bằng vệ sinh ................................................................................... 19 2.10.2. Phòng bệnh bằng vaccine .................................................................................. 19 2.10.3. Điều trị ............................................................................................................... 20 2.11. SƠ LƯỢC VÀI CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ................................................. 20 Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT .................................... 22 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ............................................. 22 3.1.1. Thời gian .............................................................................................................. 22 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................................. 22 3.2. ĐỐI TƯỢNG KHẢO SÁT ..................................................................................... 22 vi 3.3. DỤNG CỤ VẬT LIỆU ........................................................................................ 22 3.4. NỘI DUNG............................................................................................................. 22 3.5. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................................................................. 23 3.5.1. Xác định tỷ lệ dương tính với Leptospira ........................................................... 23 3.5.1.1. Phương pháp thu thập mẫu ............................................................................... 23 3.5.1.2. Phương pháp tiến hành ..................................................................................... 23 3.5.1.3. Thử nghiệm định tính ....................................................................................... 24 3.5.1.4. Đánh giá kết quả theo mức độ ghi nhận như sau ............................................. 26 3.5.2. Xác định số serovar trên chó ............................................................................... 26 3.5.3. Xác định số serovar trên từng cá thể ................................................................... 26 3.5.4. Xác định hiệu giá kháng thể ................................................................................ 26 3.6. Các công thức tính .................................................................................................. 28 3.7. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................... 28 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 29 4.1. TỶ LỆ DƯƠNG TÍNH VỚI LEPTOSPIRA ........................................................... 29 4.1.1. Tỷ lệ dương tính theo lứa tuổi ............................................................................. 29 4.1.2. Tỷ lệ dương tính theo giới tính ............................................................................ 30 4.1.3. Tỷ lệ dương tính theo nhóm giống ...................................................................... 32 4.1.4. Tỷ lệ dương tính trên chó đã và chưa chủng ngừa .............................................. 33 4.1.5. Tỷ lệ dương tính trên chó có triệu chứng nghi bệnh do Leptospira .................... 34 4.2. CÁC SEROVAR ĐƯỢC PHÁT HIỆN TRÊN CÁC MẪU ĐIỀU TRA ............... 37 4.3. CÁC SEROVAR DƯƠNG TÍNH TRÊN MỘT CÁ THỂ ..................................... 39 4.4. HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ TRÊN TỪNG SEROVAR NGƯNG KẾT .................. 41 4.5. HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ Ở 7 CHÓ CÓ BIỂU HIỆN TRIỆU CHỨNG NGHI BỆNH DO LEPTOSPIRA .................................................................................................. 44 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 45 5.1. Kết luận................................................................................................................... 45 5.2. Tồn tại ..................................................................................................................... 45 5.3. Đề nghị ................................................................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 47 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 2.1: Dãy chuồng chó sinh sản ................................................................................. 4 Hình 2.2: Hình dạng xoắn trùng Leptospira dưới kính hiển vi điện tử ......................... 10 Hình 2.3: Sơ đồ xét nghiệm Leptospira theo thời gian ................................................. 13 Hình 2.4: Sơ đồ biểu diễn đường lây truyền bệnh ......................................................... 15 Hình 2.5: Sơ đồ diễn biến huyết thanh học ................................................................... 15 Hình 3.1: Kết quả phản ứng MAT âm tính dưới kính hiển vi nền đen ......................... 24 Hình 3.2: Kết quả phản ứng MAT dương tính dưới kính hiển vi nền đen .................... 24 Sơ đồ 3.1: Thực hiện phản ứng vi ngưng kết ................................................................ 25 Sơ đồ 3.2: Định lượng kháng thể ................................................................................... 27 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các serovar gây bệnh chủ yếu ở Đông Nam Á ............................................... 8 Bảng 2.2: Đặc điểm phân biệt hai loài Leptospira .......................................................... 9 Bảng 4.1: Tỷ lệ dương tính với Leptospira ................................................................... 29 Bảng 4.2: Tỷ lệ dương tính theo lứa tuổi ...................................................................... 29 Bảng 4.3: Tỷ lệ dương tính theo giới tính ..................................................................... 30 Bảng 4.4: Tỷ lệ dương tính theo giới tính và tuổi ......................................................... 32 Bảng 4.5: Tỷ lệ dương tính theo việc chủng ngừa ........................................................ 33 Bảng 4.6: Tỷ lệ dương tính trên chó có triệu chứng nghi bệnh do Leptospira ............. 35 Bảng 4.7: Tỷ lệ dương tính theo việc chủng ngừa và triệu chứng nghi bệnh do Leptospira ...................................................................................................... 36 Bảng 4.8: Sự hiện diện của các serovar Leptospira trong các mẫu dương tính ............ 38 Bảng 4.9: Các serovar dương tính trên một cá thể ........................................................ 40 Bảng 4.10: Hiệu giá kháng thể ở các mẫu huyết thanh dương tính .............................. 42 Bảng 4.11: Hiệu quả điều trị ở 7 chó có một số biểu hiện triệu chứng nghi bệnh do Leptospira ..................................................................................................... 44 ix DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ (%) dương tính theo lứa tuổi ........................................................... 30 Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ (%) dương tính theo giới tính .......................................................... 31 Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ (%) dương tính theo giới tính và tuổi .............................................. 32 Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ (%) dương tính theo việc chủng ngừa ............................................. 34 Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ (%) dương tính trên chó có triệu chứng nghi bệnh do Leptospira ..... 35 Biểu đồ 4.6: Tỷ lệ dương tính theo việc chủng ngừa và triệu chứng nghi bệnh do Leptospira .................................................................................................. 36 Biểu đồ 4.7: Tỷ lệ (%) các serovar dương tính trong các mẫu điều tra ......................... 38 Biểu đồ 4.8: Tỷ lệ (%) các serovar dương tính trên một cá thể .................................... 41 Biểu đồ 4.9: Tỷ lệ (%) dương tính ở các hiệu giá kháng thể dương tính ...................... 43 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày càng phát triển, đời sống được nâng cao, nhu cầu của con người ngày càng đa dạng và phong phú cả trong lĩnh vực vật chất lẫn tinh thần. Vì thế, phong trào nuôi chó ở nước ta phát triển khá mạnh. Ngày nay, người ta nuôi chó không chỉ để giữ nhà, phục vụ cho công tác bảo vệ an ninh quốc phòng, mà còn để làm cảnh, làm bạn thân thiết,… Có rất nhiều chủng loại chó được nuôi trên thế giới nói chung, Việt Nam nói riêng như: Chihuahua, Phú Quốc, Bắc Kinh,... Trong đó, giống chó Phú Quốc được nhiều người yêu thích, bởi giống chó này có nhiều ưu điểm nổi bật: rất thích săn thú, giữ nhà tốt, rất gần gũi và thân thiện với chủ, tính hung dữ đối với những loài chó khác. Nhằm phục vụ thị hiếu của nhân dân, nước ta có rất nhiều trung tâm nhân giống các loại chó, đặc biệt là giống chó Phú Quốc. Trong đó, trung tâm nghiên cứu và sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long tại thành phố Cần Thơ, thuộc công ty TNHH Vương Trung Sơn được thành lập từ năm 1999, chuyên nhân giống, tạo giống chó thuần nhằm cung cấp cho những người có nhu cầu. Tuy nhiên, cùng với sự gia tăng về số lượng, tình hình nhiễm bệnh cũng tăng theo, đặc biệt là những bệnh truyền nhiễm, các bệnh truyền lây giữa người và thú như: bệnh dại, bệnh do Leptospira và một số bệnh ký sinh trùng,… Trong đó, bệnh do Leptospira là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, nó không chỉ gây bệnh trên chó mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Theo khảo sát của Nguyễn Quang Thông (2004), trên 136 mẫu huyết thanh chó điều trị tại Bệnh xá Thú y trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ dương tính với Leptospira ở hiệu giá từ 1100 trở lên (25,74%) với sự hiện diện 13 serovar. Gần đây, qua khảo sát của Võ Thị Ngọc Hân (2006) trên 105 mẫu máu chó thu thập từ những chó đến khám và điều trị tại Bệnh xá Thú y – trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh trong 4 tháng cho thấy chó nhiễm Leptospira với tỷ lệ (34,39%) với sự hiện diện của 19 serovar gây bệnh. 2 Bệnh do Leptospira trên chó có biểu hiện như: vàng da, niêm mạc nhợt nhạt hoặc vàng, sốt cao, ói mửa và bỏ ăn nhiều ngày, gây sẩy thai… Nguy hiểm hơn, bệnh Leptospira có thể lây từ chó sang người trong quá trình tiếp xúc. Do đó, việc kiểm tra huyết thanh học định kỳ trên chó là điều hết sức cần thiết, nhằm phòng ngừa cho đàn chó cũng như góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Ngày nay, nhiệm vụ của ngành thú y không chỉ khám và điều trị bệnh cho các loài động vật, mà còn phải tuyên truyền, vận động người nuôi đem thú nuôi nói chung, chó nói riêng đến các phòng xét nghiệm thú y để kiểm tra định kỳ nhằm phát hiện kịp thời các bệnh, đặc biệt bệnh truyền nhiễm có thể lây sang người, tránh trường hợp đáng tiếc xảy ra. Xuất phát từ thực tế nêu trên, đồng thời được sự chấp thuận và phân công của Khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát tỷ lệ huyết thanh dương tính với Leptospira trên chó tại Trung tâm nghiên cứu và sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long” dưới sự hướng dẫn của Th.S Nguyễn Văn Phát và Th.S Bùi Ngọc Thúy Linh. Hy vọng đề tài này sẽ góp phần nhỏ trong công tác nghiên cứu phòng và trị bệnh do Leptospira. 1.2. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Điều tra tình hình nhiễm bệnh do Leptospira trên chó tại trung tâm nghiên cứu và sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long, nhằm mục đích cung cấp cơ sở số liệu cho công tác điều tra dịch tể và chẩn đoán bệnh. 1.2.2. Yêu cầu Xác định tỷ lệ dương tính với Leptospira trên chó Ghi nhận tỷ lệ dương tính theo: tuổi, giới tính Xác định tỷ lệ dương tính trên chó có chủng ngừa, không chủng ngừa Xác định tỷ lệ dương tính trên chó có biểu hiện triệu chứng lâm sàng Xác định số serovar dương tính trên chó Xác định số serovar dương tính trên mỗi cá thể Xác định hiệu giá kháng thể trên các mẫu dương tính Theo dõi hiệu quả điều trị ở chó có triệu chứng nghi bệnh do Leptospira 3 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ TRẠI CHÓ PHÚ QUỐC CỬU LONG 2.1.1. Về địa lý Trung tâm nghiên cứu và sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long nằm trên địa bàn ấp Phú Khởi, xã Thạnh Hòa, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Cần Thơ. Phía Đông giáp với thành phố Cần Thơ Phía Tây giáp với tỉnh Sóc Trăng Phía Nam giáp với quốc lộ 1A Phía Bắc giáp với cánh đồng xã Thạnh Hòa 2.1.2. Lịch sử hình thành Trung tâm nghiên cứu và sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long trực thuộc Công ty TNHH Vương Trung Sơn, được thành lập vào năm 1999 và tồn tại cho đến nay. 2.1.3. Nhân sự Đại học: 1 người Trung cấp: 1 người Công nhân: 2 người 2.1.4. Cơ cấu đàn Cơ cấu đàn được tính đến ngày 01062007 như sau: Tổng đàn: 131 con Chó con: 26 con Chó hậu bị: 39 con Chó đực giống: 10 con Chó sinh sản: 56 con 4 2.2. Điều kiện nuôi dưỡng và chăm sóc thú 2.2.1. Chuồng trại Chuồng được xây thành từng dãy riêng biệt, gồm 4 chuồng (2 chuồng chó sinh sản, 1 chuồng chó con và 1 chuồng chó hậu bị), mỗi chuồng có 2 dãy, mỗi dãy được chia thành những ô chuồng, ngăn cách với nhau bằng lưới B40, nền đất, mỗi ô nuôi 5 con. Hình 2.1: Dãy chuồng chó sinh sản 2.2.2. Thức ăn và nước uống Thức ăn chủ yếu trại cho chó ăn là cá biển nấu chín xay nhuyễn trộn với cơm, đồng thời nước được cho uống bằng núm tự động. 2.2.3. Vệ sinh thú y Vệ sinh công nhân: công nhân của trại được trang bị quần áo, ủng bảo hộ lao động, có phòng thay đồ và hố sát trùng trước khi xuống trại. Xe chở thức ăn và khách mua bán chó trước khi vào trại phải chạy qua hố sát trùng. 2.2.4. Phòng bệnh Chó 2 tháng tuổi được tiêm lần đầu bằng vaccine Tetradog, sau 4 tuần tiêm lần thứ 2 bằng vaccine Hexadog, sau đó cứ mỗi năm tiêm một lần. 2.3. KHÁI NIỆM BỆNH DO LEPTOSPIRA Leptospirosis là bệnh truyền nhiễm chung giữa người, gia súc và nhiều dã thú do Leptospira interrogans gây nên. 5 Trong thể cấp tính chó bệnh thường có biểu hiện viêm dạ dày, ruột xuất huyết thường ói ra máu và phân sậm màu (thể thương hàn) hoặc gây hoàng đản, nước tiểu vàng sậm (thể hoàng đản). Tỷ lệ chết có thể đến 60 – 90 % (Trần Thanh Phong, 1996). 2.4. LỊCH SỬ VÀ PHÂN BỐ ĐỊA LÝ CỦA BỆNH DO LEPTOSPIRA 2.4.1. Lịch sử bệnh Bệnh được phát hiện đầu tiên trên chó vào năm 1850 ở Stuttgart (Đức). Sau đó đến năm 1886, Mathieu và Adoft Weil mới mô tả một bệnh có biểu hiện vàng da, vàng mắt, sốt lặp lại nhiều ngày cùng với bệnh tích ở thận và gọi đó là Weil’s disease. Sau đó một năm (1887) Goldsmidt đặt lại tên cho bệnh là “ Maladie de Weil”. Đến năm 1912 R. Ianda và Y. Ido (Nhật), phân lập được vi khuẩn từ gan của chuột lang có tiêm máu của bệnh nhân bị sốt vàng da và đặt tên cho vi khuẩn là Spirochaeta icterohaemorrhagiae. Năm 1917 do có dạng xoắn khuẩn, mảnh, Noguchi đề nghị đặt tên là Leptospira (Trần Thị Bích Liên, 1999). Từ năm 1999 đến nay người ta đã phân lập được nhiều serovar như: Leptospira grippotyphosa (Lepto gây bệnh cúm) do S.I.Tarassov L.hebdomadis (1919) do Japon L.pyrogenes (1923) do H. Vervett L.bataviae (1926) (bệnh sốt ruộng lúa) B. Walch L.autumnalis (1926) (bệnh sốt mùa thu) do M. Korhim L.canicola (1933) (bệnh Stuttgart) do W. Schuffnes L.pomona (1937) L.autralis (1937) do G. Lumley. Đến năm 1967 tổ chức F.A.O khuyến cáo là bệnh lan tràn khắp nơi trên thế giới. Hiện nay, phức hệ interrogans gồm khoảng 240 type huyết thanh gây bệnh được xếp trong 23 nhóm huyết thanh. 6 2.4.2. Phân bố địa lý Trên thế giới: Theo tác giả C.O.R. Everard (1992) thì chó ở Châu Âu thường nhiễm các serovar: L.icterohaemorrhagiae, L.canicola. Nhưng qua khảo sát của M.Seigal (1995) thì cho rằng L.gryppotyphosa và L.pomona là nguyên nhân chính của những biểu hiện trên chó. Ở Mỹ, theo Barlough và Pedersen (1995) cho rằng chó ở Mỹ nhiễm chủ yếu các serovar: canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grypotyphosa và bataviae. Nhưng theo nghiên cứu của McDonough (1997) thì lại cho rằng chó có thể nhiễm bởi các serovar như: canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grypotyphosa, bratislava, copenhagenii, australis, autumnalis, ballum, bataviae. Ông cũng cho biết thêm về sự lưu hành của bệnh do Leptospira trên đàn chó ở thành phố là 37,8% cao hơn so với vùng ngoại ô là 18,7% điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Davol (2001) (trích dẫn bởi Nguyễn Quang Thông, 2004). Ở Việt Nam: + Miền Bắc: Theo kết quả nghiên cứu của Lê Thanh Hải – Nguyễn Thị Diện – Phạm Quân (1986) tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó khá cao có thể lên đến 80% ở những cơ sở chó nuôi nghiệp vụ và 27,5% trên chó nuôi ở hộ dân (Hà Nội) với các serovar phổ biến là: L.bataviae, L.canicola, L.icterohaemorrhagiae, L.hebdomadis, L.pomona (trích dẫn bởi Thái Thị Mỹ Hạnh, 1997). Năm 2000, Nguyễn Thị Ngân và Nguyễn Đăng Khải khi kiểm tra 48 mẫu máu nghi ngờ thì tỷ lệ dương tính tới 83,3%, gồm 9 serovar trong đó cao nhất là serovar canicola (62,50%) và icterohaermorrhagiae (50%). Gần đây, theo khảo sát của Nguyễn Thị Ngân, Phương Song Liên và Nguyễn Ngọc Tiến thuộc Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương (2000 – 2003) trên 200 mẫu máu của những bệnh nhân nghi nhiễm xoắn khuẩn do một số bệnh viện (Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Nhi Thụy Điển, Viện Vệ Sinh Phòng Dịch Quân Đội) gởi sang thì có 135 mẫu dương tính, chiếm 66,83%, chủ yếu do các serovar L.pomona (22,22%), L.icterohaemorrhagie (25,92%) và L.autumnalis (20,00%) (trích dẫn bởi Lê Văn Thanh, 2005). 7 + Miền Nam: Qua khảo sát của Thái Thị Mỹ Hạnh (1997) trên 400 mẫu máu chó thu thập tại trạm Phòng Chống Dịch và Phòng Trừ Bệnh Dại của Chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh trong bốn tháng mùa khô thì tỷ lệ dương tính với Leptospira ở hiệu giá từ 1100 trở lên là 13,5%. Với sự hiện diện của tất cả là 10 serovar gồm L.bataviae, L.javanica, L.canicola, L.icterohaemorrhagiae, L.hebdomadis, L.sejroe, L.ballum, L.louisiana, L.tarassovi và L.pomona. Tại tỉnh Đaklak, theo điều tra của Hoàng Mạnh Lâm, Đậu Ngọc Hào và Đào Xuân Vinh (2002) trên 411 mẫu máu của dân cư trong vùng thì có đến 74 mẫu cho kết quả dương tính với Leptospira chiếm (19,8%) với 14 serovar, trong đó có 4 serovar phát hiện tại Đaklak là: L.panama, L.sejoe, L.seramanga, L.tarassovi. Trong khi đó, theo khảo sát của Võ Thị Ngọc Hân (2006) trên 105 mẫu huyết thanh được khám và điều trị tại Bệnh xá Thú y trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thì tỷ lệ dương tính với Leptospira hiệu giá từ 1100 trở lên là 34,29%. Với sự hiện diện của 19 serovar là L.autralis, L.autumnalis, L.bataviae, L.canicola Hond Utrech IV, L.castellonis, L.pyrogenes, L.icterohaemorrhagiae Verdum, L.tonkini LT96 68, L.cynopterie, L.grippotyphosa, L.hebdomalis, L.panama, L.patoc, L.pomona, L.tarassovi, L.vughia, L.canicola Chiffon, L.saxkoebing, L.hursbridge. 8 Bảng 2.1: Các serovar gây bệnh chủ yếu ở Đông Nam Á STT Serogroup Serovar Chủng 1 AUSTRALIS australis Ballico 2 AUTUMNALIS autumnalis Akiyamia A 3 BATAVIAE bataviae Van Tienen 4 CANICOLA canicola Hond Utrech IV 5 BALLUM castellonis Castellon 3 6 PYROGENES pyrogenes Salinem 7 ICTEROHAEMORRHAGIAE tonkini LT 96 68 8 ICTEROHAEMORRHAGIAE icterohaemorrhagiae Verdun 9 CYNOPTERIE cynopterie 3522 C 10 GRYPPOTYPHOSA gryppotyphosa Moskva V 11 SEJROE hardjo Hardjo Bovis 12 HEBDOMADIS hebdomadis Hebdomadis 13 JAVANICA javanica Veldrat Bataviae 46 14 PANAMA panama CZ 214K 15 SEMARANGA patoc Patoc I 16 POMONA pomona Pomona 17 TARASSOVI tarassovi Mitis Johnson 18 TARASSOVI vughia LT 09 68 19 SEJROE hardjo Hadjoprajitno 20 SEJROE saxkoebing Mus 24 21 CANICOLA canicola Chiffon 22 LOUISIANA louisiana LSU 1945 23 HURSTBRIDGE _ _ (Nguồn: viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, 2000) 9 2.5. CĂN BỆNH HỌC 2.5.1. Phân loại Leptospira thuộc: Lớp: Schizomycetes Bộ: Spirochaetales Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira Loài: Leptospira interrogans Leptospira biflexa Bảng 2.2: Đặc điểm phân biệt hai loài Leptospira Đặc điểm phân biệt L.interrogans L.biflexa Khả năng gây bệnh Mọc ở 130C Mọc khi có 8 – azaguanine 225 μgml Biến thành dạng hình cầu khi có NaCl 1M Lipase Guanine – Cytosine (%) + _ _ + thay đổi 30 – 40 _ + + _ + 38 – 41 (Nguồn: Carter 1994) Cho đến nay, được biết giống Leptospira gồm có 12 loài: L.alexanderi, L.biflexa, L.borgpetersenii, L.fainei, L.inadai, L.interrogans, L.kirschneri, L.noguchii, L.santarosai, L.weilii, L.meyeri và L.wolbachii. Hiện nay, chỉ có L.interrogans và L.fainei được ghi nhận là có gây bệnh cho người (Kanti Laras, Cao.T.B.Van và ctv, 2002 – trích dẫn bởi Lê Văn Thanh, 2005). 2.5.2. Hình thái học Leptospira có dạng xoắn nên gọi là xoắn trùng, có chiều dài từ 6 – 25 μm, chiều ngang là 0,1 – 0,3 μm, tuỳ thuộc vào serovar, môi trường và thời gian nuôi cấy, có nhiều vòng xoắn (18 – 30 vòng) mảnh và rất sát nhau, cong ở một hoặc hai đầu tạo thành những dạng khác nhau như chữ S, J, C. Leptospira di động mạnh nhờ vào sự co rút, quay theo ba hướng dọc, ngang và xoay tròn trong khi toàn bộ tế bào vẫn giữ nguyên, do sự vận động các sợi trục nguyên sinh chất và làm cho toàn bộ tế bào xoắn trùng chuyển động theo (Leon Lemior, 1987 – trích dẫn bởi Trần Thị Bích Liên, 1999) 10 Hình 2.2: Hình dạng xoắn trùng Leptospira dưới kính hiển vi điện tử (Nguồn: http:pathmicro.med.se.eduleptospira.jpg) Hiện tượng di động toàn thân cùng với kích thước, hình dạng và sự mềm dẻo cho phép các xoắn trùng chui qua được màng lọc có đường kính 0,1 – 0,14 μm. Chính vì vậy, Leptospira có khả năng làm tạp nhiễm các chất cần được thanh trùng bằng phương pháp lọc và thâm nhập vào hầu hết các mô. Do kích thước rất hẹp về bề ngang, các xoắn trùng Leptospira chỉ được quan sát bằng kính hiển vi nền đen hoặc kính hiển vi phản pha. Xoắn trùng không nhuộm được dễ dàng bằng các phẩm nhuộm aniline thông thường, mà phải dùng các phương pháp nhuộm đặc biệt như phương pháp Romanopski, phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana – Tribondeau (Carter, 1994 – trích dẫn bởi Võ Thị Ngọc Hân, 2006). 2.5.3. Đặc điểm nuôi cấy Leptospira là vi trùng hiếu khí bắt buộc, chúng có các men catalase, oxydase. Trong quá trình phát triển, cần vitamin B1, B12 và các yếu tố khác như Fe++, Ca++, Mg++,… Leptospira phát triển tốt ở môi trường lỏng hoặc bán lỏng có chứa nhiều huyết thanh thỏ, các môi trường E.M.J.H (Ellinghausen – McCullough – Johnson – Herris), Stuart. Sau 3 – 6 tuần, đôi khi đến gần 10 tuần mới quan sát được sự phát triển của Leptospira trên môi trường. Trên môi trường thạch (1 – 2% agar), xuất hiện những khuẩn lạc nhỏ, không màu trên mặt hoặc sát bề mặt môi trường. Nhiệt độ thích hợp 10 – 300C, pH: 7,2 – 7,6 (Trần Thị Bích Liên, 1999). 11 2.5.4. Sức đề kháng Các chất sát trùng thông thường, các tác nhân vật lý như ánh sáng mặt trời, sức nóng, sự khô hạn và pH ở mức dưới 6 và trên 8 có thể tiêu diệt các xoắn trùng Leptospira dễ dàng. Sự sống sót của các Leptospira gây bệnh trong thiên nhiên bị chi phối bởi các yếu tố như: pH nước tiểu của vật chủ, pH của đất hoặc nước nơi nó thải vào, và nhiệt độ xung quanh. Các Leptospira trong phần lớn các “chỗ đi tiểu” trong đất vẫn giữ được khả năng gây nhiễm trùng trong vòng 6 – 48 giờ. Nước tiểu toan chỉ cho phép hạn chế sự sống sót của vi khuẩn, tuy nhiên nếu nước tiểu trung tính hoặc kiềm nhẹ và được thải vào một môi trường ẩm ướt tương tự, ở đó có độ mặn thấp, không bị ô nhiễm nặng bởi các vi sinh vật, các chất tẩy rửa và có nhiệt độ trên 220C, thì các Leptospira có thể sống sót trong vài tuần (Sanfort và ctv, 1999). Như vậy, với nước tiểu trâu bò Leptospira có thể sống lâu hơn nước tiểu chó (Trần Thanh Phong, 1996). 2.5.5. Cấu trúc kháng nguyên Leptospira có 2 loại kháng nguyên: Kháng nguyên P (kháng nguyên bề mặt): bản chất là protein, không chịu nhiệt, giữ vai trò thiết yếu trong phản ứng vi ngưng kết do có những vị trí quyết định kháng nguyên (epitope) mà có thể xác định được serovar và serogroup. Kháng nguyên S (kháng nguyên thân): bản chất là polysaccharide, chịu nhiệt, Leptospira còn có kháng nguyên O ở thành tế bào. Một số serovar có thể tạo ít kháng thể (tạo miễn dịch) do tính kháng nguyên yếu (ví dụ: hardjo có đáp ứng miễn dịch thấp so với saxkoebing mặc dù trong cùng một serogroup). Leptospira có rất nhiều serogroup khác nhau do sự khác biệt về cấu trúc kháng nguyên, mỗi serogroup lại có rất nhiều biến thể huyết thanh học gọi là serovar. Cho đến nay có khoảng 23 serogroup và hơn 240 serovar khác nhau đã được tìm thấy. Mỗi serovar có khuynh hướng kết hợp với vật chủ chuyên biệt, nhưng một số serovar có thể hiện diện ở nhiều vật chủ và một vật chủ có thể chứa nhiều serovar. Những vùng địa lý khác nhau thì sự tồn tại của các serovar cũng khác nhau (Nguyễn Quang Thông, 2004). 12 2.6. TRUYỀN NHIỄM HỌC 2.6.1. Loài mắc bệnh Bệnh xảy ra trên phạm vi rộng rãi, người, gia súc, thú hoang dã đều nhiễm, trong đó loài gậm nhấm (đặc biệt chuột xám) đóng vai trò quan trọng. Ở chó mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng bệnh thường xảy ra trên chó đực hơn (Trần Thanh Phong, 1996). Tỷ lệ mắc bệnh tùy thuộc vào type gây bệnh, động vật cảm thụ, chế độ nuôi dưỡng, vệ sinh chuồng trại. Một trong những đặc điểm của cảm nhiễm Leptospira là sự hiện diện của nhiều thú mang trùng và bài trùng với bề ngoài có vẻ khoẻ mạnh. Sự phát hiện những thú này bằng phản ứng vi ngưng kết rất bấp bênh, nhất là đối với thú hoang. Việc mắc bệnh ở người thường do tính cách nghề nghiệp phải tiếp xúc thường xuyên với nguồn bệnh như công nhân chăn nuôi, chế biến sản phẩm gia súc gia cầm, công nhân lò mổ, công nhân cầu đường, nhân viên thú y,… Người không đóng vai trò quan trọng trong việc làm truyền lây căn bệnh này. Tóm lại, đây là bệnh truyền lây có tính chất nguồn dịch thiên nhiên. 2.6.2. Chất chứa căn bệnh (Trần Thanh Phong, 1996) Máu thường chỉ chứa Leptospira trong khoảng hơn hai tuần đầu sau khi nhiễm. Dịch não tuỷ có thể chứa Leptospira trong khoảng hai tuần. Nước tiểu chó có thể chứa và bài Leptospira trong khoảng 600 – 700 ngày (đối với loài gậm nhấm thì có thể là suốt đời). Gan, thận, lách,… là bệnh phẩm ưa chuộng để nuôi cấy phân lập. Cần lưu ý rằng: thời gian mang trùng, mức độ bài trùng tùy thuộc vào loài mang trùng và chủng Leptospira. Trên chó, việc chủng ngừa chỉ hiệu quả trong việc làm giảm nguy cơ và mức độ trầm trọng của bệnh nhưng không ngăn được sự nhiễm trùng. Ở những chó đã được điều trị và kiểm soát được bệnh thì chúng vẫn tiếp tục bài xuất mầm bệnh qua nước tiểu qua đến hơn 3 tháng sau đó, thậm chí có thể hơn 700 ngày (Davol, 2001 – trích dẫn bởi Võ Thị Ngọc Hân, 2006). 13 HOAØNG ÑAÛN SOÁT 5 10 15 20 NGAØY NHIEÄT ÑOÄ 370 C Hình 2.3: Sơ đồ xét nghiệm Leptospira theo thời gian (Trần Thanh Phong, 1996) 2.6.3. Đường xâm nhập Leptospira xâm nhập chủ yếu qua niêm mạc hay qua vết thương ở da nhưng cũng có thể là qua đường tiêu hoá (như do ăn phải thức ăn có nhiễm nước tiểu của chuột). Hoặc qua giao phối hay truyền qua nhau thai. 2.6.4. Cách sinh bệnh (Trần Thanh Phong, 1996) Sau khi xâm nhiễm, Leptospira vào trong máu nhân lên mạnh mẽ gây bại huyết, gây sốt đồng thời kích thích sinh kháng thể, sau đó chúng đến định vị ở những cơ quan ưa thích, nhất là gan, thận, dịch não tủy,… Chính sự định vị ở các cơ quan này giải thích cho những biểu hiện bệnh học khác nhau. Leptospira trong giai đoạn bại huyết, có thể đến những cơ quan khác như cơ quan sinh dục (gây xáo trộn sinh sản), hệ thần kinh trung ương (gây viêm màng não)… Ở gan, nó có thể gây viêm gan, phá hủy chức năng gan gây thiểu năng gan (lượng đường huyết giảm, bilirubin huyết tăng, hoàng đản,…). Ở thận, cũng có biểu hiện tương tự viêm thận, thiểu năng thận (urê huyết, albumin niệu), có thể dẫn đến vô niệu do các loại trụ niệu. HUYEÁT THANH HOÏC CAÁY MAÙU DÒCH TUÛY NAÕO NÖÔÙC TIEÅU 400C 14 Ngoài ra, trong quá trình theo máu, Leptospira còn sinh độc tố (hemolysin) phá hủy hồng cầu, phá hủy nội mạc mao mạch gây vỡ hoặc tắc nghẽn mao mạch, hậu quả là gây hoại tử, xuất huyết ở niêm mạc… Sau khi khỏi bệnh, thú có miễn dịch nhưng chỉ với loài Leptospira trước đó bị nhiễm. 2.6.5. Cách lây lan Nhiễm trùng trên thú chủ yếu qua đường tiêu hóa do thú ăn, uống phải thức ăn, thức uống có chứa mầm bệnh. Cũng có thể nhiễm qua nhau thai, vết cắn, qua da bị trầy xước và qua tiếp xúc niêm mạc (niêm mạc mắt, niêm mạc tiêu hóa) hay da nguyên lành khi ngâm nước lâu làm da mềm, các lỗ chân lông nở ra là điều kiện tốt cho Leptospira xâm nhập. Leptospira có thể xâm nhập theo 2 phương thức: + Trực tiếp: qua nhau thai, giao phối, gieo tinh nhân tạo. + Gián tiếp: do tiếp xúc chất thải của các sinh vật nhiễm bệnh. Ngoài ra, còn có các yếu tố khác ảnh hưởng đến sự lây lan của bệnh như thời tiết (mùa mưa tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn mùa nắng), địa hình, phương thức nuôi hay chế độ dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm. Người nhiễm bệnh thường không liên quan đến giới tính mà chủ yếu là liên quan đến nghề nghiệp. Nguồn lây lan chủ yếu cho thú khỏe và người như nước tiểu, nước nhiễm từ gia súc, chuột, động vật hoang dã bị nhiễm là nguyên nhân chính gây nhiễm (trích dẫn bởi Lê Văn Thanh, 2005). 15 Thôøi ñieåm nhieãm Thôøi kyø im laëng cuûa huyeát thanh 1 2 3 4 5 TUẦN Hình 2.4: Sơ đồ biểu diễn đường lây truyền bệnh (Trần Thanh Phong, 1996) 2.6.6. Miễn dịch học Hình 2.5: Sơ đồ diễn biến huyết thanh học (trích dẫn bởi Nguyễn Quang Thông, 2004) CHAÁT CHÖÙA MAÀM BEÄNH (Ñaát, nöôùc, nöôùc tieåu nhieãm Leptospira) Beänh ngheà nghieäp Beänh ngheà nghieäp Leptospira LOAØI GAËM NHAÁM (CHUOÄT) Phaân + nöôùc tieåu Gia suùc CON NGÖÔØI SÖÏ NHIEÃM TRUØNG (Infection) THỜI KỲ PHÁT HIỆN ĐƯỢC KHÁNG THỂ 1400 1800 KHAÙNG THEÅ ÑAÏT MÖÙC CAO NHAÁT THÔØI KYØ MAÕN TÍNH Söï suy giaûm khaùng theå tuøy thuoäc vaøo töøng caù theå. Neáu cheá ñoä dinh döôõng vaø veä sinh, chaêm soùc keùm thì khaùng theå duy trì ôû möùc ñoä thaáp hoaëc = 0 16 Khi mắc bệnh kháng thể IgM sẽ gia tăng trước vào khoảng hơn 1 tuần kể từ lúc nhiễm bệnh, sau đó giảm dần, kháng thể này không đặc hiệu gây ngưng kết với nhiều serovar. Kháng thể IgG sẽ xuất hiện chậm và tăng từ từ đến khi ngang bằng với IgM sau khoảng 2 – 3 tháng, kháng thể này có tính đặc hiệu cao đối với từng serovar gây bệnh. Việc xuất hiện kháng thể IgM, IgG cho phép ta suy diễn về các giai đoạn của bệnh, dựa vào sơ đồ sinh bệnh học, được trình bày qua Hình 2.5. Tuy nhiên, do xoắn khuẩn có khuynh hướng thích khu trú ở hệ thống ống lượn của thận, dịch não tủy, thủy tinh dịch của mắt và trong lòng ống cơ quan sinh dục (như tử cung), cho nên sự tác động của kháng thể rất hạn chế ở những nơi này, điều này giải thích sự tồn tại dai dẳng của mầm bệnh ở các động vật bị nhiễm (Prescott và Zuerner, 2000 – trích dẫn bởi Trần Văn Don, 2006). 2.7. TRIỆU CHỨNG 2.7.1. Dạng cấp tính: tình trạng bại huyết phát triển nhanh sau vài giờ nhiễm, sốt cao 40 – 410C và suy nhược nặng, có 2 thể Thể thương hàn (hay còn gọi là bệnh Stuttgart): bệnh xảy ra trên chó trưởng thành, làm suy yếu nhanh, bỏ ăn hoàn toàn, sốt cao 40 – 41,50C, chó có biểu hiện xuất huyết trầm trọng ở da và niêm mạc, viêm kết mạc mắt. Sau đó thân nhiệt giảm 37 – 380C, thú gầy nhanh, thở khó hay nôn, niêm mạc miệng bị hoại tử, hơi thở có mùi hôi, thời kì cuối có biểu hiện run cơ bắp, đau cơ, đau vùng bụng khi sờ nắn, nôn ra máu, hay chảy máu mũi, phân sậm màu, gầy nhanh, thân nhiệt giảm còn 36 – 36,50C. Cuối cùng là hôn mê hoặc co giật, chó chết khoảng 2 – 4 ngày, tỷ lệ tử vong là 60 – 90%, thường do serovar canicola gây ra. Thể hoàng đản: thường thấy ở chó non thân nhiệt lúc đầu thường từ 39,5 – 400C đến khi xuất hiện vàng da, vàng niêm mạc, thân nhiệt giảm (36 – 36,50C), chó có biểu hiện viêm kết mạc mắt, nước tiểu sậm màu (giàu sắc tố mật và albumin), khó thở, hơi thở hôi, tiêu chảy, đôi khi xuất huyết và có biểu hiện viêm não trước khi hấp hối. Thú chết trong vòng 5 – 8 ngày, thể này thường do các chủng icterohaemorrhagiae và pomona gây ra. 17 2.7.2. Dạng bán cấp tính và mãn tính Thể này tương ứng với hội chứng sinh urê huyết, hậu quả của viêm thận mà một trong những biểu hiện là chứng khát nhiều nước, chứng đái nhiều cùng với ói và tiêu chảy trong một thời gian. Hôn mê do urê huyết chó sẽ chết (Trần Thanh Phong, 1996) Diễn biến và mức độ trầm trọng của bệnh phụ thuộc vào serovar nhiễm, khả năng phòng vệ của chó và hiệu quả của chẩn đoán điều trị. 2.8. BỆNH TÍCH (Trần Thanh Phong, 1996) 2.8.1. Thể cấp tính Thể thương hàn: có thể gặp các bệnh tích như viêm dạ dày – ruột xuất huyết, các chất tiết có thể lẫn máu, xuất huyết da và các niêm mạc, có thể gặp gan sưng, hạch bạch huyết xuất huyết,... Thể hoàng đản: da vùng bụng vàng; gan bàn chân, lỗ tai, niêm mạc vàng, bàng quang chứa nhiều nước tiểu vàng sậm và có thể xuất huyết, mổ khám có mùi đặc trưng,… 2.8.2. Thể bán, mãn tính Viêm thận kẻ hay viêm thận mãn tính, vết lở loét ở miệng và lưỡi có thể gặp trên chó có urê trong máu… 2.9. CHẨN ĐOÁN 2.9.1. Chẩn đoán lâm sàng Triệu chứng và bệnh tích thay đổi tùy thuộc vào chủng nhiễm, khả năng phòng vệ của chó và việc điều trị. Trong trường hợp hoàng đản, cần chẩn đoán phân biệt với trường hợp trúng độc tố nấm mốc (aflatoxin), trúng độc các chất do nhiễm vi trùng gây dung huyết mạnh. Trong trường hợp xáo trộn tiêu hóa, ói mửa và phân có máu cần phân biệt với bệnh Carré, bệnh do Parvovirus,… 2.9.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm Trong trường hợp không dùng kháng sinh để điều trị, việc phân lập Leptospira từ máu, dịch não tủy trong 12 ngày bệnh (thường trước 5 ngày), có thể thực hiện được một cách dễ dàng. Từ tuần thứ ba, Leptospira thải nhiều qua nước tiểu, việc chọn mẫu để phân lập tùy thuộc vào tình trạng bệnh. Người ta có thể lấy máu khi thú đang ở giai 18 đoạn huyết nhiễm trùng (trong 5 ngày đầu), dịch não tủy (tuần đầu) và nước tiểu tuần thứ 15. Leptospira được nuôi cấy trong môi trường lỏng có chứa huyết thanh thỏ hay huyết thanh bò như môi trường Reiter – ramme, Stuart, E.M.J.H. Canh trùng được ủ ở 28 – 300C trong thời gian có thể đến 8 tuần, tốt nhất là ngày thứ sáu sau khi nuôi cấy cần kiểm tra canh trùng dưới kính hiển vi nền đen. Thường kết hợp nuôi cấy với tiêm động vật thí nghiệm như chuột bạch, chuột lang (Trần Thị Bích Liên, 1999). 2.9.3. Phương pháp huyết thanh học Để chẩn đoán huyết thanh học Leptospirosis, người ta dùng một số phản ứng sau: Phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test = M.A.T) Phản ứng kết hợp bổ thể (Fixation Complement) Phản ứng ELISA (Enzyme – Linked – Immuno – Sorbent – Assay) Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immuno Fluorescence test = I.F.T)… Mỗi phản ứng đều có những thuận lợi và khó khăn của nó. Tuy nhiên, hiện nay phản ứng vi ngưng kết vẫn được coi là phản ứng tiêu chuẩn để chẩn đoán Leptospira và được ứng dụng rộng rãi trên thế giới, vì thử nghiệm này phát hiện được kháng thể đặc hiệu cho serovar, do đó phản ảnh được một cách tương đối serovar nào gây bệnh. Phản ứng này do Martin và Pettite đề xuất vào năm 1918. Phản ứng dựa trên nguyên tắc: kháng thể đặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh con vật bị nhiễm Leptospira sẽ ngưng kết với xoắn trùng Leptospira. Sự ngưng kết được đọc trên kính hiển vi nền đen. Bộ kháng nguyên dùng trong phản ứng MAT có thể là kháng nguyên sống hoặc kháng nguyên chết. Lợi điểm của kháng nguyên sống là nhạy cảm hơn, ít có phản ứng chéo nhưng dễ bị ngoại nhiễm và khó bảo quản. Trái lại, dùng kháng nguyên chết dễ bảo quản, không tạp nhiễm nhưng kém nhạy hơn có nhiều phản ứng chéo. Phản ứng MAT rất nhạy cảm với các trường hợp đã mắc bệnh trên 1 tuần và chẩn đoán chắc chắn khi lấy huyết thanh 2 lần cách nhau 2 – 3 tuần. Sự tăng hiệu giá kháng thể cho phép xác định bệnh đang tiến triển hoặc có sự cảm nhiễm mới. Ngược lại, sự giảm hiệu giá là bệnh có khuynh hướng giảm, hết (Trần Thị Bích Liên, 1999). 19 2.10. VỆ SINH PHÒNG BỆNH 2.10.1. Phòng bệnh bằng vệ sinh Sự không hoàn hảo của việc phòng bệnh bằng vaccine, đặt gánh nặng cho việc phòng bệnh bằng những biện pháp vệ sinh. Giữa nhiều yếu tố vệ sinh, hai yếu tố chiếm vị trí quan trọng là: + Những thú chứa và mang Leptospira + Nước nhiễm Leptospira Trong thực tế, giải quyết hai vấn đề này gặp không ít khó khăn do số thú là ổ chứa và mang vi trùng liên quan đến quá nhiều loài, tính chất nguồn dịch thiên nhiên của bệnh làm cho không thể kiểm soát nhất là môi trường nước ngày càng bị ô nhiễm… (Trần Thanh Phong, 1996). Cần kiểm soát dịch bệnh ở gia súc qua việc định kỳ kiểm tra huyết thanh học là cần thiết, gia tăng các biện pháp diệt chuột ở mọi nơi, tránh tắm, sử dụng nguồn nước tại các nơi nghi ngờ đã bị nhiễm Leptospira. Cần bảo vệ đối tượng làm việc trong môi trường dễ bị nhiễm Leptospira bằng cách mang găng tay, ủng, quần áo bảo hộ,… và định kỳ kiểm tra huyết thanh học trên các đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao như công nhân lò mổ, công nhân chăn nuôi… là hữu ích. Theo nghiên cứu ở Panama, khi vào vùng dịch có thể uống ngừa bằng doxycycline liều 200 mg, 1 lần trong tuần thì có thể ngừa được trong 3 tuần (Nguyễn Quang Thông, 2004). 2.10.2. Phòng bệnh bằng vaccine Việc chủng ngừa cho người và gia súc kém mang lại hiệu quả do không biết rõ type huyết thanh đang lưu hành trong khu vực. Vấn đề nên hay không nên chủng ngừa cho chó đang còn nhiều tranh cãi vì một số tác giả cho rằng việc tạo miễn dịch cho chó không ngăn ngừa được tình trạng mang trùng hay tình trạng thải trùng. Thậm chí, việc này còn góp phần làm che lấp biểu hiện của tình trạng trên đàn chó (trích dẫn bởi Nguyễn Quang Thông, 2004). Thêm vào đó các vaccine hiện có trên thị trường đều là sản phẩm phối hợp giữa các vaccine vi khuẩn và vaccine virus để cùng lúc phòng nhiều bệnh (như Eurican, Tetradog, Hexadog, Canigen…), đây là sự bất hợp lý do có sự không đồng bộ về độ dài bảo hộ của vaccine có nguồn gốc vi khuẩn và vaccine có nguồn gốc từ virus. Theo được biết, các vaccine hiện có trên thị trường chỉ chứa 2 20 serovar L.icterohaemorrhagiae và L.canicola không hữu hiệu trong việc phòng bệnh trên chó. 2.10.3. Điều trị Chó bị nhiễm Leptospira có thể dùng kháng huyết thanh phù hợp với serovar mà chó bị nhiễm. Liều dùng 10 – 30 ml tùy lứa tuổi và trọng lượng (Trần Thanh Phong, 2006). Nguyên tắc khi dùng kháng sinh: kháng sinh phải phân bố được đến gan thận nhưng không gây độc cho các cơ quan này. Theo Belinda Rowlanl (2002), bệnh phải được chẩn đoán và điều trị sớm khi đang ở giai đoạn đầu với các kháng sinh hữu hiệu như penicilin, doxycyline hoặc erythromycin. Còn Davol (2001) thì cho rằng song song với liệu pháp kháng sinh quá trình điều trị cần phải bù đắp cho sự hồi phục các thành phần của dịch thể, sự tạo nước tiểu, quá trình lọc của thận và tuần hoàn máu là cần thiết để hồi phục chức năng gan – thận đã bị hư hại. Thậm chí cần truyền máu nếu xuất huyết quá nhiều. Tuyệt đối không dùng kháng sinh nhóm aminoglycosides trên những chó có biểu hiện ở thận (trích dẫn bởi Võ Thị Ngọc Hân, 2006) Thành công của việc điều trị thường là kết hợp liệu pháp kháng sinh với việc chữa trị triệu chứng mất nước và acid hóa (dùng dung dịch lactate riêng lẻ hoặc với dung dịch muối đường dextrose và vitamin nhóm B liều cao). 2.11. SƠ LƯỢC VÀI CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Ở Mỹ, theo Barlough và Pedersen (1995) cho rằng chó chủ yếu nhiễm các serovar: canicola, icterohaemorrhagiae, ponoma, grippotyphosa và batavia. Theo Mc.Donough (1997), thì sự lưu hành Leptospira trên đàn chó thành phố là 37,8% cao hơn so với vùng ngoại ô là 18,7%. Ông cũng cho biết, chó có thể nhiễm serovar như: canicola, icterohaemorrhagiae, ponoma, grippotyphosa, bratislava, copenhagenii, australis, autumnalis, ballum và bataviae (trích dẫn bởi Võ Thị Ngọc Hân, 2006). Qua khảo sát của Thái Thị Mỹ Hạnh (1997), với trên 400 mẫu huyết thanh chó thu thập tại trạm phòng chống dịch và phòng trừ bệnh dại của Chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh trong 4 tháng mùa khô thì tỷ lệ dương tính với Leptospira ở hiệu giá 1100 là 13,5% với sự hiện diện của 10 serovar gồm: bataviae, javanica, canicola, icterohaemorrhagiae, hebdomadis, sejroe, ballum, louisiana, tarassovi và pomona. 21 Trong 6 tháng cuối năm 2004, Lưu Khánh Duy đã khảo sát trên 100 mẫu huyết thanh chó được khám và điều trị tại Bệnh xá Thú y trường Đại học Nông Lâm TP. HCM cho thấy tỷ lệ dương tính với Leptospira là 32% với sự hiện diện của 9 serovar là bataviae, canicola Hond Utrech IV, pyrogenes, tokini, icterohaemorrhagiae, javanica, tarasovi, canicola Chiffon, hursbridge. Trong khi đó, theo khảo sát của Lê Văn Thanh (2005), tỷ lệ huyết thanh dương tính với Leptospira trên 103 mẫu khảo sát là 34,95% với sự hiện diên của 13 serovar khác nhau: autralis, autumnalis, bataviae, canicola Hond Utrech IV, pyrogenes, icterohaemorrhagiae Verdun, tonkini LT 96 68, gyppotyphosa, hursbridge, javanica, semaranga, canicola Chiffon, louisiana. Gần đây, theo Võ Thị Ngọc Hân (2006) qua khảo sát 105 chó được khám và điều trị tại Bệnh xá Thú y trường Đại học Nông Lâm TP. HCM cho thấy tỷ lệ dương tính với Leptospira là 34,29% với sự hiện diện của 19 serovar khác nhau, chiếm tỷ lệ cao nhất là các serovar canicola Chiffon (19,70%), bataviae (16,67%). 22 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 3.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện: từ 10042007 đến 10082007 3.1.2. Địa điểm Địa điểm xét nghiệm: Bệnh viện Thú y trường Đại học Nông Lâm Địa điểm lấy mẫu: Trung tâm nghiên cứu và sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long 3.2. ĐỐI TƯỢNG KHẢO SÁT Trên 105 con chó giống Phú Quốc thuộc trại chó giống Phú Quốc – Cửu Long 3.3. DỤNG CỤ VẬT LIỆU Kính hiển vi tụ quang nền đen Ống tiêm vô trùng, găng tay, vỉ nhựa đáy bằng Ống chiết huyết thanh, micropipette, đầu type Bộ kháng nguyên chuẩn với 23 serovar do viện Pasteur TP. HCM cung cấp Một số dụng cụ khác như: máy ly tâm, ống nghiệm, lame kính, đèn cồn, tủ lạnh, tủ ấm, tủ sấy,… 3.4. NỘI DUNG Tỷ lệ dương tính chung Ghi nhận tỷ lệ dương tính theo: tuổi, giới tính Tỷ lệ dương tính trên chó có chủng ngừa, không chủng ngừa Tỷ lệ dương tính trên chó có biểu hiện triệu chứng lâm sàng Xác định các serovar dương tính trên chó Xác định số serovar dương tính trên mỗi cá thể Xác định hiệu giá kháng thể trên các mẫu dương tính Theo dõi hiệu quả điều trị ở chó có triệu chứng nghi bệnh do Leptospira 23 3.5. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.5.1. Xác định tỷ lệ dương tính với Leptospira 3.5.1.1. Phương pháp thu thập mẫu Lấy máu ở tĩnh mạch chân trước hoặc chân sau Sau khi lấy xong, đặt nghiêng để máu đông tự nhiên, sau đó trích huyết thanh vào eppendoff có đánh số thứ tự mẫu trước đó. Đem ly tâm (3000 vòngphút) trong 5 phút, trích huyết thanh lần nữa, sau đó đem bảo quản huyết thanh ở ngăn đá tủ lạnh (0oC) nếu chưa tiến hành xét nghiệm ngay. 3.5.1.2. Phương pháp tiến hành Để xác định tỷ lệ dương tính Leptospira trên chó, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng MAT theo phương pháp được hướng dẫn của bộ Lep MAT – kit (viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, 2000). + Nguyên tắc sử dụng phản ứng MAT (Microscopic Agglutination Test): Phản ứng MAT là phản ứng giữa kháng nguyên Leptospira với kháng thể kháng Leptospira trong huyết thanh chó với mức độ ngưng kết được đánh giá theo quy định của tổ chức Dịch Tể Thế Giới (OIE, 2000). + Bảo quản và kiểm tra kháng nguyên: Bộ kháng nguyên sống gồm 23 serovar đại diện cho 23 serogroup được sử dụng trong khoảng 1 tuần và bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh (4 – 10oC). Trước khi kiểm tra kháng nguyên phải tiến hành pha loãng kháng nguyên trước với tỷ lệ 12. Trước khi thực hiện phản ứng MAT, phải kiểm tra kháng nguyên: nhỏ một giọt từ mỗi type kháng nguyên lên phiến kính và kiểm tra dưới kính hiển vi nền đen. Kháng nguyên đạt yêu cầu khi xoắn khuẩn Leptospira phải xuất hiện đầy trên vi trường, hoạt động mạnh và không tự ngưng kết. 24 Hình 3.1: Kết quả phản ứng MAT âm tính dưới kính hiển vi nền đen (x100) Hình 3.2: Kết quả phản ứng MAT dương tính dưới kính hiển vi nền đen (x100) 3.5.1.3. Thử nghiệm định tính Pha loãng kháng nguyên tỷ lệ 13: thêm 2 ml dung dịch đệm (PBS) vào mỗi type kháng nguyên sống (1 ml) lắc đều. Pha loãng huyết thanh (125): cho 100 μl huyết thanh và 2,4 ml dung dịch đệm vào mỗi ống nghiệm, lắc đều. Trong phiến lỗ đáy bằng: + Nhỏ lần lượt 50 μl kháng nguyên đã pha loãng vào giếng 1 đến 23 + Sau đó, mỗi giếng thêm 50 μl huyết thanh đã pha loãng + Ủ phiến lỗ ở 28oC trong 2 giờ Nhỏ lên lam kính 10 μl (khoảng 1 giọt) từ mỗi giếng và đọc kết quả ngưng kết trên kính hiển vi nền đen. 25 2 ml dung dịch đệm PBS Pha loãng KN 1 ml KN chuẩn Pha loãng HT 1 2 3 4 23 (2,4) ml dd đệm 0,1 ml HT 1 2 3 4 23 50 μl 50 μl 1 2 3 4 23 Mẫu 1 Mẫu 2 28oC 2 giờ Vỉ trộn KN + KT 10μl Xem lame Kính dưới KHV nền đen Sơ đồ 3.1: Thực hiện phản ứng vi ngưng kết (MAT) Ghi chú: HT: huyết thanh KN: kháng nguyên KT: kháng thể Dd Đệm 26 3.5.1.4. Đánh giá kết quả theo mức độ ghi nhận như sau (theo OIE, 2000) Mức độ (+ + + +): khi tất cả 100% Leptospira ngưng kết thành cụm mạng nhện hoặc cụm tròn, không còn xoắn khuẩn tự do. Mức độ (+ + +): có trên 75% số xoắn khuẩn bị ngưng kết so với đối chứng âm. Mức độ (+ +): 50% đến 75% số xoắn khuẩn bị ngưng kết so với đối chứng âm. Mức độ (+): từ 25% đến 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết so với đối chứng âm. Từ những mẫu dương tính, chúng tôi đánh giá tỷ lệ dương tính với Leptospira trên tổng số chó tại trại. Từ đó xác định tỷ lệ dương tính theo tuổi và giới tính. Âm tính: Xoắn khuẩn tự do trong vi trường trên 50% 3.5.2. Xác định số serovar trên chó Dựa trên phản ứng định tính, chúng tôi xác định số serovar hiện diện trên tổng số mẫu khảo sát. 3.5.3. Xác định số serovar trên từng cá thể Một cá thể có thể nhiễm nhiều serovar, sau khi thử nghiệm định tính (MAT), ghi nhận những serovar dương tính trên từng cá thể. 3.5.4. Xác định hiệu giá kháng thể Sau khi thực hiện phản ứng MAT định tính, những mẫu huyết thanh có kết quả dương tính và ở mức độ 2+ trở lên được tiến hành phản ứng định lượng với kháng nguyên tương ứng. Cách tiến hành: + Pha loãng huyết thanh cần định lượng với dung dịch đệm PBS từ độ pha loãng 150 đến 13200…mỗi
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TỶ LỆ HUYẾT THANH DƯƠNG TÍNH VỚI LEPTOSPIRA TRÊN CHÓ TẠI TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHÓ GIỐNG PHÚ QUỐC – CỬU LONG Họ tên sinh viên : NGUYỄN THỊ KIM NGỌC Ngành : Thú Y Niên khóa : 2002-2007 Tháng 11/2007 KHẢO SÁT TỶ LỆ HUYẾT THANH DƯƠNG TÍNH VỚI LEPTOSPIRA TRÊN CHĨ TẠI TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHÓ GIỐNG PHÚ QUỐC – CỬU LONG Tác giả NGUYỄN THỊ KIM NGỌC Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Bác sỹ ngành Thú y Giáo viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN VĂN PHÁT ThS BÙI NGỌC THÚY LINH Tháng 11 năm 2007 i LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm khoa Chăn ni Thú y, quý thầy cô truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báo cho em Lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Văn Phát Th.S Bùi Ngọc Thúy Linh Đã tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực tập tốt nghiệp bảo vệ luận văn Xin cảm ơn BSTY Lê Thị Hà BSTY Nguyễn Thị Minh Hòa Tập thể nhân viên Bệnh viện Thú y trường Đại học Nơng Lâm tồn anh chị em trại chó giống Phú Quốc - Cửu Long Đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Cảm ơn bạn lớp Thú y 19 thực tập, động viên, chia giúp đỡ tơi lúc khó khăn suốt qng đời sinh viên Nguyễn Thị Kim Ngọc ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Khảo sát tỷ lệ huyết dương tính với Leptospira chó Trung tâm nghiên cứu sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long” thực từ tháng đến tháng năm 2007 Bệnh viện Thú y trường Đại học Nông Lâm trung tâm nghiên cứu sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long Bằng phản ứng MAT (Microscopic Agglutination Test), với kháng nguyên sống gồm 23 serovar thuộc 23 serogroup viện Pasteur TP Hồ Chí Minh cung cấp, chúng tơi tiến hành thu thập 105 mẫu huyết giống chó Phú Quốc trại chó giống Phú Quốc – Cửu Long Cho thấy tỷ lệ dương tính với Leptospira hiệu giá từ 1/100 trở lên 36,19% Với diện 13 serovar khác cho phản ứng dương tính Trong đó, tỷ lệ huyết dương tính cao với serovar canicola Chiffon (46%) hardjo Hardjo Bovis (26%) Hiệu giá kháng thể mức 1/100 chiếm 50%, 1/200 chiếm 30%, 1/400 chiếm 12%, 1/800 1/1600 chiếm 4% Mặt khác, qua xét nghiệm cho thấy 81,58% chó nhiễm serovar, serovar 10,53%, serovar 2,63%, serovar 5,26% khơng có trường hợp dương tính nhiều serovar cá thể iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm ơn .ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách hình sơ đồ viii Danh sách bảng ix Danh sách biểu đồ x Chương MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU .2 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ TRẠI CHÓ PHÚ QUỐC - CỬU LONG 2.1.1 Về địa lý .3 2.1.2 Lịch sử hình thành 2.1.3 Nhân 2.1.4 Cơ cấu đàn .3 2.2 Điều kiện ni dưỡng chăm sóc thú 2.2.1 Chuồng trại 2.2.2 Thức ăn nước uống 2.2.3 Vệ sinh thú y 2.2.4 Phòng bệnh 2.3 KHÁI NIỆM BỆNH DO LEPTOSPIRA 2.4 LỊCH SỬ VÀ PHÂN BỐ ĐỊA LÝ CỦA BỆNH DO LEPTOSPIRA .5 2.4.1 Lịch sử bệnh 2.4.2 Phân bố địa lý 2.5 CĂN BỆNH HỌC 2.5.1 Phân loại iv 2.5.2 Hình thái học 2.5.3 Đặc điểm nuôi cấy .10 2.5.4 Sức đề kháng .11 2.5.5 Cấu trúc kháng nguyên 11 2.6 TRUYỀN NHIỄM HỌC 12 2.6.1 Loài mắc bệnh .12 2.6.2 Chất chứa bệnh 12 2.6.3 Đường xâm nhập 13 2.6.4 Cách sinh bệnh 13 2.6.5 Cách lây lan 14 2.6.6 Miễn dịch học 15 2.7 TRIỆU CHỨNG .16 2.7.1 Dạng cấp tính .16 2.7.2 Dạng bán cấp tính mãn tính 17 2.8 BỆNH TÍCH 17 2.8.1 Thể cấp tính 17 2.8.2 Thể bán, mãn tính 17 2.9 CHẨN ĐOÁN 17 2.9.1 Chẩn đoán lâm sàng 17 2.9.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm .17 2.9.3 Phương pháp huyết học .18 2.10 VỆ SINH PHÒNG BỆNH 19 2.10.1 Phòng bệnh vệ sinh 19 2.10.2 Phòng bệnh vaccine 19 2.10.3 Điều trị .20 2.11 SƠ LƯỢC VÀI CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 20 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT 22 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI .22 3.1.1 Thời gian 22 3.1.2 Địa điểm 22 3.2 ĐỐI TƯỢNG KHẢO SÁT .22 v 3.3 DỤNG CỤ - VẬT LIỆU 22 3.4 NỘI DUNG 22 3.5 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .23 3.5.1 Xác định tỷ lệ dương tính với Leptospira 23 3.5.1.1 Phương pháp thu thập mẫu .23 3.5.1.2 Phương pháp tiến hành .23 3.5.1.3 Thử nghiệm định tính .24 3.5.1.4 Đánh giá kết theo mức độ ghi nhận sau .26 3.5.2 Xác định số serovar chó .26 3.5.3 Xác định số serovar cá thể 26 3.5.4 Xác định hiệu giá kháng thể 26 3.6 Các công thức tính 28 3.7 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 TỶ LỆ DƯƠNG TÍNH VỚI LEPTOSPIRA 29 4.1.1 Tỷ lệ dương tính theo lứa tuổi .29 4.1.2 Tỷ lệ dương tính theo giới tính 30 4.1.3 Tỷ lệ dương tính theo nhóm giống 32 4.1.4 Tỷ lệ dương tính chó chưa chủng ngừa 33 4.1.5 Tỷ lệ dương tính chó có triệu chứng nghi bệnh Leptospira 34 4.2 CÁC SEROVAR ĐƯỢC PHÁT HIỆN TRÊN CÁC MẪU ĐIỀU TRA .37 4.3 CÁC SEROVAR DƯƠNG TÍNH TRÊN MỘT CÁ THỂ .39 4.4 HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ TRÊN TỪNG SEROVAR NGƯNG KẾT 41 4.5 HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ Ở CHÓ CÓ BIỂU HIỆN TRIỆU CHỨNG NGHI BỆNH DO LEPTOSPIRA 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Tồn .45 5.3 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 2.1: Dãy chuồng chó sinh sản Hình 2.2: Hình dạng xoắn trùng Leptospira kính hiển vi điện tử 10 Hình 2.3: Sơ đồ xét nghiệm Leptospira theo thời gian 13 Hình 2.4: Sơ đồ biểu diễn đường lây truyền bệnh .15 Hình 2.5: Sơ đồ diễn biến huyết học 15 Hình 3.1: Kết phản ứng MAT âm tính kính hiển vi đen 24 Hình 3.2: Kết phản ứng MAT dương tính kính hiển vi đen 24 Sơ đồ 3.1: Thực phản ứng vi ngưng kết 25 Sơ đồ 3.2: Định lượng kháng thể 27 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các serovar gây bệnh chủ yếu Đông Nam Á .8 Bảng 2.2: Đặc điểm phân biệt hai loài Leptospira Bảng 4.1: Tỷ lệ dương tính với Leptospira 29 Bảng 4.2: Tỷ lệ dương tính theo lứa tuổi 29 Bảng 4.3: Tỷ lệ dương tính theo giới tính .30 Bảng 4.4: Tỷ lệ dương tính theo giới tính tuổi 32 Bảng 4.5: Tỷ lệ dương tính theo việc chủng ngừa 33 Bảng 4.6: Tỷ lệ dương tính chó có triệu chứng nghi bệnh Leptospira .35 Bảng 4.7: Tỷ lệ dương tính theo việc chủng ngừa triệu chứng nghi bệnh Leptospira 36 Bảng 4.8: Sự diện serovar Leptospira mẫu dương tính 38 Bảng 4.9: Các serovar dương tính cá thể 40 Bảng 4.10: Hiệu giá kháng thể mẫu huyết dương tính 42 Bảng 4.11: Hiệu điều trị chó có số biểu triệu chứng nghi bệnh Leptospira .44 viii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ (%) dương tính theo lứa tuổi 30 Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ (%) dương tính theo giới tính 31 Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ (%) dương tính theo giới tính tuổi 32 Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ (%) dương tính theo việc chủng ngừa .34 Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ (%) dương tính chó có triệu chứng nghi bệnh Leptospira 35 Biểu đồ 4.6: Tỷ lệ dương tính theo việc chủng ngừa triệu chứng nghi bệnh Leptospira 36 Biểu đồ 4.7: Tỷ lệ (%) serovar dương tính mẫu điều tra .38 Biểu đồ 4.8: Tỷ lệ (%) serovar dương tính cá thể 41 Biểu đồ 4.9: Tỷ lệ (%) dương tính hiệu giá kháng thể dương tính 43 ix Bảng 4.8: Sự diện serovar Leptospira mẫu dương tính STT Serovar Số lần ngưng kết (*) Tỷ lệ dương tính (%) autralis 2 pyrogenes tonkini icterohaemorrhagiae cynopterie hardjo (2) 13 26 javanica hardjo (3) saxkoebing 10 canicola (1) 23 46 11 louisiana 12 hustbridge 50 100 Tổng cộng(*) Ghi chú: (*): Tổng số lần ngưng kết 50 lần tổng số 38 mẫu huyết dương tính (1): Canicola canicola Chiffon (2): Sejroe hardjo Hardjo Bovis (3): Sejroe hardjo Hardjo Hadjoprajitho 2% 2% 2% 4% 6% 26% 46% 2% 2% autralis icterohaemorrhagiae javanica canicola (1) 2% 2% pyrogenes cynopterie hardjo (3) louisiana 4% tonkini hardjo (2) saxkoebing hustbridge Biểu đồ 4.7: Tỷ lệ (%) serovar dương tính mẫu điều tra 38 Như vậy, lần điều tra phát diện 12 serovar, thấp so với điều tra Nguyễn Đức Toàn (2004) với 14 serovar Võ Thị Ngọc Hân (2006) với 19 serovar chó trại nuôi tập trung chủng ngừa đầy đủ Qua muốn làm rõ đặc điểm dịch tể bệnh Leptospira cần có nhiều điều tra Trong serovar canicola Chiffon chiếm tỷ lệ dương tính cao (46%) serovar hardjo Hardjo Bovis (26%) điều phù hợp với điều tra Lê Văn Thanh (2005) Võ Thị Ngọc Hân (2006) cho thấy serovar canicola Chiffon chiếm tỷ lệ dương tính cao (25,45%; 19,7%) Tuy nhiên, kết khơng có khác biệt lần điều tra Theo chúng tôi, serovar canicola Chiffon chiếm tỷ lệ dương tính cao diện kháng thể mẫu huyết chó tiêm phòng 4.3 CÁC SEROVAR DƯƠNG TÍNH TRÊN MỘT CÁ THỂ Số serovar dương tính cá thể trình bày qua Bảng 4.9 39 Bảng 4.9: Các serovar dương tính cá thể Dương tính với serovar Các serovar (+) Số mẫu (+) Dương tính với serovar Các serovar (+) Dương tính với serovar Số mẫu (+) Các serovar (+) icterohaemorrhagiae canicola (1) tonkini Số mẫu (+) Dương tính với serovar Các serovar (+) pyrogenes cynopterie louisiana hustbridge autralis hardjo(2) saxkoebing canicola (1) Số mẫu (+) 40 canicola (1) 18 javanica canicola (1) pyrogenes hardjo (2) canicola (1) hardjo (3) tonkini javanica hardjo (2) 10 tonkini Tổng cộng 31 Tỷ lệ (%) 81,58 10,53 2,63 5,26 Ghi chú: (*): Số ngoặc tương ứng với tên serovar dương tính (1): Canicola canicola Chiffon (2): Sejroe hardjo Hardjo Bovis (3): Sejroe hardjo Hardjo Hadjoprajitho 1 2,63% 5,26% 10,53% 81,58% Với serovar Với serovar Với serovar Với serovar Biểu đồ 4.8: Tỷ lệ (%) serovar dương tính cá thể Qua Bảng 4.9 Biểu đồ 4.8, cho thấy mẫu dương tính với serovar, có 31 mẫu dương tính với serovar chiếm tỷ lệ (81,58%), có mẫu dương tính với serovar (10,53%), có mẫu dương tính với serovar (2,63%), có mẫu dương tính với serovar (5,26%) Kết khác với điều tra trước Phùng Tấn Tài (2003), Nguyễn Quang Thông (2004) Võ Thị Ngọc Hân (2006) Kết tương đương với điều tra Lưu Khánh Duy (2004) Lê Văn Thanh (2005) có đến mẫu dương tính với serovar (6,25%) (5,56%) Theo chúng tôi, kết dương tính với nhiều serovar cá thể thể đáp ứng chủng ngừa, với nhiễm serovar khác bên ngồi mơi trường 4.4 HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ TRÊN TỪNG SEROVAR NGƯNG KẾT Kết hiệu giá kháng thể ngưng kết serovar mẫu huyết dương tính phản ứng MAT trình bày qua Bảng 4.10 41 Bảng 4.10: Hiệu giá kháng thể mẫu huyết dương tính STT Các serovar Hiệu giá kháng thể ngưng kết Số lần ngưng kết 1/100 autralis pyrogenes 2 tonkini 3 icterohaemorrhagiae 1 cynopterie (2) 1/200 1/400 1/800 1/1600 1 hardjo 13 11 javanica 1 hardjo (3) saxkoebing 1 10 canicola (1) 23 11 louisiana 12 hurstbridge 1 2 1 Tổng cộng(*) 50 25 15 2 Tỷ lệ (%) 100 50 30 24 4 Ghi chú: (*): Tổng số lần ngưng kết: 50 lần tổng số 38 mẫu huyết dương tính (1): Canicola canicola Chiffon (2): Sejroe hardjo Hardjo Bovis (3): Sejroe hardjo Hardjo Hadjoprajitho 42 4% 4% 12% 50% 30% 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 Biểu đồ 4.9: Tỷ lệ (%) dương tính hiệu giá kháng thể dương tính Qua kết Bảng 4.10, nhận thấy đa số trường hợp dương tính có hiệu giá tập trung mức 1/100 1/200 chiếm (80%) Ở mức hiệu giá kết luận giai đoạn bệnh, để biết nhiễm bệnh giai đoạn hiệu giá kháng thể tiêm chủng, cần làm phản ứng MAT lần cách lần – tuần, hiệu giá kháng thể lần cao lần đầu hai bước pha loãng huyết ta kết luận chó bị bệnh giai đoạn cấp tính Tuy nhiên, có hai mẫu ngưng kết hiệu giá 1/1600 với serovar canicola Chiffon, mức hiệu giá thấp so với điều tra trước Lê Văn Thanh (2005) Võ Thị Ngọc Hân (2006) Thực tế qua điều tra, ghi nhận với mức hiệu giá 1/1600 chưa thấy biểu lâm sàng chó Điều ảnh hưởng khơng nhỏ đến cơng tác chẩn đốn dịch tể bệnh Kết phù hợp với nhận định Barlough Pedersen (1995) (trích dẫn Võ Thị Ngọc Hân, 2006) phần lớn nhiễm trùng Leptospira chó thể ẩn tính, khơng có có biểu lâm sàng Việc làm để phát bệnh giai đoạn sớm thể bệnh ẩn tính để có biện pháp phòng trị có hiệu vấn đề lưu ý với nhà chuyên môn 43 4.5 HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ Ở CHÓ CÓ BIỂU HIỆN TRIỆU CHỨNG NGHI BỆNH DO LEPTOSPIRA Qua điều tra ca chó bệnh có số biểu nghi Leptospira trại lấy mẫu xét nghiệm, kết điều trị ca trình bày qua Bảng 4.11 Bảng 4.11: Hiệu điều trị chó có số biểu triệu chứng nghi bệnh Leptospira Số mẫu khảo sát Hiệu điều trị Tỷ lệ khỏi, tiến Khỏi, tiến triển tốt Chết không rõ triển tốt (%) 71,43 Qua Bảng 4.11, cho thấy ca bệnh có biểu triệu chứng nghi bệnh Leptospira điều trị kháng sinh liên tục – ngày, chí kéo dài hơn, có ca khỏi bệnh tiến triển tốt chiếm tỷ lệ 71,43% Trong ca điều trị có ca dương tính với Leptospira qua phản ứng MAT Theo dõi trình điều trị chó này, chúng tơi thấy có ca tiến triển tốt chiếm tỷ lệ 75% ca tử vong (dương tính với serovar tonkini, icterohaemorrhagiae hiệu giá 1/100 canicola Chiffon hiệu giá 1/1600) Theo Trần Thanh Phong (1996), thể cấp tính có hồng đản bệnh Leptospira chó tỷ lệ chết lên đến 60 – 90% Còn theo Davol (2001) tỷ lệ chó chết trực tiếp Leptospirosis thường không vượt 10% thường xảy vào khoảng từ – 10 ngày sau biểu Chết nguyên nhân thứ phát thường gặp có liên quan đến tiến triển q trình hư hại gan, thận không xảy sau thời gian dài mắc bệnh (thể mãn tính) Như vậy, hiệu trình điều trị phụ thuộc nhiều vào việc phát chẩn đốn sớm bệnh Barlough Pedersen (1995) khuyến cáo bệnh Leptospira cần điều trị kháng sinh phù hợp trì vài tuần cho dến chức gan, thận hồi phục thải mầm bệnh thể bệnh thấp (trích dẫn Võ Thị Ngọc Hân, 2006) 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian khảo sát trung tâm nghiên cứu sản xuất chó giống Phú Quốc – Cửu Long, rút kết luận sau: Tỷ lệ dương tính với Leptospira 105 chó Phú Quốc khảo sát trại chó giống Phú Quốc – Cửu Long 36,19% Có 12 serovar khác cho phản ứng dương tính Trong đó, tỷ lệ dương tính cao serovar canicola Chiffon (46%) hardjo Hardjo Bovis (26%) Số serovar ngưng kết cá thể: dương tính với serovar chiếm (81,58%), dương tính với serovar chiếm (10,53%), dương tính với serovar chiếm (2,63%) với serovar (5,26%), khơng có trường hợp dương tính lúc nhiều serovar cá thể Hiệu giá kháng thể chủ yếu tập trung mức 1/100 1/200 chiếm (80%), mức 1/400 (12%), mức 1/800 1/1600 (4%), khơng có mức hiệu giá cao phát Hiệu điều trị chó chó biểu nghi ngờ bệnh Leptospira đạt hiệu tốt chiếm 71,43% Các vaccine thị trường chưa thực hiệu việc phòng bệnh Leptospirosis chó, tích cực vệ sinh chăm sóc quản lý làm giảm nguy mắc bệnh Leptospira chó 5.2 Tồn Mặc dù có nhiều cố gắng xong đề tài số hạn chế sau: Chưa làm phản ứng MAT lần để khẳng định giai đoạn bệnh Chưa thực nuôi cấy phân lập mẫu huyết dương tính với phản ứng MAT Chưa làm phản ứng huyết học khác như: ELISA, PCR để khắc phục hạn chế phản ứng MAT 45 5.3 Đề nghị Để kết xác điều tra nghiên cứu cần phải cố gắng làm thêm phản ứng MAT lần có điều kiện nên làm phản ứng ELISA, PCR, Đối với trại: + Nên định kỳ kiểm tra huyết chó năm + Đối với chó có triệu chứng nghi ngờ phải tách riêng nghi bệnh để quan sát điều trị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Văn Chính, 2003 Hướng dẫn thực tập phần mềm Minitab12.21 for windows Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Trang 65-67 Nguyễn Văn Cơng, 2000 Thống kê sinh học ứng dụng chăn nuôi thú y Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Trang 81-83 Lưu Khánh Duy, 2004 Điều tra tình hình nhiễm Leptospira chó khám điều trị Bệnh xá Thú y trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Trần Minh Cơng, 2007 Điều tra tình hình nhiễm Leptospira chó khám điều trị Bệnh xá Thú y trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tiểu luận tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Thái Thị Mỹ Hạnh, 1997 Điều tra tình hình nhiễm Leptospira đàn chó điều trị trạm phòng chống dịch phòng trừ bệnh dại Chi cục Thú y TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Bác sĩ Thú y, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh Thú y Tủ sách trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Trang 81-83 Trần Thanh Phong,1996 Một số bệnh truyền nhiễm chó Tủ sách trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Trang 82-97 Phùng Tấn Tài, 2003 Điều tra tình hình nhiễm Leptospira chó khám điều trị Bệnh xá Thú y trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Lê Văn Thanh, 2005 Điều tra tình hình nhiễm Leptospira chó khám điều trị Bệnh xá Thú y trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 10 Phạm Ngọc Thạch, 2006 Những bí chẩn đốn bệnh cho chó NXB Nơng Nghiệp Trang 117-119 11 Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài Nguyễn Văn Tó, 2006 Những bệnh thường gặp chó cách phòng chống NXB Lao Động Trang 65-69 47 12 Nguyễn Quang Thơng, 2004 Điều tra tình hình nhiễm Leptospira chó khám điều trị Bệnh xá Thú y trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 13 Nguyễn Đức Tồn, 2004 Điều tra tình hình nhiễm Leptospira chó khám điều trị Bệnh xá Thú y trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 48 PHỤ LỤC Tỷ lệ dương tính theo giới tính Nhiem 11 9.41 KhNhiem 15 16.59 Total 26 27 28.59 52 50.41 79 Total 38 67 105 Chi-Sq = 0.269 + 0.152 + 0.088 + 0.050 = 0.560 DF = 1, P-Value = 0.454 Tỷ lệ dương tính theo lứa tuổi Nhiem 11 10.50 KhNhiem 18 18.50 Total 29 27 27.50 49 48.50 76 Total 38 67 105 Chi-Sq = 0.024 + 0.014 + 0.009 + 0.005 = 0.053 DF = 1, P-Value = 0.819 Tỷ lệ dương tính theo giới tính tuổi CON ĐỰC Nhiem 6.77 KhNhiem 11 9.23 Total 16 4.23 5.77 10 Total 11 15 26 Chi-Sq = 0.462 + 0.339 + 0.740 + 0.543 = 2.084 DF = 1, P-Value = 0.149 49 CON CÁI Nhiem 4.44 KhNhiem 8.56 Total 13 21 22.56 45 43.44 66 Total 27 52 79 Chi-Sq = 0.546 + 0.283 + 0.107 + 0.056 = 0.992 DF = 1, P-Value = 0.319 ≤12 THÁNG Nhiem 6.07 KhNhiem 11 9.93 Total 16 4.93 8.07 13 Total 11 18 29 Chi-Sq = 0.188 + 0.115 + 0.232 + 0.142 = 0.677 DF = 1, P-Value = 0.411 >12 THÁNG Nhiem 3.55 KhNhiem 6.45 Total 10 21 23.45 45 42.55 66 Total 27 49 76 Chi-Sq = 1.686 + 0.929 + 0.255 + 0.141 = 3.011 DF = 1, P-Value = 0.083 Tỷ lệ dương tính theo việc chủng ngừa Nhiem 35 34.38 KhNhiem 60 60.62 Total 95 3.62 6.38 10 Total 38 67 105 Chi-Sq = 0.011 + 0.006 + 0.106 + 0.060 = 0.183 DF = 1, P-Value = 0.668 50 Tỷ lệ dương tính chó có triệu chứng nghi bệnh Leptospira Nhiem 3.71 KhNhiem 3.29 Total 5.29 4.71 10 Total 17 Chi-Sq = 0.023 + 0.026 + 0.016 + 0.018 = 0.084 DF = 1, P-Value = 0.772 Tỷ lệ dương tính chó theo việc chủng ngừa triệu chứng nghi bệnh Leptospira CÓ CHỦNG Nhiem KhNhiem Total 1 0.74 1.26 2 34 34.26 59 58.74 93 Total 35 60 95 Chi-Sq = 0.094 + 0.002 + 0.055 + 0.001 = 0.152 DF = * WARNING * cells with expected counts less than 1.0 * Chi-Square approximation probably invalid cells with expected counts less than 5.0 KHÔNG CHỦNG Nhiem KhNhiem 1.50 Total 3.50 1.50 3.50 Total 10 Chi-Sq = 1.500 + 0.643 + 1.500 + 0.643 = 4.286 DF = 1, P-Value = 0.038 cells with expected counts less than 5.0 51 KHÔNG NGHI NGỜ Nhiem KhNhiem 34 32.27 Total 59 60.73 1.73 3.27 Total 34 64 98 93 Chi-Sq = 0.093 + 0.050 + 1.735 + 0.922 = 2.799 DF = 1, P-Value = 0.094 cells with expected counts less than 5.0 NGHI NGỜ Nhiem KhNhiem 1.14 Total 0.86 2.86 2.14 Total Chi-Sq = 0.018 + 0.007 + 0.024 + 0.010 = 0.058 DF = * WARNING * cells with expected counts less than 1.0 * Chi-Square approximation probably invalid cells with expected counts less than 5.0 52 ... Ở gan, gây viêm gan, phá hủy chức gan gây thi u gan (lượng đường huyết giảm, bilirubin huyết tăng, hoàng đản,…) Ở thận, có biểu tương tự viêm thận, thi u thận (urê huyết, albumin niệu), dẫn đến... nguồn dịch thi n nhiên bệnh làm cho khơng thể kiểm sốt môi trường nước ngày bị ô nhiễm… (Trần Thanh Phong, 1996) Cần kiểm soát dịch bệnh gia súc qua việc định kỳ kiểm tra huyết học cần thi t, gia... .2 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 GIỚI THI U SƠ LƯỢC VỀ TRẠI CHÓ PHÚ QUỐC - CỬU LONG 2.1.1 Về địa lý .3 2.1.2 Lịch sử hình