Đang tải... (xem toàn văn)
Vitamin E là tên gọi của 1 nhóm hợp chất gồm các tocopherol và các tocotrienol (gọi chung là các tocol). Chúng là những chất tan trong lipid, dễ bị oxi hóa khi tiếp xúc với các điều kiện nhiệt, ánh sáng, môi trường kiềm. Cấu tạo của chúng gồm vòng chromanol phân cực và nhóm 16 carbon kị nước (Hình 1). Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocopherol và 4 tocotrienol phân biệt bởi số và vị trí nhóm methyl trên vòng chromanol.
Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228 Phân tích vitamin E số loại dầu thực vật phương pháp HPLC đảo pha 1.Đặc điểm chất cần phân tích: Vitamin E tên gọi nhóm hợp chất gồm tocopherol tocotrienol (gọi chung tocol) Chúng chất tan lipid, dễ bị oxi hóa tiếp xúc với điều kiện nhiệt, ánh sáng, môi trường kiềm Cấu tạo chúng gồm vòng chromanol phân cực nhóm 16 carbon kị nước (Hình 1) Vitamin E tự nhiên tồn dạng khác nhau, có tocopherol tocotrienol phân biệt số vị trí nhóm methyl vòng chromanol Hình Cấu trúc hóa học tocopherols tocotrienols Các tocol có hoạt tính sinh học giống α-tocopherol α-tocopherol tự nhiên có hoạt tính cao nhất, β-, γ- and δ-tocopherols α- and β-tocotrienols có hoạt tính 50%, 10%, 3%, 30% 5% α-tocopherol Là chất chống oxy hóa, tocol làm chậm trình phát triển số bệnh tim mạch hay ung thư Ngoài chúng chứng minh có tác dụng điều hòa biểu gene, tín hiệu tế bào, đáp ứng miễn dịch làm giảm mức cholesterol máu Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228 Vì tocol hợp chất dễ hòa tan lipid Chúng dễ dàng hòa tan dung mơi hữu Sử dụng Methanol-Nước làm dung mơi 2.Nguồn gốc: Tocopherols có mặt hầu hết thực phẩm từ thực vật dầu thực vật loại hạt Hầu hết tocotrienols bắt nguồn từ dầu cọ số ngũ cốc ngũ cốc, lúa mì, lúa mạch yến mạch Dầu ô liu dầu đậu nành sử dụng làm nguồn phân tích tocopherol 3.Cách chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu bước tiêu tốn nhiều thời gian phân tích ảnh hưởng đến độ xác Để giảm mát tocol, việc chuẩn bị mẫu nên làm đơn giản Các tocopherol dễ bị oxi hóa gặp điều kiện nhiệt độ, ánh sáng hay kiềm Để tránh mát Vitamin E, ta sử dụng vật liệu tối màu ánh sáng hồng ngoại Với mẫu dầu không cần thiết phải chiết tách Tocopherol khỏi dầu trước chạy sắc kí thành phần khác dầu phytosterols hay carotenoids có thời gian lưu khác với chất cần phân tích Các bước chuẩn bị mẫu: -Dầu pha với hexane (1:10) -Sau 200 μl chuyển sang ống có chứa 600 μl methanol 200 μl dung dịch chuẩn (300 μg/ml α-tocopherol acetate ethanol) -Sau mẫu trộn vortex ly tâm (5000RPM,5mins) -Có thể lọc qua màng lọc 0,45 μm trước đưa mẫu vào -50μl mẫu nạp vào nạp mẫu -Mẫu giữ bình tối màu -20 °C khoảng tuần 4.Điều kiện chạy sắc kí: Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228 HPLC kĩ thuật sử dụng rộng rãi để phân tích tocol, bao gồm HPLC thường (NP HPLC) HPLC đảo pha (RP HPLC) Các tocol ổn định điều kiện HPLC, dễ tan vào dung mơi thích hợp kết hợp với nhiều loại detector Fluorescence detection (FLD) ultraviolet detection (UV) sử dụng rộng rãi Khi tocol cần phân tách hay sử dụng NP HPLC Nhưng cần tách số loại định dùng RP HPLC Với NP HPLC, mẫu hòa tan dung môi hữu không phân cực phân tách hấp thụ Sự phân cực tocol bị ảnh hưởng số nhóm metyl vòng chromanol RP HPLC dùng để phân tích tocol RP HPLC có lợi thể sử dụng pha động độc hại NP HPLC (VD: methanol, ethanol, ) Vì RP HPLC phân tách chất cần phân tích mà có khác lớn cấu trúc hóa học, RP HPLC dùng để phân tách lúc tocol hợp chất tan chất béo khác 4.1 Pha động: Pha động sử dụng Methanol-Nước (96:4) 4.2 Dung môi: Dung môi Methanol-Nước Dầu pha với hexane tỉ lệ 1:10 4.3 Cột sắc kí: Sử dụng cột thẳng Kích Hình thước hạt dạng hạt 5μm Hình cầu Diện tích bề mặt 320 m2/g Kích thước lỗ 150Å Kích thước cột: 150x4,4 mm I.D Vật liệu nhồi cột: Silica gel 4.4 Pha tĩnh: Thể tích lỗ 1.15 mL/g Nhóm gắn vào Octadecyl C18- Lượng Carbon Khoảng pH 18.5% - 7.5 Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228 Silica gel gắn với C18 Các yếu tố ảnh hưởng: Tốc độ dòng chảy: ml/min Nhiệt độ cột: 45°C Sử dụng detector UV λ = 292 nm đo sau phút chạy sắc kí Kết quả: 6.1 Kết điện di: Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228 Các tocol có hấp thụ ánh sáng UV λ = 290-300 nm thường sử đụng để phát định lượng mẫu có hàm lượng tocopherol cao dầu thực vật Do không chiết tách tocopherol trước chạy sắc kí , phần đầu bảng số thành phần khác dầu carotenoids hay phytosterols, chúng có thời gian lưu khác với tocopherol Hỗn hợp dầu hexane tỉ lệ 1:10 làm cho peak tách rời 6.2 Thẩm định phương pháp: α-tocopherol acetate sử dụng làm chất chuẩn sẵn có chất có cấu trúc gần giống với chất cần phân tích Tỷ lệ diện tích peak α-tocopherol αtocopherol acetate (y) với khối lượng chuẩn α-tocopherol (x) tuyến tính khoảng phân tích δ-tocopherol tuyến tính với hệ số tương quan lên đến 0.999 khoảng phân tích Độ xác q trình chạy đo cách tính RSD αtocopherol δ-tocopherol 10 mẫu dầu ô liu 10 mẫu dầu đậu nành Ở trường hợp, kết cho chấp nhận với nồng độ khoảng μmol/l Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228 Một phương pháp khác để kiểm tra độ xác phương pháp cho αtocopherol δ-tocopherol chuẩn vào với tường mức nồng độ khác để đo lượng mẫu thu hồi Kết thu với α-tocopherol 100%, 107.05%, 102,02%, với δ-tocopherol 91.95%, 94.50%, 94.40% Để kiểm tra độ nhạy phương pháp, đo giới hạn phát (Detection limit) giới hạn định lượng (Quantification limit) DL α-tocopherol δ-tocopherol 11.5 ng 12 ng Q α-tocopherol δ-tocopherol 23 ng 25 ng 6.3 Nhận xét: Ưu điểm: Chuẩn bị mẫu nhanh, đơn giản Độ nhạy cao Phương pháp có độ xác cao (RSD=2.69%) lượng mẫu thu hồi cao (98,14%) Mẫu dầu phân tích nhiều lần mà không làm ảnh hưởng đển chất lượng cột sắc kí Nhược điểm: Cột C18 khơng phân tách β- γ- tocol Giới thiệu hệ thống thiết bị: HPLC tiến hành với thiết bị sắc kí lỏng Hewlett Packard, bơm HP1050, nạp mẫu Rheodyne model 7125, Detector HP-1040 cột sắc kí Tracer Extrasil ODS-2 Trần Duy Anh - KTSH2-K59 - 20140228 Tài liệu tham khảo: Journal of Chromatography A: Volume 881 issue 1-2 2000 E Gimeno; A.I Castellote; R.M Lamuela-Raventós; M.C de la Torre Rapid determination of vitamin E vegetable oils by RP HPLC Analysis of Tocopherols and Tocotrienols by HPLC http://lipidlibrary.aocs.org/Analysis/content.cfm?ItemNumber=40389 ... Volume 881 issue 1-2 2000 E Gimeno; A.I Castellote; R.M Lamuela-Raventós; M.C de la Torre Rapid determination of vitamin E vegetable oils by RP HPLC Analysis of Tocopherols and Tocotrienols by HPLC. .. nhiều loại detector Fluorescence detection (FLD) ultraviolet detection (UV) sử dụng rộng rãi Khi tocol cần phân tách hay sử dụng NP HPLC Nhưng cần tách số loại định dùng RP HPLC Với NP HPLC, mẫu... dung mơi hữu Sử dụng Methanol-Nước làm dung mơi 2.Nguồn gốc: Tocopherols có mặt hầu hết thực phẩm từ thực vật dầu thực vật loại hạt Hầu hết tocotrienols bắt nguồn từ dầu cọ số ngũ cốc ngũ cốc,