Các phương pháp dùng trong giám định hài cốt Hiện hiện nay có 3 phương pháp chính dùng trong giám định hài cốt: 1.Giám định hình thái xương (đòi hỏi hộp sọ phải còn nguyên vẹn) 2.Giám định qua di vật. 3.Giám định hài cốt bằng kỹ thuật phân tích hệ gen ty thể.
Ứng dụng DT & SHPT giám định hài cốt I Giới thiệu II Ty thể ◦ Ty thể gì? ◦ Hệ gen ty thể ◦ Đặc điểm di truyền hệ gen ty thể III Các bước giám định hài cốt ◦ Chuẩn bị mẫu ◦ Nhân bội AND PCR ◦ Giải trình tự gen ◦ So sánh gen theo dòng mẹ IV Kết luận I Giới thiệu Các phương pháp dùng giám định hài cốt H i ệ n h i ệ n n a y c ó p h n g p h p c h í n h d ù n g t ro n g g i m định hài cốt: 1G G i mmđđị n v iậ x t n g ị nhh qh nah dtih ( áò m i hỏ s ọi cpốhtả ibcằònng n g u y ê n v ẹ n ) 3.G đ iị nhhộ ph kỹ thuật phân tích hệ gen ty thể * Phương pháp giám định hài cốt thông qua kỹ thuật phân tích vùng gen đặc trưng ty thể mang lại hiệu độ xác cao II Ty thể Ty thể gì? - Ty thể bào quan phổ biến tìm thấy hầu hết tế bào nhân chuẩn - Chức ty thể cung cấp lượng (ATP) cần thiết cho hoạt động sinh tổng hợp vận động tế bào II Ty thể Hệ gen ty thể - Ty thể bào quan có hệ gen riêng, nhân độc lập với gen nhân - DNA ty thể người tồn dạng mạch vòng kép, có kích thước 16560 bp, gồm: ◦ 37 gen mã hóa cho phân tử ARN ribosome ◦ 22 phân tử ARN vận chuyển ◦ 13 phân tử protein thành phần cần thiết phức hợp chuỗi hô hấp - So với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa trình tự khơng mã hóa xen kẽ với vùng mã hóa - Ngồi ra, gen ty thể có vùng khơng mã hố gọi vùng kiểm sốt hay vùng D-Loop có chứa nhiều đặc điểm cấu trúc ADN đặc trưng cho cá thể nhận vật liệu di truyền theo dòng mẹ II Ty thể - Hệ gen ty thể (mtDNA) tồn lâu sau tế bào bị phá hủy so với hệ gen nhân do: ◦ Có cấu trúc dạng vòng bền vững ◦ Trong tế bào có đến hàng nghìn ty thể, có đến hàng nghìn mtDNA DNA nhân có hai với nhiễm sắc thể II Ty thể Đặc điểm di truyền hệ gen ty thể theo dòng mẹ, giống DNA nhân khác Người mẹ truyền hệ gen ty thể cho con, có gái bà truyền hệ gen cho hệ Cơ chế giải thích sau : III Các bước giám định hài cốt Chuẩn bị mẫu Nhân bội ADN Giải trình tự gen So sánh theo dòng mẹ Bước 1: Chuẩn bị mẫu - Lấy lượng nhỏ xương hài cốt để tách chiết DNA ty thể - Mẫu làm sạch, nghiền thành bột nitơ lỏng Sau đó, mẫu bột xương ngâm vào hoá chất đặc biệt - DNA tách chiết từ mẫu hóa chất thiết bị chun dụng - Mọi cơng đoạn thực môi trường in vitro Bước 2: Nhân bội DNA PCR Sau tách đươc DNA ty thể từ hài cốt tiến hành nhân bội DNA vùng D-loop để thu lượng lớn DNA ty thể phục vụ cho việc giải trình tự PCR phản ứng nhân trình tự DNA ống nghiệm Phương pháp thực in-vitro với diện enzyme DNApolymerase Bước 2: Nhân bội DNA PCR Các thành phần tham gia: ◦ Mạch khuôn (DNA RNA) ◦ Đoạn mồi (Primers) ◦ Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq) ◦ dNTP ◦ Dung dịch đệm (buffers) ◦ Ion Mg2+ Giai đoạn biến tính • Phân tử DNA biến tính nhiệt độ 94-950C 30s đến phút • Cầu nối hydrogen nối sợi DNA bị phá vỡ tạo thành mạch đơn Giai đoạn lai • Nhiệt độ < Tm mồi (55650C, tùy thuộc vào độ lớn Tm mồi), mồi bắt cặp với khn • Thời gian từ 30s – phút • Mồi xi gằn đầu 3’ mạch khuôn 5’-3’, mồi ngược bắt cặp đầu 3’ mạch khuôn 3’-5’ Giai đoạn tổng hợp Ở 720C, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống, bắt đầu bám vào hoạt động dọc theo sợi DNA Thời gian khoảng 30s đến vài chục phút tùy thuộc kích thước đoạn DNA cần khuyếch đại Kết Từ hay vài đoạn mạch khuôn sau thời gian ngắn cho số lượng lớn đoạn gen cần khuyếch đại Bước 3: Giải trình tự gen Có phương pháp: Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy Giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học Bước 1: Biến tính phân tử DNA Thành mạch đơn,đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’ Bước 2: Xử lý hóa học phân hủy đặc trưng loại nucleotid mạch DNA tạo oligonucleotide Gồm loại phản ứng 1 Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học Bước 3: Điện di gel polyacrylamide Bước 4: Đọc kết phóng xạ tự ghi,thu trình tự nucleotid mạch đơn DNA Nhược điểm: Khó thực phải xác định nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm 2 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy Nguyên tắc bản: Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn nucleotide vào mạch đơn DNA tổng hợp vị trí 3’OH,khi gặp nucleotide khơng có nhóm 3’OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại Thành phần cần thiết cho ống ◦ DNA khn ◦ Primer có đánh dấu phóng xạ P32 ◦ Các loại dNTP ◦ Enzyme Taq DNA polymerase ◦ Dung dịch đệm ◦ 1% loại ddNTP 2 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy Bước 1: Cắt, tách đoạn AND thành sợi đơn nhân dòng AND để tạo đủ nguyên liệu nghiên cứu Bước 2: Chuẩn bị môi trường thực phản ứng tổng hợp Bước 3: Chạy điện di so sánh kết chuỗi mạch đơn để xác định trình tự mạch đơn Giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động Nguyên tắc: Dựa sở phương pháp dideoxy Tiến hành: Tùy loại máy mà thực bước khác Bước 1: Chuẩn bị Master mix Bước 2: Thực phản ứng nhân gen qua máy PCR Bước 3: Chạy máy giải trình tự xử lý kết Ưu điểm: - Máy đọc trình tự mạch đơn - Các ddNTP không đánh dấu phóng xạ mà đánh dấu chất huỳnh quang khác => Có thể giảm nhầm lẫn kỹ thuật nên nhanh chóng,chính xác Bước 4: So sánh gen theo dòng mẹ Cấu trúc AND ty thể người lần Anderson giải trình tự năm 1981 Trình tự gốc sử dụng trình tự chuẩn để so sánh trình tự AND ty thể mẫu giám định Trong trình tự gen vùng điều khiển D’Loop có nhiều đặc trưng cho cá thể Trong quần thể người AND ty thể di truyền nghiêm ngặt theo dòng mẹ nên so sánh trình tự mẫu cần giám định với trình tự vùng D’Loop mẹ, dì, cậu… So sánh trình tự với phần mềm, thơng qua trình tự chuẩn Anderson để tìm mối quan hệ huyết thống chúng IV Kết luận Ưu điểm: ◦ Thời gian thực nhanh, cần khoảng để khuếch đại trinh tự DNA với phương pháp tạo dòng khoảng tuần ◦ Đơn giản tốn ◦ Độ tinh mẫu khơng cần cao ◦ Chỉ cần tìm mẫu đối chứng trực hệ theo dòng mẹ xác định IV Kết luận Nhược điểm ◦ Chỉ xác định huyết thống có mẫu thuộc dòng mẹ ◦ Nếu xương bị mủn tách chiết DNA ty thể ◦ Phương pháp PCR không hoạt động với đoạn DNA lớn 3kb (Phương pháp sử dụng tốt với đoạn DNA có độ dài 1,5kb) ◦ Độ ngoại nhiễm cao ◦ Taq-polymerase cho tỷ lệ sai cao (có thể khắc phục cách kết hợp Taq Pfu polymerase để hoan thiện chế sửa sai exonuclease 3’ – 5’) IV Kết luận Tóm lại, di truyền tế bào chất (ty thể) có nhiều ứng dụng có ý nghĩa to lớn cho phát triển nghiên cứu lồi người, cơng tìm kiếm hài cốt liệt sỹ Sự hiểu biết hoạt động gen ty thể nằm mối quan hệ phức tạp với máy di truyền nhân góp phần phát triển, hồn thiện vấn đề tổ chức điều hòa hoạt động hệ thống di truyền tế bào ứng dụng chọn giống (VD: xác định nguồn gốc loài động vật bị tuyệt chủng; ứng dụng bất thụ đực tế bào chất sản xuất giống lai ) Cảm ơn thầy bạn lắng nghe ... Các phương pháp dùng giám định hài cốt H i ệ n h i ệ n n a y c ó p h n g p h p c h í n h d ù n g t ro n g g i m định hài cốt: 1G G i mmđđị n v iậ x t n g ị nhh qhuì nah dtih ( áò m i hỏ s ọi... giải thích sau : III Các bước giám định hài cốt Chuẩn bị mẫu Nhân bội ADN Giải trình tự gen So sánh theo dòng mẹ Bước 1: Chuẩn bị mẫu - Lấy lượng nhỏ xương hài cốt để tách chiết DNA ty thể -... tự năm 1981 Trình tự gốc sử dụng trình tự chuẩn để so sánh trình tự AND ty thể mẫu giám định Trong trình tự gen vùng điều khiển D’Loop có nhiều đặc trưng cho cá thể Trong quần thể người AND ty