Thông tin di truyền lưu trữ trong DNA được sao chép sang RNA và sau đó được dùng để tổng hợp protein Tuy nhiên không phải mọi thông tin di truyền đều được sử dụng mà chỉ có một phần thông tin di truyền trong hệ gene được sử dụng trong mỗi loại tế bào. Việc gene nào được biểu hiện là do cơ chế kiểm soát của bộ máy sao chép DNA sang mRNA trong quá trinh phiên mã Quá trình phiên mã cũng bị điều khiển bởi nhiều nhân tố khác và được con người nghiên cứu, tìm hiểu ngày càng rõ.
I Giới thiệu RNAi 1.Dòng thơng tin di truyền tế bào : Dòng thơng tin di truyền tế bào • Thơng tin di truyền lưu trữ DNA chép sang RNA sau dùng để tổng hợp protein • Tuy nhiên khơng phải thông tin di truyền sử dụng mà có phần thơng tin di truyền hệ gene sử dụng loại tế bào • Việc gene biểu chế kiểm soát máy chép DNA sang mRNA q trinh phiên mã • Q trình phiên mã bị điều khiển nhiều nhân tố khác người nghiên cứu, tìm hiểu ngày rõ Khái niệm RNAi “ RNA can thiệp ” ( RNAi ) hệ thống bên tế bào sống , giúp kiểm soát gene hoạt động Đó đoạn RNA ngắn ức chế biểu gene có trình tự tương đồng với Các phân tử RNAi gây lên hiêu ứng: Ức chế dịch mã đơn vị mRNA Ức chế phiên mã gene nhân Phân giải mRNA Vai trò RNAi RNAi có nhiều chức quan trọng tế bào : – Bảo vệ tế bào chống lại gene ký sinh trùng, virut yếu tố di truyền vận động ( Transposon) – Điều hoà biểu gene – Điều khiển phát triển tổ chức – Giữ gìn NST tăng cường phiên mã – Có thể RNAi có nhiều chức khác mà người chua khám phá hết, khám phá tương lai Các thành phần tham gia vào trinh can thiệp RNAi Quá trình can thiệp RNAi thực chế : + siRNA + miRNA siRNA : thành phần tham gia : • dsRNA ( double strand RNA – RNA sợi đôi ) : đoạn RNA dài mạch kép có trình tự bổ xung với gene đích ( target RNA ) có đầu thò 3’OH • Dicer : loại enzyme endonuclease ( Ribonuclease III ) chịu trách nhiệm hồn thiện sợi dsRNA • Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex ) : Phức hệ gắng gene kích ứng RNA Phức hệ có chứa enzyme helicase số protein quan trọng protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động endonuclea cắt mRNA • siRNA (small interfeing RNA ) : RNA can thiệp kích thước nhỏ tạo từ dsRNA miRNA Là đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 – 24 nu, khơng tham gia vào q trình tổng hợp protein Bộ máy miRNA bao gồm : • Pri- mRNA ( primary-mRNA ) : chuỗi mRNA nguyên thuỷ , dài hàng nghìn nu mang đầu 5’CAP, đuôi poly A PrimRNA chữa hay nhiều vòng kẹp tóc ( hairpin ) vòng dài khoảng 70 nu • Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex ): Phức hệ gắng gene kích ứng RNA Phức hệ có chứa enzyme helicase số protein quan trọng protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động endonuclea cắt mRNA • Hai enzyme cắt : + Drosha : nhân tế bào + Dicer : tế bào chất Con đường hình thành máy can thiệp RNAi 2.1 Con đường hình thành siRNA : Quá trình hình thành siRNA diễn tế bào chất (cytoplasma ) • Các đoạn dsRNA sợi kép cắt enzyme Dicer tạo đoạn RNA ngắn ( siRNA ) • Sau siRNA tháo xoắn táuc dụng enzyme helicase biến tính thành mạch đơn gắng với phức hệ RISC Con đường hình thành máy can thiệp RNAi + mạch đơn này, mạch có đầu 5’ có hoạt lực với Agronauttrong phức hệ RISC gằn với phức hệ RISC => tạo phức hợp siRNA-RISC + Mạch lại đầu 5’ khơng có hoạt lực với Agronaut => không liên kết với RISC • Sự xuất mạch đơn siRNA hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (RISC* ) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.Nuôi tế bào: • Tế bào trùng Spodoptera frugiperda (Sf21) nuôi 27 °C chai nuôi tế bào 25cm có chứa ml mơi trường Grace’s (Sf21) có bổ sung 10 % foetal bovine serum 2.Tạo dsRNA • Đoạn DNA gen mục tiêu khuếch đại phương pháp PCR sử dụng trình tự mồi bảng dsRNA tổng hợp kit megascript T7 RNAi (Ambion) theo hướng dẫn nhà sản xuất 3.Baculovirus tái tổ hợp biểu gen VP28 WSSV • Tái tổ hợp AcMNPV-D/G-VP28 +Hệ thống biểu gen baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) sử dụng để biểu lúc green fluorescent protein (GFP) từ điểm p10 gen VP28 WSSV từ điểm polyhedrin tế bào Sf21 • Kỹ thuật xung điện, chuyển gen chiết tách bacmid DNA +1µl Fastbac-D/G-VP28 véctơ (300ng/ µl) đưa vào 50 μl tế bào khả nạp E coli DH10BTM (Invitrogen) kỹ thuật xung điện sử dụng thiết bị Bio-Rad MicroPulser + Tế bào E coli sau phục hồi ml môi trường Luria-Bertani (LB) ủ 2.5 37˚C máy lắc 225 vòng/phút + 100 µl tế bào vi khuẩn sau tán lên mặt đĩa thạch LB có chứa Bluo-gal (100 mg/ml), IPTG (40 mg/ml), kanamycin (50 mg/ml), tetracyline (10mg/ml) gentamycin (7 mg/ml) Đĩa thạch LB sau ủ 48 37˚C + Để xác định khuẩn lạc có chứa bacmid tái tổ hợp, khuẩn lạc màu trắng cấy chuyển sang đĩa thạch LB có chứa Bluo-gal (100 mg/ml), IPTG (40 mg/ml), kanamycin (50 mg/ml), tetracyline (10 mg/ml) gentamycin (7 mg/ml) ủ qua đêm 37˚C +Sau khuẩn lạc ni qua đêm ml mơi trường LB có chứa kanamycin (50 mg/ml) gentamycin (7 mg/ml) 37˚C máy lắc 225 vòng/phút +Dung dịch vi khuẩn ly tâm 2000 vòng/phút 15 phút °C rút bỏ mơi trường hồ tan 200 ml đệm lạnh GTE (50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl pH 8.0; 10 mM EDTA; 0.1 mg/ml RNase) +Sau cho vào 400 μl dung dịch NaOH/SDS solution (0.2 N NaOH; % SDS), 300 μl M sodium acetate, pH 5.5 để phút nước đá ly tâm 14,000 vòng/phút 10 phút + Phần dung dịch chuyển sang ống ependorft cho vào 600 μl isopropanol lạnh, trộn đều, ly tâm 14,000 vòng/phút 15 phút Phần dịch rút bỏ phần cặn rửa 500 μl dung dịch 70 % ethanol +DNA sau làm khơ nhiệt độ phòng 15 phút hồ tan 40 μl TE có chứa 20 μg/ml RNase A +Tái tổ hợp bacmid DNA xác định phương pháp PCR sử dụng mồi xuôi M13 (5’- GTTTTCCCAGTCACGAC-3’) mồi ngược gentamycin (5′GCCACCTACTCCCAACATC-3′) • Tải nạp bacmid DNA vào tế bào Sf21 để tạo baculovirus tái tổ hợp +Tế bào Sf21 ni đĩa 96 giếng có chứa ml môi trường Grace’s bổ sung 10 % FBS mật độ khoảng 0.5-1 x 106 tế bào/ml Bacmid DNA (1 mg/ml tế bào) chuyển nạp vào tế bào côn trùng dung dịch chuyển nạp Cellfectin (Invitrogen) theo hướng dẫn nhà sản xuất Ba ngày sau chuyển nạp, dung dịch nuôi tế bào côn trùng thu giữ ºC • Nhân vi-rút +Tế bào Sf21 cells (1.2 x 107 tế bào) nuôi chai 75 cm2 27˚C + Sau nuôi qua đêm, dung dịch nuôi tế bào rút bỏ tế bào gây nhiễm với ml mơi trường Grace’s có chứa 10 % FBS baculovirus tái tổ hợp mức độ nhiễm (multiplicity of infection-moi) 0.5 TCID50/tế bào +Sau tiếp tục ủ tế bào 27 ˚C lắc nhẹ 20 phút rút bỏ dung dịch gây nhiễm rửatế bào với ml mơi trường Grace’s có chứa 10 % FBS + Sau cho vào 12 ml môi trường ủ 27 ˚C từ 48-72 + Tế bào Sf21 sau chuyển sang ống nghiệm 10 ml li tâm 2,000 vòng/phút phút Phần dung dịch sau li tâm chuyển sang ống nghiệm giữ °C • Xác định hàm lượng pha lỗng tối đa (End-point dilution) +Dich chiết chứa vi-rút sau gây nhiễm với tế bào SF21 pha loãng từ 10-1 đến 10-9 ống eppendorf Sf21 + Sau 90 ml tế bào Sf21 (mật độ 1.5 x 106 tế bào/ml mơi trường Grace’s có bổ sung 10 % FBS) cho vào ống eppendorf có chứa vi-rút pha loãng +Tiếp đến, 10 ml dung dịch vi-rút/tế bào chia vào giếng đĩa 60 giếng Mỗi mật độ vi-rút lập lại lần (A đến F), mật độ thấp Dãy giếng cuối đĩa cho vào (10 ml/giếng) dung dịch tế bào không nhiễm vi-rút để làm đối chứng Đĩa ủ 3-7 ngày 27 °C hộp giữ ẩm + Hàm lượng pha loãng tối đa xác định cách quan sát hiệu ứng gây độc tế bào giếng kính hiển vi Liều gây nhiễm 50% tế bào (TCID50/ml) tính theo công thức Reed Muench (1938): TCID50/ml = 10(a+x)*200, đó: a = log n; n = độ pha loãng cao mà số tế bào nhiễm virút lớn 50 %; x = (b-50 %)/(b-c); b = phần trăm số tế bào nhiễm vi-rút giếng có độ pha loãng n; c = phần trăm số tế bào nhiễm vi-rút giếng có độ pha lỗng n gấp 10 lần độ pha loãng n 4.Tải nạp dsRNA vào tế bào trùng • dsRNA (0.5 mg/ml tế bào) tải nạp vào tế bào côn trùng (khoảng x 10 tế bào/ml) dung dịch tải nạp Cellfectin (Invitrogen) theo hướng dẫn nhà sản xuất 5.Xác định mức độ biểu gen • Hoạt tính GFP (protein phát huỳnh quang) tế bào trùng xác định kính hiển vi quỳnh quang sau 24 48 chuyển nạp véc tơ tái tổ hợp AcMNPVD/G-VP28 6.Đếm tế bào nhiễm vi-rút • Tế bào nhiễm vi-rút phần trăm số tế bào nhiễm (tế bào phát huỳnh quang) xác định sau 48 gây nhiễm máy đếm tế bào phát huỳnh quang (fluorescence-activated cell sorter-FACS calibur, Becton Dickinson) Số liệu xử lý phần mềm CellQuest 7.RT-PCR (Reverse transcriptase PCR) • RNA chiết tách từ tế bào Sf21 dung dịch TriZol (Invitrogen) cDNA tạo kit reverse transcriptase superscript III (Invitrogen) theo hướng dẫn nhà sản xuất cDNA (100 ng) sử dụng để phát gen VP28 WSSV RT-PCR sử dụng trình tự mồi bảng Kết Gây nhiễm tế bào côn trùng với AcMNPV-WSSV VP28 Hệ thống biểu gen baculovirus Bac-toBac sử dụng để tạo baculovirus tái tổ hợp biểu gen VP28 WSSV tế bào Sf21 Gen VP28 tạo dòng từ khởi điểm polyhedrin véc tơ pFastBac-D/GFP Véc tơ chứa gen GFP nằm sau khởi điểm p10 Baculovirus tái tổ hợp đặt tên AcMNPV-WSSV-VP28 biểu nhận nhờ gen phát huỳnh quang (GFP) Tế bào SF21 phát huỳnh quang sau gây nhiễm baculovirus tái tổ hợp AcMNPV-WSSV VP28 Hình bên trái quan sát kính hiển vi phản pha Hình bên phải quan sát thị trường với hình bên trái chế độ huỳnh quang 2.dsRNA can thiệp baculovirus tái tổ hợp biểu gen VP28 WSSV tế bào Sf21 Ảnh hưởng hàm lượng dsRNA lên nhiễm baculovirus tế bào côn trùng (1) đối chứng; (2) dsRNA-luc 100ng; (3) dsRNA-luc 150ng; (4) dsRNA-gp64 100ng; (5)dsRNA-gp64 150ng; (6) dsRNA-IE1 100ng; (7) dsRNA-IE1 50ng; (8) dsRNA-IE1 100ng; (9) dsRNA-IE1 150ng 3.dsRNA can thiệp biểu gen VP28 baculovirus tái tổ hợp Kết phân tích FACS tế bào Sf21 sau 48 nhiễm AcMNPV-GFP-VP28 a) đối chứng nhiễm baculovirus (AcMNPV-GFP-VP28); b) tế bào chuyển nạp dsRNA-luc nhiễm baculovirus; c) tế bào chuyển nạp dsRNA-AcMNPV-GP64 nhiễm baculovirus; d) tế bào chuyển nạp dsRNA-AcMNPV-IE1 nhiễm baculovirus; e) tế bào chuyển nạp dsRNA-VP28 nhiễm baculovirus Kết điện di gel 1.5% agarose mức độ phát RNA thông tin gen VP28 RT-PCR M0 thang DNA; 1) tế bào chuyển nạp nước nhiễm baculovirus; 2) tế bào chuyển nạp dsRNA-WSSV-VP28 nhiễm baculovirus; 3) tế bào chuyển nạp dsRNA-AcMNPV-IE1 nhiễm baculovirus; 4) tế bào chuyển nạp dsRNA-AcMNPVGP64 nhiễm baculovirus; 5) tế bào chuyển nạp dsRNA-luc nhiễm baculovirus; 6) tế bào chuyển nạp nước không nhiễm baculovirus Kết luận Kết nghiên cứu cho thấy hiệu ức chế gen VP28 WSSV gây bệnh tôm dsRNA điều kiện in vitro dsRNA có trình tự tương đồng với gen VP28 WSSV can thiệp từ 80-100% biểu gen VP28 biểu baculovirus tái tổ hợp Kết mở triển vọng cho nghiên cứu ứng dụng RNAi để phòng bệnh đốm trắng tơm nuôi ... Khái niệm RNAi “ RNA can thiệp ” ( RNAi ) hệ thống bên tế bào sống , giúp kiểm sốt gene hoạt động Đó đoạn RNA ngắn ức chế biểu gene có trình tự tương đồng với Các phân tử RNAi gây lên hiêu ứng: Ức... tăng cường phiên mã – Có thể RNAi có nhiều chức khác mà người chua khám phá hết, khám phá tương lai Các thành phần tham gia vào trinh can thiệp RNAi Quá trình can thiệp RNAi thực chế : + siRNA +... việc “ lập trình” biểu hệ gene quan trọng giới sinh vật RNAi LÊN GEN VP28 CỦA WSSV BIỂU HIỆN BẰNG BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP TRÊN TẾ BÀO CÔN TRÙNG RNAi sử dụng phổ biến để ức chế lây nhiễm vi-rút