Đang tải... (xem toàn văn)
1. Khái niệm Gen được hiểu chung nhất là 1 đoạn DNA (RNA) mang thông tin di truyền xác định cấu trúc 1 chuỗi peptid hoặc 1 loại RNA Kỹ thuật gen là tập hợp các kỹ thuật, thao tác trên gen (bộ gen), biến đổi có định hướng gưn (bộ gen) nhằm tạo gen, bộ gen mới hoặc tạo protein tái tổ hợp, hoặc đặc điểm tính trạng mới của sinh vật theo ý muốn của con người Kỹ thuật gen còn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gen,… Kỹ thuật gen là cơ sở nền của CNSH phân tử 2. Sơ đồ cấu trúc gen mang mã di truyền promoter vùng mang mã di truyền teminator (ORF) điềm khởi đầu phiên mã điểm kết thúc phiên mã TATA box: vị trí – 25 CAAT box: vị trí – 80 (khoảng 22bp) GC box: vị trí 100 (khoảng 20bp) Spacer DNA gồm nhiều đoạn (mỗi đoạn 1420 nucleotid) Vị trí khởi đầu phiên mã gồm khoảng 620 bp trước bộ ba mở đầu CAT Tín hiệu gắn đuôi poly A có trình tự AATAAA 3. Vị trí và sự phân bố của gen ở sinh vật eurokaryot gen nằm trên NST, trên các phân tử DNA trần trong ty thể, lạp thể ở sinh vật prokaryote gen nằm trên các phân tử DNA trong nhân, plasmid, ti thể gen phân bố trên NST hoặc phân tử DNA theo đường thẳng
KỸ THUẬT GEN CHƯƠNG 1: TỔNG QUÁT I Khái lược gen Khái niệm - Gen hiểu chung đoạn DNA (RNA) mang thông tin di truyền xác định cấu trúc chuỗi peptid loại RNA - Kỹ thuật gen tập hợp kỹ thuật, thao tác gen (bộ gen), biến đổi có định hướng gưn (bộ gen) nhằm tạo gen, gen tạo protein tái tổ hợp, đặc điểm tính trạng sinh vật theo ý muốn người - Kỹ thuật gen gọi kỹ thuật di truyền, công nghệ gen,… - Kỹ thuật gen sở CNSH phân tử Sơ đồ cấu trúc gen mang mã di truyền promoter vùng mang mã di truyền teminator (ORF) điềm khởi đầu phiên mã II điểm kết thúc phiên mã - TATA box: vị trí – 25 - CAAT box: vị trí – 80 (khoảng 22bp) - GC box: vị trí- 100 (khoảng 20bp) - Spacer DNA gồm nhiều đoạn (mỗi đoạn 14-20 nucleotid) - Vị trí khởi đầu phiên mã gồm khoảng 6-20 bp trước ba mở đầu CAT - Tín hiệu gắn poly A có trình tự AATAAA Vị trí phân bố gen - sinh vật eurokaryot gen nằm NST, phân tử DNA trần ty thể, lạp thể - sinh vật prokaryote gen nằm phân tử DNA nhân, plasmid, ti thể - gen phân bố NST phân tử DNA theo đường thẳng Phân loại gen - Có nhiều cách khác nhua tùy theo cấu trúc chức gen Phân loại a Dựa vào vật chất di truyền - Gen cấu trúc DNA mạch kép - Gen có cấu trúc DNA mạch đơn - Gen có cấu trúc RNA mạch đơn - Gen có cấu trúc RNA mạch kép b Dựa vào đặc điểm mang mã, không mang mã - Gen mã hóa Protein - Gen mã hóa RNA - Các đoạn đệm (gen đệm) - Các trình tự lặp - Các trình tự kết thúc - Các trình tự chưa rõ chức - Các đoạn dị nhiễm sắc thể c Dựa vào chức gen - Gen mã hóa protein - Gen nhảy - Gen giả d Dựa vào cấu trúc - Gen đồng - Gen khảm Chức gen Gen mã hóa Protein- gọi chung gen cấu trúc - Mang mã di truyền mã hóa protein khác thể sống - Chức cấu tạo: cấu trúc tế bào mô, quan - Chức miễn dịch - Chức điều hòa - Chức bảo vệ thê - Chức sinh sản di truyền - Chức thích nghi Gen mã hóa loại RNA - Chức tổng hợp Protein (Trna, RrNA) - Chức điều hòa hoạt động gen sau dịch mã - Chức bảo vệ tế bảoo Các đoạn DNA, RNA không mang mã - Promotor, operator, điều hòa hoạt động phiên mã - Itron - Telemere - Centromer - Các trình tự lặp (mini, micro, macro salltelite DNA) - III Các đoạn DNA, RNA chưa rõ chức - Điều hòa hoạt động gen sau dịch mã - Bảo vệ tế bào Các họ gen - Họ gen globin - Họ gen albumin - Họ gen histon Sơ lược gen - Bộ gen tập hợp toàn DNA tế bào, gồm gen nhân gen nhân - eurokaryote có cá gen tập hợp thành nhiễm sắc thể - prokaryote gen nhân dạng sợi vừa dạng vòng vừa dạng sợi Gen nhân gen nằm Plasmid So sánh gen sinh vật bậc cao bậc thấp CHƯƠNG 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT GEN I Các yếu tố cần thiết Vật liệu - DNA, RNA, tinh (khuôn, đoạn insert) Phương tiện - Các loại ez (giới hạn, tổng hợp DNA, RNA) - Phương tiện vận chuyển gen (vector tách dòng, vector biểu hiện) - Hệ thống biểu gen (tế bào chủ, động vật, thực vật) Thiết bị - Các loại máy: PCR, ổn nhiệt, ly tâm lạnh, … - Dụng cụ: hộp peptri, ống effendof, giấy lọc, màng lọc, … Con người - Người có hiểu biết nắm vững kỹ thuật II Các loại enzim cần thiết Enzym cắt đặc hiệu DNA (enzym giới hạn RE) - Enzym tổng hợp DNA: DNA polymerase (taq DNA polymerase, TuDNA polymerase, …) - Enzym phiên mã ngược (RT) - Enzym nối DNA lygase - Enzym phân hủy DNA (DNAase S1, exonuclase) - Enzym phân hủy RNA (RNAse H) Enzym giới hạn RE a Tên gọi IV V III - - Chữ đầu viết hoa tên chi, họ sinh vật, chữ viết thường tên loài, số la mã thứ tự chủng tách chiết enzym) Do hamilton Smith cộng phát 1970 Chia làm nhóm Nhóm 1: enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA cách vị trí nhận biết khoảng 1000bp Nhóm 2: enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA vị trí nhận biết Nhóm 3: enzym nhận biết vị trí đặc hiệu cắt phân tử DNA vị trí cách vị trí nhận biết 20bp Chỉ có RE2 thương mại hóa sử dụng kỹ thuật gen b Các kiểu cắt enzym giới hạn Cắt đầu cân Cắt đầu so le 5’ cuối Cắt đầu so le 3’ cuối c Vai trò enzym giới hạn kỹ thuật gen Nhận biết cắt đặc hiệu đoạn DNA xác Là sở cho mối ghép gen, không làm chức gen Lập đồ gen giới hạn, so sánh gen Enzym tổng hợp DNA Trong KTCT ta sử dụng nhiều ez tổng hợp DNA (DNA polymerase) Taq DNA polymerase Tu DNA polymerase Stoffel taq … Tách chiết tinh axit nucleic Nguyên tắc chung Thu mẫu sinh học: mảnh mô, dịch sinh học, Phá vỡ cấu trúc mơ, tế bào để giải phóng DNA (nghiền, đun sôi, …) Xử lý enzym protase để loại bỏ protein Xử lý enzym RNA để loại bỏ RNA Kết tủa DNA, thu nhận DNAnghiền t Kiểm tra độ tinh sạch, hàm lượng, chất lượng DNA Từ loại mẫu sinh học lựa chọn kỹ thuật tách chiết DNA khác a Tách DNA tổng số từ vi khuẩn Đun sôi cách thủy 15 phút, đặt nhanh đá phút - - Ly tâm 1200 vòng/ phút 10 phút Hút lấy dịch phía chạy điện di PCR b Tách chiết plasmid từ Ecoli Bước 1: thu mẫu: nuôi cấy vi khuẩn Ecoli chứa plasmid chúa gen VP6 Bước 2: phá tế bào Bước 3: thu nhận DNA Bước 4: kiểm tra kết tách chiết c Tách DNA tổng số từ động vật, thực vật theo CTAB Lấy mảnh mô (mô thịt) 1- mm cho vào tủ -85°C Nghiền nito lỏng dung dich EDTA, SDS, proteinase K để phá vỡ màng tế bào nhân, giải phóng DNA Sử dụng phenol, cloroform, isoamyl với tỷ lệ tương ứng 25:24:1 để loại bỏ protein, DNA cacbonhydrate Tủa DNA ethanol lạnh nồng độ 100% (ethanol mẫu 2.5:1) isoprapanol ( mẫu 1:1) Ly tâm thu DNA, rửa tủa 70% ethanol làm khơ tự nhiên để bay hết ethanol Hòa tan DNA pellet dung dịch TE cuối bảo quản tủ lạnh -4°C -20°C d Tách RNA tổng số Tách RNA tổng số từ mô lách gà: mổ gà thu nhận mô lách Lấy 1- gram mô lách cho vào tù -85°C Nghiền nito lỏng Thu tế bào vào ống efendof 1.5 ml, bổ sung 700µl trizol, đảo nhẹ phút Bổ sung 300µl cloroform đảo nhẹ phút Ly tâm 800 rpm 15 phút/ 4°C, loại bỏ dịch nổi, thu cặn Rửa cặn cồn lạnh (700µl ethanol 70%) để nhiệt độ phòng 10 phút Ly tâm 8000 vòng/ phút 4°C, loại bỏ dịch thu cặn Làm khơ 10 phút, bổ sung 50µl dung dịch DEPC Sử dụng sản phẩm để tạo c DNA bảo quản -80°C e Tách chiết RNA thông tin Tách chiết mRNA thường sử dụng mối oligo –dt Mẫu: để tủ -85oC 2-3 h sau nghiền nito lỏng => bột mịn Thêm 15µl dung dịch đệm bao gồm 20mM NaCl, 200mM Tris pH= 7.5, 1.5mM MgCl2 2% SDS, ur 60 phút 45oC Ly tâm 6000 vòng, 5-10 phút Thêm NaCl 0.5 M trộn kỹ IV - - Thêm mồi ologo- dT, lắc nhẹ vài ly tâm tốc độ 3000 vòng phút Rửa oligo với đệm thích hợp Ly tâm 3000 vòng phút sau rửa DECP, ly tâm thu m ARN Kỹ thuật nhân gen PCR PCR chuẩn PCR khuếch đại số lượng copy đoạn DNA định Ví dụ: Nhân gen NST Y để phát giới tính Quy trình PCR nhân gen VP6 từ plasmid Thành phần phản ứng PCR: 5mM dNTPs: 1µl + 10x buffer: 2.5µl + 5µM mồi xi: 1µl + 5µM mồi ngược: 1µl + DNA khn: 1µl + Taq DNA pol: 0.2µl + H2O: 18.3 µl + Tổng: 25µl a Thành phần phản ứng PCR sử dụng master mix PCR master mix: 12.5µl Primer: µl Plasmid: µl H2O PCR: 9.5 µl Tổng: 25 µl b Chu trình nhiệt chạy PCR: 94oC 94oC 58oC 72oC 72oC 4oC - Kiểm tra sản phẩm PCR Điện di gel agarose PCR ngược a PCR ngược: 30 s 1min 30s 90s lặp lại bước đến 35 lần 5-10 2-12 h - - - - - RT-PCR kỹ thuật PCR nhân gen từ m RNA, RNA gồm giai đoạn: phiên mã ngược từ mRNA, RNA, RNA virut tạo DNA; sử dụng DNA mạch kép làm khuôn, phản ứng tạo nên vơ số copy Có thể thực theo cách: Tạo cDNA ống effendoff, thực phản ứng PCR ống effendoff khác Tiến hành PCR ngược với giai đoạn ống effendoff b Quy trình RT-PCR nhân gen từ RNA virut bước Chuẩn bị dung dịch đệm Chuẩn bị RNA tinh hàm lượng 100mg/ µl Chuẩn bị thành phần phản ứng Chu trình nhiệt RT-PCR PCR lồng PCR lồng gồm laafn PCR Kết lần làm khuôn cho lần Nested PCR nhân đoạn gen đặc hiệu PCR đảo Do Jonathan Siliver cải tiến từ PCR chuẩn năm 1989, để nhân đoạn DNA lạ, chưa biết trình tự để thiết kế mồi Các bước thực PCR chuẩn Khác biệt bước chuẩn bị DNA khuôn Tách tinh DNA Trường hợp biết đoạn trình tự giữa: sử dụng loại RE DNA ligase để tạo template, có trình tự biết nằm đầu phân tử DNA, thiết kế mồi đặc hiệu cho PCR Trường hợp đoạn DNA trình tự sử dụng adapter biết trình tự, DNA ligase để gắn vào đầu phân tử DNA, thiết kế mồi đặc hiệu cho PCR PCR phức PCR phức kỹ thuật dử dụng để nhân đoạn exon gen sinh vật nhân chuẩn Gen chứa nhiều exon, có có nhiều cặp mồi Thực nhưu PCR chuẩn, kết PCR chạy điện di, đưa vào kích thước để tách riêng exon nhân Sử dụng DNA ligase adapter đặc hiệu để nối exon theo thứ tự gen PCR insitu Là kỹ thuật PCR để nhân gen, đoạn DNA mẫu tế bào, mơ khơng cần tách chiết tinh DNA - - - Được sử dụng phát virut Human papolovavirus, HIV Có nhiều tên gọi khác nhau: inall PCR, PCr insituhubridization Điều kiện ảnh hưởng: Kích thước khn, độ tinh khn Kích thước mồi, hàm lượn mồi, trình tự mồi Hàm lượng tỉ lệ loại nu tự do, đảm bảo cân đối, đủ hàm lượng cần thiết Hoạt tính độ bền nhiệt DNA polymerase, hàm lượng định hiệu PCR Chế độ nhiệt độ PCR, chu kì PCR để thời gian, nhiệt độ ko phù hợp hiệu Độ tinh hóa chất, nước, dụng cụ, … Dung dịch đệm phản ứng: MgCl2 Na+ Kỹ thuật Real time PCr Là kỹ thuật mà kết khuếch đại DNA đích thực hiển thị sau chu kì phản ứng PCR Gọi PCR thời gian thực hay định lượng Cho biết sản phẩm khuếch đại a Ngun tắc chung: Gồm mẫu dò gắn chất phát tín hiệu huỳnh quang đầu 5’, đầu 3’ gắn chất thu nhận tín hiệu Prohe thiết kế gắn với trình tự gen đích nằm mồi xi mồi ngược phản ứng Giai đoạn gắn mồi: prohe gắn đặc hiệu vào trình tự gen đích, tín hiệu huỳnh quang phát từ reporter bị quenher dập tắt giai đoạn kéo dài: mồi xuôi phản ứng kéo dài đến vị trí gắn prohe taq DNA polymerase phá hủy liên kết gắn prohe với trình tự đích đồng thời phá hủy prohe, làm cho reporter phát tín hiệu huỳnh quang, máy real time PCR thu nhận tín hiệu huỳnh quang tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với nồng độ prohe bị phá hủy Tín hiệu tăng lên gấp đôi sau chu kỳ khuếch đại Dựa vào tín hiệu huỳnh quang thu phần mềm tính nồng độ DNA ban đầu mẫu thử b Real time PCR gồm trình diễn đồng thời Nhân DNA phản ứng PCR Đo độ huỳnh quang tỷ lệ với số lượng đoạn DNA tạo thành c Ưu điểm Nhanh, độ nhạy cao Cho phép theo dõi tiến trình phản ứng biết lượng DNA tạo thành thời điểm - Không cần điện di - Thực nhiều mẫu - Hạn chế tạp nhiễm - Lượng mẫu biến động Kỹ thuật LAMP LAMP gi? - Kỹ thuật khuếch đại DNA đơn giản, nhanh, không PCR, không điện di Nguyên tắc chung - Sử dụng mồi thiết kế đặc biệt cho đoạn DNA gen đích - Khuếch đại phát DNA có cách ủ hỗn hợp mẫu, primer, DNA polymerase Đặc điểm - Không cách tách DNA mạch đôi thành mạch đơn - Phản ứng khuếch đại xảy liên tục điều kiện đẳng nhiệt 65o - Hiệu khuếch đại cao, lượng DNA khuếch đại đạt 10^910^10 lần 15-60 phút - Thiết kế cặp mồi nhận biết đoạn riêng biệt, LAMP khuếch đại đặc hiệu đoạn gen quan tâm - Giá thành thấp LAMP khơng cần hóa chất đặc biệt có thiết bị phù hợp Kỹ thuật điện di Điện di chiều - Kỹ thuật điện di tạo điện trường gel - Các đại phân tử DNA, RNA, Protein chạy từ cực âm sang cực dương có điện trường dòng điện a Các bước - Chuẩn bị đổ gel agar khn có sẵn - Để agase nóng chảy lò 3-5 - Lấy gel đặt vào thiết bị điện di - Chấm mẫu - Chạy điện di - Soi gel Điện di biến tính a Nguyên lý - Phương pháp điện di chiều cho biết thay đổi hàm lượng, biến đổi protein riêng rẽ hệ protein tế bào - V VI Các kết hợp nguyên lý khác Theo chiều thứ 1: phân tử protein phân tách dựa theo điểm đẳng điện nguyên lý hội tụ theo điểm đẳng điện - Theo chiều thứ 2: phân tử protein phân tách gel polymeacrylamide theo trọng lượng phân tử - pI giá trị pH điện tích bề mặt tổng số Protein Mỗi protein có giá trị pI xác định Do chúng có vị trí khác nên tạo thành đồ điện di Sự khác biệt điểm đẳng điện cở sở - gel IPG tạo giải gradient pH cố định, liên tục vaftanwg dần với chiều dài khác nhau, hạn chế di chuyển, trơi dạt hóa chất làm cho q trình ổn định - phân tích hình ảnh điện di chiều phần mềm VII Ly tâm lạnh - Ly tâm lạnh thiết bị thiết kỹ thuật gen - Cần ống ly tâm đặt vào roto cân đối - Đóng chặt đáy - Bật máy, đặt tốc độ, thời gian thích hợp VIII Xác định trình tự gen Nhóm cổ điển - Phương pháp phân hủy hóa học đặc hiệu - Phương pháp dideoxy- phương pháp sanger, Sangger, Smith coulson phát năm 1977 Nhóm phương pháp - Phương pháp metagenomic - Phương pháp màng nano Giải trình tự gen DNA theo Maxam gilbert a Nguyên lý chung - Sử dụng sợi DNA mạch đơn làm khuôn, đánh dấu P32 đầu 5’ mạch khuôn - Sử dụng phản ứng phân hủy hóa học đặc hiệu, tao mạch đơn nu - Điện di sản phẩm riêng rẽ, tập hợp kết để xác định trình tự gen b Xử lý hóa học - Dimetyl sunfat- cắt G - Acid pH= 2- cắt A, G - Hydrazim- cắt C, T - Hydrazim + NaCl- cắt C - Điện di b - IX Xác định trình tự gen theo F Sanger - Dựa vào nguyên tắc tổng hợp DNA tế bào sống - Sử dụng khuôn DNA mạch đơn làm DNA ϕ 174 - Sử dụng mồi, dNTP, DNA polymerase để tổng hợp DNA - Bổ sung tỷ lệ thích hợp dd NTP, tạo mạch đơn nu - Điện di sản phẩm riêng rẽ gel polyacrymid - Xác định trình tự gen a Thực hiện: - Biến tính DNA khn, điện di gel polyacrymid có ure để tách lấy mạch đơn làm khuôn - Bổ sung vào ống buffer, DNA khuôn, mồi, dNTP - Thêm vào dung dịch đệm 1% loại dNTP Xác định trình tự gen thiết bị sequences a Nguyên tắc chung - Có loại xác định trình tự gen bán tự động tự động - Dựa nguyên lý Sanger - Sử dụng đánh dấu huỳnh quang thay cho đánh dấu phóng xạ, loại dNTP đánh dấu màu khác - Tổng hợp mạch khn, so sánh, kiểm sốt sai xót - Tích hợp phần mềm tính tốn máy, cho độ xác cao b Các bước: - Chuẩn bị DNA khuôn tinh - Chuẩn bị dung dịch đệm theo protocal hãng - Chạy máy giải trình tự - Phân tích kết từ liệu máy tính, so sánh kết thu từ mạch đơn tổng hợp đưa kết Giải trình tự gen hệ - Xác định trình tự gen cũ, 800- 1000 nu/ phản ứng giải trình tự gen toàn gen cấy lúa người ta đến vài năm - Giải trình tự gen hệ lúc xác định đến vài trăm ngàn đến chục triệu trình tự ngắn/ phản ứng - Trình tự có kích thước vài chục nu 400 nu, trình tự ngắn nối thành trình tự liên tục thuật toán tin sinh học - Giải mã gennome lúa người ta vài ngày với chi phí thấp Kỹ thuật lai phân tử Kỹ thuật southernblottiny - Do Edward Southern phát minh năm 1975 Nguyên lý: Tách, tinh DNA sử dụng enzym giới hạn cắt thành đoạn nhỏ Điện di gel agarose để tách đoạn DNA theo kích thước Biến tính đoạn DNA gel đ kiềm Chuyể gel lên màng lai Thực phản ứng laii với mẫu dò, đánh dấu phóng xạ Kiểm tra kết b Các bước thực Chuẩn bị mẫu: chạy điện di, biến tính template Bloting: chuyển đoạn DNA biến tính lên màng nitrocellulo Lai Southern: cho màng lai vào túi lai, thực phản ứng lai với mẫu dò đánh dấu phóng xạ Hiện hình phóng xạ, xác định kết Kỹ thuật Nouthern blotting Là cải tiến từ kỹ thuật Southern blotting để lai RNA với mẫu dò DNA a Nguyên lý Tách tinh RNA thực giống kỹ thuật SB b Các bước thực Chuẩn bị mẫu RNA tinh sạch, chạy điện di Blotting: chuyển phân tử RNA lên màng lai nito Lai Nother: cho màng lai vào túi lai, thực phản ứng lai với mẫu DNA đánh dấu phóng xạ Hiện hình phóng xạ, xác định kết Kỹ thuật tái chế a Nguyên lý Không cần tách chiết DNA, RNA lai trực tiếp NST tế bào Thực phản ứng loại protein va RNA nhờ enzym protease RNAase Lai với mẫu dò đánh dấu phóng xạ đánh dấu huỳnh quang b Các bước thực Chuẩn bị mẫu tế bào Biến tính, tách DNA Biến tính mẫu dò đánh dấu huỳnh quang Lai Phát c Kính hiển vi thường sử dụng loại đầu dò a - - - X - - XI - - Đầu dò Ar laser đọc bước sóng 458- 514 nm Đầu dò Hene lase đọc bước sóng 516, 633 nm Đầu dò lase Diod đọc bước sóng 405 nm d Một số loại thuốc nhuộm huỳnh quang phổ biến CY2, CY3, CY5, Sybrgreen, Biotin Cy2 cho dải quang phổ màu xanh Cy3 cho dải quang phổ màu lục Cy5 cho dải quang phổ màu đỏ Các kỹ thuật phân tử khác Kỹ thuật RAPD Do William phát minh năm 1990 Wesh cộng hoàn thiện 1991 a Các bước bản: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA máy PCR Điện di gel agarose gel polyacrylamid Xác định hệ số đồng dạng di truyền tính theo cơng thức Sij = đó: Ni số vạch giống i Nj số vạch giống j Nij số vạch chung giống Kỹ thuật RFLP Kỹ thuật SSR Kỹ thuật DNA Microarray a Các bước Chọn mẫu Tách chiết tinh RNA, phiên mã ngược tạo c RNA Đánh dấu huỳnh quang c RNA Lai với mẫu dò Microarray Quét tia lase Đọc ảnh Kỹ thuật chuyển gen Khái niệm Chuyển gen tập hợp nhiều kỹ thuật khác nhằm gắn gen đoạn DNA vào gen tế bào sinh vật Chuyển gentruwcj tiếp Bằng phương pháp vật lý Biến nạp DNA trực tiếp: siêu âm, PEG Kỹ thuật điện xung Kỹ thuật vi tiêm Kỹ thuật bắn gen Chuyển gen gián tiếp - - - - - Chuyền gen nhờ Agrobascterium tumefascien Chuyển gen nhờ virut Các bước chuyển gen Chuẩn bị gen mục tiêu (gen đích): gen chịu hạn, chịu mặn, chịu sâu, …tách chiết, tinh sạch, tạo gen mục tiêu Tạo vetctor tái tổ hợp mang gen mục tiêu: chọn vector, gắn gen vào vector, thêm gen thị Thực kỹ thuật chuyển gen: biến nạp: tạo thể tái tổ hợp gen cần chuyển với gen tế bào chủ Sàng thể chuyển gen Kiểm tra hoạt tính gen thể chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen nhờ thiết bị siêu âm a Nguyên lý chung Làm cho gen cần chuyển tái tổ hợp với gen tế bào chủ Sàng lọc để lựa chọn thể chuyển gen b Các bước thực Lựa chọn tế bào đích loại vector mang gen cần chuyển Chọn tần số thời gian siêu âm thích hợp Sàng lọc tế bào chuyển gen ni cấy riêng Kiểm tra hoạt tính gen chuyển thể chuyển gen Kỹ thuật điện xung a Nguyên lý chung Tạo điều kiện thích hợp để DNA lạ dễ dàng vào tế bào chủ Tạo thể tái tổ hợp gen tế bào chủ với gen cần chuyển b Các bước thực Sử dụng enzim tạo tế bào trần, tạo huyền phù tế bào trần plasmid mang gen cần chuyển Sử dụng điện cao thời gian cực ngắn để tạo lỗ màng giúp DNA lạ dễ vào tế bào Phục hồi thành tế bào, sàng lọc tế bào chuyển gen nhờ gen thị Nuôi cấy tế bào, kiểm tra hoạt tính gen thể chuyển gen Chuyển gen kỹ thuật PEG a Nguyên lý chung Tạo lỗ màng tế bào giúp gen lạ dễ vào tế bào Tái tổ hợp gen lạ với gen tế bào chủ Sàng lọc, lựa chọn thể chuyển gen b Các bước thực - - - - Tách tế bào trần (sử dụng pectimase cellulose) Thu nhận tế bào trần ly tâm Treo tế bào trần mơi trường ni cấy thích hợp Bổ sung PEG DNA lạ Sàng lọc tế bào tái tổ hợp, phục hồi thành tế bào Kiểm tra hoạt động gen gen thị Chuyển gen kỹ thuật vi tiêm a Nguyên lý chung Đưa gen cần chuyển vào tế bào chủ Tạo điều kiện tái tổ hợp gen cần chuyển với gen tế bào chủ Sàng lọc để lựa chọn thể chuyển gen b Các bước thực Lựa chọn tế bào cần chuyển gen (R): trứng đơn bội n, hợp tử sau thụ tinh tế bào lưỡng bội 2n Hút bỏ nhân tế bào đích Hút lất nhân tế bào cho (D) bơm vào tế bào đích (R) Kích thích xung điện để tạo phơi sau cấy phơi vào tử cung “mẹ ni” Kiểm tra hoạt động gen thể chuyển gen Chuyển gen súng bắn gen a Nguyên lý chung Làm cho gen cần chuyển tái tổ hợp với gen tế bào Sàng lọc để lựa chọn thể chuyển gen b Các bước thực Lựa chọn tế bào đích Lựa chọn loại vector mang gen cần chuyển Chọn loại vi đạn, kích thước vi đạn, kích thước tế bào đích đầu nòng súng bắn gen Sàng lọc tế bào chuyển gen Nuôi cấy mô Kiểm tra hoạt động gen thể chuyển gen 10 Kỹ thuật chuyển gen sốc nhiệt a Nguyên lý chung Tạo lỗ màng tế bào giúp gen lạ dễ dàng vào tế bào Tái tổ hợp gen lạ với gen tế bào chủ b Các bước thực Nuôi tế bào khả biến môi trường dinh dưỡng thích hợp Bổ sung CaCl2 50mM plasmid tái tổ hợp có gen cần chuyển nhiệt độ 5oC 30 phút, tăng nhiệt độ lên đến 42oC phút, làm lạnh đến 4-5oC 30 giây - Sàng lọc tế bào chuyển gen gen thị maker màu thị kháng sinh - Kiểm tra hoạt động gen chuyển B KỸ THUẬT CHUYỂN GEN GIÁN TIẾP - Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium - Vi khuẩn gây khối u nhiều lạ thực vật mầm - Nó mang Tiplasmid 140-200kb - Plasmid vi khuẩn có đoạn T-DNA gồm gen mã hóa cuxin, opin, xitokinin, tạo khối u - Cải biến plasmid vi khuẩn cách cắt bỏ đoạn TDNA, gắn thêm đoạn p BR322 gen cần chuyển để tạo plasmid tái tổ hợp sử dụng làm vector chuyển gen thực vật I Thiết lập thư viện gen thư viện c DNA Thư viện gen Thư viện c DNA CHƯƠNG 3: TÁCH DÒNG GEN I Khái niệm - Tách dòng gen tách đoạn gen đích, gắn với vector tách dòng, chuyển vào tế bào khả biến tạo dòng tế bào khác nhau, dòng mang gen đích - Các kiểu tách dòng gen: a Tách dòng thực nghiệm: • Từ DNA gen • Từ m RNA RNA b Tách dòng ảo: tách dòng từ cở sở liệu biết II Tách dòng thực nghiệm Vector tách Vector tách dòng: - Là phân tử DNA mạch kép dạng vòng nhỏ, gắn đoạn DNA lạ, tạo số copy lớn Đặc điểm vector tách dòng: - Cho phép dễ cài gắn đoạn DNA lạ - Khả tái cao: tạo sổ lượng copy lớn - Kích thước nhỏ - Mang gen thị dễ nhận biết: thị màu kháng sinh - Không gây ảnh hưởng hoạt động tế bào chủ - a b c Cấu trúc: d Phân tử DNA mạch kép, dạng vòng Kích thước nhỏ, dễ vào tế bào Có điểm cắt đặc hiệu Re Cho phép cài đoạn DNA lạ Có trình tự tái ori Có gen thị: kháng sinh màu Các loại vector tách dòng - Loại vector Kích thước đoạn DNA gắn cài Plasmid 1-5 kb Phage 12-25 kb Phagemid 20-? Kb Cosmid 30-45 kb BAC 100- 300 kb YAC 1000kb HAC NST nhân tạo người Viral vector Các bước tách dòng thực nghiệm: bước a Bước 1: xác định tách DNA, sử dụng RE cắt tạo gen đích - Xác định xác nguồn mang gen đích - Tách chiết DNA từ vi khuẩn, sinh vật prokasypte sử dụng kỹ thuật khác - Gen đích nguồn gốc sinh vật bậc cao, cần sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược để tạo đoạnc DNA từ m RNA - Sử dụng loại RE phù hợp để cắt DNA, tạo đoạn DNA cần thiết (gen đích) b Bước 2: lựa chọn vector tách dòng, cắt mở vòng vector - Căn nguồn góc, kích thước gen đích loại tế bào chủ để lựa chọn loại vector tách dòng phù hợp - Sử dụng RE thích hợp, cắt mở vòng vector phù hợp đầu đoạn gen đích c Bước 3: tạo vector tái tổ hợp, sử dụng enzym nối DNA ligase - Nguyên liệu: DNA tinh sạch, PCR tạo lượng sản phẩm đủ lớn, sủ dụng RE để cắt tạo gen đích - Vetor tách dòng để mở rộng vòng RE - Tạo phản ứng nối gen đích với vector tách dòng DNA ligase Điện di kiểm tra kết tạo vector tái tổ hợp vector tái tổ hợp tạo cất giữ tủ lạnh sâu -80 đến -85oC để tiếp tục nghiên cứu d Bước 4: biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ - Tùy mục đích tạo dòng tái tổ hợp mà chọn tế bào chủ thích hợp - Với mục đích tách dòng gen, tạo dòng gen,… thường sử dụng chủng E.coli DH52, … tạo dòng gen mã hóa protein tái tổ hợp, sử dụng chủng biểu Ecoli BL21, nấm men saccaromices cerevisiae, … - Biến nạp: tùy thuộc vào loại tế bào chủ, sử dụng sốc nhiệt, siêu âm, bắn gen, … e Bước 5: sàng lọc chủng tái tổ hợp - Dựa vào gen kháng sinh, thị màu kháng thể - Dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp gọi dòng tái tổ hợp, ni cấy tủ lạnh Kỹ thuật biến nạp tách dòng thực nghiệm a Biến nạp vào Ecoli DH 52 sốc nhiệt - Tạo tế bào Ecoli khả biến - Biến nạp b Biến nạp vào tế bào nấm men xung điện - Chuẩn bị tế bào - Xung điện Tách dòng insilico: tách dòng ảo: bước CHƯƠNG 4: BIỂU HIỆN GEN I Khái niệm chung biểu gen - Là q trình chuyển đổi thơng tin di truyền gen thành protein đặc trưng đặc điểm, tính chất thể - Là phương thức trả lời tác động tác nhân nội bào điều kiện sống, đảm bảo tồn thích nghi thể lồi - Mỗi lồi sinh vật, cá thể có phương thức biểu gen đặc trưng, phù hợp giai đoạn phát triển tế bào thể - bướm, vòng đời từ trứng => sâu => nhộng => bướm, có đặc điểm hình thái, khác hồn tồn, phát triển từ trứng ban đầu có số lượng gen giống - biểu gen invitro: biểu gen nhân taojtheo mục đích người II Vector biểu gen Cấu trúc chung vector biểu gen - Vòng DNA mạch kép, có điểm cắt RE, ori - III - - - - plant DNA Có gen kháng sinh, gen thị màu Promotor mạnh vòng liên kết riboxom Bộ ba mở đầu ATG cách vùng liên kết riboxom nu xuôi Các yếu tố kết thúc phiên mã Một số loại vector biểu gen a Vector biểu gen baculo virus Là vector biểu mang gen đích vị trí tương ứng gen polyhedrin Baculovirus Tạo Bculovirus tái tổ hợp Gây nhiễm virus vào tằm sâu Nuôi cấy, thu nhận tinh protein tái tổ hợp b Vector biểu gen Ecoli Vector biểu gen p ET ưa chuộng sử dụng nhiều promotor T7 có vùng đa nối protein tái tổ hợp chuyển đến khoang chứa chất, dễ dàng tinh P tái tổ hợp nhờ đoạn His-Tag nằm trước đầu C protein, cảm ứng IPTG hiệu Vector p ET sử dụng chất cảm ứng IPTG- C9H18O5S Vector biểu gen vi khuẩn Bacillus Hệ vector hiểu có nhiều ưu điểm: Gen ngoại lai điều khiển promotor mạnh, có tính đặc hiệu cao, có chứa gro E promotor Bacillus, Iac Operator cảm ứng IPTG Có vùng đa cắt nối Trình tự samy Q giúp protein tiết mơi trường Hàm lượng protein tái tổ hợp đượ sinh 10-13 % Vector biểu nấm men Là gen lai plasmid vi khuẩn trình tự ori nấm men Gen kháng sinh vi khuẩn Các gen thị chọn lọc nấm men Biểu gen thực vật Cấu trúc promotor gen plant DNA enhancer Vector biểu tế bào động vật teminator III Thường sử dụng promotor virus động vật Promotor mạnh Gen kháng sinh để lựa chọn dòng tế bào : zeoan Các ori virus MCS Hệ thống biểu gen Các hệ thống biểu gen Hệ thống biểu Prokaryote Virus Eukaryote Đặc điểm hệ thống biểu gen a Trong virus Ưu điểm: Biết rõ đặc điểm di truyền cấu trúc gen Khả tạo sản phẩm cao, tăng trưởng nhanh: 8h Hiệu cao, giá thành hạ Chi phí cho cơng nghệ, hóa chất thấp Hạn chế Khó thực protein > 50kDa, khơng glycocin hóa, khơng cắt đoạn tín hiệu, khơng thay đổi cấu trúc sau dịch mã Không tạo liên kết disunfua S-S Một số chủng gây bệnh, protein endotocin liên kết màng tạo protein ngoại bào Khơng có chế cắt intron b Trong Baculovirus Ưu điểm Cho biểu protein kích thước > 50 kDa, thực phản ứng glucocin hóa xác, cắt chuỗi tín hiệu Hiệu giá thành thấp Sử dụng promotor mạnh, cho phép biểu protein người Được sử dụng nhiều thực tiễn Hạn chế: Phát triển chậm 10-15 ngày - - Tế bào chủ Ecoli, bacillus Baculovirus - Nấm nem puchia pastoris s cerevisiae - Tế bào S2 ruồi giấm - Tế bào động vật có vú - Thực vật - - IV - Môi trường nuôi cấy phức tạp c Nấm man S.cerevisiae Đã biết đầy đủ cấu trúc gen, FDA chứng nhận an toàn loại biểu gen loại vector biểu chủ yếu: dạng episom plasmid, vector cài nhập NST nhân tạo Biểu quy mơ > 10l Có thể biểu Protein kích thước > 50 kDa, tạo sản phẩm nhanh, hiệu suất cao Các protein glycosyl hóa, tiết ngồi tế bào mạnh Hình thành liên kết S-S, thay đổi cấu trúc protein Có thể tạo nhiều phức hợp Protein d Nấm men pichia Pastoris Biết rõ đặc điểm di truyền cấu trúc gen Sử dụng vector biểu Ecoli nấm men promotor AOX, có khả kiểm sốt đoạn DNA insert cao Tạo sản phẩm nhanh, hiệu suất cao: 50- 5000 mg/l Cho biểu protein kích thước > 50kDa Có thể thực phản ứng glycosyl hóa, cắt chuỗi tín hiệu Hình thành liên kết S-S, thay đổi cấu trúc protein Có chế cắt intron e Tế bào động vật có vú Ưu điểm Thường sử dụng CHO Sử dụng vector với promotor mạnh Cho biểu protein kích thước > 50kDa Phản ứng glycosyl hóa cắt chuỗi tín hiệu xác, ứng dụng sản xuất nhiều loại protein thích hợp Tránh độc tố VSV Tạo nên protein có cấu trúc khơng gian thích hợp Hạn chế: Chỉ biến nạp xung điện Thời gian sàng lọc lâu Nuôi cấy phức tạp, giá thành cao Một số kỹ thuật cần thiết biểu gen Kỹ thuật tạo vector biểu tái tổ hợp a Tạo vector từ gen đích tách dòng Lấy dòng tái tổ hợp giữ tủ lạnh -20oC, -80oC ni cấy mơi trường thích hợp Phá tế bào, ly tâm thu vector tách dòng tái tổ hợp - - - - V Chọn enzym giới hạn để cắt gen đích từ vector tách dòng, mở vòng vector biểu Chuẩn bị đệm cho phản ứng nối gen đích với vector biểu nhiệt độ, thời gian thích hợp để thực phản ứng nối lựa chọn vector biểu tái tổ hợp, điện di với thanhg DNA chuẩn, kiểm tra, thu vector biểu b từ mẫu chứa gen đích tách chiết tinh DNA, RNA PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen đích Chọn vector biểu hiện, chọn RE thích hợp cắt gen đích cắt mở vòng vector biểu Thực phản ứng nối gen đích vector biểu Lựa chọn vector biểu tái tổ hợp Biến nạp tạo dòng tế bào chủ vector biểu tái tổ hợp Chọn tế bào chủ biểu thích hợp Biến nạp vector biểu tái tổ hợp bào tế bào chủ: sốc nhiệt, xung điện, súng bắn gen, … Lựa chọn tế bào chủ biểu chứa vector biểu tái tổ hợp Ni cấy, tạo gen đích biểu Kỹ thuật sàng lọc chủng tái tổ hợp a Sàng lọc kháng sinh: Sử dụng vector kháng loại kháng sinh loại kháng sinh Ưu điểm: đơn giản, dễ làm Hạn chế: hiệu chọn lọc ko cao, xuất đột biến kháng thuốc b Sàng lọc thị màu Kết hợp sàng lọc kháng sinh thị màu cho hiệu cao X- gel: bị thủy phân chuyển từ không màu sang xanh c Sàng lọc kháng nguyên- kháng thể Các bước biểu gen Bước 1: tách dòng gen đích Bước 2: gắn gen đích với vector biểu hiện, tạo vector biểu tái tổ hợp Bước 3: biến nạp vector biểu tái tổ hợp vào tế bào chủ Bước 4: tách vector tái tổ hợp tế bào biến nạp để kiểm tra chiều gắn gen Bước 5: biến nạp vector biểu vào tế bào chủ để biểu Bước 6: nuôi cấy môi trường thích hợp Các điều kiện ảnh hưởng đến kết biểu protein Vector biểu Promotor: mạnh, yếu Cảm ứng, không cảm ứng: điều kiện cảm ứng Promotor mạnh: hiệu trình tổ hợp protein tái tổ hợp cao, chiếm 10-30%/ protein tổng số Promotor cảm ứng triệt để với chất cảm ứng Trong điều kiện chất cảm ứng: promotor bị ức chế hồn tồn Promotor cảm ứng nhiệt độ, có hiệu tổng hợp protein tái tổ hợp cao hơn, khả hình thành cấu trúc tốt Tế bào chủ Chất cảm ứng Loại chất cảm ứng sử dụng quan trọng tác động trực tiếp đến promotor trình nhân gen tế bào vật chủ Nồng độ chất cảm ứng ảnh hưởng đáng kết biểu Thời gian cảm ứng cần lựa chọn phù hợp với loại tế bào chủ, gen đích, promotor ảnh hưởng điều kiện mơi trường ni cấy ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng -> tổng hợp protein tái tổ hợp môi trường đảm bảo đủ chất dinh dưỡng số protein tái tổ hợp bị phân giải protease môi trường Giới hạn pH, nhiệt độ phù hợp với tế bào chủ số loại protein tái tổ hợp ổn định tổng hợp môi trường cao nấm men 1% pepton 2% Mơi trường có bổ sung thêm 5m EDTA làm tăng tính ổn định protein tái tổ hợp ảnh hưởng môi trường nuôi cấy thu tế bào thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến thời kỳ sinh trưởng tế bào chủ chọn thời gian nuôi cấy đảm bảo cho tế bào chủ pha sinh trưởng để đảm bảo thu lượng tế bào lớn Một số vấn đề cần lưu ý kỹ thuật biểu gen Protein < 30kDa nên chọn hệ thống biểu gen vi khuẩn Nếu Protein > 100kDa chọn biểu gen eukaryote Protein có q trình glycosyl hóa chọn hệ thống biểu CHO - - - - VI - - - Protein có q trình biến đổi sau dịch mã chọn hệ thống biểu nấm men, baculovirus, CHO, … Biểu Ecoli, protein tiết vào nhu chất màng nhầy, tiết vào môi trường, cần lưu ý cường độ tổng hợp protein, thêm số chất cảm ứng vào môi trường giai đoạn sau pha lỏng Chế độ nuôi cấy ... Kỹ thuật điện xung Kỹ thuật vi tiêm Kỹ thuật bắn gen Chuyển gen gián tiếp - - - - - Chuyền gen nhờ Agrobascterium tumefascien Chuyển gen nhờ virut Các bước chuyển gen Chuẩn bị gen mục tiêu (gen. .. động gen sau dịch mã - Bảo vệ tế bào Các họ gen - Họ gen globin - Họ gen albumin - Họ gen histon Sơ lược gen - Bộ gen tập hợp toàn DNA tế bào, gồm gen nhân gen ngồi nhân - eurokaryote có cá gen tập. .. dò Microarray Quét tia lase Đọc ảnh Kỹ thuật chuyển gen Khái niệm Chuyển gen tập hợp nhiều kỹ thuật khác nhằm gắn gen đoạn DNA vào gen tế bào sinh vật Chuyển gentruwcj tiếp Bằng phương pháp vật