Chương 13 ENZYME TRONG THỦY PHÂN PROTEIN

Chương 13 : ENZYME TRONG THỦY PHÂN PROTEIN13.1 GIỚI THIỆU Protein được sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp thực phẩm và có thể được tìm thấy trong nhiều loại nguyên

Chương 13 : ENZYME TRONG THỦY PHÂN PROTEIN

13.1 GIỚI THIỆU

Protein được sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp thực phẩm và có thể được tìm thấy trong nhiều loại nguyên liệu như sữa (casein và whey), lúa mì (gluten), đậu nành, thịt (gelatine và chiết xuất từ thịt), vv Những sản phẩm khác nhau chứa các protein có thuộc tính khác nhau Một trong những phương pháp để thay đổi các thuộc tính này là thủy phân protein thành các peptide nhỏ hơn Một ví dụ điển hình công nghệ này đã được sử dụng trong nhiều năm với các sản phẩm thay thế sữa mẹ ít gây dị ứng ,bằng cách sử dụng các protease để giảm gây dị ứng cho các protein

Các tính chất của protein thủy phân được điều chỉnh bằng việc lựa chọn các protease, xử

lý sơ bộ nguyên liệu, các thông số của quá trình thủy phân cũng như các chế biến phí sau của quá trình thủy phân Ngoài protease dùng để thủy phân protein thì còn có các ezyme khác nhưng hiện tại chúng chưa được sử dụng rộng rãi Ví dụ:

* Transglutaminase: bằng cách tạo một mối quan hệ isopeptide giữa glutamine và lysine được sử dụng trong việc thay đổi các protein trong một sản phẩm thực phẩm

* Lactase: xảy ra một phản ứng oxy hóa có thể hình thành liên kết giữatyrosine-tyrosine, hình thành cầu nối disulfua

* Peptidoglutaminase được sử dụng trong quá trình oxy hoá khử của glutamine với axit glutamic, nhưng cho đến nay chỉ trên quy mô phòng thí nghiệm

13.2 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN

Thủy phân là một quá trình hóa học trong đó một phân tử bị phân cắt khi có mặt của phân

tử nước Một phần của phân tử sau khi cắt sẽ tương tác với cation H+ từ phân tử nước, phần khác sẽ liên kết với anion OH- còn lại

Bản chất của quá trình thủy phân protein: là quá trình phá vỡ các liên kết peptide khi có mặt của nước Do liên kết peptide là liên kết bền, nên quá trình thủy phân cần có mặt chất xúc tác Các tác nhân xúc tác gồm:

• Tác nhân hóa học: acid (HCl) hay base (NaOH)

• Tác nhân hóa sinh học: enzyme thủy phân protein (protease)

Trong sản xuất thực phẩm, thường dùng phương pháp thủy phân bằng acid hay enzyme hay kết hợp chứ không dùng kiềm Bởi vì, khi sử dụng dụng kiềm sẽ xảy ra hiện tượng racemic hóa làm giảm giá trị dinh dưỡng của các acid amine Hiện nay, quá trình thủy phân protein được ứng dụng rộng rãi vào các quá trình sản xuất thực phẩm như sản xuất nước tương, các sản phẩm lên men

Trong phương pháp này, enzyme protease đóng vai trò thủy phân chính Chúng phân cắt các liên kết peptide theo hai cách (exopeptidase và endopeptidase) Vì vậy, tùy theo yêu cầu sản phẩm cuối cùng, mà có thể lựa chọn enzyme phù hợp

Protease được xúc tác gây ra phản ứng gắn kết một liên kết peptide trong protein được

Hình 13.1 sơ đồ phản ứng đối với protease được xúc tác (tại pH gần 6)

Phạm vi hay mức độ thủy phân được xác định bởi tỷ lệ phần trăm liên kết peptide thủy phân:

13.3 kiểm soát phản ứng thủy phân

Phương pháp chính xác nhất để đo phản ứng là phương pháp đo chỉ số pH Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp thẩm thấu để giám sát qua trình phản ứng Tuy nhiên phải mất thời gian đẻ lấy được kết quả

Bảng 13-1 Các phương pháp đo lường mức độ thủy phân

Nguyên lý của phương pháp Độ pH

Dựa trên thành lập nhóm

amin

với các nhóm amin chính để thành lập một hợp chất có màu thơm

6

c axit phản ứng với các nhóm amin để tạo thành một hợp chất có thể phát hiện màu

7,8

nhóm amin để tạo thành một 7

hợp chất có thể phát hiện màu

Dựa trên sự điều chỉnh

acid

Độ PH Giữ ổn định pH trong quá

Chuẩn độ pH Chuẩn axit được hình thành

trong quá trình thủy phân

5.5 - 8

Thay đổi độ pH Thực hiện theo pH trong

quá trình thủy phân 9

Căn cứ vào tính chất khác

với chất khô hòa tan

7

Chỉ số TCA Lượng peptide hòa tan trong

axit trioaxetic

7

Độ dài chuỗi Peptit Phương pháp HPLC dựa

trên sắc ký thẩm thấu gel

Theo độ nhớt sự thay đổi độ nhớt trong

suốt quá trình thủy phân 7

Một số phương pháp dùng để phân tích sự ảnh hưởng giữa mức độ thủy phân và tính chất của protein trong nó Ví dụ, việc thay đổi độ nhớt , độ nhớt thường giảm khi thủy phân protein , protein trở nên hòa tan, mà có thể đo bằng nitơ hòa tan, chỉ số TCA và brix Những tính năng này rất quan trọng đối với nhiều ứng dụng, nhưng việc sử dụng sự thay đổi tính chất vật lý để kiểm soát quá trình là hoàn toàn không chính xác

Các enzyme trong biến đổi protein

Hình 13.2 Ví dụ đường cong thủy phân theo dõi độ thẩm thấu và độ pH

13.4 Proteases (Như)

Protease được phân loại theo nguồn gốc xuất xứ (vi sinh vật, động vật, thực vật), ), Các vị trí chúng thủy phân protein (endo- hoặc exo-peptidase) và bản chất của các vị trí xúc tác(serine protease, metallo protease, aspartic protease) Các protease trên thị trường khác nhau về độ tinh khiết

Trong Bảng 13.2, một số các protease điển hình có sẵn được thể hiện cùng với một mô tả

về đặc điểm của chúng Do sự khác biệt về đặc trưng của các enzyme, dẫn đến peptide cũng khác nhau rất nhiều

13.3 Phân bố trọng lượng phân tử cho thủy phân whey protein với DH 4% sản xuất bởi protease phẩm khác nhau (a) trypsin từ tụy lợn, (b) glutamic acid cụ thể protease từ vi khuẩn Bacillus, (c) aspartic

13,4 phân bố trọng lượng phân tử cho thủy phân whey protein với DH 8% sản xuất bởi trypsin

13.5 TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN THỦY PHÂN

13.5.1 Hương vị.

Một trong những đặc tính quan trọng nhất cho thực phẩm là hương vị Một vài trường hợp người tiêu dùng sẽ không mua sản phẩm mà họ không thích Khi mà họ tin rằng lợi ích mà họ nhận được là bất lợi khi sản phẩm được tiêu thụ

Protein nguyên thủy là không vị ở dạng tinh khiết Khi protein được thủy phân có hai tác dụng chính tạo nên vị Một là tiền tố của các thành phần hương vị 'ẩn' trong cấu trúc protein, được tạo thành khi các protein được thủy phân Hai là sự hình thành các peptide nhỏ có hàm lượng cao của các axit amin kỵ nước có xu hướng tạo ra vị cay, đắng…

Hình 13.5 Mô tả định tính về sự gia tăng vị đắng

trong những nguyên liệu thủy phân protein khác

nhau

Thủy phân peptide riêng lẻ, nhưng là vấn đề với

nhiều khía cạnh Được đề cập đi theo những biến số

chính cho kiểm soát vị đắng

1 Tính kỵ nước trung bình của protein thủy phân ,

tính kỵ nước cao có khả năng dẫn đến vị đắng cao

2 Mức độ thủy phân ảnh hưởng cả 2 nồng độ peptide kỵ nước tan và độ dài của chúng

3 Đặc trưng của enzim là xác định xem liệu aa cuối là kỵ nước hay ưa nước

4 Tách thủy phân, trong đó có thể loại bỏ một phần của vị đắng nếu aa/peptide kỵ nước loại bỏ bởi những lắng đọng ở pH thích hợp

5 Che đậy vị đắng như một cách để giảm thiểu

chúng

Hình 13.6 Mô tả định tính về gia tăng vị đắng

trong thủy phân protein sang protease khác

Vị đắng là khác nhau ở nguồn protein khác nhau Vị đắng được sắp xếp theo thứ tự gelatin< thịt< cá <đậu < whey< đậu nành< casein Đây là mô tả rất tổng quát , khách quan Theo nghiên cứu gần đây , Pedrosa điều tra vị ngon của những công thức thức ăn dành cho em bé, dựa trên thủy phân protein và nhận thấy mùi của những công thức dựa trên việc trộn protein tốt hơn dùng protein đơn

Ngăn ngừa vị đắng bằng cách lựa chọn loại protease và điều kiện hoạt động của quy trình thủy phân Hạn chế sự gia tăng mức độ thủy phân để loại bỏ vị đắng ở mức độ thủy phân cao: ở 15% vị đắng được giảm, gia tăng vị brothy gây ra bởi aa tự do và peptide ngắn

Nước tương có đượclà nhờ hoạt tính enzim , lên men và protein được thủy phân với mức độ thủy phân khoảng 70% với sự có mặt của nhiều aa tự do Để thủy phân protein thực vật thường đun sôi nguyên liệu có protein trong acid mạnh HCL và mức độ thủy phân cao

Biểu đồ thể hiện tính tan và pH của casein tự

nhiên và staphylococus aureus Tính tan được

thể hiện theo % protein tổng trong dung dịch

Casein- hình tròn, mức độ thủy phân 2%- hình

vuông, mức độ thủy phân 6%- hình tam giác

Nếu vị đắng không thể bị loại bỏ bằng những

cách khác nó có thể sẽ được giấuđi, nhờ một vài

thành phần trong thực phẩm , trong đó peptide

được sử dụng, thành phần giúp che đậy vị đắng

Citric và acid malic và hỗn hợp của chúng là

mentioned Hoặc sử dụng cyclodextrins Cyclodextrin có hh́nh dạng giống và peptide có

xu hướng che giấu một phần kỵ nước của chúng trong cấu trúc vòng bên trong của phân

tử cuclodextrin, kết quả vị đắng thấp.Tamira cũng đã thảo luận việc sử dụng tinh bột và protein như whey protein tập trung cho các mục đích tương tự

13.5.2 Tính tan

Protein tự nhiên có tính tan khác nhau, phụ thuộc các yếu tố khác, có thể dựa vào độ

pH của dung dịch

Hình 13.7 : Sự ảnh hưởng của thủy phân casein với mức độ thủy phân 2% và 6,7% vào khả năng hòa tan protein và so sánh điều này với casein tự nhiên mà không hòa tan ở pH đẳng điện của nó(4,5)

Tính tan của casein gia tăng đáng kể , nhưng pH tại tính tan thấp nhất đang thay đổi đi lên Đường cong có thêm nhiều thông tin: số lượng casein tan tại isoelectric pH không lớn hơn khoảng 50%, từ mức độ thủy phân 2%-6,7%

13.5.3 Độ nhớt

Thông thường quá trình thủy phân protein gây giảm độ nhớt của dung dịch protein Độ nhớt của dung dịch gelatin giảm dần với sự gia tăng DH lên đến 7% Protein đậu nành phản ứng rất khác nhau, như độ nhớt giảm đáng kể ngay cả ở DH = 3% và duy trì ổn định ở mức DH cao hơn Đối với protein gluten trong bắp, độ nhớt tăng vọt trong thời gian thủy phân với Neutrase Gelatin là một loại protein đồng nhất, và gelatin thủy phân

có một sự tương quan giữa chiều dài chuỗi peptide và độ nhớt Protein đậu nành là một hỗn hợp không đồng nhất của các hạt protein ít tan

Có một protease đặc biệt có ảnh hưởng tới độ

nhớt khi thủy phân protein.Trong quá trình thủy

phân whey protein tăng độ nhớt mô tả trong

hình 13.9 Độ nhớt ở mức thấp trong thời gian

thủy phân cho đến khi DH 4%, tiếp theo là một

sự gia tăng dốc cho đến khi DH 6%, sau đó độ

nhớt giảm một lần nữa Có ý kiến cho rằng độ

nhớt cao được gây ra bởi sự kết hợp của các

peptide gây ra một sự đông tụ

Hình 13.9 Độ nhớt của thủy phân whey protein

được sản xuất bởi một axit

glutamic-endoprotease đặc biệt

13.5.4 Nhũ tương hóa (Thúy Ngân)

Protein có nguồn gốc như casein, đậu nành và whey protein được sử dụng rộng rãi như

chất nhũ hoá trong ngành công nghiệp thực phẩm Khi thủy phân, tính chất nhũ hoá của

nó được thay đổi

Trong một nghiên cứu của Adler- Nissen và

Olsen Nghiên cứu cho thấy khả năng nhũ hoá

đạt tối đa tại DH khác nhau của hai enzyme

Alcalase tối đa là tại DH = 5%, trong khi

Neutrase có khả năng nhũ hóa cao trong phạm vi

DH từ 2-6, nhưng vẫn thấp hơn mức tối đa

Alcalase (Hình 13.10)

Hình 13.10 Khả năng nhũ hóa của protein đậu nành tại DH khác nhau được sản xuất

bằng cách thủy phân với Alcalase và Neutrase

Alcalase và Neutrase sử dụng protein đậu nành và caseinate Họ phát hiện ra ngay khi khả năng nhũ hoá tăng là kết quả của quá trình thủy phân, không có cải thiện sự ổn định của nhũ tương so với các protein chưa bị thủy phân

Thủy phân whey protein lên đến DH 20%

khi sử dụng Alcalase và Protamex, hai

endoproteases Bacillus, cho thấy sự khác

biệt chủ yếu là ở sự ổn định nhũ tương Dữ

liệu được trình bày trong Hình 13.11, cho

thấy một sự suy giảm trong cả hai khả năng

nhũ hóa và ổn định tăng DH trên 5% và sự

ổn định của nhũ tương Protamex- thủy

phân tốt hơn đáng kể so với khi sử dụng

Alcalase

Bảng 13.11 Khả năng nhũ hóa và ổn định

của thủy phân whey protein với Alcalase và Protamex

Van der Ven đã thực hiện một nghiên cứu sâu rộng về thủy phân casein và whey protein được sản xuất bởi 11 hướng khác nhau Các thủy phân đại diện cho một phạm vi DH từ 1% đến 24% Họ kết luận rằng không có mối quan hệ trực tiếp giữa DH và làm sữa bất động

13.5.5 Sự tạo bọt

Thủy phân là đặc tính quan trọng đã được

đề nghị cho việc làm lòng trắng trứng thay

thế từ protein soya.Isolate trong protein

soya ở DH là 3% làm bởi Alcalase có thể sử

dụng (hình 13.12)

Ở DH rất thấp, khoảng 0,5% cho chức

năng tối ưu Enzyme được sử dụng là

M.miehei protease, ngoài ra nó còn được

biết đến như là vi khuẩn men dịch vị để sản xuất pho mát

DH cao ảnh hưởng tiêu cực đến tính tạo bọt Điều này đã được ghi nhận bởi Severin và Xia,người đã thử nghiệm whey Protein thủy phân

Họ cũng nhận thấy có những khác biệt lớn trong proterties tạo bọt, phụ thuộc vào loại enzyme được sử dụng Họ đã thử nghiệm Alcalase và Protamex và tìm thấy các thuộc tính của hydrolyzates thực hiện với Protamex là tốt nhất Tuy nhiên, thủy phân bằng enzyme làm giảm rõ rệt sự ổn định của hệ bọt ở DH 5% Và ở nơi hiệu suất tối ưu của thủy phân tức DH từ 0 – 5% thì kết qua

không như mong đợi, theo trình bày của

hình 13.12

Trong một trình bày khác về sự khác nhau

giữa sử dụng Alcalase và Neutrase, đã bị

thủy phân được thực hiện với Alcalase có 12

– lần cải thiện phình bọt, trong khi với

neutrase chỉ có bốn lần, thu được kết quả tốt

hơn với protein không thủy phân Trong cả

hai trường hợp, việc phình bọt tối đa xảy ra

tại DH 3-4%.40 (hình 13.13)

dài của bọt với whey protein hydrozates cũng thấp hơn so với protein nguyên vẹn

13.5.6 Gelling

Việc sử dụng gel cổ điển để phân

giải protein trong thực phẩm là sản

xuất pho mát Sự phân giải protein

κ-casein trong sữa được thủy phân

ở liên kết peptide Phe105 – Met106

gây ra làm mixen casein thay đổi,

do đó làm đặc lại Một trong những

sản phẩm phản ứng là casein vĩ mô

peptide (CMP), được cho vào vào

whey

Whey đã được tìm thấy có đặc tính có thể được sử dụng bằng cách cách ly CMP và trong các sản phẩm thực phẩm chức năng Thay vì sản xuất pho mát từ sữa đông, nó có thể được sử dụng để sản xuất men dịch vị casein Trong trường hợp này, sữa đông được làm nóng, nó nhận gel và tạo các whey, tiếp theo là casein khô

Việc sử dụng protease cũng đã được đề nghị cho đông máu protein soya44-46

Trypsin, papain, pronase và protease từ Streptomces griseus đều tạo gell của whey

protein DH cho keo là 27,1% đối với trypsin, 23,1% cho papain, 28,2% cho pronase và

15,6% cho các protease S griseus.47 To và cộng sự 48 phát hiện ra rằng pepsin đã cải thiện độ bền gel của whey protein nhưng DH thấp

13.5.7: Chất gây dị ứng trong thực phẩm

Công nghệ ngày nay đã tạo ra những sản phẩm có thể thay thế được nguồn sữa mẹ và có thể dùng được cho những trẻ em bị dị ứng hoặc không thể hấp thụ những sản phẩm từ sữa

bò 2 dạng trẻ em này cần có những sản phẩm phù hợp với tình trạng của mình Dạng thứ

1 (trẻ em bị dị ứng với sản phẩm làm từ sữa bò) cần những sản phẩm mà chất protein được thủy phân hoàn toàn Trong khi dạng thứ 2 có thể sử dụng các sản phẩm có lượng

DH thấp hơn thế để giảm việc bị dị ứng

Thành phần B-lactoglobulin có hàm lượng cao trong sữa bò (khoảng 9.8% ở sữa protein) nhưng trong sữa người thì lại hoàn toàn ko có Số đông những người bị dị ứng với sữa protein, có đến khoảng 60-80% bị dị ứng với thành phần B-lactoglobulin, 60% bị dị ứng với casein, 50% với alpha-lactalbumin và 50% với huyết thanh albumin Trong các tài liệu, sự nỗ lực của công nghệ trong việc giảm sự dị ứng thường tập trung nhiều ở các chất proteins và caseins bởi vì có rất nhiều loại protein có trong thành phần thức ăn của trẻ nhỏ Những nghiên cứu ngày nay cho thấy lớp whey này tốt hơn các hợp chất amino acid Malmoud và các đồng nghiệp đã phát hiện được sự suy giảm kháng nguyên của casein bằng cách dùng protease ở tụy Họ tiến hành đo hoạt độ miễn dịch của casein trong lúc tăng dần hiệu suất của quá trình thủy phân lên gần 70%

13.5.8: Các peptides có hoạt tính sinh học (Văn Long)

Từ nhiều năm nay việc sử dụng các peptides như là 1 thành phần sinh học Như về sữa, 1 lượng lớn peptides với các ứng dụng về mặt sinh học khác nhau đã được tách ra và phân loại tính chất Sexelin tổng hợp toàn bộ các loại peptides hoạt tính có trong sữa bò và được phân loại theo từng tính năng như: peptides chống tăng huyết áp, peptides giúp cơ đối vận, peptides kháng khuẩn, peptides mang tính vô cơ và peptides giúp giảm áp lực Peptides có nhiều trong casein và sữa đặc protein Trong cấu trúc, peptides có thể được chuyển thể từ các hoạt động của enzyme trong hệ thống tiêu hóa hoặc cũng có thể là kết quả axit lactic trong quá trình lên men diễn ra trong ruột

Công nghệ được áp dụng vào quy trình sản xuất vitro của peptides hoạt tính cần nguyên liệu, thành phần gốc nguyên chất và sự chọn lựa kĩ càng các chất protease