f Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng GVHD T S Đỗ Biên Cương Giới thiệu chung về enzyme papain Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng Kết luận Giới thiệu chung[.]
Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng GVHD: T.S Đỗ Biên Cương Giới thiệu chung enzyme papain Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng Kết luận Giới thiệu chung enzyme papain Nguồn gốc • Papain (EC 3.4.22.3) thuộc họ enzyme protease thủy phân protein • Là cysteine protease ( sulfhydryl) biết đến nhiều phân lập lần vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya) • Trong nhựa đu đủ ngồi enzyme papain cịn có loại protease khác chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase số enzyme khác Cấu tạo hóa học • Là endoprotease có chứa 16% N 1.2% S • Mạch polipetide gồm 212 axit amin khơng có chứa methionine • Phân tử lượng M= 23 350 Da • Đầu N isoleucine, đầu C asparagine, có gốc cysteine tạo thành cầu disulfur vị trí 22-63, 56-95, 153-200 khơng có chức sinh học, làm tăng tính bền vững cấu trúc nhóm –SH tự vị trí 25 Cầu đisulfur Phân tử SH tự Cấu trúc khơng gianu trúc khơng gian • Mạch bị gấp thành hai phần riêng biệt khe, trung tâm hoạt động nằm khe • Phần xoắn anpha chiếm 20% tồn enzyme + Phía trái: xoắn anpha + Phía phải : xoắn anpha • Có hai nhân kị nước • Dạng hình cầu với kích thước 36.48.36 A • Hoạt tính papain dựa hai tâm hoạt động Cys25 His159 • Khoảng pH hoạt động papain rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào chất • Khi chất casein hoạt tính tối ưu papain vùng pH từ 5.7 – 7.0 nhiệt độ thích hợp 50 – 570C Trung tâm hoạt độngt độngng Gồm có nhóm –SH cysteine 25 vàm có nhóm –SH cysteine 25 vàa cysteine 25 nitrogen bậc histidine 159 Bên c cysteine 25 vàa histidine 159 Bên cạt độngnh nhóm imidazole cysteine 25 vàa His 159 liên kết với Asp 175 liên kết t với Asp 175 liên kết i Asp 175 liên kết i liên kết với Asp 175 liên kết t hydrogen Vùng tâm hoạt độngt độngng cysteine 25 vàa papain chứa mạch polypeptide với cáca mạt độngch polypeptide với Asp 175 liên kết i amino acid là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys Phản ứng hóa học papain Thủy phân protein => polypeptide amino acid, đóng vai trị vừa endopeptidase vừa exopeptidase Thể hoạt tính xúc tác –SH trạng thái tự => sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain sang trạng thái hoạt động TTHĐ có tính khử => chất hoạt hóa chất có tính khử như: cysteine, glytation aicd, hdrocyanic Bất hoạt papain: + Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) chất oxy hóa như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine hợp chất disufur khác => Chúng tác dụng với –SH TTHD => phá vỡ cấu trúc TTHĐ + Papain bị bất hoạt thuận nghịch khơng khí, cysteine nồng độ thấp + Papain tác dụng với chloromethul cetone Phe Lys hồn tồn hoạt tính Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác papain Nhiệt độ: Chịu nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khơ papain khơng bị biến tính 1000C Ở dạng dung dịch papain bị hoạt tính sau 30 phút 82.50C nhiệt độ tăng cao (>1000C) bị hồn tồn hoạt tính kể thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch pH: Hoạt động khoảng pH tương đối rộng (4.5-8.5) dễ biến tính mơi trường acid có pH < 4.5 mơi trường kiềm mạnh có pH > 12 Khi phản ứng với chất tùy thuộc vào chất chất mà pH tối ưu khác Dung môi: : Papain không thay đổi độ quay quang học dung môi methanol 70% không thay đổi độ nhớt dung môi methanol 50% Các chất gây biến tính mạnh TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch độ quay quang học hoạt tính papain Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng Bánh dầu đậu phộng gì? • Là loại bánh làm sau ép dầu đậu phộng, xác phần bã cịn lại thừa làm thành miếng bánh tròn Sau ép xong máy ép thủy lực pitton hay dụng cụ ép dầu (hay gọi bọng gỗ) gom phần bã thừa để làm thành miếng bánh tròn • Bên bánh dầu đậu phộng có chứa nhiều loại chất khoáng khác nhau, khoảng 40% đạm hữu nhiều loại vitamin có ích cho vật ni trồng • Tác dụng + Dùng làm phân bón hữu để giúp cho trồng phát triển nhanh, đồng đều, an toàn sạch, cho suất thu hoạch cao + Dùng làm thức ăn cho gia súc chủ yếu, làm thức ăn cho vật ni nhà chó, mèo, chim… Quy trình Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành Thu nhậc histidine 159 Bên n enzyme papain từ nhựa trái đu đủ nhựa trái đu đủa trái đu đủa cysteine 25 - Khảo sát điều kiện thu nhận enzyme papaino sát điều kiện thu nhận enzyme papainu kiện thu nhận enzyme papainn thu nhậc histidine 159 Bên n enzyme papain - Đ nh lượng hoạt tính enzyme papain sau giai đoạn tinh chế.ng hoạt độngt tính cysteine 25 vàa enzyme papain sau giai đoạn tinh chế.i giai đoạt độngn tinh chết với Asp 175 liên kết - Khảo sát điều kiện thu nhận enzyme papaino sát sựa trái đu đủ biết với Asp 175 liên kết n đổi lượng hoạt tính enzyme papain theo thời gian.i lượng hoạt tính enzyme papain sau giai đoạn tinh chế.ng hoạt độngt tính enzyme papain theo thời gian.i gian - Khảo sát điều kiện thu nhận enzyme papaino sát yết với Asp 175 liên kết u tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain ảo sát điều kiện thu nhận enzyme papainnh hưởi liên kết ng đết với Asp 175 liên kết n hoạt độngt tính enzyme papain Khảo sát điều kiện thu nhận enzyme papaino sát phảo sát điều kiện thu nhận enzyme papainn ứa mạch polypeptide với cácng thủa cysteine 25 vày phân bánh dầu đậu phộngu đậc histidine 159 Bên u phộngng - Xác đ nh hàm lượng hoạt tính enzyme papain sau giai đoạn tinh chế.ng đạt độngm formol đạt độngm amoniac theo thời gian.i gian phảo sát điều kiện thu nhận enzyme papainn ứa mạch polypeptide với cácng - Khảo sát điều kiện thu nhận enzyme papaino sát sựa trái đu đủ thay đổi lượng hoạt tính enzyme papain theo thời gian.i hàm lượng hoạt tính enzyme papain sau giai đoạn tinh chế.ng xúc tác, pH nhiện thu nhận enzyme papaint động ảo sát điều kiện thu nhận enzyme papainnh hưởi liên kết ng đết với Asp 175 liên kết n thu nhận enzyme papainu suấu trúc không giant phảo sát điều kiện thu nhận enzyme papainn ứa mạch polypeptide với cácng thủa cysteine 25 vày phân Phương pháp nghiên cứu Vật liệu thí nghiệm: Bánh dầu đậu phộng: Mua cửa hàng thức ăn gia súc Mủ đu đủ: Thu nhận nhà vườn Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với nhân tố: pH, nhiệt độ, nồng độ chất thời gian thủy phân • Khảo sát pH tối ưu từ 8-10 • Khảo sát nhiệt độ tối ưu • Khảo sát tương tác nhiệt độ pH lên q trình thủy phân • Khảo sát tương tác nồng độ chất thời gian lên q trình thủy phân • Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung enzym vào giai đoạn khác lên hiệu suất thủy phân Kết thảo luận Kết khảo sát pH tối ưu => Cơ chất bánh dầu đậu nành papain hoạt động mạnh khoảng pH 6-7, thể hoạt tính thủy phân mạnh pH 7,0, tương ứng với hàm lượng đạm amin hiệu suất thủy phân nhận 11,60 mgN/g 15,67 %N Hoạt tính enzim thấp pH 4, 5, 8, 9, 10 => Có thể xem pH tối thích cho hoạt động papain chất bánh dầu đậu phộng 7,0 Kết khảo sát nhiệt độ tối ưu Þ Động bều kiện thu nhận enzyme papainn nhiện thu nhận enzyme papaint cysteine 25 vàa enzyme papain rộngng khoảo sát điều kiện thu nhận enzyme papainng 45ºC - 65ºC, thu nhận enzyme papainu suấu trúc không giant thủa cysteine 25 vày phân cao khác biện thu nhận enzyme papaint không ý nghĩa nhiệt a nhiện thu nhận enzyme papaint động Ở nhiệt độ thấp 4ºC 25ºC enzyme hoạt động yếu nhiện thu nhận enzyme papaint động thấu trúc không gianp 4ºC 25ºC enzyme hoạt độngt độngng yết với Asp 175 liên kết u n so với Asp 175 liên kết i ởi liên kết 75ºC 85ºC=> Papain enzyme rấu trúc không giant bều kiện thu nhận enzyme papainn nhiện thu nhận enzyme papaint Þ Nhiện thu nhận enzyme papaint động 55ºC nhiện thu nhận enzyme papaint động tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain.i ưu cho hoạt độngt độngng thủa cysteine 25 vày phân cysteine 25 vàa papain protein bánh dầu đậu phộngu đậc histidine 159 Bên u phộngng 3 K t khảo sát tương tác pH nhiệt độ lên hiệu suất thủy khả khảo sát tương tác pH nhiệt độ lên hiệu suất thủy o sát tương tác pH nhiệt độ lên hiệu suất thủy tương tác pH nhiệt độ lên hiệu suất thủy ng tác pH nhiệt độ lên hiệu suất thủy a pH nhiệt độ lên hiệu suất thủy t độ lên hiệu suất thủy lên hiệt độ lên hiệu suất thủy u suất thủy t thủy y phân protein bánh dầu đậu phộngu đậu phộngu phộ lên hiệu suất thủy ng Hện thu nhận enzyme papain số ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain tươn ng quan = 99,0365% => Þ Có th khẳng định điều kiện pH 7,0 nhiệt độ 55ºC điều kiện ng đ nh điều kiện thu nhận enzyme papainu kiện thu nhận enzyme papainn pH 7,0 nhiện thu nhận enzyme papaint động 55ºC điều kiện thu nhận enzyme papainu kiện thu nhận enzyme papainn tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain.i ưu cho hoạt độngt độngng thủa cysteine 25 vày phân cysteine 25 vàa enzyme papain lên protein bánh dầu đậu phộngu đậc histidine 159 Bên u phộngng Kết khảo sát tương tác chất thời gian lên trình thủy ph ân Kết khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung enzym vào giai đoạn khác lên hiệu suất thủy phân Þ Khơng có sựa trái đu đủ khác biện thu nhận enzyme papaint nhiệt a viện thu nhận enzyme papainc cho enzyme vào mộngt lúc hay bổi lượng hoạt tính enzyme papain theo thời gian sung enzyme vào từ nhựa trái đu đủng thời gian.i m khác trình thủa cysteine 25 vày phân Þ Hiện thu nhận enzyme papainu suấu trúc không giant thủa cysteine 25 vày phân tính theo phầu đậu phộngn trăm thu hồm có nhóm –SH cysteine 25 vài vậc histidine 159 Bên t chấu trúc không giant khô sau gam không tăng nhiệt a cho thấu trúc không giany phảo sát điều kiện thu nhận enzyme papainn ứa mạch polypeptide với cácng thủa cysteine 25 vày phân kết với Asp 175 liên kết t thúc, nhiên hàm lượng hoạt tính enzyme papain sau giai đoạn tinh chế.ng đ ạt độngm amin v n cịn tăng khơng cao peptid hịa tan v n đượng hoạt tính enzyme papain sau giai đoạn tinh chế.c tiết với Asp 175 liên kết p tục thủy c thủa cysteine 25 vày phân thành acid amin nết với Asp 175 liên kết u kéo dài thời gian.i gian, tổi lượng hoạt tính enzyme papain theo thời gian.ng phầu đậu phộngn trăm chấu trúc không giant khô hịa tan nhìn chung khơng đổi lượng hoạt tính enzyme papain theo thời gian.i Kết luận Papain hoạt động mạnh chất bánh dầu phộng điều kiện tối ưu nhiệt độ 55oC pH 7,0 Sản phẩm thủy phân nhận axit amin cịn có polypeptit có trọng lượng phân tử từ 14,4-25,0 kDa Để thủy phân triệt để polypeptit lại cần khảo sát thêm điều kiện xử lý mẫu điều kiện acid hay kiềm hay bổ sung enzim exoproteaz Tài liện thu nhận enzyme papainu tham khảo sát điều kiện thu nhận enzyme papaino Dương Thị Hương Giang, Nguyễn Thị Xuân Dung, Phan Thị Bích Trâm (2006), “Nghiên cứu sử dụng enzyme papain thô từ nhựa đu đủ để thủy phân protein bánh dầu đậu nành”, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, Số 5, Trang 115 – 122 Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006), Công nghệ sinh học (tập 3) – Enzyme ứng dụng, Nxb Giáo dục, Hà Nội, Trang – 28 S Damrongsakkul, K Ratanathammapan, K Komolpis, W Tanthapanichakoon (2008), “Enzymatic hydrolysis of rawhide using papain and neutrase”, Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 14, pp 202 – 206 ... papain Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng Bánh dầu đậu phộng gì? • Là loại bánh làm sau ép dầu đậu phộng, xác phần bã lại thừa làm thành miếng bánh trịn Sau ép xong máy ép thủy. .. thiệu chung enzyme papain Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng Kết luận Giới thiệu chung enzyme papain Nguồn gốc • Papain (EC 3.4.22.3) thuộc họ enzyme protease thủy phân protein... suất thủy u suất thủy t thủy y phân protein bánh dầu đậu phộngu đậu phộngu phộ lên hiệu suất thủy ng Hện thu nhận enzyme papain số ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain tươn ng quan = 99,0365%