Ứng dụng enzyme azoreductase trong phân huỷ thuốc nhuộm trong nước thải công nghiệp

ỨNG DỤNG ENZYME AZOREDUCTASE TRONG PHÂN HUỶ THUỐC NHUỘM TRONG NƯỚC THẢI CƠNG NGHIỆP Thuốc nhuộm Azo • Chứa nhiều nhóm chức azo (–N=N-) • Tương đối bền mơi trường • Được ứng dụng nhiều ngành công nghiệp dệt may, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm • Độc tính cao, có khả gây ung thư hay đột biến • Là ngun nhân gây nhiễm nguồn nước • Thường xử lý khắc phục vi sinh vật chiết xuất từ thực vật Enzyme Azoreductase • Cịn gọi Azobenzene reductase • Là enzyme, xúc tác phản ứng hoá học (phản ứng thuận nghịch): + Với chất gồm: N,N-đimetyl-1,4-phenylenediamine, anilin, NADP+ + Tạo sản phẩm: 4-đimetylamino (azobenzene), NADPH, H+ • Enzyme Azoreductase thuộc họ chất oxi hố • Hầu hết isoenzyme azoreductase có khả khử hợp chất azo, khơng thể khử thuốc nhuộm azo sulfo hố, nhiên B29 có khả • Enzyme Azoreductase vi khuẩn có khả xúc tác cho phân cắt khử liên kết azo với trợ giúp NADH / NADPH Sản xuất enzyme azoreductase tái tổ hợp • Chủng: vi khuẩn C violaceum (MTCC 2656) • Sử dụng chủng E coli BL21 (DE3) biến nạp với vector PET28aCV_RS09840 tái tổ hợp (6 × thẻ Histidine đầu N) • Mơi trường: ml LB bổ sung 50 μg/μl kanamycin (HiMedia)g /μg/μl kanamycin (HiMedia)l kanamycin (HiMedia) • Ni tủ ấm lắc, 37oC, 180 rpm • Khi OD600= 0.4, tế bào thứ cấp nuôi tủ ấm lắc trì 20°C, 180 rpm Sản xuất enzyme azoreductase tái tổ hợp • - Tinh protein: Nuôi tế bào thứ cấp 16oC, 8h Ly tâm 5000 rpm, 10 phút Siêu âm phá vỡ tế bào: 6s bật, 10s tắt siêu âm, với đệm (20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl pH 7,5 2,5% Glycerol) - Ly tâm 12.000 rpm 40 phút ° C, thu dịch - Tinh protein sắc ký cột His-tag: + Cột axit Ni-Nitrilotriacetic (10 mM imidazole 20 mM Tris-HCl 250 mM NaCl pH 7,5) + Rửa giải protein dung dịch đệm rửa giải (250 mM imidazole 20 mM Tris-HCl 250 mM NaCl) + Thẩm tích protein tinh khiết để loại bỏ imidazole lại (đệm 25 mM KH2PO4 25 mM K2HPO4 pH 7,2) Đặc điểm động học Enzyme • Các liên kết azo có thuốc nhuộm bị giảm bắt đầu bổ sung Enzyme • Đo vận tốc phản ứng máy quang phổ, Công nghệ Agilent Carry 100 UV – Vis , nhiệt độ thường, bước sóng λ= 340 nm - Trong ml mẫu: K2HPO4 25mM, KH2PO4 25 mM pH 7,2 (HiMedia) nồng độ thay đổi (1 nM – 1000 nM) metyl đỏ, metyl cam thuốc nhuộm amaranth, NADH 0.1 mM, FMN 10 μg/μl kanamycin (HiMedia)M μg/μl kanamycin (HiMedia)g enzyme - Ủ mẫu cách thuỷ 30oC, phút - Đo OD • Xét động học Enzyme theo mơ hình Michaelis-Menten, biểu đồ đối ứng kép để tính Km, Vm Tối ưu điều kiện cho Enzyme • pH: - Xét pH từ 4.0 – 11.0 - Hỗn hợp đệm: K2HPO4 25 mM (pH 4.0–11.0), KH2PO4 25 mM (pH 4.0–11.0), thuốc nhuộm azo μg/μl kanamycin (HiMedia)M, NADH 0.1 mM, FMN 10 μg/μl kanamycin (HiMedia)M μg/μl kanamycin (HiMedia)g enzyme - Ủ cách thuỷ 30oC - Đo OD340 • Nhiệt độ: -Xét nhiệt độ từ 10oC- 60oC -Hỗn hợp đệm: K2PO4 25 mM (pH 7.2), KH2PO4 25 mM (pH 7.2), thuốc nhuộm azo μg/μl kanamycin (HiMedia)M, NADH 0.1 mM, FMN 10 μg/μl kanamycin (HiMedia)M μg/μl kanamycin (HiMedia)g enzyme -Ủ cách thuỷ nhiệt độ từ 10-60oC -Đo OD340 Thử nghiệm độc tính thuốc nhuộm • Vật liệu: dịng tế bào ngun sợi L929 • Thuốc thử: muối MTT [3-(4,5 dimethylthiazol yl) 2,5 diphenyl tetrazolium bromide] • Phương pháp: - Ni cấy tế bào vào 96 đĩa thạch, 37oC, 24h - Cho thuốc nhuộm nồng độ từ (20 μg/μl kanamycin (HiMedia)g đến 1000 μg/μl kanamycin (HiMedia)g) vào đĩa thạch 37oC, 24h - Thêm vào đĩa 200 μg/μl kanamycin (HiMedia)l MTT (0,5 mg/ml) 37oC 4h - Sau 4h, MTT loại bỏ hết, thêm 100 μg/μl kanamycin (HiMedia)l DMSO trộn - Độ hấp thụ đo 570 nm máy đọc đĩa vi mô (BIOTEK Synergy HT) Tính ổn định enzyme Azoreductase • Tính ổn định azoreductase đo theo phần trăm hoạt tính enzyme với chất biến tính khác nhau: Ure, GdmCl, SDS • Thực hiện: - μg/μl kanamycin (HiMedia)g enzyme ủ với nồng độ khác Urê, GdmCl SDS 12 nhiệt độ phịng - Hoạt tính đo máy quang phổ • Hoạt độ Enzyme azoreductase tái tổ hợp tinh khiết đo cách xét giảm nồng độ NADH Kết điều kiện tối ưu cho enzyme (A) The optimum working temperature for azoreductase was 30 °C to 37 °C (B) Optimum pH was analysed for azoreductase enzyme from the pH 4.0 to10.0 The optimum activity was found at the pH 7.2 with a wide pH range of enzymatic activity pH tối ưu 7.2 Nhiệt độ tối ưu 35oC Đặc điểm động học Enzyme A: Km= 24,06 ± 2,48 nM Vm= 2,98 ± 0,23 nM/s B: Km= 38,23 ± 1,57 μg/μl kanamycin (HiMedia)M Vm= 2,30 ± 0,06 μg/μl kanamycin (HiMedia)M/s C: Km= 8,57 ± 1,08 nM Vm= 3,82 ± 0,17 nM/s D: Km= 59,94 ± 1,42 μg/μl kanamycin (HiMedia)M Vm= 2,61 ± 0,10 μg/μl kanamycin (HiMedia)M/s E: Km= 25,22 ± 3,44 nM Vm= 3,44 ± 0,20 nM/s F: Km= 56,44 ± 9,33 μg/μl kanamycin (HiMedia)M Vm= 1,63 ± 0,05 μg/μl kanamycin (HiMedia)M/s Kinetic characterization of azoreductase from C violaceum Thử nghiệm độc tính thuốc nhuộm Thuốc nhuộm nồng độ 20μg/mlg/ml 90% Thuốc nhuộm nồng độ 1000μg/mlg/ml 70% 88% 60% 86% 50% 84% 40% 82% 30% 80% 20% 78% 10% 76% 74% Metyl đỏ ama-ranth thuốc nhuộm metyl cam thuốc nhuộm phân huỷ 0% Metyl đỏ ama-ranth thuốc nhuộm metyl cam thuốc nhuộm phân huỷ Sau phân huỷ, độc tố thuốc nhuộm giảm đáng kể 120% 120% 100% 100% % hoạt độ Enzyme % hoạt độ Enzyme Tính ổn định Enzyme 80% 60% 40% 20% 0% 0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 Nồng độ Ure (M) 80% 60% 40% 20% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% Nồng độ SDS (%) Enzyme Azoreductase có tính ổn định cao 120% % hoạt độ Enzyme 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0.5 1.5 2.5 Nồng độ GdmCl 3.5 4.5 Thích hợp dụng phân huỷ thuộc nhuộm Kết luận • Sự phân hủy enzym thuốc nhuộm azo phát phương pháp hiệu quả, hữu ích tiết kiệm chi phí • Lượng độc tố thuốc nhuộm giảm đáng kể, tỉ lệ tế bào sống sót tăng mạnh thêm Enzyme • Enzyme tìm thấy ổn định điều kiện khắc nghiệt => Azoreductase C violaceum trở thành lựa chọn cho ngành liên quan đến xử lý nước thải có chứa thuốc nhuộm đóng vai trị quan trọng vai trị việc làm môi trường ... ama-ranth thuốc nhuộm metyl cam thuốc nhuộm phân huỷ 0% Metyl đỏ ama-ranth thuốc nhuộm metyl cam thuốc nhuộm phân huỷ Sau phân huỷ, độc tố thuốc nhuộm giảm đáng kể 120% 120% 100% 100% % hoạt độ Enzyme. .. (azobenzene), NADPH, H+ • Enzyme Azoreductase thuộc họ chất oxi hố • Hầu hết isoenzyme azoreductase có khả khử hợp chất azo, khử thuốc nhuộm azo sulfo hố, nhiên B29 có khả • Enzyme Azoreductase vi khuẩn... ổn định cao 120% % hoạt độ Enzyme 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0.5 1.5 2.5 Nồng độ GdmCl 3.5 4.5 Thích hợp dụng phân huỷ thuộc nhuộm Kết luận • Sự phân hủy enzym thuốc nhuộm azo phát phương pháp hiệu