Ứng dụng enzyme collagenase trong collagen

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đề tài: Ứng dụng enzyme collagenase collagen 01 Chương Collagenase 02 KẾT CẤU 03 Chương Collagen Chương Ứng dụng collagenase collagen Collagenase ? ⮚ Chỉ có collagenase enzyme có khả phân giải collagen chất trạng thái siêu xoắn ⮚ Collagenasecó khả phân cắt đoạn collagen rút ngắn thời gian phân cắt, hiệu suất thu hòi cao, sản phẩm collagen có tính hịa tan cao thân thiện môi trường Đặc điểm collagenase vi khuẩn pH trung tính: – Nhiệt độ : 37oC bất hoạt 45oC Cắt vùng xoắn ba liên kết X – Y – Gly Collagen bị phân cắt collagenase vi khuẩn Phân cắt chuỗi polypeptide nhiều vị trí Nguồn gốc Nguyên liệu thực phẩm Mạnh vụn ruột giun đất Vùng nhiệt Đất Nước mắm Chất thải ( da, xương) Các nguồn bệnh lí khác Collagen ? 01 04 03 Hàng nghìn cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có glycine, proline, hydroxyproline Collagen không chứa tryptophan 02 42 chuỗi polypeptide dạng: collagen hình dạng sợi, FACIT collagen, collagen chuyển màng, collagen loại collagen khác Collagen loại protein cấu trúc thể động vật Ứng dụng collagen Trong công nghiệp thực phẩm ▪ Tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm ▪ Độ dẻo, dai mềm thịt ▪ Chất tạo gel, chất kết dính, tạo xớp ▪ Màu sắc śt óng ánh Trong y học • Sản xuất th́c kháng sinh, hormone tăng trưởng • Chữa lành vết thương bị bỏng, tái tạo xương • Thẩm mĩ: bơm mơi, căng da mặt Tăng khả bám dính ni cấy Trong lĩnh vực khác • Ni cấy tế bào nghiên cứu • Tái tạo cấu trúc xương, da, phục hồi da tổn thương Mảnh bọt biển sử dụng nha khoa Nghiên cứu trích ly collagen enzyme collagenase kết hợp với acid Nhiệt độ: 37oC Một Gram dương Bacillus cereus (CNA1) Nguồn: da cá ba Dấc tra pH: 7,5 Trọng lượng khô da cá: 54,6% Cách tiến hành Chuẩn bị da cá cho khai thác collagen Xử lý da cá acid Chiết xuất collagen collagenases Phân tích điện di chiết xuất collagen Kết Chuẩn bị da cá cho khai thác collagen • Tất thủ tục chuẩn bị thực 4oC khuấy liên tục • Da trộn với dung dịch NaOH 0,1 N với tỉ lệ (w/v) 1:10 24 • Dung dịch kiềm thay đổi sáu Sau đó, mẫu loại bỏ protein rửa nước lạnh nước rửa đạt pH trung tính base yếu • Da bị khử protein khử chất béo butyl alcohol 10% với tỉ lệ 1:10 24 giờ, dung môi thay đổi sáu 2 Xử lý da cá acid • Da cá khử chất béo rửa nước lạnh, sau ngâm acid acetic 0,5M với tỉ lệ 1:15 24 • Ly tâm 8000 vòng/phút 30 phút 4oC Gạn lưu giữ 4oC • Các kết tủa tái chiết xuất acid acetic 0,5 M với tỉ lệ 1:30 16 khuấy nhẹ nhàng, sau ly tâm thu gạn Các chất gạn thu kết hợp với chiết xuất • Các chất chiết xuất kết hợp NaCl để đạt nồng độ cuối 2,6 M TrisHCl 0,05M (pH 7,5) • Các kết tủa sau ly tâm hòa tan 10 thể tích acid acetic 0,5 M Dung dịch thu được thẩm tách với 10 thể tích acid acetic 0,1 M màng thẩm tách với phân tử trọng lượng cho qua 8000 Da 12 với thay đổi dung dịch bớn • Sau đó, cất thường xuyên thay đổi nước đạt pH trung tính Chiết xuất collagen collagenases • Da cá hịa thể tích dung dịch 0,1 M loại đệm pH thích hợp xử lý với collagenase (CNA1) 100 U/mg chất khô 48 4oC khuấy nhẹ nhàng • Dung dịch nhớt ly tâm thu gạn • Thẩm tách với đệm phosphate natri 0,02 M (pH 7,2) màng thẩm tách với trọng lượng phân tử cho qua 8000 Da 24 4oC với thay đổi dung dịch sau bớn • Dung dịch thẩm tách thu được ly tâm hòa tan 10 thể tích acid acetic 0,5 M kết tủa NaCl để nồng độ cuối 2,6 M Tris-HCl 0,05 M (pH 7,5) • Kết tủa thu sau ly tâm tái hòa tan 10 thể tích acid acetic 0,5 M thẩm tách với nước cất đơng khơ 4 Phân tích điện di chiết xuất collagen • Điện di sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) • Mẫu collagen đơng khơ hịa tan đệm natri phosphate 0,02 M (pH 7,2) có chứa 1% (w/v) SDS ure 3,5 M khuấy nhẹ nhàng 4oC 12 • Chất gạn thu thập sau ly tâm 3000×g phút 4oC Mẫu collagen hòa tan trộn lẫn với mẫu đệm (Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 có chứa 4% SDS, 20% glycerol) có khơng có 10% β-mercaptoethanol (βME), tỉ lệ 1:1 • Điện di với dịng điện 20 mA/gel sử dụng thiết bị Compact PAGE Sau điện di, gel nhuộm màu với 0,05% Coomassie xanh R-250 15% methanol 5% acid acetic tẩy màu với 30% methanol 10% acid acetic • Đánh dấu phân tử khới lượng lớn để ước tính trọng lượng phân tử protein Collagen tan acid loại I từ da bê sử dụng làm collagen chuẩn 5 Kết luận • Sản lượng collagen tương ứng chiết xuất thấp 3,7% (theo khối lượng chất khô) Tuy nhiên, collagenase áp dụng cho cặn không tan thu sau xử lý acid, sản lượng collagen trích xuất collagenase từ CNA1 18,1% (theo khới lượng chất khơ) • Collagen loại I có thành phần gồm hai chuỗi α1 chuỗi α2 ([α1]2α2) Người ta cho collagen loại I collagen collagen chiết xuất i collagenases từ CNA1 • Vì chuỗi α3 có khối lượng phân tử phân biệt với α1 khơng thể tách khỏi α1 điện di, diện đồng thời α3 với α1 Hình ảnh điện di mẫu collagen từ da cá hồi điều kiện khử không khử ...01 Chương Collagenase 02 KẾT CẤU 03 Chương Collagen Chương Ứng dụng collagenase collagen Collagenase ? ⮚ Chỉ có collagenase enzyme có khả phân giải collagen chất trạng thái siêu xoắn ⮚ Collagenasecó... dạng: collagen hình dạng sợi, FACIT collagen, collagen chuyển màng, collagen loại collagen khác Collagen loại protein cấu trúc thể động vật Ứng dụng collagen Trong công nghiệp thực phẩm ▪ Tạo độ... protein Collagen tan acid loại I từ da bê sử dụng làm collagen chuẩn 5 Kết luận • Sản lượng collagen tương ứng chiết xuất thấp 3,7% (theo khối lượng chất khô) Tuy nhiên, collagenase áp dụng cho