Nghiên cứu đặc điểm thực vật và bước đầu khảo sát thành phần hóa học của cây nhương lê kim cang (myxopyrum smilacifolium blume)

TRẦN THỊ YẾN 1201725 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY NHƯƠNG LÊ KIM CANG MYXOPYRUM SMILACIFOLIUM BLUME KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ

TRẦN THỊ YẾN

1201725

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY

NHƯƠNG LÊ KIM CANG

(MYXOPYRUM SMILACIFOLIUM

BLUME)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

TRẦN THỊ YẾN

1201725

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY

NHƯƠNG LÊ KIM CANG

2 Bộ môn Dược học cổ truyền Trường Đại học Dược Hà Nội

khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Hà Vân Oanh, PGS

TS Đỗ Thị Hà, DS Nguyễn Minh Luyến, những người thầy đã luôn tận tâm

hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu khoa Hóa thực vật 2 – Viện dược liệu và các thầy cô bộ môn Dược học cổ truyền đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Trần Thị Yến

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Đ T VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về họ Nhài - Oleaceae Error! Bookmark not defined 1.2 Tổng quan về chi Myxopyrum 4

1.3.Tổng quan về loài Myxopyrum smilacifolium Blume 5

1.3.1 Đặc điểm thực vật 5

1.3.2 Sinh thái và phân bố 6

1.3.3 Thành phần hóa học 6

1.3.4 Tác dụng dược lý 12

1.3.5 Công dụng 16

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật 18

2.2.2 Nội dung nghiên cứu hóa học 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật 18

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hóa học 19

CHƯƠNG III - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20

3.1 Nghiên cứu về thực vật 20

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật của cây

20

3.1.5 Đặc điểm vi phẫu thân 23

3.1.6 Đặc điểm bột thân 24

3.1.7 Đặc điểm vi phẫu rễ 25

3.1.8 Đặc điểm bột rễ 26

3.2 Nghiên cứu về hóa học 27

3.2.1 Chiết xuất 27

3.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 29

3.2.3 Khảo sát và phân lập các hợp chất trong cao n-butanol 35

3.3 àn luận 44

3.3.1.Về đặc điểm thực vật 44

3.3.2 Về h a thực vật 44

CHƯƠNG IV - KẾT LU N VÀ KIẾN NGH 46

4.1 Kết luận 46

4.2 Kiến nghị 46 PHỤ LỤC

Magnetic Nesonance Spectroscopy)

1

H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy) DEPT

Bảng 1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất c trong dƣợc liệu 34

Hình 1.2 Myxopyrum smilacifolium Blume 6 Hình 1.3 Một số hợp chất alcaloid trong Myxopyrum

smilacifolium

7

Hình 1.4 Một số triterpen trong Myxopyrum smilacifolium 8 Hình 1.5 Các iridoid phân lập đƣợc từ Myxopyrum smilacifolium 9 Hình 1.6 Các acid hữu cơ và dẫn chất trong Myxopyrum

Hình 1.8 Một số hợp chất khác trong lá Myxopyrum smilacifolium 12

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Myxopyrum thuộc họ Nhài Oleaceae, phân bố chủ yếu ở các nước châu Á Trên thế giới, chi Myxopyrum có 4 loài, ở Việt Nam có 3 loài là M pierrei, M

nervorsum và M smilacifolium [5]

Cây Nhương lê kim cang, tên khoa học là Myxopyrum smilacifolium Blume,

họ Nhài Oleaceae Đây là cây bụi trườn, thường mọc trong rừng thưa nơi ẩm ven suối, ở độ cao 500-1000m, có mặt ở các tỉnh Thừa Thiên-Huế, Thành phố Hồ Chí

Minh [8], Yên Bái, Quảng Ninh, Đồng Nai [5] Lá Myxopyrum smilacifolium trị

xáo trộn thần kinh, trị tê thấp, suyễn, ho [8], [10] Ở Ấn Độ, lá còn được sử dụng làm thuốc trị hen suyễn, thấp khớp, sốt, đau đầu, đau thần kinh, các vết thương [10], [19], [29], [31] Rễ dùng để trị ngứa và ghẻ ở trẻ em, các bệnh ho, sốt, thấp khớp, các vết cắn và vết thương [10], [19], [29]

Tuy nhiên, cho đến nay, ở trong nước chưa c nghiên cứu nào về Nhương lê kim cang Trên thế giới, các nghiên cứu về loài này còn chưa nhiều Để góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về cây Nhương lê kim cang, làm cơ sở cho việc thu hái, sử dụng cây này làm thuốc, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và bước đầu khảo sát

thành phần hóa học của cây Nhương lê kim cang (Myxopyrum smilacifolium

lume)” được thực hiện với những mục tiêu sau:

1 Mô tả đặc điểm thực vật của cây Nhương lê kim cang thu hái ở Yên Bái

2 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Nhương lê kim cang

Để thực hiện các mục tiêu trên đề tài cần thực hiện những nội dung sau:

1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi phẫu thân, lá, rễ; đặc điểm vi học bột thân, bột lá, bột rễ và giám định tên khoa học của cây Nhương lê kim cang

2 Định tính các nhóm chất trong cây bằng phản ứng hóa học

3 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một hợp chất trong cây

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về họ Nhài – Oleaceae

Họ Nhài (Lài) hay còn gọi là họ Ô-liu có danh pháp khoa học là Oleaceae,

c tên đồng nghĩa là Ligustraceae, Nyctathaceae [5],[34]

Sau khi họ Nhài được thành lập vào năm 1809, đầu thế kỷ 19 đã c nhiều tác giả đi sâu nghiên cứu phân loại họ này ở các quốc gia và vùng lãnh thổ khác nhau Do đ c nhiều hệ thống phân loại họ Nhài được ra đời, chủ yếu theo hai quan điểm khác nhau là:

Theo quan điểm thứ nhất, họ Oleaceae được chia thành các tông (Tribus) rồi chia tiếp thành các chi (Gernus) và các bậc nhỏ hơn Dựa trên cơ sở dữ liệu về trình tự AND của 76 loài đại diện cho 25 chi thuộc họ này và một số loài thuộc các

họ có quan hệ gần gũi với họ Oleaceae, Wallander E., & V.A Albert (2000) đã phân chia họ Oleaceae thành 5 tông: Oleeae, Jasmineae, Myxopyreae, Fontanesieae

và Frosytheae Ngoài ra, hai tác giả này cũng đã đề xuất mối quan hệ phát sinh chủng loài trong họ được trình bày trong hình 1.1 [11]

Hình 1.1 Mối quan hệ phát sinh chủng loài trong họ Oleaceae

Thứ hai là chia họ Oleaceae thành các phân họ (Subfamilia), rồi chia tiếp thành các tông (Tribus) và các bậc nhỏ hơn [5] Theo quan điểm này có hai cách phân loại khác nhau Tác giả Takhtajan (1997, 2009) chia họ này thành 3 phân họ là Jasminoideae gồm 5 tông (Jasmineae, Fontanesia, Fosythieae, Schrebareae, Myxopyrear), Oleoideae gồm 2 tông (Fraxineae, Oleeae) và Nyctanthoideae gồm 1

chi Nyctanthes Cách phân loại này hiện nay không được các nhà nghiên cứu ủng hộ,

Oleaceae

Myxopyreae Fontanesieae Forsythieae Jasmineae + Oleeae

bởi các đặc điểm hình thái của chi Nyctanthes có nhiều điểm chung với hai chi cùng

tông Myxopyreae Các tác giả khác thì chia họ này thành 2 phân họ (Oleoideae và Jasminoideae) và 7 tông (Oleeae, Jasmineae, Myxopyreae, Fontanesieae, Frosythieae, Schrebereae và Fraxineae) Tuy nhiên các tác giả này lại không chấp

nhận vị trí phân loại của chi Nyctnathes thuộc họ Oleaceae [5]

Các loài thuộc họ Oleaceae thường là cây gỗ to hay nhỏ hoặc dây leo Lá đơn, nguyên, mọc đối, không có lá kèm, ít khi lá kép hình lông chim Cụm hoa chùm hay xim ở nách lá, ít khi hoa riêng lẻ Hoa đều, lưỡng tính hay đơn tính Đôi khi hoa mẫu 5 hay 6 (Nhài) Đài dính, gồm 4 phiến đính theo hình chữ thập, 2 phiến

ở vị trí trước - sau, 2 phiến ở vị trí 2 bên, tiền khai van 4 cánh hoa dính nhau thành ống hình phễu hay hình đinh, tiền khai vặn, van hay lợp Một vài loài trong chi

Fraxinus không có bao hoa hoặc có cánh hoa rời Bộ nhị gồm 2 nhị đính trên ống

tràng ở vị trí hai bên (phân họ Oleoideae) hoặc trước - sau (phân họ Jasminoideae)

Bộ nhụy gồm 2 lá noãn đính xen kẽ với nhị, hợp thành bầu trên, 2 ô, mỗi ô đựng 2 noãn, 1 vòi nhụy Quả nang, mọng hay quả có cánh hoặc quả hộp Hạt có hay không

Nhiều loài trong họ có tầm quan trọng kinh tế đáng kể Ô liu (Olea

europaea) có tầm quan trọng để thu hoạch quả cũng như dầu thực vật chiết ra từ nó,

các loài Tần bì (Fraxinus spp.) có giá trị vì có gỗ cứng và dai, còn Liên kiều (Forsythia spp.), Tử đinh hương, Nhài, Mộc tê, Thủy lạp (Ligustrum spp.) và Lưu

tô (Chionanthus spp.) là những loại cây cảnh có giá trị trong nghề làm vườn và tạo

cảnh quan [34] C 3 loài thường được dùng làm thuốc là Liên kiều, Nhài và Chè vằng, trong đ Liên kiều được dùng trong công nghiệp Dược [6]

1.2 Tổng quan về chi Myxopyrum

Theo quan điểm phân loại họ Oleacea của Wallander E., & V.A Albert

(2000), vị trí phân loại của chi Myxopyrum như sau [5]:

ở gần gốc ống tràng; bao phấn hình bầu dục rộng Noãn 2 Quả dạng hạch, gần tròn hay bầu dục Hạt 1-4 [5]

Phân bố: Trên thế giới có 4 loài, phân bố ở các vùng châu Á như Banglades, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaixia, Mianma, New Guinea,

Philippin, Thái Lan, Trung Quốc; ở Việt Nam hiện có 3 loài: M pierrei, M

nervorsum, M smilacifolium [5]

M pierrei là cây bụi trườn, dài 1-2m, thân vuông, có cánh thấp, không

lông Lá đơn, mọc đối; phiến lá hình bầu dục-mác, cỡ 9-20× 5-8cm, dạng da, gốc hơi tròn hoặc hình nêm, ch p c mũi ngắn, mép c răng cưa thưa nhỏ hoặc không

c răng, thường uốn xuống; gân bên 2-3 đôi, xuất phát từ gốc; cuống mảnh, dài 1,5 cm Cụm hoa hình chùy, mọc ở nách lá, dài 5-7 cm, c lông thưa, lá bắc hình tam giác, dài 1-4 mm Đài hình chén, dài 0,6-0,8 mm, có lông; 4 thùy, hình tam giác, dài 0,2-0,4 mm Tràng màu trắng đục, ống dài 0,8-1,2 mm; 4 thùy hình bầu dục, dài

1-0,3-0,5 mm Nhị 2, đính ở họng tràng; bao phấn hình gần tròn, dài 0,5 mm Bầu hình trứng không lông, dài 0,5 mm; vòi nhụy ngắn; đầu nhụy xé đôi, dài 0,1-0,2 mm Quả dạng hạch, hình tròn hoặc hình bầu dục, cỡ 0,8-1× 1,5-2 cm, vỏ quả có mẩu nhỏ Loài này được tìm thấy ở các tỉnh Lai Châu, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Quảng Nam, mọc trong rừng, nơi ẩm ở độ cao 500-1200 m [5]

M nervorsum cũng là cây bụi trườn, dài 2-3m; thân có cánh thấp, không

lông Lá đơn, mọc đối; phiến lá hình bầu dục rộng-thuôn, cỡ 10-15× 6-7 cm, dạng

da, không lông; gốc tù hoặc tròn, chóp lá tù hoặc c mũi ngắn, mép c răng cưa nhỏ hoặc không; gân bên 2-3 đôi, xuất phát từ gốc; cuống lá dài 0,5-1,5 cm Cụm hoa hình chùy mọc ở nách, dài 10-15 cm, có lông; lá bắc hình sợi, dài 2-3 mm Hoa hình chuông Đài hình chén, c lông ngắn, dài 0,3-0,8 mm, 4 thùy, hình tam giác, dài 0,4-0,6 mm Tràng màu trắng, ống 0,8-1 mm; 4 thùy hình bầu dục, dài 0,3-0,4 mm Nhị 2, đính ở họng tràng, ống 0,8-1 mm; 4 thùy hình bầu dục, dài 0,3-0,4 mm Nhị

2, đính ở họng tràng; bao phấn hình bầu dục rộng hoặc tam giác, dài 0,3-0,4 mm Bầu hình cầu, không lông, dài 0,5 mm; vòi nhụy ngắn; núm nhụy xẻ đôi, dài 0,2

mm Quả hạch, hình tròn hoặc hình bầu dục, cỡ 2,5-3× 9-12 mm Hạt 4, hình bầu dục, cỡ 8-10 mm Loài này phân bố ở các tỉnh Thừa Thiên-Huế, Đà Nẵng, Đồng Nai, trong rừng thưa, nơi dốc, khe núi ở độ cao 100-2000m [5]

1.3 Tổng quan về loài Myxopyrum Smilacifolium Blume

1.3.1 Đặc điểm thực vật:

Myxopyrum smilacifolium lume còn c tên đồng nghĩa là Myxopyrum

serratulum A.W.Hill [34] Tên thường gọi là Nhương lê kim cang thuộc chi Myxopyrum, họ Nhài Oleaceae [5]

Đặc điểm thực vật: cây bụi trườn, dài 2-3 m, cành tròn không lông Lá đơn, mọc đối; phiến lá hình bầu dục hoặc hình trứng, cỡ 10-17× 4-9 cm, dạng da, gốc hình nêm hoặc tù, ch p lá c mũi kéo dài, toàn bộ mép c răng cưa to, gân bên 3 đôi xuất phát từ gốc Cụm hoa hình chùy, mọc ở nách lá, dài 10-12 cm, c lông thưa; lá bắc nhỏ hình sợi, có lông dài 2-3 mm Đài hình chén nhẵn, dài 0,5-1 mm, 4 thùy hình bầu dục, dài 0,5 mm Tràng màu trắng, ống dài 1-1,5 mm, 4 thùy hình bầu dục

thuôn, dài 1-1,5 mm, không lông Nhị 2, đính gần họng tràng; bao phấn hình bầu dục rộng, dài 0,5 mm Bầu hình trứng, không lông, dài 1 mm; nhụy xẻ đôi, dài 0,2-0,4 mm Quả dạng hạch hình cầu, cỡ 3-5× 8-10 mm Hạt 2, hình bán cầu, cỡ 4-5

mm [5]

1.3.2.Sinh thái và phân bố:

Cây thường mọc trong rừng thưa nơi ẩm ven suối, ở độ cao 500-1000m [5] Phân bố: Thừa Thiên-Huế, Thành phố Hồ Chí Minh [8], Yên Bái, Quảng Ninh, Đồng Nai [5] Còn có ở Ấn Độ, Campuchia, Thái Lan, Malaixia [10], Trung Quốc, Banglades, Lào, Mianma [5]

1.3.3 Thành phần hóa học

Praveen R.P và Ashalatha S.Nair (2014) đã xác định sơ bộ thành phần hóa học

của dịch chiết rễ Myxopyrum smilacfolium cho thấy có các hợp chất alcaloid,

phenolic, glycosid, glycosid tim, tannin, flavonoid, carbonhydrat, protein, phytosteroid, phytosterol, saponin [18]

Năm 2015, các tác giả trên tiếp tục nghiên cứu để phân tích và so sánh các nhóm chức có trong dịch chiết methanol của rễ, quả và mô sẹo Kết quả phân tích phổ FTIR cho thấy cả 3 dịch chiết đều chứa các hợp chất mang các nhóm chức giống nhau là: alcol, alkan, alken, aldehyd, xeton, amin, nhóm carboxyl, alkyl halogen [20]

Lá Myxopyrum smilacifolium cũng đã được chứng minh chứa các hợp chất

thuộc nhóm alcaloid, glycosid, tannin, phenol, saponin, terpenoid, carbonhydrat, dầu thực vật, steroid, flavonoid, anthranoid và acid amin [23],[24]

1.3.3.1 Alcaloid

Năm 2013, S.Gopalakrishnan và R.Rajameena đã phân lập hợp chất dimethoxy-13-carbomethoxy-15-(3,4,5-trimethoxybenzoxy)-13,14-

7,8-didehydroalloberban (1) từ dịch chiết ethanol của lá [26]

Từ dịch chiết của thân Myxopyrum serratulum A.W.Hill, bằng phương pháp

sắc kí kết hợp khối phổ, K Rajalakshmi và V.R.Mohan (2016) đã xác định sự có

mặt của 3 alcaloid: 4-phenyl-3,5-pyrazolidinedion (2), dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro isoquinolin (3), 3-dodecyl-4-[(4-methoxybenzyl)oxy]- 2-methyl quinolin (4) [15]

Hình 1.3 Một số hợp chất alcaloid trong Myxopyrum smilacifolium

1.3.3.2 Triterpen

Kết quả định lượng của Sudharmini, D và Ashalatha S Nair năm 2008 cho

thấy lá Myxopyrum smilacifolium chứa acid ursolic (5) với hàm lượng 0,175mg/g

[29]

Nghiên cứu của K Rajalakshmi và V.R.Mohan đã chỉ ra sự có mặt của các

hợp chất triterpen từ thân Myxopyrum serratulum : α-amyrin (6), β-amyrin (7),

betulin (8) [15]

Hình 1.4 Một số triterpen trong Myxopyrum smilacifolium

1.3.3.3 Iridoid

Từ dịch chiết của lá Myxopyrum smilacifolium, Henrik Franzyk và các cộng sự

(2000) đã phân lập được các iridoid glycosid: myxopyrosid (9), (E/Z)-p-methoxy cinnamoylmyxopyrosid (10), (11) Sự hiện diện của các hợp chất

6-o-acetyl-7-o-này cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa chi Myxopyrum và Nyctanthes, vì các iridoid tương tự cũng đã được tìm thấy từ Nyctanthes Phát hiện này càng khẳng định mối

quan hệ đã được xác định trong họ Oleaceae bằng các kỹ thuật sắp xếp gen hiện đại

là: 3 chi Nyctanthes, Dimetra và Myxopyrum cùng thuộc 1 tông Myxopyreae [12]

Hình 1.5 Các iridoid phân lập được từ Myxopyrum smilacifolium

1.3.3.4 Acid hữu cơ và các dẫn chất

Bằng phương pháp sắc kí kết hợp khối phổ và phương pháp HPTLC, các nhà khoa học Ấn Độ (2016) đã phát hiện sự có mặt của nhiều acid hữu cơ và dẫn chất từ

lá Myxopyrum serratulum [32] Bên cạnh đ , nghiên cứu [15] cũng phát hiện được

nhiều hợp chất thuộc nhóm này Công thức cấu tạo của các acid hữu cơ và dẫn chất

trong Myxopyrum smilacifolium được trình bày ở hình 1.5

Hình 1.6 Các acid hữu cơ và dẫn chất trong Myxopyrum smilacifolium

1.3.3.5 Các hợp chất khác

Bên cạnh các nhóm chất chính trên, nghiên cứu [15] cũng xác định trong thân

Myxopyrum serratulum còn có hợp chất steroid

9,19-cycloergost-24(28)-en-3-ol-4,14-dimethyl acetat (12), phenolic

4-((1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenol (13), các carbohydrat D-mannopyranose (14), ethyl

α-D-glucopyranosid (15), phytol (16), galactiol (17), amin (3-nitrophenyl) methanol isopropyl ether (18), vitamin E DL-tocopherol (19), aldehyd 5-hydroxy

methylfurfural (20), ceton 7-ethyl-4-decen-6-on (21) [15]

Hình 1.7 Một số hợp chất khác trong thân Myxopyrum smilacifolium

Lá Myxopyrum serratulum còn chứa các amin 2[p-(dimethylamino)

phenyl]-1-(p-nitro phenyl cyclopropan carbonitril (22), 1-[(2-methoxy phenyl) hexanediamin (23), anthranoid 1-phenyl-9,10-anthracenedion (24), dẫn chất molyb

methyl]-1,6-molybdenumcarbonyl-(2,4cyclopentadien-1-yl)-[P,Pdiphenyl-N-(1-phenylethyl)

phosphinous amid] nitrosyl stereoisomer (25) [26], các dẫn chất của silic acid silicic (26), octamethyl cyclotetrasiloxan (27), dodecamethyl cyclohexasiloxan (28), các hợp chất hydrocacbon naphtalen (29), 2-methylbicyclo[2,2,1]heptan (30), neophytadien (31), các alcol 2-(cyclohexen-1-yl) ethanol (32), 2-pentadecyn-1-ol (33) [32]

Hình 1.8 Một số hợp chất khác trong lá Myxopyrum smilacifolium

1.3.4 Tác dụng dược lý

Các nghiên cứu trên Myxopyrum smilacifolium cho thấy loài này có những

tác dụng dược lý như: kháng khuẩn, kháng nấm [17],[27],[29] hạ sốt, chống viêm [13],[16],[22], chống oxy hóa [14],[19],[30], làm giãn phế quản [31], làm lành vết thương [25], chống ung thư [21]

1.3.4.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Sudharmini, D và Ashalatha S Nair (2008) đã nghiên cứu hoạt tính kháng

khuẩn của acid ursolic trong lá Myxopyrum smilacifolium bằng phương pháp

khuếch tán trên thạch Kết quả cho thấy acid ursolic có tính kháng các vi khuẩn

Gram dương: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, nấm Candida albicans và C

glabrata [29]

Theo tài liệu số [27], các cao chiết từ lá của Myxopyrum serratulum A W

Hill (Oleaceae) có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gram dương:

Streptococcus faecalis, Baccillus subtilis và Baccillus cereus, các vi khuẩn gram

âm: Klebsiella aerogens, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteas

vulgaris và nấm Candida albicans, các chủng Asparagillus flavans Trong số các

cao chiết ether dầu hoả (40-60 C), benzen, chloroform, ethanol và nước, cao chiết ethanol từ lá Nhương lê kim cang thể hiện tác dụng ức chế cao nhất đối với các vi sinh vật nghiên cứu Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết ethanol dao động từ 200 đến 300 µg/ml với các vi khuẩn khác nhau [27]

Năm 2014, Praveen R.P và Ashalatha S Nair đã tiến hành nghiên cứu so sánh hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết methanol của rễ, mô sẹo và quả

Myxopyrum smilacifolium Blume Kết quả cho thấy:

Về hoạt tính kháng khuẩn: sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch với

4 chủng vi khuẩn Escherechia coli, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis và

Staphylococcus aureus Tất cả các dịch chiết đều có tác dụng ức chế tương đương

nhau với E faecalis và B subtilis Dịch chiết từ quả tương đối hiệu quả hơn trên tất

cả các chủng trừ S.aureus Dịch chiết quả còn có tác dụng kháng E faecalis mạnh hơn so với Gentamycin Mô sẹo có tác dụng kháng S aureus nhưng ở nồng độ cao hơn Dịch chiết rễ và mô sẹo không có tác dụng với E.coli [17]

Về hoạt tính kháng nấm: thử trên nấm Candida albicans, dịch chiết mô sẹo

và quả cho thấy có hoạt tính ức chế so với các tiêu chuẩn chống nấm [17]

1.3.4.2 Tác dụng hạ sốt, chống viêm

Năm 2014, Jolly Samu và các cộng sự đã nghiên cứu đánh giá tác dụng

chống viêm của cao chiết ethanol và cao chiết nước từ lá Myxopyrum smilacifolium

ở các nồng độ khác nhau (25, 50, 100, 200 µg/ml) bằng phương pháp ổn định màng

tế bào hồng cầu và khả năng ức chế sự biến tính protein Kết quả cho thấy cả hai cao chiết đều có tác dụng ức chế sự biến tính protein và làm ổn định màng hồng cầu Trong đ , cao chiết ethanol ở nồng độ 200 µg/ml, ức chế 91,54% sự biến tính protein, tác dụng này tương đương với chất chứng dương là diclofenac nồng độ 100 µg/ml Đối với tác dụng làm ổn định màng hồng cầu, cao chiết nước ở nồng độ 200

µg/ml ức chế 69,60% sự tan máu, mạnh hơn cao chiết ethanol (46,58% ở nồng độ

100 µg/ml) nhưng yếu hơn diclofenac 100 µg/ml (97,059%) [13]

Đến năm 2015, Manu Skaria Varughese và các cộng sự đánh giá tác dụng chống viêm và hạ sốt của cao chiết ethanol từ lá trên động vật thực nghiệm [16]

Tác dụng chống viêm: cao chiết ethanol từ lá Myxopyrum smilacifolium

liều 200 và 400 mg/kg có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carageenan và formalin Tác dụng của liều 400 mg/kg cao hơn liều 200 mg/kg nhưng thấp hơn so với chất chứng dương là diclofenac liều 10 mg/kg [16] Tác dụng hạ sốt: thử tác dụng hạ sốt trên mô hình động vật sử dụng nấm men bia với hai mức liều 200 và 400 mg/kg, so sánh với nhóm chứng dương paracetamol 150 mg/kg và nhóm chứng bệnh propylen glycol 5 mg/kg Sau 18h tiêm nấm men thì thân nhiệt động vật ở 4 nh m đều tăng ( khoảng 400C), bắt đầu điều trị hạ sốt và khảo sát nhiệt độ sau 0, 1, 2, 3 giờ Kết quả cho thấy cao chiết ethanol của lá với liều 400 mg/kg có tác dụng hạ sốt mạnh hơn liều 200 mg/kg nhưng yếu hơn chất chứng dương paracetamol [16]

Hoạt tính chống viêm tiếp tục được các nhà khoa học Ấn Độ nghiên cứu (2016) sử dụng carrageenan gây phù não ở chuột, so sánh với indomethacin Kết

quả cũng cho thấy chiết xuất từ lá có hoạt tính kháng viêm mạnh: M Serratulum ức

chế tối đa 86,09% ở liều 400 mg/kg trong khi indomethacin ức chế 85,37% [22]

Như vậy các nghiên cứu cho thấy Myxopyrum smilacifolium là một nguồn

để phát triển các thuốc liên quan đến tác dụng hạ sốt, chống viêm

1.3.4.3 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2013, T.Sheela Rani và các cộng sự đã đánh giá hoạt tính chống oxy

hóa in vitro của dịch chiết methanol bằng cách nghiên cứu khả năng dọn gốc tự do

DPPH và oxit nitric so với vitamin C Kết quả cho thấy dịch chiết methanol có tác dụng chống oxy hóa khá mạnh, ức chế tương ứng với DPPH và oxit nitric là 81,75% và 84,95%, so với vitamin C ( tương ứng là 83,45% và 84,20%) ở cùng mức liều 250 µg/ml [30]

Một nghiên cứu khác ở Ấn Độ năm 2015 đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết ethanol và dịch chiết nước qua khả năng khử gốc tự do DPPH và superoxid, năng lực khử, gốc oxit nitric, sử dụng các nồng độ khác nhau ( 10, 25, 50,

100 µg/ml) Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cao chiết ethanol và nước của

Myxopyrum smilacifolium có hoạt tính chống oxy h a nhưng tương đối kém hơn

acid ascorbic Ở nồng độ 100 µg/ml, khả năng ức chế DPPH của cao chiết ethanol

và nước lần lượt là 66,31% và 64,84%, trong khi acid ascorbic 25 µg/ml ức chế 99,79 % [14]

Năm 2015, Praveen R.P và Ashalatha S Nair đã so sánh tác dụng chống

oxy hoá của các cao chiết từ rễ, mô sẹo và quả của Myxopyrum smilacifolium thông

qua khả năng dọn gốc tự do DPPH và dọn gốc NO/hydroxyl Kết quả cho thấy cao chiết methanol từ rễ có tác dụng ức chế DPPH và NO với IC50 lần lượt là 37,5 µg/ml và 525 µg/ml Trong khi đ cao chiết methanol từ quả có tác dụng ức chế gốc hydroxyl với IC50 là 950 µg/ml [19]

vivo Cao chiết nồng độ 400 mg/kg kéo dài thời gian trước co giật ( preconvulsive

time) lên 102,3 ± 3,8 giây trong khi chứng dương clorpheniramin 100 mg/kg kéo dài lên 121,3 ± 4,5 giây (p < 0,05) Cao chiết có tác dụng giãn nở phế quản qua cơ chế đối kháng thụ thể H1 tương tự chlorpheniramin

1.3.4.5 Tác dụng làm lành vết thương

Năm 2013, S Gopalakrishnan và R Rajameena Rajangam đã đánh giá tác

dụng chữa lành vết thương của cao chiết ethanol từ lá Myxopyrum serratulum Kết

quả cho thấy trong mô hình vết thương trên chuột, thời gian liền vết thương và thời gian biểu bì hóa khi điều trị bằng cao chiết ethanol lần lượt là 19 và 17 ngày, tương đương với khi điều trị thuốc mỡ cipladin Ở các liều 100 mg/kg, 200 mg/kg, 400

mg/kg trọng lượng mô hạt hình thành lần lượt là 86,6; 85,3; 88,7 mg trong khi với cipladin 50 mg trọng lượng mô hạt là 146,4 mg [25]

1.3.4.6 Tác dụng chống ung thư

Năm 2015, Praveen R.P và Ashalatha S Nair đã đánh giá tác dụng gây độc

tế bào của cao chiết methanol từ rễ và mô sẹo của Myxopyrum smilacifolium trên

dòng tế bào ung thư gan HepG2 Kết quả cho thấy khi sử dụng phương pháp MTT, cao chiết methanol của rễ và mô sẹo ức chế sự phát triển của tế bào HepG2 với IC50 tương ứng là 63,75 μg/ml và 98,75 μg/ml Trên mô hình nhuộm Trypan blue, các cao chiết này cũng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư gan và ức chế mạnh nhất ở nồng độ 200 μg/ml [21]

1.3.5.Công dụng

Bộ phận dùng: Lá, rễ

Công dụng: Lá trị xáo trộn thần kinh, trị tê thấp, suyễn, ho [8], [10] Ở Ấn

Độ, lá được sử dụng làm thuốc trị hen suyễn, ho, thấp khớp, sốt, đau đầu, đau thần kinh, các vết thương [10], [19], [29], [30] Rễ dùng để trị ngứa và ghẻ ở trẻ em, các bệnh ho, sốt, thấp khớp, các vết cắn và vết thương [10], [19], [29]

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu thân, lá, rễ làm nguyên liệu nghiên cứu đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học

- Rễ cây được làm nhỏ, sấy khô ở 50°C, bảo quản trong túi nilong kín làm nguyên liệu nghiên cứu về mặt hóa học

- Nơi thu hái: Yên ái

- Thời điểm thu hái: tháng 11/2016

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

 Dụng cụ, thiết bị, máy móc:

Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

Máy cắt vi phẫu cầm tay, dao, bộ dụng cụ nhuộm tiêu bản

Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa thủy tinh, pipet, bình gạn, phiến kính, lam kính,…

Kính hiển vi quang học Leica

Máy cô quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi)

- Phổ khối lượng (MS): Hewlett Packard HP 5890, Serie II

 Hóa chất, dung môi:

Hóa chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: javel, cloralhydrat, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn

Dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu thành phần hóa học: TT Mayer,

TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT diazo mới pha, FeCl3 5%, geletin 1%, chì acetat 5%, TT Lugol, dung dịch natri nitroprussiat, TT ninhydrin 3%, ethanol 96%,

n-hexan, diclomethan, ethyl acetat, methanol, n-butanol, toluen, acid acetic, acid

formic,…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu cây Nhương lê kim cang thu hái ở Yên

Bái

- Giám định tên khoa học của mẫu

- Mô tả đặc điểm vi học của mẫu

2.2.2 Nội dung nghiên cứu hóa học

- Định tính sơ bộ các nhóm chất thường gặp trong rễ cây Nhương lê kim cang bằng các phản ứng hóa học

- Khảo sát các thành phần có trong dịch chiết phân đoạn n-butanol của rễ cây

Nhương lê kim cang bằng sắc ký lớp mỏng

- Phân lập và xác định cấu trúc các thành phần c trong phân đoạn n-butanol

của rễ cây Nhương lê kim cang bằng phương pháp sắc ký cột

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực

 Mô tả hình thái thực vật:

Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái cây Nhương lê kim cang theo phương pháp trong tài liệu [7]

 Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:

Thu thập các mẫu cây Nhương lê kim cang ở Yên Bái Các mẫu sau khi thu thập được xử lý và làm tiêu bản theo quy trình làm tiêu bản trong tài liệu [7] Đối chiếu với các mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật như: Cây cỏ Việt Nam [8], Từ điển cây thuốc Việt Nam [10], Thực vật chí Trung Quốc [33], tiêu bản mẫu tại Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật

Nhờ chuyên gia giám định tên khoa học của cây Các tiêu bản mẫu sau khi giám định tên khoa học được đưa vào lưu trữ tại bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội

 Nghiên cứu đặc điểm vi học:

- Cắt vi phẫu bằng dao và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép [3]

- Quan sát cấu tạo vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột thân, bột lá, bột rễ bằng kính hiển vi, chụp ảnh các đặc điểm vi học bằng máy ảnh theo phương pháp trong các tài liệu: [1], [3]

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hóa học

2.3.2.1 Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu ở rễ Nhương

lê kim cang bằng các phản ứng hóa học

Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo các tài liệu [1], [2], [4]

2.3.2.2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các chất phân lập được

- Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngâm lạnh, sử dụng dung môi là ethanol 80%, 3 lần, mỗi lần 7 ngày Gộp các dịch chiết, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao tổng Phân tán cao tổng trong 500 ml nước nóng 80°C

Chiết lỏng - lỏng với các dung môi c độ phân cực tăng dần: n-hexan, dichlomethan, ethyl acetat, n-butanol Dịch chiết các phân đoạn được cất thu hồi dung môi, thu được các cao phân đoạn tương ứng: cao n-hexan (cao H), cao dichlomethan (cao D), cao ethyl acetat (cao E), cao n-butanol (cao B), cao nước (cao N)

- Khảo sát thành phần hóa học có trong dịch chiết phân đoạn n-butanol bằng phương pháp SKLM

- Tiến hành phân lập các thành phần có trong dịch chiết phân đoạn n-butanol

CHƯƠNG III - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật của cây

Cây bụi trườn, dài 2-3 m, thân không có lông

Lá đơn, mọc đối, mép nguyên, phiến lá hình bầu dục thuôn, thon dài dần về phía gốc, mũi lá nhọn và ngắn Lá dài 10 - 15 cm, rộng 6 - 7 cm, cuống lá dài 0,5 – 1,5 cm

Cụm hoa hình chùy, mọc ở nách Quả hạch hình cầu

3.1.2 Giám định tên khoa học

Dựa vào quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái của mẫu, đối chiếu với các tài liệu tham khảo cùng sự giúp đỡ của Ths Bùi Hồng Quang - Viện Sinh thái

và Tài nguyên sinh vật, cây Nhương lê kim cang dùng để nghiên cứu đã được giám

định tên khoa học là Myxopyrum smilacifolium (Wall.) Blume, thuộc họ Nhài

Oleaceae Tiêu bản mẫu sau khi giám định được lưu tại tại bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu SD02

Hình 3.1 Tiêu bản Nhương lê kim cang

3.1.3 Đặc điểm vi phẫu lá

Cấu tạo gân lá mặt trên lõm, mặt dưới lồi Biểu bì trên (1) là một lớp tế bào tương đối đều đặn Lông che chở (13), c kích thước ngắn, mọc rải rác một vài cái ở mặt trên của lá Mô dày trên (2), gặp ở phần gân chính giữa của phiến lá, gồm 2 lớp

tế bào màu đỏ đậm, có vách dày, xếp thành dải Gỗ (3), gồm các bó mạch gỗ có kích thước to dần từ trên xuống dưới, xếp xen kẽ với các đám tế bào mô mềm gỗ và sợi gỗ (4) Libe (5) gồm các tế bào c kích thước nhỏ chỉ bằng 1/5 hoặc bằng 1/10

tế bào mô mềm, xếp thành từng đám xung quanh gỗ Sợi libe (6) là các tế bào có vách rất dày, bắt màu xanh xếp rải rác bên ngoài libe Mô dày (7) là vài tế bào có vách dày xếp thành từng đám nhỏ phía ngoài sợi libe Mô mềm (8) gồm các tế bào hình tròn, có vách mỏng, xếp lộn xộn nhau Mô dày dưới (9) gặp ở gân chính của

vi phẫu, cấu tạo khoảng 6 lớp tế bào có vách dày, bắt màu hồng đậm, kích thước không đều nhau và xếp lộn xộn nhau Biểu bì dưới (10) là một hàng tế bào tương đối đều đặn nhau

Cấu tạo phiến lá: gồm biểu bì trên và biểu bì dưới Mô khuyết (11) gồm các tế bào hình thù đa dạng, xếp thành từng đám cách nhau để hở khoảng trống lớn Mô giậu (12) cấu tạo bởi 1 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp sát nhau đến hết phần phiến lá