Phân lập và bước đầu định danh vi nấm biển từ vịnh nha trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP VÀ BƯỚC ĐẦU ĐỊNH DANH VI NẤM BIỂN TỪ VỊNH NHA TRANG Giáo viên hướng dẫn : TS PHẠM THU THỦY Sinh viên thực : HUỲNH NGÔ Ý NHI Mã số sinh viên : 55131222 Khánh Hòa: 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP VÀ BƯỚC ĐẦU ĐỊNH DANH VI NẤM BIỂN TỪ VỊNH NHA TRANG GVHD: TS Phạm Thu Thủy SVTH: Huỳnh Ngô Ý Nhi MSSV: 55131222 Khánh Hòa, tháng 6/2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Phân lập bước đầu định danh vi nấm biển từ vịnh Nha Trang” trình bày luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn xác rõ nguồn gốc Khánh Hòa, ngày 26 tháng 06 năm 2017 Tác giả luận văn Huỳnh Ngô Ý Nhi ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên muốn gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường tạo điều kiện cho hoàn thành khóa luận tốt nghiệp đại học Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn TS Phạm Thu Thủy PGS.TS Nguyễn Văn Duy tận tình bảo truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi thực đề tài Bên cạnh đó, muốn gửi lời cảm ơn đến toàn Quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học & Môi trường truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian năm đại học Cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị hỗ trợ, giúp đỡ, động viên suốt trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp đại học Khánh Hòa, ngày 26 tháng 06 năm 2017 Tác giả luận văn Huỳnh Ngô Ý Nhi iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG viii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi nấm biển 1.1.1 Giới thiệu vi nấm biển 1.1.2 Phân loại vi nấm 1.1.3 Vai trò ứng dụng vi nấm biển 1.1.4 Nấm men 1.1.4.1 Khái niệm nấm men 1.1.4.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo nấm men 1.1.4.3 Dinh dưỡng nấm men 1.1.4.4 Hình thức sinh sản nấm men 10 1.1.5 Nấm mốc 11 1.1.5.1.Khái niệm nấm mốc 11 1.1.5.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo nấm mốc 11 1.1.5.3 Dinh dưỡng nấm mốc 13 1.1.5.4 Hình thức sinh sản nấm mốc 14 1.2 Giới thiệu vịnh Nha Trang 15 1.3 Phương pháp định danh vi nấm biển 16 1.3.1 Định danh vi nấm quan sát hình thái 16 1.3.2 Định danh vi nấm kĩ thuật sinh học phân tử 17 1.3.3 Chỉ thị phân tử ứng dụng nghiên cứu phân loại vi nấm 18 iv 1.4 Một số nghiên cứu đa dạng vi nấm biển giới Vệt Nam 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 26 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Nguyên vật liệu 27 2.2.1 Môi trường 27 2.2.2 Thuốc nhuộm 28 2.2.3 Hóa chất khác 28 2.3 Dụng cụ thiết bị chuyên dụng 30 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 31 2.5 Phương pháp nghiên cứu 32 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu nước biển 32 2.5.2 Phân lập vi nấm phương pháp màng lọc 33 2.5.3 Phương pháp nuôi cấy bảo quản chủng vi nấm 34 2.5.4 Phương pháp soi tươi nhuộm đơn tế bào vi nấm 36 2.5.5 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số nấm mốc 37 2.5.6 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số nấm men 39 2.5.7 Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 vi nấm 40 2.5.8 Kỹ thuật điện di gel Agarose 41 2.5.9 Giải phân tích trình tự gen 42 2.5.10 Xây dựng phát sinh loài 42 2.5.11 Phương pháp xử lý số liệu Excel 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Phân lập vi nấm từ mẫu nước biển vịnh Nha Trang 43 v 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng vi nấm biển phân lập 43 3.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng nấm men phân lập 43 3.2.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng nấm mốc phân lập 53 3.3 Tách chiết DNA tổng số từ 14 chủng vi nấm biển vịnh Nha Trang 61 3.4 Giải phân tích trình tự gen đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 12 chủng vi nấm biển 64 3.4.1 Trình tự 12 chủng vi nấm biển 64 3.4.2 Phân tích trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 12 chủng vi nấm biển phân lập 70 3.5 Xây dựng phát sinh loài 74 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Viết đầy đủ PCR ITS Internal Transcribed Spacer DNA Deoxyribonucleic Acid rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid TAE Tris – Acetate EDTA Tm SDA Sabouraud Dextrose Agar 10 YPD Yeast Extract Peptone Dextrose 11 PDA Potato Dextrose Agar 12 SSU Small subunit (Tiểu đơn vị nhỏ) 13 LSU Large subunit (Tiểu đơn vị lớn) 14 IGS1 Intergenic Spacer 15 IGS2 Intergenic Spacer 16 VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định 17 RBP1 Retinol Binding Protein (Vùng liên gen 1) 18 RBP2 Retinol Binding Protein (Vùng liên gen 2) 19 nu - rDNA 20 mt -rDNA 21 NCBI National Center for Biotechnology Information 22 EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid 23 SDS Sodium Dodecyl Sulfate Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi nhờ polymerase) Melting temperature (Nhiệt độ nóng chảy) Nuclear - Ribosomal Deoxyribonucleic Acid (rDNA nhân) Mitochondrial Ribosomal Deoxyribonucleic Acid (rDNA ty thể) vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Đặc điểm hình thái tế bào nấm men Hình 1.2: Cấu tạo tế bào nấm men Hình 1.3: Cấu trúc thành tế bào nấm men Hình 1.4: Sợi nấm có vách ngăn sợi nấm không vách ngăn 12 Hình 1.5: Cấu trúc sợi nấm 13 Hình 1.6: Dạng bào tử đính 14 Hình 1.7: Hình thái tế bào khuẩn lạc nấm mốc Aspergillus fumigatus 16 Hình 1.8: Cơ quan sinh sản nấm mốc Aspergillus fumigatus 17 Hình 1.9: Cấu trúc gen rDNA nhân vi nấm 19 Hình 1.10: Hệ gen ty thể nấm Phlebia radiata 20 Hình 1.11: So sánh kết khuếch đại thị ITS, LSU, SSU RPB1 loài vi nấm 22 Hình 1.12: Gen rRNA nhân cặp mồi thể vùng ITS 22 Hình 2.1: Thiết bị lấy mẫu nước nằm ngang (Wildco, Mỹ) 33 Hình 2.2: Thiết bị lọc hút chân không 33 Hình 2.3: Cấy chuyển vi nấm sang đĩa peptri que cấy vòng 35 Hình 2.4: Làm tiêu giọt ép 37 Hình 3.1: Kết tách chiết DNA tổng số 14 chủng 61 Hình 3.2: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 chủng vi nấm biển Cửa sông Cái 62 Hình 3.3: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 chủng vi nấm biển bãi biển trung tâm Nha Trang 62 Hình 3.4: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 chủng vi nấm biển nhiệt độ bắt cặp 60°C 63°C 63 Hình 3.5: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 chủng vi nấm biển nhiệt độ bắt cặp 50°C 63 Hình 3.6 Cây phát sinh loài 12 chủng vi nấm biển phân lập 74 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thông tin chi tiết vị trí lấy mẫu 26 Bảng 3.1: Kết phân lập chủng vi nấm biển chạm lấy mẫu 43 Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc tế bào nấm men 44 Bảng 3.3: Hình thái khuẩn lạc tế bào nấm mốc 53 Bảng 3.4: Danh sách chủng lựa chọn cho định danh phương pháp sinh học phân tử 60 Bảng 3.5: Trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 12 chủng vi nấm biển 64 Bảng 3.6: So sánh trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 12 chủng phân lập với chủng gần GenBank công cụ BLAST 70 Bảng 3.7: Tổng kết chủng vi nấm biển qua bước nghiên cứu 73 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đặng Vũ Hồng Miên, Hệ thống nấm mốc Việt Nam Phân loại, tác hại, độc tố, cách phòng chống, 2015, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008, Giáo trình vi sinh đại cương Lại Thúy Hiền, Vương Thị Nga, Nguyễn Thị Yên, Đỗ Thu Phương, Kiều Thị Quỳnh Hoa, Nguyễn Thị Thu Huyền, Akihiko Maruyama, 2012, Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật vịnh tiếng Việt Nam phương pháp sinh học phân tử đại, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Tr 387-400 Lương Đức Phẩm, 2009, Nấm men công nghiệp, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào, 2011, Thực hành vi sinh vật học Nguyễn Đức Hùng, 2004, Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006, Thí Nghiệm Vi Sinh Vật, Tập Nguyễn Lân Dũng cộng sự, 2012,Vi sinh vật học,Tập Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2003, Vi sinh vật học 10 Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành, 2005, Giáo trình nấm học 11 Nguyễn Đình Luyện, Trần Thị Hồng Hà, Trần Thị Như Hằng, Lê Hữu Cường, Vũ Đình Giáp, Đỗ Hữu Nghị, Phạm Quốc Long, Nguyễn Hoài Nam, Lê Mai Hương, 2012, Khảo sát sơ hoạt tính kháng vi sinh vật số chủng nấm phân lập từ mẫu sinh vật biển Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Tr 448-455 12 Nguyễn Văn Hoàng, 2012, Một số giải pháp quản lý môi trường hoạt động du lịch khu bảo tồn biển vịnh Nha Trang – tỉnh Khánh Hòa, Tạp chí Khoa học Công nghệ & Phát triển, Tập 15, số M1, Tr 54-63 13 Trần Linh Thước, 2007, Phương pháp phân tích vi sinh vật 14 Trần Thị Lệ Quyên, Đào Thị Lương, Hà Thị Hằng, Dương Văn Hợp, 2010, Nghiên cứu đa dạng nấm men phân lập vườn quốc gia Cát Tiên núi 77 LangBiang Lâm Đồng, Hôi nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nghiên sinh vật lần thứ 15 Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải, 2008, Công nghệ sinh học, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ, Tập 16 Trần Thanh Thủy, Tống Kim Thuần, Phân loại chủng nấm men biển TS1 sinh lipid, phân lập từ nước biển đảo Trường Sa, 2005, Tạp chí khoa học công nghệ - Tập 43, số 4, Tr 15-21 17 Võ Thị Bích Vân, 2010, Nghiên cứu khả sinh enzym protease số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập măn, Luận văn thạc sĩ sinh học Tài liệu tiếng anh 18 Beck A., Hang I., Oberwinkler F., Kottke I., 2007, Structural characterization and molecular identification of arbuscular mycorrhiza morphotypes of Alzatea verticillata, a prominent tree in the tropical mountain rain forest of South Ecuador Mycorrhiza 17: 607-625 19 Blackwell, 2011, The fungi 5.1 million species Am J Bot 98:426-438 20 Begerow D., Nilsson H., Unterseher M., Maier W, 2010 Current state and perspectives of fungal DNA barcoding and rapid identification procedures Appl Microbiol Biotechnol 87:99-108 21 Christophersen C., Crescente O., Jens C Frisvad, Gram L, Nielsen J,Nielsen H P, Lisa Rahbak, 1999, Antibacterial activity of marine – derived fungi, Mycopathologia, 143(3), p 135-138 22 Deacon W J., 2006, Fungal Biology 4th Ed 23 David M., Geoffrey D R and Anthony P.J Trinci, 2011, Diversity marine fungi 24 Ebel R., 2010, Terpenes from marine – derived fungi Marine Drugs 8(8): 23402368 25 Gao Z., Zackary I J and Wang G, 2010, Molecular characterization of the spatial diversity and novel lineages of mycoplankton in Hawaiian coastal waters, The ISME Journal, 4:111-120 26 Li L., Singh P., Liu Y., Pan.S, Wang G., 2014, Diversity and biochemical features of culturable fungi from the coastal waters of Southern China, AMB Express 4:60 78 27 Marnel M., Ferd I P and Jac W., 2012, Diversity and Characteriz ation of Culturable Fungi from Marine Sediment Collected from St Helena Bay, South Africa 28 Nikos A., Lone H., Philip K., Michael R Hall, Gavin E., Rose E Cobb, Benjamin R Gordon, Elizabeth Evans-Illidge, 2015, Diversity of MarineDerived Fungal Cultures Exposed by DNA Barcodes: The Algorithm Matters 29 Hausner G., 2003, Fungal mitochondrial genomes, plasmids and introns, Fungal Genomics, p 101-131 30 Hawksworth D L., 2001, The magnitude of fungal diversity: the 1,5 million species estimate revisited Mycol Res 105:1422-1432 31 Hudspeth M., 1992, The fungal mitochondrial genome – a broader perspective, Ed Handbook of applied Mycology, Fungal Biotechnology 4:213-242 32 Josep G., G Josepa G., and Stchigel Alberto M., 1999, Developments in fungal taxonomy Clinical Microbiology Reviews 3:454-500 33 Joo-Hyun H., Seokyoon J., Young M H., Mihee M., Hwanhwi L., Young M L., Hanbyul L., Jae-Jin K., 2015, Investigation of marine derived fungal diversity and their exploitable biological activities Marine Drugs 13:41374155 34 Poll C., Brune T , Begerow D, Kandeler E., 2009, Small-scale diversity and succession of fungi in the detritusphere of rye residues, Microb Ecol 59:130140 35 Pietra F., 1997, Secondary metabolites from marine microorganisms: bacteria, protozoa, algae and fungi Natural Product Report 14:453-464 36 Rodrigues K.F., Hesse M., Werner C., 2000, Antimicrobial activities of sencondary metabolites produced by endophytic fungi from Spondias mombin Journal of basic microbiology 40:261-267 37 Raghukumar C., Raghukumar S., Chinnaraj A., Chandramohan D., D’ Souza T M and Reddy C A., 1994, Laccase and other lignocellulose modifying enzymes of marine fungi isolated from the coast of India Botanica Marina 37:515-523 38 Schmit J., and Mueller G., 2007, An estimate of the lower limit of global fungal diversity Biodivers Conserv 16: 99-111 79 39 Sherman F., et al.,1986, The laboratory course manual for methods in yeast genetics Cold spring harbor press, cold spring harber, p.179 40 Siti A A., Zainuddin N and Jones E B G, 2010, Biodiversity of marine fungi in Malaysian mangroves, Botanica Marina 53:545-554 41 Seifert K A., Samson R A., Dewaard J R., Houbraken J., Levesque C A., Moncalvo J M., Louis-Seize G., Hebert P D N., 2007, Prospects for fungus identification using COI DNA barcodes, with Penicillium as a test case, Proc Natl Acad Sci USA 104:3901-3906 42 Salavirta H., Oksanen I., Kuuskeri J., Makela M., Laine P., et al, 2014, Mitochondrial genome of Phlebia radiata is the second largest (156 kbp) among fungi and features signs of genome flexibility and recent recombination events, PloS ONE 9(5):e97141 43 Schoch C.L., Seifert K.A., Huhndrorf S., Robert V., Spouge J.L., Levesque C.A., etal, 2012, Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi Natl Acad 109:6241-6246 44 Taylor D L., Hollingsworth T N., McFarland J W., Lennon N J., Nusbaum C., and Ruess R W., 2014, A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning Ecol Monogr 84(1): 3-20 45 Tao Z., Neng F W., Yu Q Z., Hong Y L., Li Yan Y., 2015, Diversity and distribution of fungal communities in the marine sediments of Kongsfjorden, Savalbard High Arctic 5:14524 46 Toju H., Tanabe A S., Yamamoto S., Sato H., 2012, High Coverage ITS Primers for the DNA-Based Identification of Ascomycetes and Basidiomycetes in Enviromental Samples PloS ONE 7(7):e40863 47 O’Brien H E., Parrent J L., Jackson J A.,Moncalvo J M., and Vilgalys R., 2005, Fungal community analysis by large-scale sequencing of enviromental samples Appl Environ Microbiol 71:5544-5550 48 Van de Peer Y., Chapelle S., and De Wachter R., 1996 A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA Nucleic Acids Res 24:33813391 80 49 Vialle A., Feau N., Allaire M., Didukh M., Martin F., Moncalvo J M., Hamelin R C., 2009, Evaluation of mitochondrial genes as DNA barcode for Basidiomycota, Mol Ecol Resour 9:99-113 50 Wu B., Wiese J., Labes A., Kramer A., Schmaljohann R., Johannes F Imhoff, 2015, Lindgomycin an unusual antibiotic polyketide from a marine fungus of the Lindgomycetaceae Marine Drugs 13:4617-4632 51 White T J., Bruns T., Lee S and Tailor J., 1989 Amplication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for Phylogenetics Genetics and Evolution 3:315-320 52 Wei-Sheng C., Jun-Na H., Yu-Biao G., Hui-Ling Y., Can-Mao X., Yong-Cheng L., Zhi-Gang S., 2011, Bostrycin inhibits proliferation of human lung carcinoma A549 cells via downregulation of the PI3K/Akt pathway Journal of experimental & Clinical cancer research 30:17 53 Xu J., 2016, Fungal DNA barcoding, Genome 59: 913-932 54 Yi-Sheng C., Fujitoshi Y., Liang-Yu C., 2009, Isolation of marine yeasts from coastal waters of northeastern Taiwan, Aquatic Biology, 8:55-60 55 Yamamoto, Naruse H., A., Ohsak T., Sekiguchi and J., 1995 Nucleotide sequence and characterization of the large mitochondrial rRNA gene of Penicillium urticae, and its comparison with those of other filamentous fungi J Biochem 117:888-896 56 Zhou S., Wang M., Feng Q., Lin Y., Zhao H., 2016, A study on biological activity of marine fungi from different habitats in coastal regions, SpringerPlus 5:1966 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết BLAST chủng vi nấm phân lập từ vịnh Nha Trang ... Phân lập bước đầu định danh vi nấm biển từ vịnh Nha Trang nhằm góp phần cho định danh, mong muốn tìm kiếm loài điều mang lại đa dạng hệ sinh thái loài vi nấm Mục tiêu đề tài - Phân lập vi nấm. .. Phân lập chủng vi nấm từ mẫu nước ven biển từ vịnh Nha Trang - Tách chiết DNA tổng số chủng vi nấm biển phân lập - Khuếch đại trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 chủng vi nấm biển 2 - Bước đầu. .. ĐẠI HỌC NHA TRANG VI N CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP VÀ BƯỚC ĐẦU ĐỊNH DANH VI NẤM BIỂN TỪ VỊNH NHA TRANG GVHD: