phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn probiotic từ sữa dê

Họ đã thực hiện một số thử nghiệm điều tra một số tiêu chí cần phải có ở vi khuẩn probiotic như sự tồn tại trong điều kiện pH ở đường tiêu hóa, sản xuất hợp chất kháng khuẩn, sản xuất cá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN

PROBIOTIC TỪ SỮA DÊ

MSSV: 3102867 LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN

PROBIOTIC TỪ SỮA DÊ

MSSV: 3102867 LỚP: CNSH K36

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp

đỡ và động viên từ quý Thầy Cô và các bạn sinh viên Viện NC & PT Công nghệ Sinh

học, Trường Đại học Cần Thơ:

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và toàn thể quý Thầy Cô Viện NC & PT Công nghệ Sinh học đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời tri ân đến PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp, người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều từ quá trình học tập đến nghiên cứu và hoàn thành đề tài khoa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ths Trần Trà My, chị Nguyễn Thị Thúy Duy cùng tất cả các anh chị học viên cao học K18, K19, các anh chị sinh viên lớp Công nghệ sinh học K34, K35 tiên tiến và các bạn sinh viên cùng thực hiện đề tài tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến chú Năm Ngọt – Người chủ hộ nuôi dê ở Chợ Lách – Bến Tre đã cung cấp nguồn mẫu sữa dê để thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân đến cha mẹ và những người thân trong gia đình đã

động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành chương trình Đại học

Cần Thơ, ngày 24 tháng 11 năm 2013

LÊ DIỆP THÚY

TÓM LƯỢC

Mười sáu dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường MRS, trong đó có 13 dòng được phân lập từ sữa dê thu tại huyện Chợ Lách – Bến Tre, 2 dòng từ chế phẩm Bioacimin và 1 dòng từ chế phẩm Probio Phần lớn các dòng vi khuẩn phân lập có hình thái khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, màu sắc trắng đục đến trắng sữa, trong đó

có 4 dòng Probi G8.1, G10.1 và G10.2 có dạng bìa chia thùy Trong tổng số các dòng

vi khuẩn, có 4 dòng dạng que và 12 dòng dạng cầu tồn tại dạng đơn, kết đôi hay kết dạng chùm Tất cả các dòng vi khuẩn đều Gram dương, kết quả thử nghiệm oxidase

âm tính, không có khả năng chuyển động, trong đó có 7 dòng có kết quả thử nghiệm catalase âm tính, bao gồm 2 dòng Bio1.2 và Bio2.1 có nguồn gốc từ chế phẩm Bioacimin và 1 dòng Probi từ chế phẩm Probio và 4 dòng vi khuẩn từ sữa dê : G1.1, G5.1, G5.6 và G6.1 Bốn dòng vi khuẩn lactic trên được chọn để tiếp tục khảo sát khả năng chống chịu pH thấp và kháng thuốc kháng sinh Kết quả khảo sát có dòng không chịu được môi trường pH 3 trong 3 giờ là G5.1 Hầu hết các dòng đều có khả năng kháng kháng sinh tốt, có thể sử dụng cho những người nhạy cảm với kháng sinh

Từ khóa: Kháng kháng sinh, pH thấp, probiotic, sữa dê, vi khuẩn acid lactic

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2

2.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 2

2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 3

2.2 Khái niệm và một số loài vi sinh vật có tiềm năng probiotic 4

2.2.1 Khái niệm probiotic 4

2.2.2 Các nhóm vi sinh vật có tiềm năng probiotic 5

2.3 Lợi ích và tiềm năng của vi khuẩn probiotic 8

2.3.1 Điều hoà hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật gây bệnh 9

2.3.2 Cải thiện và tăng cường miễn dịch, giảm viêm và dị ứng 10

2.3.3 Phòng chống ung thư ruột 11

2.3.4 Hỗ trợ tiêu hoá và dung nạp lactose 12

2.3.5 Giảm cholesterol 13

2.3.6 Ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản và môi trường 13

2.3.7 Vấn đề chăn nuôi - thú y và những vai trò của probiotic 14

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Phương tiện nghiên cứu 15

3.1.1 Thiết bị thí nghiệm 15

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 15

3.1.3 Hoá chất thí nghiệm 15

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật từ nguồn sữa dê và chế phẩm men đông

khô 16

3.2.2 Phương pháp khảo sát các đặc tính vi sinh học 22

3.2.3 Phương pháp so sánh và đánh giá các thuộc tính probiotic 25

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Nguồn gốc các dòng phân lập 28

4.2 Giá trị pH các mẫu sữa dê 29

4.3 Một số đặc điểm khuẩn lạc và các thử nghiệm sinh hóa 30

4.3.1 Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 30

4.3.2 Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa dê 32

4.4 Đặc điểm tế bào và khả năng chuyển động 35

4.4.1 Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 35

4.4.2 Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa dê 36

4.5 So sánh và đánh giá khả năng kháng pH thấp 38

4.5.1 Ở độ pH 6,4 38

4.5.2 Ở độ pH 3 41

4.6 So sánh và đánh giá khả năng kháng kháng sinh 42

4.6.1 Ampicillin 42

4.6.2 Tetracylin 44

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Tiếng Việt 47

Tiếng Anh 48

Trang web 50

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phụ lục số liệu

Phụ lục 2: Phụ lục thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Các loài vi sinh vật thường xuất hiện trong các sản phẩm probiotic 8

Bảng 2: Thành phần môi trường MRS broth (De Man, Rogosa and Sharpe) .19

Bảng 3: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm sinh học và từ sữa dê 28

Bảng 4: Kết quả pH các mẫu sữa dê 29

Bảng 5: Một số đặc điểm khuẩn lạc và thử nghiệm sinh hóa chế phẩm men tiêu hóa 31

Bảng 6: Một số đặc điểm khuẩn lạc và thử nghiệm sinh hóa mẫu sữa dê 33

Bảng 7: Đặc điểm tế bào, khả năng chuyển động và kết quả nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn được phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 36

Bảng 8: Đặc điểm tế bào, khả năng chuyển động và kết quả nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu sữa dê 37

Bảng 9: Bảng giá trị OD của các mẫu ở pH 6,4 38

Bảng 10: Bảng giá trị OD của các mẫu ở pH 3 40

Bảng 11: Bảng kết quả so sánh khả năng kháng kháng sinh ampicillin 43

Bảng 12: Bảng kết quả so sánh khả năng kháng kháng sinh tetracylin 44

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Hình thái khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa: Bio1.2, Bio2.1 và Probi 31 Hình 2: Hình thái khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa: Bio1.2, Bio2.1 và Probi 32 Hình 3: Kết quả thử nghiệm catalase của một số dòng phân lập từ sữa dê 34 Hình 4: Ảnh nhuộm Gram của các dòng Bio1.2 (que ngắn) (A), Bio2.1 (cầu đôi) (B)

và Probi (que dài) (C) dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 35 Hình 5: Ảnh nhuộm Gram các dòng G1.1 (A), G9.1 (B) dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 36 Hình 6: Sự phát triển của các dòng vi khuẩn (Bio1.2, Bio2.1, Probio, G1.1, G5.1,

G5.6, G6.1) ở độ pH 6,4 (logCFU/ml) qua các mốc thời gian 40 Hình 7: Sự phát triển của các dòng vi khuẩn (Bio1.2, Bio2.1, Probio, G1.1, G5.1,

G5.6, G6.1) ở độ pH 3 (logCFU/ml) qua các mốc thời gian 41 Hình 8: Khả năng kháng kháng sinh Ampicillin (A) và Tetracylin (T) ở nồng độ

256mg/l của một số dòng vi khuẩn lactic phân lập: Bio2.1, G1.1, G5.6 và G6.1 43

CÁC TỪ VIẾT TẮT

WHO World Health Organization

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Khi những nhu cầu về vật chất được đáp ứng, chúng ta ngày càng quan tâm đến sức khỏe của mình hơn Vì vậy, con người đã và luôn đi tìm những sản phẩm tốt, vừa có thể tăng cường sức khỏe, vừa có thể ngăn ngừa và điều trị một số bệnh trong cơ thể Với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt trong lĩnh vực Công nghệ sinh học thì vấn đề trên không còn là vấn đề nan giải

Probiotic là sản phẩm không còn xa lạ trong đời sống của chúng ta Hàng ngàn năm trước con người đã biết sử dụng probiotic như một thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhưng vào những năm gần đây probiotics mới được đánh giá cao và nghiên cứu sâu hơn

Từ “probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp, có nghĩa tiếng Anh là “for life” nghĩa là “dành cho cuộc sống” Probiotic là “vi sinh sống trong đó khi được quản lý phù hợp về mật số lượng đem lại lợi ích cho sức khỏe trên vật chủ” (FAO, 2001) Cơ chế tác động của probiotics gần như giống với kháng sinh, ưu điểm của probiotic là an toàn, tự nhiên, và phần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào

Probiotic là những vi khuẩn sống trong đường tiêu hoá, chúng được mệnh danh là

“vi khuẩn tốt bụng” bởi vì giúp cơ thể bảo vệ chống lại một số các vi khuẩn có hại, nấm

và siêu vi Vi khuẩn dùng rộng rãi trong sản xuất probiotic và được thử nghiệm lâm sàng

nhiều nhất là các loại Lactobacillus (như L acidophilus, L rhamnosus, L bulgaricus, L

reuteri và L casei); nhiều dòng Bifidobacterium và Saccharomyces boulardii là những vi

nấm không gây bệnh Như vậy vi khuẩn Lactic là một trong những nguồn vi khuẩn

probiotic quan trọng nhất, chiếm ưu thế cao

Vì có nhiều cơ chế tác dụng, nhiều probiotic khác nhau có những ứng dụng cho nhiều bệnh khác nhau Vì vậy nguồn vi khuẩn probiotic càng phong phú sẽ góp thêm khả năng phòng và trị bệnh nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập được các dòng vi khuẩn probiotic từ sữa dê

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1899, một dòng Bifidobacterium lần đầu tiên được phân lập bởi Henry Tissier

và ông đặt tên là vi khuẩn Bacillus bifidus và vi khuẩn này về sau được đặt tên là

Bifidobacterium bifidum

Năm 1917, Alfred Nissle (người Đức) đã phân lập một dòng không gây bệnh của vi

khuẩn Escherichia coli từ phân của một người lính trong Thế chiến thứ I và ông đã dùng dòng vi khuẩn này chữa lành bệnh do vi khuẩn Salmonella và Shigella

Minoru Shirota (1899-1982) có một phát minh quan trọng vào năm 1930 khi làm việc tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học của Trường Đại học Hoàng gia Y khoa Kyoto (nay là Đại học Kyoto) Đó là việc phân lập và nuôi cấy được một dòng vi khuẩn thuộc

loài Lactobacillus casei và về sau được mang tên là dòng Lactobacillus casei Shirota Từ

đó đến nay các nhà khoa học Nhật Bản đã dày công nghiên cứu về tác dụng của vi khuẩn

này đối với sức khỏe con người

Martin et al (2003) đã phân lập vi khuẩn acid lactic từ sữa của 8 bà mẹ khỏe mạnh

và phân của họ Họ đã xác định vi khuẩn acid lactic bằng máy phân tích RAPD-PCR và trình tự 16S rDNA Kết quả họ đã xác định vi khuẩn phân lập từ sữa người như

Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Enterococcus faecium Những loài này

được coi là một trong các vi khuẩn probiotic (Holzapfel et al , 1998 và Collins et al.,

1998) và chứa các dòng được sử dụng trong các sản phẩm probiotic trên thị trường Heikkila và Saris (2003) đã tập trung vào hoạt động kháng khuẩn chống lại

Staphylococcus aureus của vi khuẩn phân lập từ sữa người Họ đã xác định các vi khuẩn

bằng các kỹ thuật phân tử khác nhau và đặt tên như là khuẩn tụ cầu, liên cầu và nhóm vi

khuẩn acid lactic (LAB) như Lactobacillus crispatus, Lactobacillus rhamnosus,

Lactococcus lactis và Leuonostoc mesenteroides, Enterococcus feacalis Sau đó, kiểm tra

hoạt động của các vi khuẩn kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus và đi đến kết

luận rằng vi khuẩn hội sinh trong sữa mẹ có một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ trẻ

sơ sinh và mẹ đối với Staphylococcus aureus

Martin et al (2004) đã nghiên cứu trên ba dòng Lactobacillus phân lập từ sữa mẹ,

xem chúng là vi khuẩn probiotic tiềm năng Họ đã thực hiện một số thử nghiệm điều tra một số tiêu chí cần phải có ở vi khuẩn probiotic như sự tồn tại trong điều kiện pH ở

đường tiêu hóa, sản xuất hợp chất kháng khuẩn, sản xuất các amin sinh học 2 dòng

Lactobacillus gasseri và 1 dòng Lactobacillus fermentum được đánh giá cho thấy rằng

tiềm năng probiotic của Lactobacillus phân lập từ sữa mẹ là tương tự như với các dòng

thường được sử dụng trong các sản phẩm probiotic thương mại

Olivares et al (2006) đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối với một số vi khuẩn gây

bệnh bằng bốn dòng Lactobacillus: Lactobacillus salivarius CECT5713, Lactobacillus

gasseri CECT5714, Lactobacillus gasseri CECT5715, Lactobacillus fermentum

CECT5716 phân lập từ sữa mẹ

Tambekar và Bhutada (2010) đã phân tích 120 mẫu sữa từ trâu, bò và dê (mỗi loài

40 mẫu) và xác định được 110 dòng vi khuẩn Lactobacillus tiêu biểu như: L acidophilus,

L brevis, L bulgaricus, L lactis, L plantarum, L rhamnosus, L helveticus, L casei và L fermentum có hoạt tính probiotic Từ các dòng vi khuẩn được phân lập xác định được 3

mẫu vi khuẩn có tiềm năng probiotic nổi trội nhất là L rhamnosus G119b, L plantarum G95a từ sữa dê và L plantarum C68a từ sữa bò

2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Phạm Thị Ngọc Lan et al (2003) đã phân lập được 789 dòng vi khuẩn lactic trong ruột gà Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định

được các dòng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis

và Lactobacillus salivarus (có khả năng kháng nồng độ 40% acid mật, sinh trưởng được

ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, Escherichia coli)

Nguyễn Thị Hồng Hà et al (2003) đã sử dụng hai dòng Bifidobacterium bifidum và

công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào

vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella

Nguyễn Thị Hường et al (2006) đã phân lập 192 dòng vi khuẩn lactic từ dạ dày, ruột non, ruột già và manh tràng của 9 con lợn ở giai đoạn trước và sau cai sữa Dựa trên

5 tiêu chuẩn của Pattterson et al (2003), đã tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn có đặc tính probiotic là dòng YHN77 và YHN99 Hai dòng này có thể ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic nhằm thay thế kháng sinh cho lợn con giai đoạn sau cai sữa

Ngô Thị Phương Dung et al (2011) đã phân lập vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men và sản phẩm men tiêu hóa đông khô Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn lactic

và kiểm tra tính kháng khuẩn 23 dòng biểu hiện tính kháng khuẩn chỉ thị B subtilis,

trong đó 10 dòng có khả năng tổng hợp bacteriocin Dòng DC213A được ghi nhận có tính kháng khuẩn mạnh nhất Kết quả định danh cho thấy 10 dòng này thuộc các giống

Leuconostoc, Enterococcus, Lactobacillus và Streptococcus

2.2 Khái niệm và một số loài vi sinh vật có thuộc tính probiotic

2.2.1 Khái niệm probiotic

Probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật sống, khi uống với số lượng nhất

định, sẽ phát huy lợi ích sức khỏe ngoài chức năng dinh dưỡng vốn có của nó (Guarner và

Schaafsma, 1998)

Theo khái niệm của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên Hợp Quốc và Tổ chức Y tế Thế giới: Probiotic là những vi sinh vật sống, khi đưa vào cơ thể ký chủ một lượng đầy đủ và hợp lý sẽ đem lại lợi ích về sức khỏe cho ký chủ

Như vậy, từ nhiều định nghĩa, khái niệm khác nhau của các tổ chức và cá nhân, ta rút ra khái niệm chung nhất về probiotic: Probiotic là những dòng vi sinh vật sống, bao gồm vi khuẩn hay vi nấm, nếu được đưa vào cơ thể với số lượng đầy đủ và được kiểm soát hợp lý sẽ đem lại sức khỏe cho người sử dụng bằng cách cải thiện các tính của hệ vi sinh vật bản địa

2.2.2 Các nhóm vi sinh vật có thuộc tính probiotic

Trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật mang thuộc tính probiotic (xem Bảng 1) Tuy nhiên, xét về tầm quan trọng và tính phổ biến thì chỉ có 4 nhóm vi khuẩn lactic là

Bifidobacterium Lactobacillus, Enterococcus và Streptococcus được quan tâm nghiên cứu

và ứng dụng hơn cả Lactobacillus và Bifidobacterium tạo thành một phần chính của hệ vi

sinh vật đường ruột ở người và động vật:

a) Nhóm vi khuẩn Bifidobacterium

Nhóm Bifidobacterium có chủ yếu trong ruột kết của người và động vật, nhất là ở trẻ

mới sinh được nuôi bằng sữa mẹ Số lượng của chúng trong ruột kết khá ổn dịnh cho đến khi về già thì số lượng giảm đi

Một số tính chất chung của các loài thuộc nhóm Bifidobacterium:

− Phân loại: thuộc nhóm trực khuẩn Gram dương, bất động, không sinh bào tử

− Hình dạng và kích thước: hình que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y, đường

kính khoảng 0,5µm, dài từ 2-3µm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009)

− Trạng thái: tập hợp thành khối, không chuyển động, không sinh bào tử

− Hình thức sinh sản: phân đôi

− Nhiệt độ sinh trưởng: từ 31-40oC

− Điều kiện sống: kỵ khí, ưa ẩm

− Kiểu lên men: lên men lactic dị hình

− Sản phẩm lên men chính: acid acetic và acid lactic, không sinh CO2

Cho đến nay đã có 30 loài thuộc nhóm Bifidobacterium được phân lập

Bifidobacterium được sử dụng như các probiotics gồm: Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium thermophilus, Bifidobacterium breve

b) Nhóm vi khuẩn Lactobacillus

Lactobacillus sống chủ yếu ở ruột non với khoảng 102 – 105 cfu/ml và ít hơn với

1% trong ruột kết

Một số tính chất chung của các loài thuộc nhóm Lactobacillus:

− Phân loại: thuộc nhóm trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử

− Hình dạng và kích thước: dạng hình que hay hình cầu, đường kính khoảng 0.5µm, chiều dài khoảng 3µm

− Trạng thái: đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi

− Hình thức sinh sản: phân đôi hay trực phân

− Nhiệt độ sinh trưởng: 30-35 oC là tối ưu

− Điều kiện sống: sống hiếu khí hay kỵ khí, ưa acid

− Kiểu lên men: lên men đồng hình hoặc dị hình

− Sản phẩm lên men chính: acid lactic, rượu etylic và chất thơm

Cơ chế tác động:

− Sinh ra acid lactic, hydrogen peroxide, một số chất giống bacteriocin ngăn chặn sự phát triển của một số vi khuẩn và nấm

− Lactobacillus còn điều chỉnh các tế bào miễn dịch không đặc hiệu bằng cách kích

thích hoạt động của lympho bào, các đại thực bào và giảm cytokine

Đến nay người ta đã tìm thấy 56 loài thuộc giống Lactobacillus Lactobacillus được sử

dụng như các probiotic bao gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus,

Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus fermentum,…

c) Nhóm vi khuẩn Streptococcus

Đại diện là Streptococcus thermophilus, được tìm thấy trong sữa và các sản phẩm từ

sữa Nó là một probiotic dùng trong sản xuất sữa chua

+ S thermophilus còn có thể hoạt động như một số chất chống ung thư, đặc

biệt chống trong trong khả năng bám chặt của vi khuẩn này vào các tế bào biểu mô

Có khả năng làm tăng số lượng tế bào sinh IgA đóng vai trò quan trọng trong việc tạo đáp ứng miễn dịch của màng nhầy

+ Chúng có khả năng chống vi khuẩn Listeria hiệu quả hơn các loài vi khuẩn

khác

+ L casei làm tăng mức lưu thông IgA ở trẻ bị nhiễm Rotavirus, do đó giúp

giảm bệnh tiêu chảy do Rotavirus gây nên

Nguồn cung cấp: các sản phẩm từ sữa

d) Nhóm vi khuẩn Enterococcus

Đại diện là Enterococcus faecium, là loại cầu khuẩn, kỵ khí không bắt buộc, Gram

dương, thuộc họ Streptococcaceae

Lên men các carbohydrate sinh ra acid lactic làm giảm pH đường ruột và ngăn chặn

sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh

Sinh ra hydroperoxide, bacteriocin, các chất kháng độc tố chống lại vi sinh vật gây bệnh, vô hoạt các vi khuẩn gây thoái hóa đường ruột

Giảm tính nhạy cảm với hầu hết thuốc kháng sinh nói chung

Bảng 1: Các loài vi sinh vật thường xuất hiện trong các sản phẩm probiotic

thermophilus Lactococcus lactis subsp lactis Lactococcus lactis subsp cremoris Propionibaterium freudenreichii Pediococcus acidilatici

Saccharomyces boulardii Leuoconostoc mesenteroides

2.3 Lợi ích và tiềm năng của vi khuẩn probiotic

Trong số các vi khuẩn được tìm thấy trong sữa động vật (sữa người, dê, bò ), những

loài thuộc Staphylococcus, Lactococcus, Enterococcus và Lactobacillus thì thường hiện diện Ngày càng có nhiều sự quan tâm đối với các loài thuộc nhóm Lactobacillus như L

gasseri, L salivarius, L rhamnosus, L plantarum và L fermentum, bởi vì chúng được

xem là là loài có tiềm năng probiotic

Nhiều nghiên cứu về vai trò mang lại những lợi ích sức khỏe của thực phẩm lên men

và probiotic Những tác động của vi khuẩn probiotic được đánh giá liên quan đến sức khỏe bao gồm:

− Điều hoà hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật gây bệnh

− Hỗ trợ tiêu hoá và điều khiển hoạt động không dung nạp lactose

− Cải thiện và tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm viêm và dị ứng

− Phòng chống ung thư ruột kết

− Giảm nồng độ cholesterol và triacylglycerol trong huyết tương

− Giảm huyết áp

− Ảnh hưởng có lợi đến quá trình trao đổi chất, mật độ và sự ổn định của xương, phòng ngừa loãng xương

− Giảm nhiễm Helicobacter pylori

− Phòng chống các bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu sinh dục

2.3.1 Điều hòa hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật gây bệnh

Đối với vấn đề này, probiotic đóng một vai trò điều hòa hệ vi khuẩn và tác động trực

tiếp trên tác nhân gây bệnh Ngoài ra, nó còn được dùng như một cách khôi phục sự cân bằng vi sinh bị gián đoạn bởi các kháng sinh và sự nhiễm trùng

Hơn nữa, hệ vi sinh vật lactic trong sữa chua (Lactococcus lactis, Lactococus

cremoris, Leuconostoc mesenteroide…) giúp làm giảm tỷ lệ bệnh tiêu chảy ở trẻ em

(Sarkar, 2008) Từ nhiều nghiên cứu cho thấy, các dòng probiotic khác nhau bao gồm

Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus rhamnosus GG và Lactobacillus casei

DN-114001 rất hữu ích trong việc giảm mức độ nghiêm trọng và thời gian lây nhiễm tiêu chảy do đã từng sử dụng thuốc kháng sinh trong thời gian dài Trong điều trị tiêu chảy do

rotavirus, Lactobacillus GG được báo cáo là thực sự hiệu quả trong việc rút ngắn thời

gian tiêu chảy Nó đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên khắp thế giới bởi một

số nhà nghiên cứu như Guandalini et al (2000), Pant et al (1996) Ngoài ra Lactobacillus

acidophilus LB1, Bifidobacterium lactis và Lactobacillus reuterii cũng được chứng minh

có hiệu quả mang lại lợi ích rút ngắn thời gian tiêu chảy (Salminen et al , 2004)

Một loại khác của bệnh tiêu chảy là tiêu chảy ở những người đi du lịch, ảnh hưởng

đến sự khoẻ mạnh của du khách không chỉ ở các nước đang phát triển mà còn ở châu Âu

Probiotic có hiệu quả trong việc ngăn ngừa một số triệu chứng của hiện tượng tiêu chảy

này Bằng chứng là Oksanen et al (1990) đã đánh giá hiệu quả của Lactobacillus GG

trong việc ngăn ngừa tiêu chảy ở 820 người đi du lịch từ Phần Lan đến Thổ Nhĩ Kỳ

Trong nghiên cứu in vitro đã chứng minh rằng một số dòng probiotic sản xuất các

hợp chất chống vi khuẩn, chẳng hạn như acid hữu cơ, H2O2 hoặc bacteriocins, reuterin

đã được chứng minh để ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn E coli, Salmonella spp và Listeria monocytogenes

Bên một số vi khuẩn có trong sữa mẹ cải thiện chức năng bảo vệ đường ruột bằng cách tăng sản xuất mucine và giảm tính thấm của đường ruột Tuy nhiên, sự cạnh tranh với các vi khuẩn sinh chất độc hay vi khuẩn gây bệnh về chất dinh dưỡng và sự gắn với thụ thể trên bề mặt biểu mô ruột là cơ chế chống viêm nhiễm chính của vi khuẩn

probiotic Chế phẩm sinh học được phân lập từ sữa người như L gasseri CECT5714, L

salivarius CECT5713 và L fermentum CECT5714 được chứng minh để ức chế sự bám

dính của vi khuẩn Salmonella cholerasuis vào mucin của ruột và tăng thời gian sống của

chuột bị nhiễm với các tác nhân gây bệnh

Các thử nghiệm lâm sàng khác nhau đã chứng minh rằng, trẻ em không có khả năng

được nuôi bằng sữa mẹ, thay vào đó trẻ được cung cấp chế độ ăn có bổ sung bằng chế

phẩm probiotic có thể bảo vệ trẻ em khỏi các bệnh viêm nhiễm Hầu hết các nghiên cứu

có liên quan đến bổ sung với L rhamnosus LGG, đã chứng minh có thể giảm tỷ lệ nhiễm

rotavirus và thời gian tiêu chảy

2.3.2 Cải thiện và tăng cường miễn dịch, giảm viêm và dị ứng

Nghiên cứu trên con người đã chỉ ra rằng các vi khuẩn probiotic có thể có tích cực

ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch của ký chủ (Mombelli và Gismondo, 2000) Dữ liệu

cho thấy tiêu thụ vi khuẩn acid lactic thuộc nhóm Lactobacillus và Bifidobacterium hỗ trợ

hệ thống miễn dịch chống lại một số tác nhân gây bệnh (Scheinbach, 1998 và Dugas et al , 1999) Probiotic ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch theo nhiều cách khác nhau: sản

xuất phân bào, kích thích đại thực bào, tăng tiết nồng độ IgA (Cakir, 2003, Scheinbach,

1998 và Dugas, et al , 1999)

Cũng trong một nghiên cứu trên người, Halpern et al (1991) bổ sung thức ăn của con người với 450 g sữa chua mỗi ngày trong 4 tháng và cuối cùng được quan sát thấy một sự gia tăng đáng kể trong việc sản xuất của γ-interferon

Trẻ em được bổ sung Lactobacillus rhamnosus GG và Bifidobacterium lactis Bb-12

cho thấy cải thiện triệu chứng dị ứng chàm so với nhóm dùng thuốc (Saarela, et al 2000)

Sự định cư ở đường ruột thường là kết quả của sự tiếp xúc đầu tiên của trẻ sơ sinh với vi sinh vật có lợi, đây là vai trò rất quan trọng cho phát triển của hệ thống miễn dịch của trẻ

sơ sinh Điều này được chứng minh rằng sự khác biệt trong thành phần vi sinh vật đường ruột ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc các bệnh lý nhất định có liên quan đến thành phần miễn dịch quan trọng, chẳng hạn như dị ứng hoặc quá trình viêm Với ý nghĩa này, tiêu thụ chế

phẩm probiotic từ sữa của con người, đặc biệt là L rhamnosus LGG cho thấy giảm tỷ lệ

mắc và mức độ nghiêm trọng của viêm da dị ứng ở trẻ

Các tác dụng điều hòa miễn dịch của chế phẩm sinh học cũng được chứng minh trong các bệnh lý của động vật nơi hệ thống miễn dịch có liên quan Dòng probiotic khác nhau được phân lập từ sữa của con người đã được báo cáo để tăng cường bảo vệ miễn

dịch của chuột Ngoài ra, probiotic từ sữa người như L gasseri CECT5714 kết hợp với L

Coryniformis CECT5711 làm giảm tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm trọng của phản ứng dị

ứng

Bên cạnh đó, các dòng E coli mang thuộc tính probiotic do Nissle khám phá năm

1917 có thể có tác dụng tương đương với Mesalazine (một loại thuốc điều trị viêm loét trong hệ tiêu hoá) trong việc giảm viêm loét đại tràng

2.3.3 Phòng chống ung thư ruột

Các nghiên cứu chỉ ra rằng nếu tiêu thụ chất béo bão hòa trong chế độ ăn uống dẫn

đến sự xuất hiện của ung thư ruột kết tăng lên trong thế giới phương Tây Enzyme của vi

khuẩn có hại (β-glucornidase, nitroreductase và azoreductase) chuyển đổi tiền chất gây

ung thư để tạo thành chất gây ung thư trong ruột kết Probiotic có khả năng giảm nguy cơ ung thư bằng cách giảm hoạt động enzyme của vi khuẩn

Nhiều bằng chứng cho thấy, việc tiêu thụ một số lượng lớn các sản phẩm khác từ

sữa, đặc biệt là các loại thực phẩm lên men như sữa chua có chứa Lactobacillus hay

Bifidobacterium có thể liên quan đến sự xuất hiện thấp bệnh ung thư ruột kết (Rafter,

2003, Hirayama và Rafter, 2000)

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng yếu tố tăng hoạt động của enzyme kích hoạt chất gây ung thư hoặc tăng lượng chất tiền ung thư (procarcinogen) trong ruột kết sẽ được thay đổi theo hướng tích cực bằng cách tiêu thụ probiotic (Brady et al , 2000)

2.3.4 Hỗ trợ tiêu hoá và dung nạp lactose

Trong số các vi khuẩn đường ruột, giới khoa học đặc biệt quan tâm nhiều tới một vài

vi khuẩn sinh acid lactic có tác dụng có lợi lên sức khỏe của con người Trong số này phải

kể đến 2 nhóm Lactobacillus và Bifidobacterium, chúng là một phần của hệ vi khuẩn

đường ruột và đã được sử dụng trong các sản phẩm sữa khác nhau

Ngoài ra, những phân tích phân tử các vi khuẩn này có vai trò trong hoạt động trao

đổi chất trong ruột người, tăng sản xuất của các chất có chức năng chuyển hóa như

butyrate Tăng độ ẩm của phân, số lần đi tiêu và khối lượng phân đã được quan sát mà có thể là liên quan đến sự gia tăng nồng độ của acid butyric trong phân

Ngoài ra, trong một thử nghiệm lâm sàng bổ sung cho trẻ sơ sinh với L rhamnosus

LGG đã được chứng minh để cải thiện sự tăng trưởng của trẻ, do vi khuẩn probiotic có vai trò điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột và nâng cao giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, cung cấp các acid amin tự do hoặc tổng hợp các vitamin cung cấp cho cơ thể Theo Isolauri (2001) sữa và các sản phẩm từ quá trình lên men sữa thường

được kết hợp với vi khuẩn probiotic được cung cấp để cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột,

giúp tiêu hoá tốt các loại thực phẩm khó tiêu hoá

Các chế phẩm probiotic có thể dùng vào chức năng cải thiện các triệu chứng ở những người bị hội chứng ruột kích thích Ngoài ra, chúng còn có chức năng giảm đầy

hơi bụng Hai loài vi sinh vật probiotic là Streptococcus thermophilus và Lactobacillus

delbrueckii ssp bulgaricus còn góp phần cải thiện tiêu hóa lactose và giảm các triệu

chứng liên quan đến không dung nạp lactose

2.3.5 Giảm cholesterol

Probiotic có vai trò quan trọng trong việc giảm cholesterol Một nghiên cứu về giảm

cholesterol đã cho thấy Lactobacillus reuteri CRL 1098 giảm cholesterol toàn phần 38%

khi nó được cung cấp cho chuột trong 7 ngày với lượng 104 tế bào VK/ ngày Liều

Lactobacillus reuteri này gây ra giảm 40% chất béo mà không có sự chuyển vi khuẩn vào

lá lách và gan (Kaur et al , 2002)

2.3.6 Ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản và môi trường

Đứng trước thực trạng trên, chế phẩm sinh học (probiotic) được coi là một công cụ

hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong ao nuôi, tạo nền tảng vững chắc cho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản trên thế giới Probiotic đã được chấp nhận rộng rãi để khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng Khác với biện pháp hóa học và kháng sinh, probiotic cung cấp một phương thức an toàn bền vững đối với người nuôi và tiêu dùng

Probiotic có khả năng chống nhiễm trùng do vi khuẩn và virus (như Rotavirus gây tiêu chảy), chống ung thư, kích thích hoạt động của hệ miễn dịch, làm giảm cholesterol

Vì probiotic tác động làm ổn định hệ vi sinh vật đường ruột, tăng các vi khuẩn có ích (các

vi khuẩn sinh vitamin, sinh chất kháng khuẩn, vi khuẩn phân giải đường bột ), làm giảm các vi khuẩn có hại (các vi khuẩn cạnh tranh thức ăn, sinh chất độc )

Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic còn là chế phẩm xử lý môi trường bằng cách kích thích sự gia tăng của các vi sinh vật có lợi trong ao nuôi Việc sử dụng các vi sinh vật hữu ích nhằm cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh, thay thế cho việc sử dụng hóa chất, kháng sinh là một giải pháp quan trọng kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản

Như vậy, mối lo lắng về sự xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc từ ao nuôi trồng thủy sản do sử dụng hóa chất, kháng sinh, có thể truyền gene kháng thuốc cho các vi khuẩn gây hại cho người (tồn tạo ngay trong ao nuôi tôm), làm cho kháng sinh không còn hiệu

dụng probiotic Hiện nay, việc sử dụng probiotic là giải pháp ưu việt nhất để có được năng suất, chất lượng, hiệu quả và sự phát triển bền vững của ngành nuôi trồng thủy sản

2.3.7 Vấn đề chăn nuôi - thú y và những vai trò của probiotic

Probiotic là chất bổ sung có chứa các vi khuẩn sống, có tác động làm cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, từ đó ảnh hưởng tốt cho động vật (Fuller, 1989) Cách thức hoạt động của probiotic là loại trừ cạnh tranh, qua đó tạo nên một hàng rào vật lý bảo vệ

sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh Chúng cũng sản xuất ra các hoạt chất kháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch của vật nuôi

Một số lợi ích nổi bật của probiotic trong chăn nuôi:

− Thúc đẩy tăng trưởng và giảm bệnh tiêu chảy, tác dụng của nó hiệu quả hơn

so với việc dùng kháng sinh liều thấp, giảm tỉ lệ chết non

− Thêm vào thức ăn để kích thích hoạt động hệ thống tiêu hóa, chức năng miễn dịch

− Giúp tăng trọng, tăng sản lượng sữa, cải thiện hiệu quả thức ăn và ở bò

− Sử dụng probiotic giúp những vi khuẩn có lợi định cư ở ruột và loại trừ bệnh

gây ra bởi các sinh vật như E coli, Salmonella và Clostridium ở những vị trí lông

nhung của ruột non, nơi mà vi khuẩn có hại sẽ phá hủy lông nhung Probiotic gia tăng sự kháng bệnh bằng cách tăng độ cao của lông nhung và tăng độ sâu của các khe nằm giữa lông nhung, theo cách đó sẽ gia tăng được diện tích bề mặt hấp thu chất dinh dưỡng Vì vậy, sẽ gia tăng hiệu quả hấp thu thức ăn

− Probiotic đặc biệt có thể tiêu diệt mầm bệnh vi khuẩn sống ở ruột gia cầm,

do đó giúp loại bỏ mối đe dọa sự ngộ độc thực phẩm vi khuẩn từ chuỗi thức ăn

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thiết bị thí nghiệm

− Tủ cấy vô trùng Airstream Biosafe II-ESCO (Pháp)

− Nồi khử trùng nhiệt ướt PBI international (Italia)

− Cân điện tử Satorius (Đức)

− Kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (Nhật)

− Tủ lạnh Sony (Nhật)

− Máy trộn đều IKA MS3

− Máy đo pH Eutech Intruments

− Máy đo OD Genesis 10UV (Hoa Kỳ)

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm

− Ống nghiệm (loại có nắp), Eppendorf (tuyp) 2 ml, Erlen (100-250-500ml), cốc thuỷ tinh (100-500ml)

− Micropipet các loại

− Đĩa petri, đèn cồn, kẹp và kim cấy

− Lame, lammelle, giấy thấm, marker, giấy parafilm

− Bọc nilon chịu nhiệt, dây thun

3.1.3 Hoá chất thí nghiệm

− Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic MRS (lỏng và đặc)

− Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, Fushin, Aceton, Iod, ethanol 95%

− Hoá chất sử dụng cho các thử nghiệm Catalase

− Hóa chất dùng để phân tích và chuẩn độ: NaOH, HCl…

− Nguồn vi khuẩn probiotic trong sản phẩm men tiêu hoá đông khô: Probio và Bioacimin

− Chất kháng sinh: Ampicilin, Tetracyclin

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật từ nguồn sữa dê và chế phẩm men

đông khô

a) Thu mẫu

Mẫu sữa dê

Phương pháp thu mẫu sữa dê được tiến hành như sau:

− Chuẩn bị túi nylon để chứa mẫu

− Khử trùng túi bằng cồn tuyệt đối, phơi khô cồn trong tử cấy vô trùng và

đựng trong một túi khác đã khử trùng

− Thu mẫu sữa: Thu 10 mẫu sữa dê từ 10 con dê cái trong giai đoạn nuôi con

và cho con bú Mỗi mẫu với thể tích khoảng 10 - 20ml (Chia thành 2 đợt)

− Trữ mẫu thu ở 0oC (trong bình trữ lạnh)

− Tiến hành các bước xử lý và phân lập tiếp theo ngay khi thu mẫu

Mẫu chế phẩm men tiêu hóa đông khô

− Mẫu chế phẩm men tiêu hóa đông được thu mua tại các cửa hàng thuốc trên

địa bàn Thành phố Cần Thơ

− Trữ và bảo quản mẫu ở điều kiện nhiệt độ phòng

− Tiến hành các bước xử lý và phân lập tiếp theo

b) Xử lý mẫu

Mẫu sữa dê

Sau khi thu mẫu, các mẫu sữa được xử lý theo phương pháp như sau trước khi phân lập:

− Lắc đều dung dịch sữa trong các túi nylon

− Trút hết mẫu vào ống nghiệm tương ứng

− Trộn đều ống nghiệm 5000 vòng/phút trong 4 lần

− Dùng micropipet hút mỗi M1ml cho vào Eppendorf 2ml thứ 1 (để trữ), đồng thời hút 1ml mẫu cho vào Eppendorf 2ml thứ 2 để pha loãng và phân lập (các Eppendorf đã được khử trùng bằng nồi khử trùng nhiệt ướt)

• Tiến hành pha loãng và trộn đều như sau:

+ Trộn đều Eppendorf 2ml thứ 2 (chứa dung dịch sữa gốc) 5000 vòng/phút trong 4 lần

+ Dùng miropipet hút 100µl dung dịch sữa gốc cho vào một Eppendorf 2ml mới + 900µl nước cất vô trùng Ta được dung dịch pha loãng 10 lần (gọi là Eppendorf 10-1)

+ Trộn đều Eppendorf 10-1 5000 vòng/phút trong 4 lần, hút 100µl dung dịch từ Eppendorf 10-1 cho vào Eppendorf 1,5ml mới + 900µl nước cất vô trùng Ta được dung dịch pha loãng 100 lần (gọi là Eppendorf 10-2)

+ Tiến hành pha loãng tương tự cho đến tỉ lệ pha loãng 1000 (gọi là Eppendorf

10-3) và áp dụng cho tất cả 10 mẫu sữa dê

Như vậy, sau khi pha loãng mỗi mẫu, ta có 4 tỉ lệ pha loãng khác nhau từ 10o đến

10-3 (gọi là Eppendorf 10o, 10-1, 10-2, 10-3)

Mẫu chế phẩm men tiêu hóa đông khô

− Chuẩn bị 6 bình tam giác loại 250ml

− Chuẩn bị 200ml môi trường MRS broth (pH 6,5) và chia vào 2 bình tam giác, mỗi bình 100ml môi trường

− Chuẩn bị nút gòn và nắp giấy cho mỗi bình Khử trùng tất cả các bình tam giác, nút gòn và nắp giấy

− Sản phẩm men tiêu hoá đông khô được hòa tan vào môi trường MRS broth theo phương pháp sau:

+ Probio:

 1g (tương ứng 109 CFU) hoà tan vào 100ml môi trường (pha loãng 100 lần) ta

được nồng độ pha loãng 107

 Lắc đều và pha loãng 1000 lần ta được nồng độ pha loãng 104 Chia 50 ml sang bình tam giác thứ 2

Như vậy, nghiệm thức lặp lại 2 lần cho nồng độ pha loãng 104 để thực hiện trong 2

điều kiện phân lập hiếu khí và kỵ khí

+ Bioacimin:

 3g (tương ứng 108 CFU) hoà tan vào 100ml môi trường (pha loãng 100 lần) ta

được nồng độ pha loãng 106

 Tiếp tục pha loãng đến 104, lắc đều và chia 50 ml sang bình tam giác thứ 2

Như vậy, nghiệm thức lặp lại 2 lần để thực hiện trong 2 điều kiện phân lập hiếu khí

và kỵ khí

− Chia 4 bình làm 2 nhóm (mỗi nhóm gồm 1 bình của chế phẩm Probio và 1 bình của chế phẩm Bioacimin ở nồng độ pha loãng 104) để ủ ở 37oC trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí khoảng 8 giờ

c) Phân lập vi khuẩn trên môi trường MRS agar

Chuẩn bị môi trường

Môi trường sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu này là môi trường MRS lỏng, môi trường MRS đặc:

+ Môi trường MRS đặc: MRS broth bổ sung 1,5% agar và CaCO3 (1.5%)

Bảng 2: Thành phần môi trường MRS broth (De Man, Rogosa and Sharpe)

− Áp dụng tương tự cho 5 mẫu với 4 mức pha loãng ta được 20 đĩa

− Ủ trong 2 điều kiện kỵ khí ở 37oC

− Quan sát sự phát triển và hình dạng của khuẩn lạc sau 24h, 48h và 72h

Phân lập từ mẫu chế phẩm men tiêu hóa đông khô

Vi khuẩn từ các chế phẩm men đông khô sau khi được xử lý được phân lập theo phương pháp sau:

− Chuẩn bị 8 đĩa petri (loại nhỏ) chứa môi trường MRS agar có bổ sung CaCO3

− Lần lượt lắc mạnh các bình tam giác chứa men đông khô (sau khi đã hoà tan vào môi trường MRS broth, pha loãng và ủ 37oC khoảng 8h) 5000 vòng/phút trong 4 lần

− Lần lượt dùng micropipet hút 50µl ở mỗi bình cho vào 1 đĩa petri và trải đều trên bề mặt môi trường

− Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37oC

− Quan sát sự phát triển và hình dạng của khuẩn lạc sau 24h, 48h và 72h

Nhận diện dạng khuẩn lạc nhóm vi khuẩn lactic

− Những dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc tròn hoặc thoi

có màu trắng đục, trắng ngà hay không màu, dạng lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy

− Khuẩn lạc này nằm trên đường cấy chuyển và không lẫn với những khuẩn lạc có hình thái và màu sắc lạ

− Khuẩn lạc có khả năng hòa tan CaCO3 tạo vùng trong suốt xung quanh

Tách ròng vi sinh vật

Sau khi các mẫu thí nghiệm đã có khuẩn lạc lên đến giai đoạn có thể tách ròng được,

áp dụng phương pháp cấy từ đĩa petri sang đĩa petri để tách ròng vi khuẩn:

− Chuẩn bị tủ cấy, kim cấy và đèn cồn

− Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn

− Mở nắp đĩa petri chứa khuẩn lạc điển hình của vi sinh vật cần chuyển, chấm nhẹ kim cấy vào môi trường đặc cho kim cấy nguội và chấm nhẹ đầu kim cấy vào khuẩn lạc, đậy nắp đĩa petri

− Mở nắp đĩa petri mới, cấy theo đường cấy ngoằn ngèo trên môi trường, đậy nắp đĩa petri lại và khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn trước khi để kim cấy xuống bàn

− Lật úp đĩa petri và đặt trong tủ ủ ở 37oC

− Quan sát sự phát triển của khuẩn lạc sau mỗi lần cấy và cấy chuyển nhiều lần

đến khi đạt độ ròng

Trữ mẫu để kiểm tra độ ròng

Áp dụng phương pháp cấy chuyển từ đĩa petri sang ống nghiệm:

− Chuẩn bị tủ cấy, kim cấy và đèn cồn

− Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn

− Mở nắp đĩa petri chứa các khuẩn lạc phát triển rời rạc và đồng nhất (ròng), chấm nhẹ kim cấy vào môi trường đặc cho kim cấy nguội và chấm nhẹ kim cấy vào khuẩn lạc, đậy nắp đĩa petri

− Mở nắp ống nghiệm chứa môi trường đặc mới, cấy theo đường zigzag trên môi trường, đậy nắp ống nghiệm lại, khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn trước khi đặt kim cấy xuống bàn

− Đặt các ống nghiệm trong tủ ủ ở 37oC

d) Kiểm tra độ ròng của vi khuẩn

− Lau kính mang vật (lame) và kính đậy vật (lammelle) bằng cồn 70o và hơ dưới

− Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội (nên chuẩn bị một đĩa môi trường MRS agar đã khử trùng và chiếu tia UV để làm nguội kim cấy, tránh mất thời gian)

− Chấm nhẹ đầu kim cấy vào khuẩn lạc trong ống nghiệm, lấy một ít vi khuẩn rồi trải đều lên giọt nước trên lame

− Đậy lammelle lại và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, sau đó chuyển

sang vật kính 40X

− Đánh giá và kết luận độ ròng của khuẩn lạc Nếu mẫu ròng, sử dụng khuẩn lạc trong ống nghiệm này cấy tiếp sang ống nghiệm thứ 2 để trữ cố định

3.2.2 Phương pháp khảo sát các đặc tính vi sinh học

a) Thí nghiệm 1: Mô tả hình dạng và sự chuyển động

Phương pháp sử dụng: Phương pháp giọt ép, giúp quan sát mẫu sống của vi khuẩn

dưới kính hiển vi quang học

Các bước thực hiện:

− Nhỏ giọt nước cất tiệt trùng lên kính mang vật

− Khử trùng kim cấy bằng lửa trên ngọn đèn cồn và để nguội

− Châm đầu kim cấy vào khuẩn lạc, lấy một ít vi khuẩn chấm vào giọt nước trên lame

− Dùng lammelle đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của lammelle tiếp xúc với lame một góc 45o, rồi hạ lammelle xuống từ từ sao cho không có bọt khí trong mẫu vật

− Quan sát dưới kính hiển vi điện tử để thấy hình dạng và sự chuyển động của

vi khuẩn trên từng dòng và ghi nhận kết quả

b) Thí nghiệm 2: Đo kích thước tế bào vi sinh vật

− Dụng cụ đo: Quan sát hình dạng và đo kích thước của tế bào vi khuẩn dưới kính

hiển vi quang học

− Phương pháp đo: Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh cho thấy rõ

ảnh của thước Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho 2

thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thức trắc vi vật kính thế nào cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với 1 vạch của thước trắc vi thị kính và 1 vạch thứ 2 nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính Đếm số khoảng của thước trắc

vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính Ta có trị số 1 khoảng của thước trắc vi thị kính

được tính theo công thức:

N: số khoảng của thước trắc vi vật kính

n số khoảng của thước trắc vi thị kính

X: trị số 1 khoảng của thước trắc vi thị kính

Thay thước trắc vi vật kính bằng mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu Di chuyển vi mẫu thế nào cho một đầu cũa mẫu đo trùng với 1 vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm 1 vạch thứ 2 trùng với đầu kia của mẫu dò Đếm số khoảng thước trắc vi nằm trong 2 vạch này Suy ra kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng nhân với trị số 1 khoảng của thước trắc vi thị kính

c) Thí nghiệm 3: Nhuộm Gram

− Lấy 10µl nước cất vô trùng nhỏ lên kính mang vật

− Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi sinh vật trải đều lên kính

− Hơ mẫu vật trên ngọn đèn cồn để cố định vi sinh vật

− Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong 2-3s,chậm nhẹ cho khô bớt nước hay để mẫu

− Rửa lại bằng nước cất vô trùng vài giây và chậm nhẹ

− Nhỏ 1-2 giọt Fushin, trải đều, để yên 1 phút

− Rửa lại nước cất vô trùng đến khi mất hết màu Fushin

− Dùng giấy thấm chấm nhẹ hay hơ cho khô nước

− Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn

Kết luận

− Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: vi khuẩn Gram dương

− Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: vi khuẩn Gram âm

d) Thí nghiệm 4: Kiểm tra sự hiện diện của enzyme catalase

Catalase là một enzyme được sản xuất bởi nhiều vi sinh vật phân hủy các hydrogen peroxide tạo nước và oxy gây ra bong bóng khí Sự hình thành của khí bong bóng cho thấy sự hiện diện của enzyme catalase theo phương trình sau:

2H2O2 → 2H2O + O2Dựa vào đặc điểm trên, phương pháp được tiến hành như sau:

− Cấy vi khuẩn probiotic ròng vào ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS

và cấy dòng vi khuẩn B subtilis vào ống thạch nghiêng đối chứng

− Nhỏ vài giọt H2O2 30% lên VSV trong ống nghiệm

− Quan sát sau 1 - 2s và kết luận:

+ Phản ứng dương tính (+): có bọt khí xuất hiện

+ Phản ứng âm tính (-): không có bọt khí xuất hiện

Nguồn: Hatice, 2007

e) Thí nghiệm 5: Kiểm tra sự hiện diện của enzyme oxydase

- Cấy chuyển các dòng vi khuẩn ròng sang đĩa petri theo đường cấy zigzag

+ Dương tính: giấy lọc đổi sang màu xanh dương đậm

+ Âm tính: giấy lọc không đổi màu

(Nguồn: Quy trình sử dụng bộ thuốc thử của Công ty Nam Khoa Biotek)

3 2.3 Phương pháp so sánh và đánh giá các thuộc tính probiotic

a) Thí nghiệm 6: So sánh và đánh giá khả năng chống chịu môi trường pH thấp

Phương pháp thực hiện

+ Chuẩn bị số ống nghiệm tương ứng với số dòng vi khuẩn thí nghiệm

+ Lấy sinh khối vi khuẩn từ ống nghiệm trữ vi sinh vật đã ủ 24h

+ Dòng vào 5ml nước cất vô trùng và trộn đều ống nghiệm

+ Hút dung dịch vi khuẩn pha loãng dòng vào dung dịch PBS (phosphate buffer saline) pH = 3 đã khử trùng

+ Trộn đều ống nghiệm

+ Sau các thời điểm 0h, 1h, 2h và 3h hút 1.5ml mỗi dòng vi khuẩn tương ứng trong dung dịch PBS đo mật độ quang OD ở bước sóng 610nm và hút 1ml để pha loãng và đếm mật số (thí nghiệm lặp lại 3 lần)



 Phương pháp đếm sống (đếm gián tiếp)

− Chuẩn bị ống nghiệm chứa dung dịch vi khuẩn phát triển trong môi trường có pH cần khảo sát

− Hút 1ml dung dịch vi khuẩn cho vào chai chứa 99ml nước cất vô trùng

− Lắc đều khoảng 20 lần ta được tỉ lệ pha loãng 10-2

− Tiếp tục thực hiện thao tác tương tự đến tỉ lệ pha loãng 10-5, tương ứng với mật số

vi khuẩn khoảng 100 - 300 tế bào trong 1ml

− Lắc đều chai có tỉ lệ pha loãng 10-5 trong 25 lần, dùng ống hút vô trùng hút 1ml và chuyển vào đĩa petri đã khử trùng

− Cho 25ml môi trường MRS agar lỏng ở 45oC vào đĩa

− Xoay nhẹ đĩa petri theo hình số 8

− Để môi trường đặc và ủ ở 37oC

− Quan sát và đếm số khuẩn lạc sau 48h

b) Thí nghiệm 7: So sánh và đánh giá khả năng kháng thuốc kháng sinh

Thực hiện trên hai loại kháng sinh: Tetracyclin, Ampicilin

Sự kháng với kháng sinh của vi khuẩn được xác định dựa theo phương pháp khuếch tán đĩa (disc diffusion) của NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)

Quy trình

- Lấy sinh khối vi khuẩn chủng vào 2ml môi trường MRS lỏng

- Nuôi hoạt hóa trong 24h ở 370C trong điều kiện kỵ khí

- Dùng micropipet hút 0,1ml dung dịch chứa sinh khối vi khuẩn nhỏ vào đĩa petri loại lớn và trải đều (mỗi dòng vi khuẩn trải ra 3 đĩa - lặp lại 3 lần)

- Chuẩn bị các mảnh giấy lọc có đường kính 0,6cm đã khử trùng

- Pha mỗi loại kháng sinh thành dãy nồng độ tăng dần từ 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8,

16, 32, 64, 128, 256 mg/l và khử trùng bằng bộ lọc vi khuẩn, mỗi nồng độ chứa trong một