phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn probiotic từ sữa dê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ SỮA DÊ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ DIỆP THÚY MSSV: 3102867 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ SỮA DÊ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ DIỆP THÚY MSSV: 3102867 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình thực đề tài, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ động viên từ quý Thầy Cô bạn sinh viên Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ: Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo toàn thể quý Thầy Cô Viện NC & PT Công nghệ Sinh học tận tình giảng dạy, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập nghiên cứu. Tôi xin gửi lời tri ân đến PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, người thầy tận tình hướng dẫn giúp đỡ nhiều từ trình học tập đến nghiên cứu hoàn thành đề tài khoa học. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ths. Trần Trà My, chị Nguyễn Thị Thúy Duy tất anh chị học viên cao học K18, K19, anh chị sinh viên lớp Công nghệ sinh học K34, K35 tiên tiến bạn sinh viên thực đề tài Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, giúp đỡ động viên suốt thời gian thực đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Năm Ngọt – Người chủ hộ nuôi dê Chợ Lách – Bến Tre cung cấp nguồn mẫu sữa dê để thực đề tài. Cuối cùng, xin gửi lời tri ân đến cha mẹ người thân gia đình động viên tạo điều kiện cho hoàn thành chương trình Đại học. Cần Thơ, ngày 24 tháng 11 năm 2013 LÊ DIỆP THÚY Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Mười sáu dòng vi khuẩn phân lập môi trường MRS, có 13 dòng phân lập từ sữa dê thu huyện Chợ Lách – Bến Tre, dòng từ chế phẩm Bioacimin dòng từ chế phẩm Probio. Phần lớn dòng vi khuẩn phân lập có hình thái khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, màu sắc trắng đục đến trắng sữa, có dòng Probi G8.1, G10.1 G10.2 có dạng bìa chia thùy. Trong tổng số dòng vi khuẩn, có dòng dạng que 12 dòng dạng cầu tồn dạng đơn, kết đôi hay kết dạng chùm. Tất dòng vi khuẩn Gram dương, kết thử nghiệm oxidase âm tính, khả chuyển động, có dòng có kết thử nghiệm catalase âm tính, bao gồm dòng Bio1.2 Bio2.1 có nguồn gốc từ chế phẩm Bioacimin dòng Probi từ chế phẩm Probio dòng vi khuẩn từ sữa dê : G1.1, G5.1, G5.6 G6.1. Bốn dòng vi khuẩn lactic chọn để tiếp tục khảo sát khả chống chịu pH thấp kháng thuốc kháng sinh. Kết khảo sát có dòng không chịu môi trường pH G5.1. Hầu hết dòng có khả kháng kháng sinh tốt, sử dụng cho người nhạy cảm với kháng sinh. Từ khóa: Kháng kháng sinh, pH thấp, probiotic, sữa dê, vi khuẩn acid lactic. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ . TÓM LƯỢC . MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG .v DANH SÁCH HÌNH vi CÁC TỪ VIẾT TẮT . vii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài .1 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nghiên cứu nước .2 2.1.1. Tình hình nghiên cứu nước .2 2.1.2. Tình hình nghiên cứu nước 2.2. Khái niệm số loài vi sinh vật có tiềm probiotic 2.2.1. Khái niệm probiotic .4 2.2.2. Các nhóm vi sinh vật có tiềm probiotic 2.3. Lợi ích tiềm vi khuẩn probiotic .8 2.3.1. Điều hoà hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật gây bệnh .9 2.3.2. Cải thiện tăng cường miễn dịch, giảm viêm dị ứng 10 2.3.3. Phòng chống ung thư ruột .11 2.3.4. Hỗ trợ tiêu hoá dung nạp lactose 12 2.3.5. Giảm cholesterol .13 2.3.6. Ứng dụng probiotic nuôi trồng thuỷ sản môi trường .13 2.3.7. Vấn đề chăn nuôi - thú y vai trò probiotic 14 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 3.1. Phương tiện nghiên cứu .15 3.1.1. Thiết bị thí nghiệm 15 3.1.2. Dụng cụ thí nghiệm .15 3.1.3. Hoá chất thí nghiệm 15 3.2. Phương pháp nghiên cứu .16 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT 3.2.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật từ nguồn sữa dê chế phẩm men đông khô .16 3.2.2. Phương pháp khảo sát đặc tính vi sinh học .22 3.2.3. Phương pháp so sánh đánh giá thuộc tính probiotic 25 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 4.1. Nguồn gốc dòng phân lập .28 4.2. Giá trị pH mẫu sữa dê .29 4.3. Một số đặc điểm khuẩn lạc thử nghiệm sinh hóa .30 4.3.1. Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 30 4.3.2. Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa dê 32 4.4. Đặc điểm tế bào khả chuyển động .35 4.4.1. Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 35 4.4.2. Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa dê 36 4.5. So sánh đánh giá khả kháng pH thấp .38 4.5.1. Ở độ pH 6,4 .38 4.5.2. Ở độ pH 41 4.6. So sánh đánh giá khả kháng kháng sinh 42 4.6.1. Ampicillin 42 4.6.2. Tetracylin 44 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận .46 5.2 Đề nghị .46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Tiếng Việt .47 Tiếng Anh .48 Trang web .50 PHỤ LỤC . Phụ lục 1: Phụ lục số liệu . Phụ lục 2: Phụ lục thống kê Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Các loài vi sinh vật thường xuất sản phẩm probiotic .8 Bảng 2: Thành phần môi trường MRS broth (De Man, Rogosa and Sharpe) .19 Bảng 3: Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm sinh học từ sữa dê .28 Bảng 4: Kết pH mẫu sữa dê 29 Bảng 5: Một số đặc điểm khuẩn lạc thử nghiệm sinh hóa chế phẩm men tiêu hóa 31 Bảng 6: Một số đặc điểm khuẩn lạc thử nghiệm sinh hóa mẫu sữa dê .33 Bảng 7: Đặc điểm tế bào, khả chuyển động kết nhuộm Gram dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa .36 Bảng 8: Đặc điểm tế bào, khả chuyển động kết nhuộm Gram dòng vi khuẩn phân lập từ mẫu sữa dê 37 Bảng 9: Bảng giá trị OD mẫu pH 6,4 38 Bảng 10: Bảng giá trị OD mẫu pH .40 Bảng 11: Bảng kết so sánh khả kháng kháng sinh ampicillin 43 Bảng 12: Bảng kết so sánh khả kháng kháng sinh tetracylin .44 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa: Bio1.2, Bio2.1 Probi 31 Hình 2: Hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa: Bio1.2, Bio2.1 Probi 32 Hình 3: Kết thử nghiệm catalase số dòng phân lập từ sữa dê .34 Hình 4: Ảnh nhuộm Gram dòng Bio1.2 (que ngắn) (A), Bio2.1 (cầu đôi) (B) Probi (que dài) (C) kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần .35 Hình 5: Ảnh nhuộm Gram dòng G1.1 (A), G9.1 (B) kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần .36 Hình 6: Sự phát triển dòng vi khuẩn (Bio1.2, Bio2.1, Probio, G1.1, G5.1, G5.6, G6.1) độ pH 6,4 (logCFU/ml) qua mốc thời gian 40 Hình 7: Sự phát triển dòng vi khuẩn (Bio1.2, Bio2.1, Probio, G1.1, G5.1, G5.6, G6.1) độ pH (logCFU/ml) qua mốc thời gian .41 Hình 8: Khả kháng kháng sinh Ampicillin (A) Tetracylin (T) nồng độ 256mg/l số dòng vi khuẩn lactic phân lập: Bio2.1, G1.1, G5.6 G6.1 .43 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT BOD Biochemical Oxygen Demand CFU Colony Forming Unit FAO Food and Agriculture Organization HTLV human T-cell leukemia virus IBS Irritable Bowel Syndrome MRS Man Rogosa Sharpe NK natural killer RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA rDNA Recombinant DNA VSV Vi Sinh Vật WHO World Health Organization Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Khi nhu cầu vật chất đáp ứng, ngày quan tâm đến sức khỏe hơn. Vì vậy, người tìm sản phẩm tốt, vừa tăng cường sức khỏe, vừa ngăn ngừa điều trị số bệnh thể. Với phát triển không ngừng khoa học kỹ thuật, đặc biệt lĩnh vực Công nghệ sinh học vấn đề không vấn đề nan giải. Probiotic sản phẩm không xa lạ đời sống chúng ta. Hàng ngàn năm trước người biết sử dụng probiotic thực phẩm bảo vệ sức khỏe vào năm gần probiotics đánh giá cao nghiên cứu sâu hơn. Từ “probiotic” bắt nguồn từ Hy Lạp, có nghĩa tiếng Anh “for life” nghĩa “dành cho sống”. Probiotic “vi sinh sống quản lý phù hợp mật số lượng đem lại lợi ích cho sức khỏe vật chủ” (FAO, 2001). Cơ chế tác động probiotics gần giống với kháng sinh, ưu điểm probiotic an toàn, tự nhiên, phần lớn ảnh hưởng có hại nào. Probiotic vi khuẩn sống đường tiêu hoá, chúng mệnh danh “vi khuẩn tốt bụng” giúp thể bảo vệ chống lại số vi khuẩn có hại, nấm siêu vi. Vi khuẩn dùng rộng rãi sản xuất probiotic thử nghiệm lâm sàng nhiều loại Lactobacillus (như L. acidophilus, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. reuteri L. casei); nhiều dòng Bifidobacterium Saccharomyces boulardii vi nấm không gây bệnh. Như vi khuẩn Lactic nguồn vi khuẩn probiotic quan trọng nhất, chiếm ưu cao. Vì có nhiều chế tác dụng, nhiều probiotic khác có ứng dụng cho nhiều bệnh khác nhau. Vì nguồn vi khuẩn probiotic phong phú góp thêm khả phòng trị bệnh nhằm bảo vệ sức khỏe cho người. 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập dòng vi khuẩn probiotic từ sữa dê. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT Martin, R., M. Olivares, M.L. Marin, L. Fernandez, J. Xaus and J.M. Rodriguez. 2005. Probiotic potential of Lactobacilli strains isolated from breast milk. J Hum Lact, 21(1): 8-17. Martin, R., S. Langa, C. Reviriego, E. Jimenez, L.M. Marin, J. Xaus, L. Fernandez and J.M. Rodriguez. 2003. Human milk is a source of lactic acid bacteria for infant gut. The Journal of Pediatrics, 143: 754-758. Martin, R., S. Langa, C. Reviriego, E. Jimenez, L.M. Marin, J. Xaus, L. Fernandez and J.M. Rodriguez. 2003. Human milk is a source of lactic acid bacteria for infant gut. The Journal of Pediatrics, 143: 754-758. Martin, R., S. Langa, C. Reviriego, E. Jimenez, L.M. Marin, M. Olivares, J. Boza, J. Jimenez, L. Fernandez, J. Xaus and J.M. Rodriguez. 2004. The commensal microflora of human milk: New perspectives for food bacteriotherapy and probiotics. Trends in Food Science&Technology, 15: 121-127. Martin, R., S. Langa, C. Reviriego, E. Jimenez, L.M. Marin, M. Olivares, J. Boza, J. Jimenez, L. Fernandez, J. Xaus and J.M. Rodriguez. 2004. The commensal microflora of human milk: New perspectives for food bacteriotherapy and probiotics. Trends in Food Science&Technology, 15: 121-127. Olivares, M., M.P. Diaz-Ropero, R. Martin, J.M. Rodriguez and J. Xaus. 2006. Antimicrobial potential of four Lactobacillus strains isolated from breast milk. Journal of Applied Microbiology, 101: 72-79. Rafter, J. 2003. Probiotics and colon cancer. Best Practice and Research Clinical Gastroenterology, 17(5): 849-859. Salminen, S., S. Gorbach, Y.K. Lee and Y. Benno. 2004. Human studies on probiotics: What is scientifically proven today?. Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional Aspects, New York: Marcel Dekker Inc. Scheinbach, S. 1998. Probiotics: Functionality and commercial status. Biotechnology Advances, 16(3): 581-608. Schrezenmeir, J. and M. Vrese. 2001. Probiotics, prebiotics, and synbiotics – approaching a definition. Am. J. Clin. Nutr., 73: 361-364. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 49 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT Tambekar D.H. and S.A. Bhutada. 2010. An evaluation of probiotic potential of Lactobacillus sp. from milk of domestic animals and commercial available probiotic preparations in prevention of enteric bacterial infections. Recent Research in Science and Technology, 2(10): 82-88. Trang web http://camnangthuoc.vn/news/disease.php?id=658&cid=3 (1/8/2013) http://qlkh.tnu.edu.vn/theme/details/713/phan-lap-tuyen-chon-mot-so-chunglactobacillus-co-kha-nang-sinh-axit-lactic-cao-tu-cac-san-pham-len (1/8/2013) http://vov.vn/Home/4-su-that-ve-ung-thu-dai-trang/20094/110019 (1/8/2013) http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=688 (1/8/2013) http://www.yakult.vn/pressarticle/detail/id/164/Ung-thu-ruot-ket-va-khuan-duong-ruot/ (1/8/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 50 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phụ lục số liệu Bảng 13: Bảng giá trị pH mẫu sữa dê Mau 10 L1 6.69 6.72 6.92 6.82 6.88 6.86 6.93 L2 6.69 6.72 6.93 6.83 6.88 6.86 6.93 L3 6.70 6.74 6.95 6.83 6.89 6.86 6.93 6.80 6.90 6.85 6.79 6.90 6.86 6.80 6.90 6.85 Bảng 14: Bảng giá trị OD 600 nm mẫu sữa dê pH 6,4 Thời gian 0h Dòng Bio1.2 Bio2.1 Probi G1.1 G5.1 G5.6 G6.1 Lần Lặp 3 3 3 Gia tri OD TB OD 0.629 0.643 0.646 0.653 0.602 0.606 0.606 0.61 0.998 1.054 1.088 1.075 0.629 0.626 0.624 0.625 0.442 0.433 0.428 0.428 0.627 0.621 0.617 0.619 0.635 0.634 0.631 0.635 1h Gia tri OD 0.632 0.652 0.645 0.606 0.612 0.598 1.02 1.062 1.07 0.605 0.632 0.626 0.457 0.443 0.4 0.604 0.632 0.631 0.615 0.641 0.644 TB OD 0.643 0.605 1.051 0.621 0.433 0.622 0.633 2h Gia tri OD 0.632 0.64 0.635 0.605 0.61 0.607 1.037 1.046 1.038 0.616 0.623 0.626 0.42 0.432 0.438 0.629 0.622 0.627 0.631 0.633 0.64 3h TB OD 0.636 0.607 1.04 0.622 0.43 0.626 0.635 Gia tri OD 0.637 0.638 0.64 0.602 0.601 0.61 1.062 1.059 1.053 0.621 0.626 0.628 0.435 0.437 0.43 0.624 0.623 0.62 0.638 0.635 0.63 TB OD 0.638 0.604 1.058 0.625 0.434 0.622 0.634 Bảng 15: Bảng số lượng khuẩn lạc theo thời gian pH 6,4 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT Thời gian Dòng Bio1.2 Lặp 3 3 3 Bio2.1 Probi G1.1 G5.1 G5.6 G6.1 0h So KL TB KL 38 37.333 37 37 40 40.333 39 42 26 26.333 27 26 31 28 31 34 27 27.333 27 28 32 30.333 30 29 1h 2h TB So KL KL 35 36.667 36 39 36 39.333 42 40 3.333 28 27.333 28 26 33 31.667 33 29 29 27.667 28 26 31 30.333 30 30 So KL 37 38 34 37 38 40 27 25 28 32 29 32 27 26 29 32 29 31 3h TB KL 36.333 38.333 3.333 26.667 31 27.333 30.667 So KL TB KL 37.333 35 38 39 38.667 38 40 38 26.333 25 27 27 31.667 34 30 31 27.333 25 30 27 30 33 28 29 Bảng 16: Bảng giá trị OD 600 nm mẫu sữa dê pH Thời gian 0h Dòng Bio1.2 Bio2.1 Probi G1.1 G5.1 G5.6 Lặp 3 3 3 Gia tri OD 0.581 0.6 0.574 0.599 0.595 0.597 0.992 0.995 0.994 0.769 0.772 0.773 0.493 0.573 0.486 0.782 0.79 0.778 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học TB OD 0.585 0.597 0.994 0.771 0.517 0.783 1h Gia tri OD 0.551 0.539 0.54 0.591 0.595 0.597 0.997 0.997 0.994 0.747 0.76 0.757 0.095 0.091 0.092 0.79 0.809 0.771 TB OD 0.543 0.594 0.996 0.755 0.093 0.79 2h Gia tri OD 0.562 0.55 0.57 0.6 0.598 0.607 1.071 1.082 1.08 0.728 0.809 0.784 0.085 0.093 0.089 0.776 0.779 0.771 3h TB OD 0.561 0.602 1.078 0.774 0.089 0.775 Gia tri OD 0.554 0.542 0.535 0.607 0.608 0.601 0.98 0.997 0.703 0.709 0.701 0.081 0.083 0.086 0.796 0.776 0.789 TB OD 0.544 0.605 0.992 0.704 0.083 0.787 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 G6.1 0.797 0.796 0.786 0.81 Trường ĐHCT 0.796 0.805 0.788 0.794 0.793 0.793 0.79 0.795 0.792 0.79 0.79 0.791 Bảng 17: Bảng số lượng khuẩn lạc theo thời gian pH Thời gian Dòng Bio1.2 Lặp 3 3 3 Bio2.1 Probi G1.1 G5.1 G5.6 G6.1 0h 1h 2h So TB KL KL 43 44.333 45 45 34 32.333 31 32 4.333 5 52 53 54 49 45 42 45 48 55 52 58 55 63 62 63 64 So KL TB KL 38 38.333 40 37 30 31.667 32 33 4 50 50.667 49 53 0 0 53 54.667 54 57 62 65 60 61 So KL TB KL 30 32.667 35 33 30 27 29 34 3.667 4 50 52 51 47 0 0 56 53.667 52 53 59 60.333 61 61 3h So KL TB KL 33 30 34 35 29 26 33 28 3.333 3 48 45 48 51 0 0 53.667 56 54 51 56.333 58 57 54 Bảng 18: Bảng số liệu kháng sinh ampicillin STT Dòng Probi Bio1.2 Bio2.1 15 G1.1 16 17 G5.6 G6.1 Lần lặp 2 2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 0.1 SL T 5 5 5 5.5 5 0.3 SL T 5 5 5.5 6 5.5 5.5 6.5 0.5 SL T 5 5.5 6 6.5 6.5 6.5 6.5 SL T 5 6.5 7 6.5 6.5 6.5 Nồng độ kháng sinh (mg/L) 16 32 SL SL SL SL SL T T T T T 5 5 5 5 5 7 7.5 7.5 11 7 7.5 10 6.5 7.5 8 7 7.5 7.5 7 6.5 7 6.5 7 8 6.5 6.5 7 7 7.5 64 128 256 SL SL SL T T T 10 15 18 11 14 18 12 12 17 11 13 16.5 13 14.5 18.5 13 13.5 18 13 13 17 12 13 17 11 14 17 10 14 18 11 12 19 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT 5.5 6.5 6.5 7.5 7.5 7.5 11 12 18 Bảng 19. Bảng số liệu kháng sinh tetracylin STT Dòng Probi Bio1.2 Bio2.1 15 G1.1 16 G5.6 17 G6.1 0.1 SL T 5 5 6 5.5 5.5 5 5.5 Lần lặp 2 2 2 0.3 SL T 5 5.5 6.5 6 5.5 5.5 6.5 0.5 SL T 5 6.5 6.5 6.5 6 6.5 6.5 SL T 5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 7 Nồng độ kháng sinh (mg/L) 16 32 64 SL SL SL SL SL SL T T T T T T 5 5 10 5 5 11 7 7.5 10 6.5 7.5 8.5 11 6.5 9 10 7 9.5 7.5 7.5 10 11 7.5 8 10 10 8 9 12 7.5 8.5 9.5 11.5 8 8.5 7.5 8.5 9.5 128 256 SL SL T T 13 16 14 17 15 22 16 22 15 20 16 18 15 20 16 19 15 19 15 20 16 19.5 15 20 Phụ lục 2: Phụ lục thống kê 2.1. Thí nghiệm pH mẫu sữa dê One-way ANOVA: M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10 Source Factor Error Total DF 20 29 SS 0.1778300 0.0010667 0.1788967 S = 0.007303 MS 0.0197589 0.0000533 R-Sq = 99.40% F 370.48 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.14% Grouping Information Using Tukey Method M3 M7 M9 M5 M6 M10 M4 M8 M2 M1 N 3 3 3 3 3 Mean 6.93333 6.93000 6.90000 6.88333 6.86000 6.85333 6.82667 6.79667 6.72667 6.69333 Grouping A A B B C C D E F G 2.2 So sánh thử nghiệm khả kháng pH thấp 2.2.1 pH = 6,4 a) OD 600 nm Bio1.2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0001129 0.0005480 0.0006609 S = 0.008276 MS 0.0000376 0.0000685 R-Sq = 17.08% F 0.55 P 0.662 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 1h 0h 3h 2h N 3 3 Mean 0.643000 0.642667 0.638333 0.635667 Grouping A A A A Bio2.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0000143 0.0001920 0.0002063 S = 0.004899 MS 0.0000048 0.0000240 R-Sq = 6.91% F 0.20 P 0.895 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 2h 0h 1h 3h N 3 3 Mean 0.607333 0.606000 0.605333 0.604333 Grouping A A A A Probio One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.000509 0.006266 0.006775 S = 0.02799 MS 0.000170 0.000783 R-Sq = 7.51% F 0.22 P 0.882 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 3h 0h 1h 2h N 3 3 Mean 1.05800 1.05367 1.05067 1.04033 Grouping A A A A G1.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0000543 0.0004947 0.0005489 S = 0.007863 MS 0.0000181 0.0000618 R-Sq = 9.88% Trường ĐHCT F 0.29 P 0.830 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 3h 2h 1h N 3 3 Mean 0.626000 0.625000 0.621667 0.621000 Grouping A A A A G5.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.000028 0.002089 0.002117 S = 0.01616 MS 0.000009 0.000261 R-Sq = 1.31% F 0.04 P 0.990 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 3h 1h 0h 2h N 3 3 Mean 0.43400 0.43333 0.43267 0.43000 Grouping A A A A G5.6 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0000416 0.0005953 0.0006369 S = 0.008627 MS 0.0000139 0.0000744 R-Sq = 6.53% F 0.19 P 0.903 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 2h 3h 1h 0h N 3 3 Mean 0.626000 0.622333 0.622333 0.621000 Grouping A A A A G6.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0000033 0.0005967 0.0006000 MS 0.0000011 0.0000746 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học F 0.01 P 0.997 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 S = 0.008636 R-Sq = 0.56% Trường ĐHCT R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 2h 3h 0h 1h N 3 3 Mean 0.634667 0.634333 0.633667 0.633333 Grouping A A A A b) Mật số pH 6,4 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.000326 0.003754 0.004080 S = 0.02166 MS 0.000109 0.000469 R-Sq = 7.99% F 0.23 P 0.872 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 3h 1h 2h N 3 3 Mean 8.87309 8.87267 8.86484 8.86085 Grouping A A A A Bio2.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.000845 0.003800 0.004644 S = 0.02179 MS 0.000282 0.000475 R-Sq = 18.18% F 0.59 P 0.637 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 3h 2h N 3 3 Mean 8.90649 8.89490 8.88824 8.88438 Grouping A A A A Probio One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 S = 0.2184 SS 0.0363 0.3815 0.4178 MS 0.0121 0.0477 R-Sq = 8.68% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học F 0.25 P 0.857 R-Sq(adj) = 0.00% Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT Grouping Information Using Tukey Method 2h 1h 3h 0h N 3 3 Mean 7.8198 7.8198 7.7347 7.6931 Grouping A A A A G1.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.000519 0.002877 0.003396 S = 0.01897 MS 0.000173 0.000360 R-Sq = 15.27% F 0.48 P 0.705 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 1h 2h 0h 3h N 3 3 Mean 8.73746 8.72652 8.72147 8.72125 Grouping A A A A G5.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 S = 0.03253 SS 0.00027 0.00846 0.00873 MS 0.00009 0.00106 R-Sq = 3.08% F 0.08 P 0.966 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 3h 1h 2h 0h N 3 3 Mean 8.80102 8.80084 8.79193 8.79103 Grouping A A A A G5.6 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 S = 0.02660 SS 0.000068 0.005659 0.005727 MS 0.000023 0.000707 R-Sq = 1.18% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học F 0.03 P 0.992 R-Sq(adj) = 0.00% Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT Grouping Information Using Tukey Method 1h 0h 2h 3h N 3 3 Mean 8.74254 8.73766 8.73728 8.73651 Grouping A A A A Means that not share a letter are significantly different. G6.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.000160 0.004855 0.005015 S = 0.02464 MS 0.000053 0.000607 R-Sq = 3.18% F 0.09 P 0.965 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 2h 1h 0h 3h N 3 3 Mean 8.78733 8.78290 8.78259 8.77705 Grouping A A A A 2.2.2 pH = a) OD 600 nm pH = Bio1.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.003461 0.000844 0.004305 S = 0.01027 MS 0.001154 0.000106 R-Sq = 80.39% F 10.93 P 0.003 R-Sq(adj) = 73.04% Grouping Information Using Tukey Method 0h 2h 3h 1h N 3 3 Mean 0.58500 0.56067 0.54377 0.54333 Grouping A A B B B Bio2.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0002149 0.0001000 0.0003149 S = 0.003536 Trường ĐHCT MS 0.0000716 0.0000125 R-Sq = 68.25% F 5.73 P 0.022 R-Sq(adj) = 56.34% Grouping Information Using Tukey Method 3h 2h 0h 1h N 3 3 Mean 0.605333 0.601667 0.597000 0.594333 Grouping A A B A B B Probio One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0157709 0.0003120 0.0160829 S = 0.006245 MS 0.0052570 0.0000390 R-Sq = 98.06% F 134.79 P 0.000 R-Sq(adj) = 97.33% Grouping Information Using Tukey Method 2h 1h 0h 3h N 3 3 Mean 1.07767 0.99600 0.99367 0.99233 Grouping A B B B G1.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.009355 0.003577 0.012932 S = 0.02114 MS 0.003118 0.000447 R-Sq = 72.34% F 6.98 P 0.013 R-Sq(adj) = 61.97% Grouping Information Using Tukey Method 2h 0h 1h 3h N 3 3 Mean 0.77367 0.77133 0.75467 0.70433 Grouping A A A B B G5.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Source Factor Error Total DF 11 SS 0.414225 0.004726 0.418951 S = 0.02431 Trường ĐHCT MS 0.138075 0.000591 R-Sq = 98.87% F 233.73 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.45% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 0.51733 0.09267 0.08900 0.08333 Grouping A B B B G5.6 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.000362 0.001035 0.001397 S = 0.01138 MS 0.000121 0.000129 R-Sq = 25.88% F 0.93 P 0.469 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 1h 3h 0h 2h N 3 3 Mean 0.79000 0.78700 0.78333 0.77533 Grouping A A A A G6.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.0000803 0.0004547 0.0005349 S = 0.007539 MS 0.0000268 0.0000568 R-Sq = 15.00% F 0.47 P 0.711 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 0.797333 0.795667 0.792667 0.790667 Grouping A A A A Means that not share a letter are significantly different. b) Mật số pH Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT Bio1.2 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.035792 0.005667 0.041459 S = 0.02661 MS 0.011931 0.000708 R-Sq = 86.33% F 16.84 P 0.001 R-Sq(adj) = 81.21% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 3h 2h N 3 3 Mean 8.94766 8.88438 8.81859 8.81426 Grouping A A B B C C Bio2.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.00459 0.01259 0.01719 S = 0.03967 MS 0.00153 0.00157 R-Sq = 26.73% F 0.97 P 0.452 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 8.81036 8.80129 8.77611 8.76125 Grouping A A A A Probio One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.01857 0.07836 0.09693 S = 0.09897 MS 0.00619 0.00980 R-Sq = 19.15% F 0.63 P 0.615 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 7.92605 7.89375 7.86144 7.81980 Grouping A A A A G1.1 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.001919 0.004192 0.006111 S = 0.02289 MS 0.000640 0.000524 R-Sq = 31.40% F 1.22 P 0.364 R-Sq(adj) = 5.67% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 9.01665 9.00551 8.99959 8.98170 Grouping A A A A G5.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 180.3756 0.0017 180.3772 S = 0.01450 MS 60.1252 0.0002 F 285943.32 R-Sq = 100.00% P 0.000 R-Sq(adj) = 100.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 3h 2h 1h N 3 3 Mean 8.9536 0.0000 0.0000 0.0000 Grouping A B B B G5.6 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 S = 0.01956 SS 0.000267 0.003061 0.003328 MS 0.000089 0.000383 R-Sq = 8.04% F 0.23 P 0.871 R-Sq(adj) = 0.00% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 9.04096 9.03854 9.03052 9.03041 Grouping A A A A Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT G6.1 One-way ANOVA: 0h, 1h, 2h, 3h Source Factor Error Total DF 11 SS 0.004155 0.001432 0.005587 S = 0.01338 MS 0.001385 0.000179 R-Sq = 74.36% F 7.74 P 0.009 R-Sq(adj) = 64.75% Grouping Information Using Tukey Method 0h 1h 2h 3h N 3 3 Mean 9.10033 9.09316 9.08153 9.05160 Grouping A A A B B Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... trong các vi khuẩn probiotic (Holzapfel et al , 1998 và Collins et al., 1998) và chứa các dòng được sử dụng trong các sản phẩm probiotic trên thị trường Heikkila và Saris (2003) đã tập trung vào hoạt động kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus của vi khuẩn phân lập từ sữa người Họ đã xác định các vi khuẩn bằng các kỹ thuật phân tử khác nhau và đặt tên như là khuẩn tụ cầu, liên cầu và nhóm vi khuẩn. .. phân tích 120 mẫu sữa từ trâu, bò và dê (mỗi loài 40 mẫu) và xác định được 110 dòng vi khuẩn Lactobacillus tiêu biểu như: L acidophilus, L brevis, L bulgaricus, L lactis, L plantarum, L rhamnosus, L helveticus, L casei và L fermentum có hoạt tính probiotic Từ các dòng vi khuẩn được phân lập xác định được 3 mẫu vi khuẩn có tiềm năng probiotic nổi trội nhất là L rhamnosus G119b, L plantarum G95a từ sữa. .. tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella Nguyễn Thị Hường et al (2006) đã phân lập 192 dòng vi khuẩn lactic từ dạ dày, ruột non, ruột già và manh tràng của 9 con lợn ở giai đoạn trước và sau cai sữa Dựa trên 5 tiêu chuẩn của Pattterson et al (2003), đã tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn có đặc tính probiotic là dòng YHN77 và YHN99 Hai dòng này có thể ứng... Lactobacillus casei Shirota Từ đó đến nay các nhà khoa học Nhật Bản đã dày công nghiên cứu về tác dụng của vi khuẩn này đối với sức khỏe con người Martin et al (2003) đã phân lập vi khuẩn acid lactic từ sữa của 8 bà mẹ khỏe mạnh và phân của họ Họ đã xác định vi khuẩn acid lactic bằng máy phân tích RAPD-PCR và trình tự 16S rDNA Kết quả họ đã xác định vi khuẩn phân lập từ sữa người như Lactobacillus gasseri,... sản xuất chế phẩm probiotic nhằm thay thế kháng sinh cho lợn con giai đoạn sau cai sữa Ngô Thị Phương Dung et al (2011) đã phân lập vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men và sản phẩm men tiêu hóa đông khô Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn lactic và kiểm tra tính kháng khuẩn 23 dòng biểu hiện tính kháng khuẩn chỉ thị B subtilis, trong đó 10 dòng có khả năng tổng hợp bacteriocin Dòng DC213A được... vitamin, sinh chất kháng khuẩn, vi khuẩn phân giải đường bột ), làm giảm các vi khuẩn có hại (các vi khuẩn cạnh tranh thức ăn, sinh chất độc ) Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic còn là chế phẩm xử lý môi trường bằng cách kích thích sự gia tăng của các vi sinh vật có lợi trong ao nuôi Vi c sử dụng các vi sinh vật hữu ích nhằm cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh, thay thế cho vi c sử dụng hóa chất, kháng... học và kháng sinh, probiotic cung cấp một phương thức an toàn bền vững đối với người nuôi và tiêu dùng Probiotic có khả năng chống nhiễm trùng do vi khuẩn và virus (như Rotavirus gây tiêu chảy), chống ung thư, kích thích hoạt động của hệ miễn dịch, làm giảm cholesterol Vì probiotic tác động làm ổn định hệ vi sinh vật đường ruột, tăng các vi khuẩn có ích (các vi khuẩn sinh vitamin, sinh chất kháng khuẩn, ... dùng dòng vi khuẩn này chữa lành bệnh do vi khuẩn Salmonella và Shigella Minoru Shirota (1899-1982) có một phát minh quan trọng vào năm 1930 khi làm vi c tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học của Trường Đại học Hoàng gia Y khoa Kyoto (nay là Đại học Kyoto) Đó là vi c phân lập và nuôi cấy được một dòng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus casei và về sau được mang tên là dòng Lactobacillus casei Shirota Từ. .. trong và ngoài nước 2.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Năm 1899, một dòng Bifidobacterium lần đầu tiên được phân lập bởi Henry Tissier và ông đặt tên là vi khuẩn Bacillus bifidus và vi khuẩn này về sau được đặt tên là Bifidobacterium bifidum Năm 1917, Alfred Nissle (người Đức) đã phân lập một dòng không gây bệnh của vi khuẩn Escherichia coli từ phân của một người lính trong Thế chiến thứ I và ông... trưởng của vi khuẩn E coli, Salmonella spp và Listeria monocytogenes Bên một số vi khuẩn có trong sữa mẹ cải thiện chức năng bảo vệ đường ruột bằng cách tăng sản xuất mucine và giảm tính thấm của đường ruột Tuy nhiên, sự cạnh tranh với các vi khuẩn sinh chất độc hay vi khuẩn gây bệnh về chất dinh dưỡng và sự gắn với thụ thể trên bề mặt biểu mô ruột là cơ chế chống vi m nhiễm chính của vi khuẩn probiotic . 4.3.1. Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa 30 4.3.2. Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa dê 32 4.4. Đặc điểm tế bào và khả năng chuyển động 35 4.4.1. Các dòng vi khuẩn phân lập từ. Sharpe) 19 Bảng 3: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm sinh học và từ sữa dê 28 Bảng 4: Kết quả pH các mẫu sữa dê 29 Bảng 5: Một số đặc điểm khuẩn lạc và thử nghiệm sinh hóa chế. lạc các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa: Bio1.2, Bio2.1 và Probi 32 Hình 3: Kết quả thử nghiệm catalase của một số dòng phân lập từ sữa dê 34 Hình 4: Ảnh nhuộm Gram của các dòng