Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia súc từ các lò mổ gia súc ở địa bàn tỉnh Vĩnh Long

Đề tài được tiến hành nhằm phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia súc hiệu hoặc cầu đã được phân lập trên môi trường bột lông heo.. Vì vậy, đề tài “Phân

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH VĨNH LONG TRƯỜNG CAO ĐẲNG CỘNG ĐỒNG VĨNH LONG

VĨNH LONG - 2014

TÓM LƯỢC

Lông gia súc được thải ra môi trường từ ngành chăn nuôi chưa qua xử lý đang

là thách thức lớn đối với con người Sự phân hủy các chất thải chứa keratin nhờ vi khuẩn mang lại những lợi ích thiết thực trong ngành công nông nghiệp như sản xuất phân bón với giá thành thấp và thân thiện với môi trường Đề tài được tiến hành nhằm phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia súc hiệu

hoặc cầu đã được phân lập trên môi trường bột lông heo Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khuẩn lạc tròn Đa số khuẩn lạc có độ nổi mô, bìa nguyên, màu trắng đục 117

15 phút phản ứng Dòng Kr89 có hoạt độ cao nhất 114,7U/ml Kết quả đánh giá khả năng phân hủy bột lông heo cho thấy 117 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy từ

Kr45 cho khả năng phân hủy cao nhất 43,7% và 37,4% Kết quả định danh cho thấy

và dòng Kr11 tương đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91với độ tương đồng 99%.

Từ khóa: Bacillus, keratinase, lông gia súc, vi khuẩn phân giải lông gia súc

MỤC LỤC

Trang

TÓM LƯỢC Error: Reference source not found

MỤC LỤC Error: Reference source not found

DANH SÁCH BẢNG i Error: Reference source not found

DANH SÁCH HÌNH Error: Reference source not found

TỪ VIẾT TẮTv Error: Reference source not found

PHẦN 1 GIỚI THIỆU Error: Reference source not found

1.1 Đặt vấn đề Error: Reference source not found

1.2 Mục tiêu đề tài Error: Reference source not found

1.3 Nội dung nghiên cứu 1

PHẦN 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆUError: Reference source not found

2.1 Sơ lược về keratin Error: Reference source not found

2.2 Sơ lược về chất thải chứa keratin Error: Reference source not found

2.3 Sơ lược về enzyme keratinase Error: Reference source not found

2.4 Sơ lược về vi khuẩn phân hủy keratin Error: Reference source not found

2.5 Khảo sát hình thái tế bào vi khuẩn Error: Reference source not found2.6 Các kỹ thuật sinh học phân tử giúp hổ trợ nhận diện các dòng vi khuẩn 7

2.7 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn phân hủy keratin

Error: Reference source not found

2.8 Văn ban cua nhà nươc có liên quan đên cac cơ sở giêt mổ gia suc 12

PHẦN 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP Error: Reference source notfound3

3.1 Phương tiện nghiên cứuError: Reference source not found

3.2 Phương pháp nghiên cứu Error: Reference source not found

3.2.1 Thu và xử lý mẫu Error: Reference source not found

3.2.2 Khao sat hiện trạng chât thai lông từ cac cơ sở giêt mổ gia suc trên điabàn tỉnh Vĩnh Long 15

3.2.3 Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc 163.2.4 Xác định các đặc điểm hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn phânlập được 17

3.2.5 Đánh giá hoạt tính enzyme keratinase của các dòng vi khuẩn 203.2.6 Đánh giá và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân hủy mạnh

lông gia súc 21

3.2.7 Nhận diện các dòng vi khuẩn 23

3.2.8 Phân tích và xử lý số liệu 25

PHẦN 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 26

CHƯƠNG 1 HIỆN TRẠNG CHẤT THẢI LÔNG GIA SÚC TẠI TỈNHVĨNH LONG 26

1 Tình hình chung 26

2 Công suất các lò giết mổ 27

3 Cách xử lý chất thải lông và nước thải 27

4 Kết quả thống kê hiện trạng xử lý chất thải lông

tại các cơ sở giết mổ gia súc 29

CHƯƠNG 2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY LÔNG HEO 30

1 Số lượng các dòng vi khuẩn phân lập được 30

2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được 32

3 Đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn 38

4 Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme keratinase bằng cơ chất azokeratin 44

5 Kết quả đánh giá khả năng phân hủy bột lông heo của các dòng vi khuẩn 47CHƯƠNG 3 NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN 49

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Trang

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình 1 Cấu trúc keratin dưới kính hiển vi 2

IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology

kDa Kilo Dalton

LSD Least significant difference

PHẦN 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Hằng năm, ở nước ta tiêu thụ hàng triệu tấn gia súc, gia cầm Theo Bộ Nôngnghiệp và Phát triển nông thôn chỉ trong tháng 7 năm 2012, sản lượng heo hơi ước đạt3.179,5 ngàn tấn, sản lượng thịt gia cầm ước đạt 744,7 ngàn tấn, sản lượng thịt trâu, bòước đạt hơn 389 ngàn tấn Bên cạnh đó, hàng ngàn tấn lông gia súc, gia cầm từ các lògiết mổ cũng được thải ra môi trường mà chưa có biện pháp xử lý hiệu quả

Ngoài những chất thải lỏng dễ phân hủy ở môi trường tự nhiên thải ra từ các lògiết mổ còn có những chất thải rắn khó phân hủy như lông, móng… chúng được cấuthành chủ yếu từ protein keratin Trong keratin lại chứa những acid amin quan trọng

có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc Bên cạnh đó, keratin còn được dùng như mộtnguyên liệu cho sản xuất phân hữu cơ, gas sinh học Tuy nhiên, việc sử dụng các biệnpháp vật lý hay hóa học để phân hủy keratin lại dễ phá hủy những acid amin và cần rấtnhiều năng lượng, tạo ra các chất gây ô nhiễm môi trường (Matikevičienė et al., 2009).Việc ứng dụng vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin đạt được các ưu thế quantrọng là không gây hại với môi trường, nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩmprotein, và đạt được hiệu quả về kinh tế hơn so với các phương pháp vật lý và hóa học

Vì vậy, đề tài “Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải

lông gia súc từ các lò mổ gia súc ở địa bàn tỉnh Vĩnh Long” được thực hiện với

mục đích bổ sung và làm phong phú thêm cho những nghiên cứu trước đó, đồng thờitạo ra triển vọng ứng dụng vào việc tận dụng và xử lý các phụ phế phẩm của ngànhchăn nuôi, giúp hướng tới sự phát triển nông nghiệp bền vững và thân thiện với môitrường

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập được một số dòng vi khuẩn có khảnăng phân hủy keratin mạnh để xử lý lông gia súc

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát hiện trạng chất thải lông ở các cơ sở giết mổ gia súc tại tỉnh Vĩnh Long

- Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc từ các mẫu thu ởcác hố chôn chất thải lông của các cơ sở giết mổ gia súc

- Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh hóa và hoạt tính enzyme của các dòng vikhuẩn phân lập được

- Đánh giá và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân hủy hiệu quả lông gia súc

PHẦN 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về keratin

Theo Eggling (2003), keratin thuộc nhóm protein cấu trúc, là những protein dạngsợi, là thành phần chủ yếu tham gia vào cấu trúc biểu bì, tóc, móng, lông, sừng…,hoàn toàn không tan trong nước, kể cả trong dung dịch acid hay kiềm Khi phân hủycho nhiều cystin (7 – 12%) và acid glutamic (4 – 17%) Dựa vào thành phần và trình tựacid amin, cũng như các đặc tính của sợi đơn polypeptide mà keratin được chia làmhai dạng chủ yếu là dạng α-helix và β-sheets Các sợi keratin ở cả hai dạng α-helix vàβ-sheets xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi (Zerdani et al.,2004) Ngoài ra, dựa vào hàm lượng lưu huỳnh (cầu nối disulfide) người ta cũng chiakeratin thành hai loại là keratin cứng (được tìm thấy ở các phần phụ như lông vũ, tóc,móng guốc và móng với hàm lượng cầu nối disulfide cao, bền và không thể kéo dài)

và keratin mềm (ở da hay mô sẹo có hàm lượng cầu nối disulfide thấp và mềm dẻohơn) (Voet D và Voet JG, 1995).Nhờ có các cầu nối disulfide, liên kết hydro và tươngtác kỵ nước mà keratin có cấu trúc khá bền vững, không tan trong nước, không bị phânhủy bởi các protease thông thường như trypsin, pepsin hay papain (VeslavaMatikevičienėet et al., 2009) Tuy nhiên, keratin vẫn có thể bị phân hủy bởi enzymekeratinase do vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm tạo ra (Onifade et al., 1998)

Hình 1 Cấu trúc keratin dưới kính hiển vi

(Nguồn: http: //php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=File:

Keratin_filaments.jpg ngày 22/8/2013)

2.2 Sơ lược về chất thải chứa keratin

Lông chứa khoảng 90% protein, trong đó thành phần chính là keratin Keratin làthành phần cấu tạo chủ yếu trong lông, tóc, móng tay, móng vuốt, da,… (Onifade etal., 1998) Đối với gia súc như heo thì lông chiếm từ 0,5 – 0,8% trọng lượng cơ thể.Đối với gà trưởng thành thì lông chiếm 5 – 7% trọng lượng cơ thể (Nguyễn ĐìnhQuyến và Lê Thị Thu Huyền, 2012) Tuy nhiên, lông rất khó bị phân hủy nên khôngđược xem là nguồn cung cấp protein chủ yếu

Lông gia súc có cấu tạo chủ yếu từ protein keratin dạng α – helix, cấu trúc nàybền vững, tương tự cấu trúc β – sheets của keratin có trong lông gia cầm cũng hết sứcchặt chẽ và khó phân hủy Trong tự nhiên, thời gian thật sự để keratin (từ lông gà) tựphân là 5 – 7 năm (Nguyễn Đình Quyến và Lê Thị Thu Huyền, 2012)

Các chất thải giàu keratin khó phân hủy và ngày càng tích lũy trong tự nhiên,chủ yếu ở dạng lông vũ, lông gia súc và tóc, góp phần gây ra vấn đề ô nhiễm môitrường (Gupta và Ramnani, 2006) Tuy nhiên, sự phân hủy các chất thải chứa keratinvẫn mang lại những lợi ích thiết thực trong ngành công - nông nghiệp như chế biếnthức ăn thủy sản, gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón

Thành phần hoá học của keratin thay đổi tuỳ theo nguồn gốc nhưng nó chứa rấtnhiều sulfur dưới hình thức acid amin Khi phân hủy keratin tạo ra nhiều acid aminnhư cystein (15 – 17%), tyrosin, leucin, acid glutamic (4 – 17% ), alanin và lysin, Những acid amin như acid glutamic, lysin, cystein, alanin và tyrosin là những acidamin cần thiết mà cơ thể không thể tự tổng hợp được (http://thuocdongy.com.vn/index.php?page=showtin&muc=&id= -15/7/2013)

Ước tính hàng năm, trên thế giới thải ra hàng triệu tấn chất thải chứa keratin từngành chăn nuôi gia cầm, thuộc da và công nghiệp chế biến thịt và tỷ lệ này tăngkhoảng 4,5% mỗi năm (C.A.S.T., 1995 và Freeman et al., 2009) Các phế phẩm củagia súc và gia cầm sau khi bị giết mổ đều thải ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọngnhư lông heo, lông bò, sừng bò, móng trâu, móng bò, lông gà, vịt,… Việc xử lý cácchất này thành thức ăn gia súc bằng các phương pháp hóa, lý tốn khá nhiều năng lượng(nhiệt độ và áp suất cao); đồng thời, làm mất đi các acid amin thiết yếu (Onifade et al.,1998), quá trình phân hủy sinh học các chất thải chứa keratin đã được đề xuất như mộtgiải pháp hiệu quả, ít tốn kém (Ignatova et al., 1999 và Xie et al., 2010)

2.3 Sơ lược về enzyme keratinase

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein có khả năng xúc tác vàthúc đẩy các phản ứng hóa học trong tế bào sống Mức độ tác động của chúng phụthuộc rất lớn vào pH, ion, nhiệt độ và sự hiện diện hay vắng mặt của các yếu tố kìmhãm hay yếu tố hoạt hóa Đất chứa đựng một số vi sinh vật sinh ra enzyme ngoại bào,

sự bất động của enzyme ngoại bào được ổn định bởi mạng lưới ba chiều của nhữngphân tử lớn và những enzyme bên trong tế bào vi sinh (Lean, 1982)

Keratinase là một trong các enzyme phân hủy protein có vai trò quan trọng trongphân hủy protein keratin từ lông gia súc, gia cầm, tóc, móng (Mozammel Hoq et al.,2005) Đây là một loại enzyme ngoại bào, chỉ được tạo ra khi có sự hiện diện của cơchất keratin Theo Hiệp hội Quốc tế về Hóa sinh và Sinh học phân tử (IUBMB),keratinase được ký hiệu là EC 3.4.99 (Owen et al., 1983), có trọng lượng phân tửkhoảng vài trăm kDa Enzyme này có trình tự tương đồng khoảng 97% so với serineprotease và nó cũng bị ức chế bởi các chất ức chế serine protease (Wang et al., 1995;Taha et al., 1998 và Bressollier et a1., 1999) Chỉ có một vài metalloprotease (là cácprotease mà trong trung tâm hoạt động có chứa ion kim loại) cho thấy có hoạt tínhphân hủy keratin Các metalloprotease này thường được thấy ở các vi khuẩn Gram âm(Brandelli, 2007) Keratinase phân hủy keratin bằng cách tấn công vào các cầu nốidisulfide (Prasad et al., 2010) Enzyme này được ứng dụng nhiều trong các quy trìnhcông nghiệp, chế biến thực phẩm hay công nghệ thuộc da (Gupta et al., 2002), có khảnăng phân hủy cơ chất keratin không tan thuộc họ protease

Enzyme keratinase được tạo ra chủ yếu từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm, chúng cókhả năng phân hủy chất thải chứa keratin và tổng hợp keratinase với hàm lượng cao(Riffel và Brandelli, 2006)

Từ vi khuẩn: theo báo cáo của Zerdani et al., 2004 thì một số dòng Bacillus có khả năng sinh enzyme keratinase, trong đó dòng Bacillus licheniformis (Ramnani et

al., 2004; Korkmaz et al., 2004; Manczinger et al., 2003; Williams et al., 1991)

được xác định là phổ biến nhất Một số dòng khác như: Burkholderia,

Chryseobacterium, Pseudomonas, Microbacterium (Brandell và Riffel., 2005) Chryseobacterium (Brandelli và Riffel, 2005; Riffel et al., 2003), Streptomyces

(Bressollier et al., 1999; Montero-Barrientos et al., 2005) cũng có khả năng sinhkeratinase

Một số dòng nấm cũng có khả năng phân hủy keratin như: Chrysosporium,

Aspergillus, Alternaria, Trichurus, Curvularia, Cladosporium, Fusarium, Geomyces, Gleomastis, Monodictys, Myrothecium, Paecilomyces, Stachybotrys, Urocladium, Scopulariopsis, Sepedonium, Penicillium, Doratomyces (Gradisar et al., 2000).

Từ những năm 90 của thế kỷ XX, các kiến thức về keratin và enzyme keratinase

đã dần được khám phá Tuy nhiên, đến nay cơ chế phân hủy sinh học keratin vẫn chưahoàn toàn được hiểu rõ Noval và Nickerson (1959) đã mô tả sự phân hủy keratin bởienzyme của vi khuẩn Sự phá hủy các cầu nối disulfide có thể là yếu tố quan trọngtrong sự phân hủy keratin (Kunert và Stransky, 1988; Kunert, 1992; Böckle và Müller,1995)

2.4 Sơ lược về vi khuẩn phân hủy keratin

Năm 1959, Molyneux et al đã phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng

phân hủy keratin Một số dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Streptomyces có khả

năng phân hủy lông vũ cũng được phân lập từ đất và lông vũ ở các cơ sở sản xuất và

chế biến gia cầm Trong đó các dòng cho khả năng phân hủy keratin tốt thuộc Bacillus sp., B licheniformis và B subtilis (Balaji et al., 2008; Cai et al., 2008; Manczinger et al., 2003; Suh và Lee, 2001; Zhang et al., 2009) Gen kerA của Bacillus licheniformis

đã được nhân dòng và giải mã trình tự (Lin et al.,1995) Ngoài ra, các dòng như B.

pumilus và B cereus cũng cho thấy khả năng tổng hợp keratinase (Ghosh et al., 2008;

Kim et al., 2001; Kumar et al., 2008; Werlang và Brandelli, 2005)

Theo nghiên cứu của Chitte et al (1999) và Mohamedin (1999) cho thấy một số

dòng Streptomyces chịu nhiệt (thermophylic) phân lập được từ đất có thể phát triển và

phân hủy keratin ở nhiệt độ trên 50oC Ngoài ra, một số dòng vi khuẩn ưa ấm

(mesophilic) như Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995) và

Streptomyces albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999) cũng cho thấy khả năng

phân hủy keratin tốt Khả năng phân hủy keratin ở các vi khuẩn Streptomyces có thể

liên quan đến việc các dòng vi khuẩn này tổng hợp được các protease phổ rộng như

pronase, đã được sản xuất thương mại từ vi khuẩn Streptomyces griseus (Jurasek et al.,

1974) Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của Böckle và Müller (1995) cho thấy

Streptomyces pactum có thể làm giảm lượng cầu nối disulfide nhờ khả năng tạo ra

enzyme disulfide reductase khi phát triển trên cơ chất lông vũ

Trong số các vi khuẩn Gram dương, các dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả

năng phân hủy keratin được nhận diện là Arthrobacter sp (Lucas et al., 2003),

Microbacterium sp (Thys et al., 2004), và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006)

Một số vi khuẩn Gram âm như các loài Vibrio sp (Sangali et al., 2000),

Chryseobacterium sp (Riffel et al., 2003) và Xanthomonas sp (De Toni et al., 2002)

cũng được cho thấy có khả năng phân hủy keratin

Một số loài vi khuẩn chịu nhiệt cũng tạo được enzyme keratinase như

Thermoanaerobacterkeratinophilus (Riessen và Antranikian, 2001), Fervidobacterium islandicum (Nam et al., 2002), và các dòng vi khuẩn ưa kiềm như Nesternkonia sp.

AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp TOA-1 (Mitsuiki et al., 2004) Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A, được

phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho thấy khả năng tạo keratinase trong quátrình phát triển trên chất thải lông cừu (Gushterova et al., 2005)

2.5 Khảo sát hình thái tế bào vi khuẩn

Phương pháp nhuộm Gram: Nhuộm Gram là phương pháp dùng để phân biệt cácloài vi khuẩn thành hai nhóm là Gram dương (Gram positive) và Gram âm (Gramnegative) dựa trên các đặt tính hóa lý của vách tế bào Phương pháp này được đặt têntheo người phát minh ra nó, nhà khoa họcngười Đan Mạch Hans Christian Gram(1853-1938) Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiềunhà khoa học khác cải tiến

Theo Nguyên Lân Dung et al (2012), phương phap nhuộm Gram dựa vào khanăng lưu giữ crystal violet của vách tế bào vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn

+ Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày từ 15 đến 50nm, dạng lưới, cấu tạobởi peptidoglycan Chất này có khả năng giữ phức hợp crystal violet Sau khinhuộm với phức hợp crystal violet, mẫu được xử lý tiếp với hỗn hợp khử màu,làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đólàm giảm khoảng cách giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợpcrystal violet bên trong tế bào, vì vậy vi khuẩn Gram dương bắt màu tím (CaoNgọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)

+ Vi khuẩn Gram âm thì thành tế bào mỏng hơn (chỉ khoảng 10nm) và thường cóthêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài Khi xử lý với hỗn hợp khửmàu thì hỗn hợp này đóng vai trò là chất hòa tan lipid và làm tan màng ngoài củathành tế bào Lớp peptidoglycan không thể giữ được phúc hợp crystal violet và tếbào Gram âm bị khử màu, sau đó bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Vì vậy Gram

âm bắt màu đỏ Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)

Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn được quan sát qua tiêu bản sống dưới kính hiển

vi quang học có độ phóng đại 1000 để xác định hình dạng và màu sắc (đặc tính Gram)

2.6 Các kỹ thuật sinh học phân tử giúp hổ trợ nhận diện các dòng vi khuẩn

Các gen rRNA của vi khuẩn có tất cả 3 loại là 16S, 23S và 5S rRNA Trong đó,gen 16S có khoảng 1500 nucleotide, gen 23S có khoảng 2900 nucleotid và gen 5Schứa khoảng 120 nucleotide (quá ít) nên ít được sử dụng, chỉ có gen 16S và 23S đượcnghiên cứu nhiều hơn Đặc biệt gen 16S rRNA được xem là gen đánh dấu chuyên biệt,được sử dụng rộng rãi và thành công trong việc kết hợp với các đặc tính hình thái vàsinh lý, sinh hóa để xác định và phân loại vi khuẩn do các chức năng của chúng ổnđịnh Từ đó, người ta có thể so sánh mối quan hệ gần hay xa giữa các vi khuẩn, gópphần phân loại vi khuẩn chi tiết và chính xác hơn Chuỗi trình tự các đoạn gen 16SrRNA được sử dụng như là một công cụ hiệu quả để đánh giá sự đa dạng di truyền củacác loài vi khuẩn Đoạn gen 16S rRNA có thể được khuếch đại nhờ kỹ thuật PCR(Barker et al., 2003)

Kỹ thuật PCR: là kỹ thuật khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu in vitro,

không cần sự hiện diện của tế bào, chỉ với sự hiện diện của một cặp mồi (primer)chuyên biệt, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do, dung dịch đệm (buffer)theo các chu kỳ nhiệt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002)

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kì lặp lại nối tiếp nhau Đây là sựkhuếch đại theo cấp số nhân Đoạn trình tự DNA đặc trưng sẽ được khuếch đại với sốlượng là 2n-1 (với n là số chu kỳ phản ứng)

Mỗi chu kỳ trong phản ứng PCR gồm ba giai đoạn (Khuất Hữu Thanh, 2006):Giai đoạn biến tính (Denaturation): Dưới tác dụng của nhiệt độ cao (thường là

90 – 95oC, thời gian khoảng từ 60 giây đến 120 giây), các liên kết hydro trong phân tửDNA đứt ra, hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau

Giai đoạn gắn đoạn mồi (Annealing): Ở nhiệt độ 55 – 65oC, các đoạn mồi bắtcặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lí Chargaff Giai đoạnnày kéo dài từ 30 giây đến 60 giây.

Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Elongation): Enzyme DNA polymerase xúc táchoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các đoạn mồi đượckéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lí Chargaff, tạo nên mạch đơnDNA mới, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymerase hoá (polymerization), đượcthực hiện ở nhiệt độ 70 – 72oC và kéo dài từ 30 giây đến vài chục phút, tuỳ thuộc vàokích thước của đoạn DNA

Trong một phản ứng, sản phẩm của chu kì trước được làm khuôn cho chu kì kếtiếp nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân Một phản ứng PCR thường

có từ 20 - 40 chu kì, từ một đoạn DNA khuôn có thể tạo nên 220 - 240 bản sao DNA

Giải trình tự DNA (DNA sequencing): kỹ thuật giải trình tự DNA (DNAsequecing) là kỹ thuật xác định các hợp phần do nucleotide hình thành nên phân tửDNA nào đó Những kỹ thuật “sequencing” cũng chỉ mới được hoàn thiện trong nhữngnăm gần đây Các công trình đầu tiên được công bố của Maxam và Gilbert (1977)nhưng trong hơn 20 năm qua, kỹ thuật này được cải tiến rất nhiều Kỹ thuật giải trình

tự trở thành công cụ rất có giá trị làm nền tảng cho phân tích gen

Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự tự động:

Nguyên tắc chung: dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy Nguyên tắc cơ bản củaphương pháp dideoxy là dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quátrình tổng hợp DNA Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạchđơn DNA.đang tổng hợp ở vị trí 3’, khi gặp nucleotid không có nhóm OH ở vị trí 3’,

phản ứng tổng hợp bị dừng lại Đặc trưng của phương pháp dideoxy là sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) để làm ngừng các mạch đơn DNA đang được tổng hợp

một cách ngẫu nhiên

Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi là đoạn mạch đơn khoảng 20nucleotid, bốn loại deoxynucleotid (dNTP) bình thường và bổ sung khoảng 1% mộtloại dideoxy-nucleotid (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng Cácdideoxy-nucleotid mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2 Khi mạch đơn DNA đang tổnghợp được gắn một ddNTP thì phản ứng tổng hợp ngừng lại, không có nhóm OH ở vịtrí 3’ ở nucleotid cuối cùng do đó mạch đang tổng hợp không được tiếp tục kéo dài

Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại

dNTP, enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện thích hợp đồng thời

có thêm khoảng 1% một loại ddNTP Tương quan giữa hàm lượng dNTP và ddNTPlàm cho quá trình tổng hợp DNA thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng ngẫunhiên, làm cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại Kết quả phản ứng tổng hợp nên cácđoạn oligonucleotid dài ngắn khác nhau một nucleotid, có thể nhận biết nhờ phươngpháp điện di (Khuất Hữu Thanh, 2006)

Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm cácnhầm lẫn do kỹ thuật Có hai loại mồi là mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược(reverse primer) được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA Biến tính DNA trong môitrường có urea và nhiệt độ cao (khoảng 55oC), hai mạch đơn DNA tách rời nhau khôngbắt cặp lại với nhau Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua các nucleotid, từ

đó tổng hợp được trình tự sắp xếp của gen (Khuất Hữu Thanh, 2006)

Các máy giải trình tự gen thông dụng của hãng ALF II (Pharmacia), ABIPRISM 3130 XL (Mỹ), có kèm theo phần mềm xử lí số liệu, kít hóa chất tiêu chuẩn.Giải trình tự gen cần tùy theo từng loại máy giải trình tự để tạo dung môi và các điềukiện thích hợp, đảm bảo độ chính xác kết quả (Khuất Hữu Thanh, 2006)

Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã:

Trong tin sinh học, BLAST là một trong những chương trình được sử dụng rộngrãi nhất, BLAST dựa trên một nền tảng thống kê vững chắc cho phép so sánh, tìmkiếm, giải mã một trình tự (DNA và Protein) với tất cả các trình tự có trong ngân hànggen (Genbank) Nói cách khác, BLAST sẽ cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm đoạnDNA, protein quan tâm có tương đồng với đoạn DNA, protein của sinh vật nào trongngân hàng gen không, khi được cung cấp một thư viện hay cơ sở dữ liệu các chuỗi đó

Có 5 chương trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST X, TBLAST N,TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide-Nucleotide BLAST) cho phép so sánhcấu trúc chuỗi nucleotide cần phân tích với cấu trúc chuỗi nucleotide trong ngân hàng

dữ liệu (Kent, 2002 và Ye et al., 2006)

2.7 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn phân hủy keratin

2.7.1 Một số nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, một số loài vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin đã được phânlập từ đất và lông vũ tại nơi giết mổ gia cầm trên môi trường có bổ sung bột lông giacầm Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Phương (2001) đã tiến hành phân lập được

từ đất 7 dòng xạ khuẩn và 15 dòng Bacillus có hoạt tính phân hủy casein rõ rệt Trong

đó 5 dòng xạ khuẩn và 2 dòng Bacillus có khả năng giải lông gà mạnh mẽ.

Các dòng vi khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… đã được phân lập từ một số

vùng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010) Các dòng

vi khuẩn này phát triển tốt ở 30 - 40oC trên môi trường có bổ sung bột lông heo và khảnăng phân hủy lông vũ đạt từ 75 - 90% sau 3 ngày nuôi cấy Bộ kit API 50CHB, API20NE và trình tự gen mã hóa 16S rRNA đã được sử dụng trong nghiên cứu đặc điểmhình thái, hóa sinh của các dòng vi khuẩn phân lập được

Nguyễn Thu Hiền et al (2010), viện khoa học và công nghệ Việt Nam, cũng đã

phân lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân hủy lông vũ.

Nguyễn Đình Quyến và Lê Thị Thu Huyền (2012) cũng thực hiện một nghiên

cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis dòng Kr2 có khả năng phân hủy lông gà, pH tối

ưu cho sự phát triển và sinh enzyme keratinase tối ưu của dòng này là 7 - 8, nhiệt độ

35°C, nồng độ lông là 20g/l

2.7.2 Một số nghiên cứu ngoài nước

Sangali et al (1999) các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin thuộc họ

Vibrionaceae đã được phân lập từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil Nghiên cứu

cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển và tạo ra enzyme phân hủy keratin của vikhuẩn này là 30oC

Riffel et al (2002) đã thực hiện một nghiên cứu cho thấy vi khuẩn

Chryseobacterium sp dòng kr6 có khả năng phân hủy hoàn toàn lông vũ trong quá

trình nuôi cấy Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của dòng này là 30oC và pH tối ưu 8.0.Dưới điều kiện này, lông vũ cũng được phân hủy một cách tối đa Nghiên cứu cũngcho thấy hoạt tính của keratinase bị ức chế bởi EDTA, Hg2+, Cu2+ và được kích hoạtbởi Ca2+

Riffel và Brandelli (2006) đã tiến hành phân lập vi khuẩn phân hủy keratin từchất thải lông gia cầm Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lôngheo và kiểm tra khả năng phân hủy protein trên môi trường sữa Trong đó có ba dòng

Gram âm (thuộc chi Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas) và một dòng Gram dương (Microbacterium sp.) Những vi khuẩn này có thể phát triển trên nhiều

loại chất thải chứa keratin như bột lông heo, lông vũ thô, móng gà, tóc và len Hoạttính phân hủy protein của dịch trích enzyme thô từ các dòng vi khuẩn này được kiểmtra với hai cơ chất azokeratin và azocasein Kết quả cho thấy enzyme keratinase hoạtđộng trên cả hai cơ chất và có khả năng phân hủy keratin tương đương với các enzymephân hủy protein có nguồn gốc từ vi khuẩn trên thị trường

Geun-Tae Park et al (2006) đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện

môi trường đến sự phân hủy lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus

megaterium F7-1 Vi khuẩn này phân hủy hoàn toàn lông gà trong vòng 7 ngày Nhiệt

độ 25 - 40oC, và pH 7,0 – 11,0 là tối ưu cho sự phát triển cũng như hoạt tính keratinasecủa dòng vi khuẩn này Hoạt tính keratinase tạo ra trong môi trường chứa 0,6% sữakhông béo là 468 U/ml, cao gấp 9,4 lần trong môi trường không bổ sung sữa Lượngkeratinase tạo ra phụ thuộc vào hàm lượng lông vũ

Joshi et al (2007) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp PW-1 có khả

năng phân hủy lông vũ từ chất thải gia cầm Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môitrường cơ bản với lông vũ đóng vai trò là nguồn carbon, nitơ và lưu huỳnh

Daroit et al (2009) cũng đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp P45 có

khả năng phân hủy protein trên môi trường sữa không béo và môi trường bột lông heo

Dòng Bacillus sp P45 có khả năng phân hủy 90% lông gà sau 72h nuôi cấy trong môi

trường lỏng có bổ sung lông gà Tuy nhiên, dòng vi khuẩn này không có khả năngphân hủy keratin tóc, có thể do sự đa dạng về cấu hình của cơ chất này so với keratinlông vũ

Ba dòng vi khuẩn B megaterium SN1, B thuringenesis SN2, B Pumilis SN3

phân lập từ bãi đất chôn lông gia cầm có khả năng phân hủy lông gà và lông bồ câusau 5 ngày nuôi cấy (Agrahari et al., 2010)

Mazotto et al (2011) đã phân lập được ba dòng vi khuẩn Bacillus (B subtilis LFB-FIOCRUZ 1270, B subtilis LFB-FIOCRUZ 1273 và B licheniformis LFB- FIOCRUZ 1274) từ nguồn chất thải lông gia cầm và tiến hành khảo khả năng tổng hợp

enzyme keratinase khi sử dụng bột lông vũ làm cơ chất Ba dòng vi khuẩn này sản sinh

ra các enzyme keratinase và peptidase ngoại bào sau 7 ngày Lông vũ được xác định là

cơ chất tốt nhất cho hoạt động của keratinase và peptidase tạo ra bởi B subtilis

LFB-FIOCRUZ 1273 và đây cũng là dòng vi khuẩn biểu hiện hoạt động enzyme mạnh nhất

Cả ba dòng vi khuẩn này có khả năng phân hủy bột lông vũ (62% đến 75%) và lông vũ(40% đến 95%), tạo ra 3,9 đến 4,4 mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ sung bộtlông vũ và tạo ra 1,9 đến 3,3 mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ sung lông vũ

2.8 Văn ban cua nhà nươc có liên quan đên cac cơ sở giêt mổ gia suc

Thông tư số 14/2011/TT-BNNPTNT về việc Quy đinh việc kiểm tra, đanh gia cơsở san xuât kinh doanh vật tư nông nghiệp và san phẩm nông lâm thuy san ngày 29thang 3 năm 2011 có quy đinh cac mưc lôi ở cac cơ sở giêt mổ gia suc gia câm nhưsau:

* Các hình thức phân loại :

Áp dụng mức phân loại A (tốt), B (đạt), C (không đạt), cụ thể như sau:

a) Loại A (tốt): áp dụng đối với cơ sở đáp ứng đầy đủ các yêu cầu về điều kiệnđảm bảo chất lượng, an toàn thực phẩm, không có lỗi nặng và lỗi nghiêm trọng;

b) Loại B (đạt): áp dụng đối với các cơ sở đáp ứng các yêu cầu về điều kiện đảmbảo chất lượng, an toàn thực phẩm, có ít lỗi nặng và không có lỗi nghiệm trọng;

c) Loại C (không đạt): áp dụng đối với các cơ sở chưa đáp ứng các yêu cầu vềđiều kiện đảm bảo chất lượng, an toàn thực phẩm, còn nhiều lỗi nặng và lỗi nghiêmtrọng, nếu không khắc phục, sửa chữa trong thời gian do cơ quan kiểm tra quy định màvẫn tiếp tục sản xuất sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng, gây mất an toànthực phẩm

PHẦN 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử ThựcVật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ

- Thời gian: đề tài được thực hiện từ tháng 7/2013 đến tháng 4/2014

3 1.2 Dụng cụ thiết bị

Thiết bị, dụng cụ để phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn

- Tủ cấy vi sinh vật Telstar – Nhật Bản

- Tủ ủ vi sinh vật Binder – Hoa Kỳ

- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational – Ý

Lông heo dùng làm cơ chất (nguồn nitơ duy nhất để phân lập) được thu tại các

lò giết mỗ gia súc trên địa bàn tỉnh Vĩnh Long

3.1.4 Hóa chất

 Môi trường bột lông (bột lông heo)

Bảng 1 Môi trường bột lông (bột lông heo)

Hóa chất Khối lượng/lít nước cấtBột lông (heo/ gia cầm) 10g

 Môi trường tăng sinh

Bảng 2 Môi trường tăng sinh

Hóa chất Khối lượng/lít nước cất

 Hóa chất dùng để điện di sản phẩm PCR: Agarose 1%, TEbuffer 1X, loading buffer, EtBr, thang chuẩn DNA 1kb.

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Vơi mẫu lông: Thu khoang 10 gram mẫu lông đang phân huỷ trong đât ở ngay cơsở giêt mổ và trang trại nuôi gia suc

Mẫu đất, mẫu lông được cho vào túi nilon tiệt trùng, ghi nhãn đem về phòng thínghiệm giữ ở nơi mát đến khi tiến hành phân lập

Bột lông heo: Lông heo được thu tại các lò giết mổ tại tỉnh Vĩnh long, rửa sạchtạp chất, sấy khô, loại bỏ da và các tạp chất còn lại, sau đó cắt nhuyễn khoảng 1,5mm

3.2.2 Khao sat hiện trạng chât thai lông từ cac cơ sở giêt mổ gia suc trên đia bàn tỉnh Vĩnh Long

+ Thông tin sơ bộ về hiện trạng chât thai lông từ cac cơ sở giêt mổ gia suc tậptrung

- Tổ chức điều tra thử nhằm ước lượng chi phí, cải thiện câu hỏi cho phiếu điều tra vàthời gian cho điều tra chính thức

- Các câu hỏi sẽ tập trung tìm hiểu: thông tin về hộ được phỏng vấn (tên, tuổi, địa chỉ,giơi tính, chu cơ sở ); thông tin về cơ sở, cach xử lý chât thai lông tại cơ sở giêt mổgia suc

- Phương phap: phỏng vân trực tiêp cơ sở giêt mổ gia suc.

- Từ số liệu điều tra nhằm đánh giá về hiện trạng chât thai lông từ cac cơ sở giêt mổ

gia suc trên đia bàn tỉnh Vĩnh Long

• Đánh giá kết quả:

Các phiếu điều tra được nhập liệu, phân nhóm, thống kê theo phần mềm Excel và

lập cac biểu bang hay biểu đồ so sanh để đanh gia về hiện trạng chât thai lông từ cac cơsở giêt mổ gia suc trên đia bàn tỉnh Vĩnh Long

3.2.3 Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc

Số cơ sở giêt mổ gia suc sẽ lây mẫu : 10 cơ sở giêt mổ gia suc theo số lượng gia sucđược giết mổ nhiều nhất

Cách thực hiện:

- Thu mẫu: từ đất, lông gia suc ở cac cơ sở giêt mổ gia suc ở tỉnh Vĩnh Long.

(gồm 2 mẫu đất và 1 mẫu lông đã và đang bị phân hủy) Mỗi cơ sở thu mẫu 3 lần cáchnhau 2 tháng (3 mẫu/ lần/lò) để đảm bảo tính đa dạng của nguồn vi sinh vật cần phânlập

- Cach lây mâu :

Vơi mẫu đât: lây 2 mẫu đât nơi có lông gia suc đang phân huỷ , 01 mẫu ở bề mătđât, 01 mẫu đào sâu khoang 20cm ở ngay cơ sở giêt mổ và chuồng nuôi gia suc, môimẫu thu khoang 10 gram mẫu

Vơi mẫu lông: Thu khoang 10 gram mẫu lông đang phân huỷ trong đât ở ngay cơsở giêt mổ và chuồng nuôi gia suc

Mẫu đất, mẫu lông được cho vào túi nilon tiệt trùng, ghi nhãn đem về phòng thínghiệm giữ ở nơi mát đến khi tiến hành phân lập

- Phân lập: khoảng 10g mẫu đất hoặc lông + 90ml nước cất vô trùng (lông gia

súc cắt nhỏ và ủ ở 30oC trong 3 ngày) Hút 1ml dịch pha loãng với nước cất Hút 10µlmẫu ở mỗi nồng độ pha loãng, trãi đều trên đĩa môi trường phân lập có chứa bột lônggia súc làm nguồn carbon và nitrogen (môi trường A: bột lông gia súc 10g/l, NaCl0.5g/l, K2HPO4 0.3g/l, KH2PO4 0.4g/l, agar 15g/l) (Cai et al., 2008), ủ ở 30oC sau 24-

72 giờ, chọn những khuẩn lạc có các đặc điểm khác nhau và có khả năng phân giảilông gia súc (tạo vòng phân giải), cấy chuyển sang môi trường mới theo cách cấy phân

lập đến khi được dòng vi khuẩn ròng Cấy chuyển vào ống nghiệm chứa môi trườngđặc (môi trường A), trữ ở 4oC.

• Chỉ tiêu theo dõi: các dòng vi khuẩn phân lập được

• Kết quả : ghi nhận các dòng vi khuẩn phân lập được

3.2.4 Xác định các đặc điểm hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập

được :

- Quan sát và mô tả các đặc điểm của khuẩn lạc (hình dạng, kích thước, dạng bìa,

độ nổi, màu sắc) phát triển trên môi trường đặc có chứa bột lông gia súc

- Quan sát và mô tả các đặc điểm của tế bào dưới kính hiển vi: hình dạng, kíchthước, khả năng chuyển động

Sau khi phân lập và tách ròng, tiến hành quan sát hình dạng của tế bào vi khuẩntrong môi trường nước cất vô trùng Các mẫu vi khuẩn sống được quan sát dưới kínhhiển vi quang học ở vật kính dầu x100

* Quan sát hình dạng của tế bào vi khuẩn

Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:

- Nhỏ 5µl nước cất vô trùng lên kính mang vật

- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

- Dùng kim cấy, lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nướctrên kính mang vật

- Dùng kính đậy vật, đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậyvật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45º, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹnhàng sau cho trong mẫu vật không có bọt khí

- Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu x100 để thấyđược hình dạng của tế bào vi khuẩn

* Quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn

Sau khi quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất

vô trùng, tiếp tục đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độphóng đại 400 lần

Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:

- Nhỏ 10µl nước cất vô trùng lên kính mang vật

- Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kínhmang vật

- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậyvật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45º, hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàngsao cho trong mẫu vật không có bọt khí

Kích thước vi khuẩn được đo bằng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vậtkính theo cách như sau:

- Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, được đặt giữa hai thấu kính của thị kính

- Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng2mm, được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10µm

Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau:

- Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh củathước

- Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho haithước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho mộtvạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và mộtvạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính

- Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vivật kính

- Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính, được tính theo côngthức:

x = (N / n) x 10µm

x: trị số một khoảng cách của thước trắc vi thị kính

N: số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N=6

n: số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n=35

x= ( 6/35) x 10µm

- Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnhcủa vi mẫu

- Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch củathước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo

- Đếm số khoảng cách thước trắc vi nằm trong hai vạch này

- Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thướcnhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn HữuHiệp, 2002)

- Xác định đặc tính Gram của vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram (Cao NgọcĐiệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008)

Sau khi quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, tiến hành nhuộm Gram theo trình

tự như sau:

- Hút 20µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật

- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi khuẩn rồi trảimỏng trên kính mang vật

- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi khuẩn trênkính mang vật

- Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet lên kính mang vật có chứa mẫu vikhuẩn đã cố định, trải đều Crystal Violet bằng que cấy và để hai phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước

- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy và đểtrong một phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô

- Rửa lại bằng cồn 70% thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mangvật cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô

- Nhỏ từ một đến hai giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để mộtphút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không cònmàu của Fushin

- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước

- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu x100 và ghi nhậnGram của vi khuẩn Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫuGram dương; có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm (Cao Ngọc Điệp vàNguyễn Hữu Hiệp, 2008).

- Thử nghiệm catalase: Chuyển sinh khối ở tâm khuẩn lạc sau 24 - 48 giờ ủ trên môitrường đặc A lên miếng lam Nhỏ lên sinh khối một giọt H2O2 3% Quan sát sự hìnhthành bọt khí: khi có sự hình thành bọt khí (dương tính) / không có sự hình thành bọtkhí (âm tính)

- Thử nghiệm oxydase: Nhỏ khoảng 3 - 4 giọt nước cất lên miếng lam vô trùng sau

đó để giấy lọc có tẩm thuốc thử oxydase vào, lấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường đặc

A sau 24 - 48 giờ ủ, dùng que cấy trải đều sinh khối trên giấy lọc nơi có thuốc thửoxydase Quan sát màu sau khoảng 10 giây: dương tính: xuất hiện màu xanh đậm/ âmtính: không xuất hiện màu xanh đậm

*Kết quả: ghi nhận các thông tin về các đặc tính hình thái – sinh hóa của các dòng

vi khuẩn phân lập được

3.2.5 Đánh giá hoạt tính enzyme keratinase của các dòng vi khuẩn (Areeb el al.,

2012)

* Tạo Azo-keratin:

Phương pháp này được thực hiện tương tự như các bước trong quy trìnhazoalbumin

- Chuẩn bị mẫu bột lông được nghiền thật mịn

- Lấy 1g bột lông cho vào bình tam giác 100 ml, cẩn thận cho phần bột lôngnằm ở đáy bình

- Cho vào tiếp 20 ml nước đã khử ion, dùng khuấy từ trộn đều hỗn hợp

- Cho tiếp vào hỗn hợp 2 ml NaHCO3 10% (w/v), khuấy đều

- Dùng ống nghiệm 10 ml, cho vào 174 mg sulfanilic acid hòa tan trong 5

ml NaOH 0.2 N

- Tiếp tục cho 69 mg NaNO2 hòa tan vào dung dịch

- Dung dịch được chuyển đổi thành môi trường acid bằng 0,4 ml HCl 5N

- Lắc đều trong 2 phút, sau đó trung hòa bởi 0,4 ml NaOH 5N

- Cho tất cả phần dung dịch trong ống nghiệm 10 ml vào bình tam giác 100

ml có bột lông đã chuẩn bị ở trên, hỗn hợp dung dịch được trộn đều trong 10 phút

- Hỗn hợp phản ứng được lọc bằng giấy lọc whatman - số 1, phần azokeratinkhông tan sẽ được rửa hoàn toàn với nước khử ion

- Azokeratin sẽ được hòa lơ lửng trong nước, được lắc đều ở 50 0C trong 2giờ và được lọc lại lần nữa

- Chu kỳ rửa được lập lại cho đến khi pH của dịch rửa 6.0 – 7.0 và sự hấpthụ quang phổ của dung dịch ở bước sóng 450 nm nhỏ hơn 0.01

- Cuối cùng, chu trình rửa được lập lại ít nhất hai lần sử dụng dung dịch đệmpotassium phosphate 50 mM pH 7.5 Azokeratin được rửa một lần nửa với nước vàlàm khô qua đêm trong chân không ở 500C

- Trữ lạnh azokeratin (4-100C) để sử dụng trong thời gian dài

* Đo hoạt tính enzyme keratinase của các dòng vi khuẩn trên cơ chất keratin

Azo-Azokeratin không hòa tan được sử dụng như một cơ chất chỉ thị màu vì khi ủvới dung dịch enzyme keratinase sẽ tạo ra sản phẩm có màu (dẫn xuất azopeptide).Cường độ màu gia tăng của sản phẩm được tạo ra trong dung dịch so với mẫu đốichứng được thể hiện với độ hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 450nm được xác định nhưhoạt tính enzyme keratinase

Sử dụng 5mg azokeratin cho vào ependorf 1,5 ml cùng với 0,8 ml dung dịchđệm potassium phosphate 50 mM, pH = 7,5 Đảo đều hỗn hợp trên cho đến khiazokeratin tan hoàn toàn

Dùng 0,2 ml dịch enzyme thô thêm vào dung dịch azokeratin, trộn và ủ lắctrong 15 phút ở 50oC

Kết thúc phản ứng bằng cách thêm vào ependorf 0,2 ml acid trichloroacetic10%

Hỗn hợp được lọc và được phân tích bằng cách đo ở bước sóng 450 nm vớimáy hấp thụ quang phổ 160 UV

Mẫu đối chứng được chuẩn bị bằng cách thêm 0,2 ml acid trichloroacetic 10%trước khi cho dịch enzyme thô

Đơn vị hoạt động của enzyme keratinase được xác định là số lần tăng độ hấpthụ ở bước sóng 450 nm sau 15 phút phản ứng so với 0,01.

• Kết quả: ghi nhận thông tin về hoạt tính enzyme keratinase của các dòng vi

khuẩn phân lập được

3.2.6 Đánh giá và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân hủy mạnh lông gia súc

• Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp

- Cân 10g lông gia súc đã xử lý, sấy khô và 90g nước cho vào bình tam giác, khửtrùng ở 121oC, 20 phút, để nguội

- Chủng 1ml dung dịch vi khuẩn đã nuôi tăng sinh khối vào các bình tam giácchứa môi trường C (Glucose 10g/l, K2HPO4 1g/l, MgSO4.7H2O 0.1g/l) và lông gia súc

đã chuẩn bị với 3 lần lập lại (3 bình lông gia súc )

- Ủ ở 30oC, sau 5 ngày thu số lông còn lại, rửa sạch, sấy 80oC sau 48giờ, để vàobình hút ẩm, cân tính kết quả

• Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất phân hủy lông: được tính bằng công thức:

Hiệu suất phân hủy (%) = (mBĐ - mC) x 100% / mBĐ

mBĐ: Khối lượng lông ban đầu

mC: Khối lượng lông còn lại sau khi bị thủy phân

3.2.7 Nhận diện các dòng vi khuẩn:

Hai dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc mạnh được chọn để tiếnhành nhận diện dựa trên trình tự đoạn gen 16S rRNA được khuyếch đại bằng kỹ thuậtPCR và giải trình tự; kết hợp với các đặc tính hình thái và sinh lý, sinh hóa đã đượcxác định

Ly trích DNA: DNA của các dòng vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp

Chelex (Yang et al., 2008)

- Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB và ủ qua đêm ở

- Cho thêm 100μl Chelex resin 10% và vortex để hòa tan sinh khối

- Tiếp tục làm lạnh và đun nóng lần nữa

- Ly tâm 10.000 rpm trong 2 phút, rút dịch bên trên cho vào túyp mới

- Trữ ở -20oC cho đến khi thực hiện bước tiếp theo

Đo OD:

OD (Optical Density) được đo ở bước sóng 260nm bằng máy Backman Coulter640B (Hoa Kỳ) Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ 50 ng/μl cho một dungdịch DNA sợi đôi Do đó, nồng độ DNA ở bước sóng 260nm được tính theo công thức:

[DNA] ng/μl = OD260nm x 50 x Độ pha loãng mẫuMẫu DNA được xem là tinh sạch khi có tỉ lệ OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng1,8 đến 2,0

Khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA:

Sau khi ly trích DNA của các dòng vi khuẩn, tiến hành phản ứng PCR với cặpmồi phổ biến mã hóa cho đoạn gen 16S rRNA (Barker et al., 2003) có trình tự nhưsau:

Mồi xuôi 8F: 5’ – AGAGTTTGATCCTGGCTCAG – 3’

Mồi ngược 1391R: 5' – GACGGGCRGTGWGTRCA – 3’

Thành phần phản ứng PCR gồm: nước cất hai lần, PCR buffer, MgCl2, dNTPs,

mồi xuôi, mồi ngược, DNA vi khuẩn và Taq DNA polymerase (Bảng 2) Phản ứng

PCR được tiến hành qua 30 chu kỳ với các mức gia nhiệt được mô tả ở Hình 3

94oC 94oC

60oC

72oC 72oC

4oC2’

Mồi xuôi 1,5Mồi ngược 1,5

Hình 2 Chu kỳ gia nhiệt cua phản ứng PCR

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose

Các mẫu DNA sau khi khuếch đại bằng phản ứng PCR, được điện di trên gelagarose 1,5% (w/v) bằng bộ điện di một chiều Embi-Tec (Hoa Kỳ) có bổ sung thêmethidium bromide (EtBr)

- Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,3g agarose cho vào bình chứa 20ml dung dịchTAE 1X, đun hỗn hợp này trong 4 phút trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn.Lấy ra để nguội tự nhiên khoảng 10 phút (cầm tay được), bổ sung 0,4μl ethidiumbromide và lắc nhẹ cho đều Sau đó đổ nhẹ dung dịch agarose vào khuôn để định hìnhgel Khi đổ gel, nên đổ dứt khoát để tránh bọt khí làm ảnh hưởng đến kết quả điện disản phẩm PCR

- Đặt gel agarose đã được định hình vào bể điện di có chứa dung dịch đệmTAE 1X, bơm 10μl sản phẩm PCR của DNA đã được trộn đều với 2μl loading buffervào các giếng trên gel agarose Tiến hành điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong

60 phút

- Sau khi điện di gel chứa sản phẩm PCR, tiến hành chụp hình gel bằng hệthống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ) Các band xuất hiện trên gel đượcquan sát và so sánh kích thước band DNA vi khuẩn với thang DNA chuẩn 1kb.

Trình tự các sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn tuyển chọn được xác địnhbằng máy giải trình tự tự động Các dòng vi khuẩn được nhận diện dựa vào sự tươngđồng giữa các kết quả trình tự này khi so sánh với trình tự của các dòng vi khuẩn đượccông bố trên ngân hàng gen NCBI bằng chương trình BLAST N

PHẦN 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 HIỆN TRẠNG CHẤT THẢI LÔNG GIA SÚC TẠI TỈNH VĨNH LONG 4.1.1 Tình hình chung

Khảo sát thực tiễn, ghi nhận, đánh giá thực trạng các hố chôn, tình hình giết mổgia súc tại các cơ sở giết mổ trên địa bàn tỉnh Vĩnh Long thông qua phương phápphỏng vấn trực tiếp

Thống kê điều tra hiện trạng xử lý chất thải lông từ các cơ sở giết mổ gia súctrên đia bàn tỉnh Vĩnh Long gồm 1 thành phố và 7 huyện Toàn tỉnh có 35 cơ sở giêt

mổ gia súc ( bảng 4)

Bang 4 Số lượng cơ sở giêt mổ ở đia bàn tỉnh Vĩnh Long

Loại gia súc giết mổ Số lượng cơ sởgiêt mổ Tỷ lệ (%)

Hình 3 Cơ sở hạ tầng được khảo sát tại một cơ sở giết mổ gia súc

100% cac cơ sở giêt mổ gia suc trên đia bàn tỉnh đều thuộc tư nhân quan lý,Các cơ sở đều có cán bộ thú y thường trực để kiểm soát, số lượng cán bộ kiểm soátgiết mổ ở mỗi cơ sở giết mổ gia súc phụ thuộc vào lượng gia súc, gia cầm nhập xuất

tại lò giết mổ Các cơ sở đều tuân thủ đúng quy định ngành thú y về giết mổ, sau khigiết mổ làm vệ sinh sạch

Nguyên liệu đun nấu chỉ có 1/35 cơ sở sử dụng gas (chiếm 3%) dùng trong đunnấu, và 34/35 cơ sở còn lại sử dụng trấu, củi, lá dừa, than đá (chiếm 97%) làm chấtđun nấu

4.1.2 Công suât cac cơ sở giêt mổ gia suc

Công suât cac cơ sở giêt mổ gia suc dao động từ 4 con đên 80 con môi ngày,vơi 10 cơ sở có công suât <10 con/ cơ sở /ngày chiêm 29%, 18 cơ sở có công suât từ

10 con đên ít hơn 20 con / cơ sở /ngày chiêm 51%, cac cơ sở còn lại có công suât từ 20con đên 80 con/ cơ sở /ngày, bình quân 35 cơ sở giêt mổ hơn 600 gia suc môi ngày,thể hiện qua bang 5

Bang 5 Công suât cac cơ sở giêt mổ gia suc

Công suât giêt mổ

(con/cơ sở)

Số lượng(cơ sở )

Tỉ lệ(%)

< 10 gia suc 10 29

10 đên < 20 gia suc 18 51

> 20 gia suc 7 20Tổng cộng 35 100

Hình 4 Công suất lò giết mổ gia súc trong tỉnh

4.1.3 Cách xử lý chất thải lông và nước thải

Các cơ sở giết mổ gia súc có hệ thống xử lý nước thải chưa hoàn chỉnh vàkhông có hệ thống trữ lạnh Cach xử lý lông gia suc tại cac cơ sở giêt mổ rât khac nhauvà chưa được đưa vào một hệ thống nhât đinh Trong đó, số cơ sở có lượng lông ban(7/35) chiếm 20%, số lò có lượng lông dùng cho trồng cây (9/35) chiếm 26%, số lògiết mổ gia súc có cách xử lý lông thải bằng cách đốt, đổ sông, rác (19/35) chiếm 54%.Trong đó, chất thải lông bán (182,4kg/539,2kg) chiếm 34%, chất thải lông dùng chotrồng cây (145,6kg/539,2kg) chiếm 27% và chất thải lông có hướng xử lý khác (đốt,chôn, rác,…) (211,2kg/539,2kg) chiếm 39%.

Bang 6 Cách xử lý chất thải lông ở các lò giết mổ gia súc

Cach xử lý lông thai Số lượng(kg) Tỉ lệ(%)

Trồng cây 145,6 27Khác (rác, đốt, tuôn xuống ao, ) 211,2 39Tổng cộng 539,2 100

Hình 5 Cach xử lý chât thai lông ở cac cơ sở giêt mổ gia suc

(A) (B)

Hình 6 (A), (B) Cach xử lý chât thai lông cua một số cơ sở giêt mổ gia suc

4.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY LÔNG GIA SUC

4.2.1 Số lượng các dòng vi khuẩn phân lập được

Sau 3 lần thu mẫu, mổi lần cách nhau 2 tháng, với 20 mẫu đất, 10 mẫu lông ởmôi lân thu mẫu tại 10 cơ sở giêt mổ gia suc theo số lượng gia suc được giêt mổ nhiềunhất trong tỉnh, đã phân lập được 117 dòng vi khuẩn (bảng 6) Trong đó, 77 dòng đượcphân lập từ các mẫu đất (chiếm 65,8 %), 40 dòng được phân lập từ các mẫu lông(chiếm 34,2 %) Các dòng vi khuẩn được tạm đặt tên là Krx với Kr và x lần lượt là kýhiệu dòng vi khuẩn và số thứ tự dòng vi khuẩn phân lập được (bảng 7), tất cả các dòngnày đều có khả năng phát triển trên môi trường bổ sung bột lông heo, chứng tỏ chúng

có khả năng sử dụng bột lông như nguồn carbon và nitơ cho sự phát triển

Bảng 7 Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn phân lập được

STT Dòng VK Mẫu

Địa điểm thu

STT Dòng VK Mẫu

Địa điểm thu

Đất

02 cơ sởgiết mổgia súcthánhphốVĩnhlong

Đất

01 cơ sởgiết mổgia súcLongHồ

ở VũngLiêm