Nghiên cứu hệ enzyme phân giải cellulose của các vi khuẩn chịu nhiệt từ bã nấm

Tóm tắt báo cáo:1.Mục đích: tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong bã thải cơ chất trồng nấm.2.Phương pháp nghiên cứu chính: Phương pháp phân lập vi khuẩn chịu nhiệt và tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase. Mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Khảo sát hoạt tính catalase. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động và độ bền của cellulase (nhiệt độ và pH). Xác định hoạt độ cellulase của các chủng có khả năng phân giải mạnh cellulose. Khảo sát khả năng phân giải giấy và rơm của một số chủng tiềm năng. Điện di biến tính và không biến tính xác định băng enzyme. Định danh các chủng có khả năng phân giải cellulose bằng sinh học phân tử.3. Kết quả nghiên cứuTừ 2 nguồn cơ chất trồng nấm khác nhau Văn Giang, Hưng Yên và Đồng Văn, Hà Nam, 15 chủng vi khuẩn đã được phân lập. 11 chủng vi khuẩn xác định có hoạt tính cellulase. Cellulase của các chủng vi khuẩn hoạt động mạnh trong dải nhiệt độ từ 30˚C đến 60˚C. 2 chủng còn giữ được hoạt tính ở 75˚C là BNĐV.6 và BNVG.8. Khả năng hoạt động của các chủng vi khuẩn trong dải pH từ 4,5 – 10. Môi trường tối ưu cho hoạt động của cellulase của các chủng vi khuẩn là ở pH trung tính (pH=7,0). Khả năng phân giải giấy và rơm mạnh nhất được thể hiện ở 2 chủng BNĐV.6 và BNVG.8 có tỷ lệ phân giải giấy và rơm lần lượt là 60%, 35% (đối với chủng BNĐV.6) và 52%, 33% (đối với chủng BNVG.8). Protein tổng số của 11 chủng vi khuẩn được xác định trong khoảng 10 – 150 kDa bằng điện di SDS – PAGE. Đồng thời chúng tôi xác định khối lượng phân tử của 11 mẫu bằng phương pháp điện di zymogram. Bằng phương pháp sinh học phân tử đã xác định sơ bộ hai chủng BNĐV.6 và BNVG.8 gần với loài Bacillus circulan và Bacillus subtilis subsp. Spizizennii.4.Kết luận chủ yếu:•Có 15 chủng vi khuẩn chịu nhiệt khác nhau đã được phân lập từ 4 nguồn mẫu. •11 chủng vi khuẩn trong số 15 chủng có khả năng phân giải cellulose trong đó có 2 chủng có khả năng phân giải mạnh cellulose là BNĐV.6 và BNVG.8 (D – d > 12 mm).•Hoạt tính cellulase mạnh khi ủ ở nhiệt độ từ 30˚C 45˚C và bắt đầu giảm hoạt tính khi tăng nhiệt .Hoạt tính cellulose của tất cả các chủng vi khuẩn đều thể hiện mạnh ở pH trung bình (pH= 7,0). Môi trường có pH kiềm ít ảnh hưởng đến hoạt tính của cellulase hơn so với môi trường có pH thấp. •Hoạt độ cellulase của các chủng là hoàn toàn khác nhau và tương đối thấp. Hoạt độ cao nhất là 0,071 Uml và thấp nhất là 0,34 Uml.•Khả năng phân giải giấy và rơm rạ của 11 chủng vi khuẩn là khá tốt. Trong đó, 2 chủng BNĐV.6 và BNVG.8 có tỷ lệ phân giải giấy và rơm >50%.•2 chủng đều thuộc chi Bacillus. có tiềm năng ứng dụng lớn đã được định danh sơ bộ tới mức độ loài dựa vào kết quả trình tự và xây dựng cây phân loại dựa trên gen mã hóa 16s rRNA.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

“Nghiên cứu hệ enzyme phân giải cellulose của các vi khuẩn chịu nhiệt từ

bã nấm”

Sinh viên thực hiện : Mông Mạnh Linh

Giảng viên hướng dẫn : TS Đặng Xuân Nghiêm

“Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam là một phần yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học”, năm học

2014 – 2015.

HÀ NỘI 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quảnêu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng công bố trong các luậnvăn, luận án và các công trình nghiên cứu khoa học trước đây

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn được sử dụng trong luận vănđều được ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan này!

LỜI CÁM ƠN

Sau một thời gian thực tập tại bộ môn Công nghệ Vi sinh, được sự quan tâm,giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại Phòng thí nghiệmcủa Bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành khóa luậntốt nghiệp của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong và ngoài khoa Công nghệSinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức vô cùng quan trọng và quý báutrong suốt thời gian học tập, rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xinbày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Xuân Nghiêm đã tận tìnhhướng dẫn và dạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập cũng như nghiên cứu Tôi xinbày tỏ lòng biết ơn tới TS Nguyễn Văn Giang, ThS Trần Thị Đào, các anh chịcùng toàn thể bạn bè đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốtthời gian thực tập

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Phòng, Ban của khoaCông nghệ sinh học và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiệnthuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp

Và cuối cùng, với tất cả tấm lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lờicảm ơn tới Bố, Mẹ, Ông, Bà và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động viên

và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu

Sinh viên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

SDS: sodium dodecyl sulfate

TÓM TẮT

Với mục đích tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vikhuẩn có khả năng phân giải cellulose trong bã thải cơ chất trồng nấm, từ đó cónhững ứng dụng trong sản xuất và đời sống, chúng tôi đã tiến hành phân lập vàđánh giá một số đăc điểm hóa sinh và sinh học của các chủng vi khuẩn Từ 2 nguồn

cơ chất trồng nấm khác nhau Văn Giang, Hưng Yên và Đồng Văn, Hà Nam, 15chủng vi khuẩn đã được phân lập Các chủng vi khuẩn được định danh sơ bộ dựatrên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, các đặc tính sinh hóa củachúng

Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm có bổ sung cơ chất và khuếch tán đĩathạch, 11 chủng vi khuẩn xác định có hoạt tính cellulase Các chủng này được đánhgiá ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt độ và khả năng hoạt động của cellulase.Nhận thấy, cellulase của các chủng vi khuẩn hoạt động mạnh trong dải nhiệt độ từ30˚C đến 60˚C 2 chủng còn giữ được hoạt tính ở 75˚C là BNĐV.6 và BNVG.8.Khả năng hoạt động của các chủng vi khuẩn trong dải pH từ 4,5 – 10 Môi trườngtối ưu cho hoạt động của cellulase của các chủng vi khuẩn là ở pH trung tính(pH=7,0)

Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase được khảo sát khả năng phân giải

cơ chất là giấy và rơm Khả năng phân giải giấy và rơm mạnh nhất được thể hiện ở

2 chủng BNĐV.6 và BNVG.8 có tỷ lệ phân giải giấy và rơm lần lượt là 60%, 35%(đối với chủng BNĐV.6) và 52%, 33% (đối với chủng BNVG.8)

Protein tổng số của 11 chủng vi khuẩn được xác định trong khoảng 10 – 150 kDa bằng điện di SDS – PAGE Đồng thời chúng tôi xác định khối lượng phân tử của 11 mẫu bằng phương pháp điện di zymogram Bằng phương pháp sinh học

phân tử đã xác định sơ bộ hai chủng BNĐV.6 và BNVG.8 gần với loài Bacillus

circulan và Bacillus subtilis subsp Spizizennii

MỞ ĐẦU

Cellulose là một polymer sinh học tự nhiên phong phú trên trái đất và nócũng chiếm lượng lớn trong chất thải nông nghiệp (Tomme, 1995) Nó là sản phẩmcủa sự quang hợp trong các môi trường trên trái đất, và là nguồn tài nguyên sinhhọc phong phú được sinh ra trong sinh quyển Sinh khối cellulose là nguồn nguyênliệu tái tạo trong chuyển hóa sinh học của vi sinh vật làm tăng giá trị của chất thảinông nghiệp (Javis, 2003) Sự thủy phân cellulose triệt để bằng enzyme cần có sựhoạt động phối hợp đồng thời của 3 loại enzyme cellobiohydrolase (exoglucanase),endoglucanase hay carboxymethycellulase (CMCase) và ß-glucosidases (PratimaGupta, 2012)

Cellulase là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong quá trìnhchuyển hóa vật chất hữu cơ trong thiên nhiên Cellulase có thể thu nhận từ nhiềunguồn khác nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật Nhưng hiệu quả kinh tếnhất vẫn là nguồn cellulose thu được từ quá trình lên men của vi sinh vật (Maiti,2013) Mặc dù cellulase được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn so với amylase vàprotease, nhưng cellulase lại có ý nghĩa rất lớn đối với con người Cellulase được

sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, bao gồm: thực phẩm, sản xuấtthức ăn chăn nuôi, sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất giấy và bột giấy, sản xuấtphân bón vi sinh và xử lý rác thải bảo vệ môi trường

Vi khuẩn chịu nhiệt là nhóm vi sinh vật có khả năng sống trong điều kiệnnhiệt độ khắc nghiệt Chúng là một trong những nhóm vi sinh vật được nghiên cứu

và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất Đã có nhiều nghiên cứu về cácchủng vi khuẩn được phân lập từ đống ủ compost, đống ủ mùn cưa, suối nướcnóng hay các khu vực gần núi lửa v.v.và đã phát hiện được nhiều ứng dụng rộng rãicủa các enzyme bền nhiệt có nguồn gốc từ chúng Tuy nhiên, còn rất ít những

nghiên cứu đầy đủ nào về hệ enzyme phân hủy cellulose của vi khuẩn phân lập từ

bã nấm và khả năng ứng dụng của nó

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hệ enzyme phân giải cellulose của các vi khuẩn chịu nhiệt từ bã nấm”.

A) Mục đích nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu nhiệt có trong bã nấm Phân loại

và mô tả đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được

- Khảo sát hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của chúng đồng thới định danh các chủng có tiềm năng ứng dụng lớn trong đề tài

B) Yêu cầu nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu nhiệt có trong bã nấm

- Phân loại và mô tả đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọnđược

- Khảo sát hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởngđến hoạt tính cellulase của chúng

- Định danh các chủng có tiềm năng ứng dụng lớn trong đề tài

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose

Cellulose là một hợp chất hữu cơ, một polysaccharide được hình thành từcác liên kết mắt xích β-D-Glucose, với công thức (C6H10O5)n trong đó n có thể nằmtrong khoảng 5000 - 14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật(Bayer EA, 1998) Cellulose là sản phẩm của sự quang hợp trong các môi trườngtrên Trái Đất, là nguồn nguyên liệu sinh học phong phú được sinh ra trong sinhquyển (100 tỷ tấn khối lượng khô/năm) mà có thể tái tạo lại được (Trần Non Nước,2012) Tỷ lệ cellulose có trong bông sợi là 90%, trong gỗ là 40-50%, trong rơm lúagạo là 33%, trong rơm lúa mạch là 44% và trong bã mía là 80-85% (Piotrowski,2011)

Cellulose được sử dụng nhiều chủ yếu để sản xuất các tông và giấy Sốlương nhỏ hơn được chuyển đổi thành một loạt các sản phẩm phát sinh như giấybóng kính và rayon (tơ nhân tạo) Chuyển đổi cellulose thành nhiên liệu sinh họcnhư ethanol đang được nghiên cứu như là nguồn nguyên liệu thay thế Celluloseđược dùng trong công nghiệp chủ yếu được lấy từ bột gỗ và bông

1.1.1 Cấu trúc cellulose

Cellulose có công thức hóa học là (C6H10O5)n bao gồm nhiều đơn vị glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside Mức độ polyme hóa trongkhoảng 5000 - 14000 đơn vị (Klemm, Heublein, Fink, & Bohn, 2005) Các đơn vịlặp đi lặp lại nhỏ nhất trong cellulose là cellobiose, trong đó bao gồm hai đơn vịglucose Trong chuỗi cellulose tinh thể dính vào nhau bởi liên kết hydro và lực vander Waals để tạo thành cấu trúc bậc cao không hòa tan

β-D-Cellulose là một chuỗi polymer mạch thẳng: không giống như tinh bộtkhông có sự cuộn xoắn hoặc phân nhánh xảy ra Chuỗi mạch thẳng tạo nên cấutrúc dạng sợi cho cellulose, đơn vị nhỏ nhất gọi là sợi sơ cấp có đường kínhkhoảng 3 nm chỉ bao gồm các phân tử β – D - glucose Giữa các sợi sơ cấp hìnhthành nên các liên kết hydro với nhau hình thành nên vi sợi (microfibril) Các visợi này lại tập hợp thành những bó lớn hơn (fibril) và có thể nhìn được dưới kínhhiển vi quang học Chính nhờ cấu trúc này mà cellulose có độ bền cao và khó bịphân hủy (Nishiyama, và cộng sự, 2002).

Hình 1.1: Cấu trúc Cellulose ( nguồn: http://generalbiomass.com)

Cellulose bao gồm tinh thể và vùng vô định hình Các tinh thể celluloseđược tạo thành do cấu trúc vi sợi kết tinh trong đó các chuỗi cellulose gắn kết vớinhau nhờ liên kết hydro và có tính tổ chức trật tự rất cao nên bền vững với tác độngcủa điều kiện bên ngoài Đối với vùng vô định hình của cellulose, được hình thànhvới cấu trúc không chặt chẽ và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Nhờ haivùng này mà cellulose vừa có tính bền vừa có tính linh động, trong đó cellulase dễdàng tác động vào vùng vô định hình, còn đối với vùng tinh thể cellulase chỉ tácđộng lên bề mặt (Peng, 2011)

Hình 2: Cấu trúc của cellulose a; cấu trúc cellulose b; nanofibril có chứa cellulose dạng tinh thể và dạng vô định hình c; tinh thể nano cellulose sau khi thủy phân bằng acid (Dodson, 2012).

1.1.2 Tính chất của cellulose

Cellulose không có hương vị, không mùi, không hòa tan trong dung môi hữu

cơ và nước, nhưng cellulose có thể trương lên do hấp thu nước Phân tử celluloserất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho sự phân cắt liên kết β – 1,4– glucoside tại 25˚C Cellulose bắt đầu bị phân hủy từ 180˚C Quá trình sinh họcthường diễn ra nhanh hơn và cung cấp nguồn carbon cho khí quyển (Falkowski P,2000)

Trong cấu trúc của cellulose, vị trí C1 – OH tại mỗi đầu phân tử glucose làmột nhóm aldehyde mang tính khử và vị trí C4 – OH là đầu không có tính khử Do

đó mà cellulose tan trong các thuốc thử như cupriethylenediamine (CED),cadmiumethylenediamine (Cadoxen), N -methylmorpholine N -oxide , và lithiumchloride /dimethylacetamid (Stenius, 2000) Cellulose gồm tinh thể và vùng vôđịnh hình Bằng cách xử lý cellulose với kiềm hoặc axit mạnh ở nồng độ cao, vùng

vô định hình có thể được chia nhỏ tạo ra các nanocrystalline cellulose, một loại vật

liệu với nhiều tính chất mới (Peng, 2011) Gần đây, nanocrystalline cellulose đãđược sử dụng làm chất độn trong giai đoạn sinh học polymer hóa để sản xuấtnanocomposites với tính chất chịu nhiệt và độ bền cơ học cao (Pranger &Tannenbaum, 2008)

Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemiccellulose, pectin,lignin tạo nên phức hệ lignocellulose Cấu trúc đó ảnh hưởng lớn đến hoạt độngthủy phân cellulose của cellulase (Dodson, 2012)

1.1.3 Nguồn gốc cellulose

Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp tự nhiên nhiều trên thế giới hiện nay,

có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra Đây cũng làloại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải v.v.) Ởcấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần được phân hủy,nếu không chúng sẽ lại tích tụ và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái

Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật Cellulose có nhiều trongsợi bông (95%), sợi lanh (71%), sợi đay (71%) Ngoài ra, cellulose còn có trong

gỗ, thực vật dưới nước (tảo, rong v.v.), sản phẩm phụ của nông nghiệp (rơm, rạ, lõingô.)

Bảng 1: Thành phần cellulose có trong một số loài thực vật (ArsèneI và

cs, 2013)

1.2 Cellulase

Cellulase là hệ enzyme khá phức tạp xúc tác cho quá trình chuyển hóacellulose thành các sản phẩm hòa tan thông qua xúc tác thủy phân liên kết β – 1,4 –glucoside (Bayer EA, 1998)

1.2.1 Phân loại cellulase và cơ chế hoạt động

Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học về cellulase như (WA., 1959)(Coughlan, 1989), Enari và cs (2002) cho thấy hệ cellulase chủ yếu gồm ba loại

enzyme (Exoglucanase, Endoglucanases, β – Glucosidases):

a. Exoglucanase (EC 3.2.1.91)

Exoglucanase (EC 3.2.1.91) hay có tên gọi khác là 1,4-β-D-glucanase,

C1, Cellobiohydrolases, CBH1, cellulobiosidase, avicelase, exo –cellobiohydrolase, exo – β glucancellobiohydrolase, β - 1,4 – glucancellubiosidase

Enzyme này thủy phân liên kết β - 1,4 – glucoside từ đầu không khử củachuỗi cellulose để tạo thành cellobiose hoặc glucose; không thủy phân cellulosedạng kết tinh và dạng hòa tan mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa của chúng

c. β – Glucosidases (EC 3.2.1.21)

β – Glucosidases hay cellobiase β – D – glucosidase, β – 1,6 – glucosidase, p– nitrophenyl – β – glucosidase, salicinase Enzyme này thủy phân cellobiose,cellodextrin và các cello – oligosaccharide mạch ngắn tạo thành glucose

1.2.2 Cấu trúc và tính chất của cellulase

a Cấu trúc

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các tiểu đơn vị là acid aminđược nối với nhau liên kết peptide – CO – NH - Cellulase có 2 vùng chức năng:

trung tâm xúc tác và trung tâm tạo liên kết với cellulose Hai vùng này nối vớinhau thông qua các vùng không xúc tác (Ainsworth, 1995)

Trung tâm xúc tác là vị trí diễn ra hoạt động phản ứng xúc tác tạo phản

ứng Thông thường cellulase chứa duy nhất 1 trung tâm xúc tác, ngoại trừ một sốtrường hợp đặc biệt

Trung tâm tạo liên kết với cellulose tạo liên kết bền vững với cellulose.

Đơn vị chức năng này giữ vai trò chủ đạo trong quá trình định hướng cơ chất làcellulose đến trung tâm xúc tác của cellulase Bên cạnh đó, một số cellulase cũngtham gia vào quá trình xúc tác bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạngtinh thể Một số khác lại có xu hướng liên kết với cellulose vô định hình thay vìcellulose dạng tinh thể (David, 2007)

Trung tâm liên kết tạo với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặctrưng cho enzyme thủy phân cellulose mà nó cấu thành nên tiểu đơn vị xúc tác cấutrúc cellulosome

Trung tâm tạo liên kết với cellulose liên kết thuận nghịch với cellulose nên

nó được ứng dụng trong công nghệ sản xuất protein (Teeri, 1997)

Vùng không xúc tác giữ vai trò cầu nối giữa trung tâm tạo liên kết với

cellulose và trung tâm xúc tác (Ainsworth, 1995)

b Tính chất

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethylcellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC) Cellulase cắt liên kết β – 1,4– glucoside trong cellulose, lichenin và các β – D – glucan của ngũ cốc

Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất của cellulose có thể khác nhau Cellulose từnguồn gốc khác nhau có những đặc điểm khác nhau về pH tối ưu, độ hòa tan và

thành phần amino acid Cellulase hoạt động ở pH từ 3,0 – 7,0 nhưng pH tối ưutrong khoảng từ 4,0 – 5,0 Nhiệt độ tối ưu từ 40˚C - 50˚C

Cellulase cũng chịu ảnh hưởng mạnh bởi các ion kim loại Các ion kim loại

có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa hoạt động của cellulase Các ion kim loại nặng ởnồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme.Các ion Hg2+ ức chế hoàn toàn hoạt tính cellulase, ion Ca2+ lại làm tăng hoạt tính

cellulase của Bacillus sp D04 lên 40% so với đối chứng (Sharma và cộng sự,

1995) Còn Mg2+ làm giảm nhẹ hoạt tính (hoạt tính còn lại 92%) và Zn2+ ức chếmạnh hoạt tính cellulase (hoạt tính chỉ còn 37% so với đối chứng) (Han và cộng

sự, 1995)

Ngoài việc chịu ảnh hưởng của các ion kim loại, cellulase cũng chịu ảnhhưởng bởi các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá

(2007) trên chủng Penicillium sp DTQ-HK1cho thấy, các dung môi hữu cơ như

methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase Cácchất tẩy rửa như Tween 20, Tween 80, SDS và Triton X-100 đều làm giảm hoạttính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm hoạt tính cellulasexuống chỉ còn 18 – 34%

1.3 Cơ chế thủy phân cellulose

Quá trình thủy phân cellulose cần có sự tham gia của cả ba loại enzymecellulose: endoglucanase, exoglucanase và β – glucoside Thiếu một trong ba loạienzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến sản phẩm cuối cùng(Bhat, 2000)

Đầu tiên, endoglucanase hoạt động trên các sợi cellulose ở vùng không địnhhình một cách ngẫu nhiên Sự phân cắt các liên kết β – 1,4 – glucoside tạo ra cácsợi cellulose tự do.Sau đó, exoglucanase hoạt động trên các đầu tự do của sợi

cellulose tạo ra cellobiose Các cellobiose lại được phân hủy bằng β – glucosidetạo ra sản phẩm cuối cùng là các phân tử glucose (Singhania, 2009).

Hình 1.3: Quá trình thủy phân cellulose (Singhania, 2009).

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủycellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơchất, lượng enzyme và một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệenzyme từ nhiều nguồm enzyme vi sinh vật khác nhau Mỗi loại vi sinh vật chỉtổng hợp ưu việt một loại enzyme Chính vì thế, việc khai thác enzyme từ nhiềunguồn vi sinh vật khác nhau là cần thiết

1.4 Hệ thống cellulase vi khuẩn

Cellulase là hệ enzyme khá phổ biến ở hầu hết các loài vi sinh vật có trong

tự nhiên bao gồm nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn Nhiều nghiên cứu cho thấycellulase được sinh ra bởi nhiều sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn (Bahkali,1996) Cả nấm và vi khuẩn đều được nghiên cứu và khai thác nhằm sản xuất mộtloạt các cellulase và hemicellulases Hầu hết chú trọng vào việc sử dụng các loạinấm nhằm sản xuất enzyme vì khả có khả năng sản xuất số lượng dồi dào, thường

ít phức tạp hơn vi khuẩn, dễ tách chiết và tinh sạch hơn (Maiti, 2013) Tuy nhiên,

những nghiên cứu về đặc tính cellulase của vi khuẩn mới gần đây khiến cho việckhai thác celluase từ vi khuẩn trở nên rộng rãi hơn Có một số lý do chính mà vikhuẩn gần đây được khai thác mạnh mẽ nhằm sản xuất được nhiều celluase hơn là

do vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm Cellulase của vi khuẩnthường phức tạp hơn và khu phức hợp đa enzyme làm tăng khả năng phân hủycellulose Vi khuẩn có khả năng sống và tạo celluase trong các điều kiện stress nhưnhiệt, lạnh, mặn v.v Do đó, các chủng vi khuẩn có thể tồn tại và sản xuất cácenzyme cellulolytic trong các điều kiện khắc nghiệt và có thể sử dụng trong quátrình bioconversion (Maiti, 2013) Điều này làm tăng tỷ lệ enzyme thủy phân, quátrình lên men và thu hồi sản phẩm Các nhà khoa học hiện nay đang tập trungnghiên cứu vào việc sử dụng và cải tiến enzyme để sử dụng trong các ngành côngnghiệp và nhiên liệu sinh học Nhiều vi khuẩn có thể sản sinh cellulase và pháttriển trên cơ chất có cellulose Chúng có khả năng phân hủy các dẫn xuất củacellulose hoặc cả các vùng vô định hình của tinh thể cellulose Tuy nhiên, chỉ córất ít vi khuẩn tổng hợp được hệ thống enzyme hoàn chỉnh để có thể phân hủy cácdẫn xuất của cellulose hay cellulose tinh thể đến sản phẩm cuối cùng Những vikhuẩn như vậy được gọi là vi khuẩn “cellulolytic true” Còn vi khuẩn mà chỉ cókhả năng sản xuất endoglucanase và β – glucosidase, nhưng không phải là hệ thốnghoàn chỉnh thì được gọi là “pseudocellulolytic” (Wood, 1988)

Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng vikhuẩn nhìn chung vẫn còn khiêm tốn so với nghiên cứu trên nấm (Crawford, 1986;

Li and Gao, 1996, Ekperigin, 2006) Dù vậy, đặc điểm phân giải cellulose của vài

nhóm vi khuẩn như Cellulomonas, Cellovibrio, Pseudomonas, Sporosphytophaga spp (Nakamura và Kappmura, 1982); Bacillus và Micrococcus (Immanuel, 2006)

đã được báo cáo

1.5 Hình thức hoạt động của cellulase trong vi khuẩn

Các nhà nghiên cứu đã tập trung vào 4 cấu trúc được cho là quan trọng trongviệc bám dính cụ thể vào cellulose của enzyme Bao gồm: 1) phức hợp đa thànhphần hay còn gọi là cellulosomes, 2) fimbriae hay pili dính, 3) Carbohydrate của vikhuẩn lớp glycocalyx, 4) miền gắn enzyme (Wood, 1988)

1.5.1 Phức hợp cellulosome

Để có thể xâm nhập vào bên trong vật liệu cellulose, vi khuẩn phải tìm ramột cơ chế hữu hiệu cho sự phân hủy cellulose khi có sự hiện diện, cạnh tranh củacác loài vi khuẩn khác và bị giới hạn bởi ATP cho sự tổng hợp cellulase Điều nàydẫn đến sự phát triển của “Hệ thống cellulase phức hợp”, được gọi là cellulosome(Susan và Leschine, 1995)

Cellulosome có kích thước lớn và ổn định, trọng lượng phân tử từ 2 – 16MDa Các cellulosome kết hợp với nhau tạo thành các polycellulosome, được gắnkết trên vách tế bào, có đường kính khoảng 60 – 200 nm và có khối lượng có thểlên tới 100 MDa Thành phần quan trọng của cellulosome là protein scaffoldinkhông có hoạt tính xúc tác nhưng lại có chức năng tập hợp các tiểu đơn vịcellulase Các tiểu đơn vị chứa những vùng dockerin Mối quan hệ này được thểhiện thông qua vùng cohesin trên scaffoldin, gắn kết vùng dockerin trên enzyme vàCBD trên scaffoldin liên kết với phức hợp cellulose Các cellulosome phức tạp

nhất và được nghiên cứu tốt nhất là cellulosome của vi khuẩn ưa nhiệt Clostridium

thermocellum (Shoham và Lamed, 1999)

1.5.2 Fimbriae

Fimbriae hay pili liên quan đến độ bám dính của vi khuẩn trên bề mặtcellulose Nó có chiều rộng từ 5 – 7 nm, chiều dài 100 – 200 nm và được tìm thấytrong vi khuẩn gram âm (Pell AN, 1993) Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các tiểuđơn vị trong cấu trúc của fimbriae chịu trách nhiệm về độ bám dính Một số tiểu

đơn vị trong các vi khuẩn gram dương Actinomyces viscocus và Sanguis

Streptococus (Lindberg, 1987).

1.5.3 Độ bám dính qua Carbohydrates epitope của vi khuẩn Glycocalyx

Một số nghiên cứu cho rằng các lớp chất nhờn xung quanh Ruminococus

albus và Ruminococus flavefaciens đã được hình thành từ glycoprotein (dư lượng

Carbohydrate) đã tham gia vào độ bám dính của vi khuẩn (Cheng, 1980) Nếucarbohydrate glycocalyx được xử lý bởi quá trình oxy hóa với protease và

dextranase thì độ bám dính của Ruminococus albus với cellulose giảm đáng kể.

1.5.4 Sự bám dính qua Cellulose – binding Domains của cellulolytic enzyme

Có hai chức năng chính được tìm thấy trong cấu trúc của cellulase Các miềnxúc tác hoạt động chịu trách nhiệm về sự phân tách thủy phân của glucosizit và cácmiền ràng buộc chịu trách nhiệm về việc gắn kết enzyme của vi khuẩn lên bề mặtcủa nó Các miền ràng buộc cellulose – binding Domains (CBD) được liên kết vớilõi xúc tác bởi mối liên kết giàu axit amin Vùng liên kết carbohydrate (CBD) liênkết chặt chẽ cellulosome với cơ chất cellulose CBD liên kết với cellulose tinh thểhiệu quả hơn là đối với cellulose vô định hình (Wood, 1988)

1.6 Bã thải sau trồng nấm (SMS – Spent Mushroom Substrate)

Spent Mushroom Substrate - SMS là một sản phẩm phụ của quá trình sảnxuất nấm Sau quá trình sản xuất nấm, các chất dinh dưỡng trong chất nền khôngcòn thuận lợi cho sự phát triển của nấm nữa, chất nền đó được thải ra gọi là bã thảisau trồng nấm (Mingxin Guo, 2001)

Quá trình thu hoạch nấm kết thúc, tuy không thể trồng nấm tiếp do hết chấtdinh dưỡng cần thiết cho nấm có trong đó nhưng bã thải sau trồng nấm (SMS) vẫncòn chứa một lượng sinh khối nấm còn lại cùng với sự phong phú của các chủngnấm và vi khuẩn dị dưỡng (Ahlawat, 2007) SMS cũng có khả năng phân hủy các

chất hữu cơ và vô cơ có trong đất và nước nhờ hệ vi sinh vật ở trong đó Cácenzyme ngoại bào ligninolytic của vi khuẩn và nấm trong SMS đặc biệt là

Pleurotus ostreatus, Pleurotus florida, Pleurotus flabellatus và P Sajor-caju đã

được báo cáo là có vai trò trong phân hủy thuốc nhuộm (Ntougias, 2004) Do đó

mà các SMS có khả năng hấp thụ và phân hủy các chất ô nhiễm trong nước thải dệtmay

Trong SMS, hệ vi sinh vật bao gồm nhiều loài khác nhau như Psedomonas

fluorescens, Rummelibacillus và Bacillus subtilis Vi khuẩn tồn tại trong SMS chủ

yếu là vi khuẩn Gram dương và quan trọng là vi khuẩn Bacillus, Paenibacillus,

Brevibacterium, Microbacterium và Arthrobacter (Nelson, 1944).

Sự đa dạng vi sinh vật trong SMS còn bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nguồn gốccủa vật liệu ủ ban đầu, bổ sung chất dinh dưỡng và quá trình xử lý thanh trùng –nhiệt Trong quá trình ủ nhiệt, một số vi sinh vật vẫn có khả năng sinh trưởngchúng được gọi là các vi sinh vật ưa nhiệt Vi sinh vật ưa nhiệt này có nhiều tínhnăng độc đáo, có thể được sử dụng khai thác trong các ngành khác nhau như côngnghệ sinh học, công nghiệp v.v Nhiều nghiên cứu quan tâm đến tiềm năng củanhóm sinh vật này bởi các khả năng như sản xuất các enzyme chịu nhiệt hữu dụng,các acid hữu cơ, các chất kháng sinh và hợp chất trao đổi thứ cấp có tầm quantrọng trong nhiều lĩnh vực (Ahlawat, 2007)

1.7 Vi khuẩn ưa nhiệt

Dựa vào nhiệt độ của môi trường và khả năng sinh trưởng của chúng mà visinh vật được chia làm 4 nhóm chính (Deacon, 2011):

- Nhóm ưu lạnh: có thể phát triển ở 0˚C hoặc thấp hơn nữa, giới hạn nhiệt độ trêncủa chúng là khoảng 25˚C

- Nhóm ưu ấm: phát triển mạnh trong nhiệt độ vừa phải, từ 20˚C đến 45˚C

- Nhóm ưa nhiệt: với nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 50˚C, tối đa là 70˚C và tối thiểu

là 20˚C

- Nhóm ưa nhiệt cao: có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trên 75˚C Ví dụ điển hình là

các loài thuộc chi Pyrodictium, được tìm thấy trong vùng địa nhiệt dưới đáy biển

sâu, có khả năng sinh trưởng trong ngưỡng nhiệt độ từ 82-110oC và phát triển tốtnhất ở nhiệt độ 105oC

Nhóm vi khuẩn ưa nhiệt thường phân bố chủ yếu ở những nơi có nhiệt độcao trong tự nhiên Chúng được tìm thấy dưới đáy đại dương, suối nước nóng, ởvùng địa nhiệt, gần miệng núi lửa, hay trong các đống ủ compost v.v (Hassen vàcộng sự, 2002)

Một số loài vi khuẩn ưa ấm thường gặp trong tự nhiên như Bacillus

licheniformis, là một loài trực khuần gram dương Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu

khoảng 30˚C, tuy nhiên nó có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn nhiều Nhiệt độ tối ưu

để sản sinh enzyme là 37˚C Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nghèo dinhdưỡng, đặc biệt là trong đất, có khả năng tạo bào tử Những bào tử này có khả năngchịu nhiệt, lạnh, bức xạ, và các áp lực môi trường khác Trong những điều kiệnbình thường, các bào tử nảy mầm trở thành tế bào vi khuẩn Vì vậy người ta sửdụng nó để sản xuất các enzyme, kháng sinh, và các chất chuyển hóa trong công

nghiệp Trong một số nghiên cứu trước đây, Bacillus licheniformis 77-2 đã được

phân lập và cho thấy khả năng sản xuất tốt xylanase ngoại bào Enzyme này hoạtđộng tối ưu ở pH 6.0, nhiệt độ 70°C và ổn định ở khoảng pH 5,0-10,0; giữ nguyênhoạt tính sau khi xử lý ở 40oC trong vòng 1 giờ (Silva và cộng sự, 2006)

Do các lợi thế của vi khuẩn như sinh trưởng nhanh, sinh enzyme đa dạng và

có khả năng chịu các điều kiện môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ, pH v.v mà sựquan tâm đối đối với vi khuẩn chịu nhiệt ngày càng được quan tâm Các enzyme cótính ứng dụng cao có tiềm năng lớn trong thương mại lớn, nhất là trong các ngành

công nghiệp nơi mà có các điều kiện khắc nghiệt ảnh hưởng trực tiếp đến hoạtđộng của enzyme

1.8 Ứng dụng cellulase

Cellulase chiếm một phần lớn thị trường enzyme chỉ đứng sau amylase vàprotease Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp bao gồm:công nghiệp chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, công nghiệp dệt, nhiên liệusinh học v.v Sinh khối thực vật lignocellulose là tái tạo và có thể được sử dụng đểsản xuất nhiên liệu (nhiên liệu sinh học) thay thế nhiên liệu từ dầu mỏ (Bayer EA,1998)

1.8.1 Trong công nghiệp giấy

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, việc bổ sung các loại enzymetrong khâu nghiền bột và xeo giấy là rất quan trọng Nguyên liệu ban đầu chứahàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quátrình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn Trongcông đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hìnhcủa sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượngnghiền cho quá trình cơ học (Bhat, 2000) Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lývới endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăngkhả năng khuếch tán hóa chất vào trong gỗ và hiệu quả khử lignin

Trong công nghiệp tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trướckhi sản xuất các loại giấy in, giấy viết Endoglucanase và hemiccellulase đã đượcdùng để tẩy trắng mực in trên giấy

1.8.2 Trong công nghiệp dệt

Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng cellulase để giữ màu vải sáng, bền

và không bị sờn cũ Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải và tạo ra

các vệt “stone washed” Trước đây, các vệt “stone washed” được làm thủ côngbằng cách dùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất lớp kiềm trên bề mặt và tạo ranhững sợi chỉ màu trắng Hiện nay người ta sử dụng cellulase thay cho việc sửdụng đá bọt Bằng cách này, người ta có thể tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằngcách tăng hay giảm lượng cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt.

1.8.3 Trong xử lý môi trường

Các chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất thảihữu cơ hiện nay ở các đô thị và các khu công nghiệp Trong các chất thải hữu cơchứa cellulose thường là những chất rất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên.Nếu để các chất hữu cơ phân hủy trong điều kiện tự nhiên thì phải mất thời gianphân hủy rất lâu; tuy nhiên nếu bổ sung sinh vật có khả năng sinh nhiều cellulasethì thời gian phân hủy sẽ ngắn hơn Điều này rất có ý nghĩa trong việc bảo vệ môitrường (hạn chế sự ô nhiễm nước, không khí và đất) đồng thời thúc đẩy quá trìnhchuyển hóa vật chất trong tự nhiên

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào đống ủ để xử lý chất thải thì việctạo ra các chế phẩm sinh học có chứa các vi sinh vật sinh cellulase đã được nghiêncứu và sản xuất

Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máygiấy thải ra Nguyên liệu làm giấy chủ yếu là gỗ chứa nhiều loại polysaccharide,trong đó có các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng của giấy Tuy

đã được xử lý nhưng nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, cácxưởng mộc vẫn chứa lượng lớn cellulose cần được xử lý

1.8.4 Trong sản xuất thức ăn gia súc

Nguồn phế liệu giàu cellulose trong tự nhiên rất đa dạng phong phú như:rơm rạ, bã mía, lõi ngô v.v Tuy nhiên, phần lớn các phế phẩm này đều bị vứt bỏ,

hoặc được ủ làm phân bón, hoặc được sử dụng làm chất đốt v.v Trong khi đó,nguồn nguyên liệu rẻ tiền dùng trong chế biến thức ăn gia súc lại thiếu Vì vậy,việc ứng dụng cellulase để phân hủy nguồn chế phẩm chứa cellulose vừa dùng làmnguồn thức ăn cho gia súc, vừa bảo vệ môi trường là một vấn đề rất để đáng quantâm.

1.8.5 Trong kỹ thuật di truyền

Chế phẩm cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền vì nó

có khả năng phá vỡ tế bào thực vật mà không làm tổn thương các cơ quan bêntrong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các nhân tố di truyền Do đó, phươngpháp này đã thay thế các phương pháp cơ học và hóa học

Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào tạo tế bào trần (protoplast), có ýnghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gen: dung hợp tế bàotrần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố và mẹ

1.8.6 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được sử dụng để khai thác các thành phần dinh dưỡng trong rau quả Glucanase được thêm vào quá trình hồ hóa mạch nha trong bia và trong công nghiệp rượu Cellulase cũng được sử dụng trongviệc khai thác carotenoid và được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm với vai trò

là chất tạo màu

1.8.6.1 Trong công nghiệp sản xuất bia

Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme như amylase, protease

và glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó làmgiảm lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia Trongdịch lên men có chứa một lượng β – glucan, chất này ảnh hưởng đến khả năng lọc

và gây đục cho bia

1.8.6.2 Trong công nghiệp sản xuất cà phê

Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cả phê chủ yếu được sản xuấtbằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao Đểtiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men được áp dụng Đó làquá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý vỏ quả cà phê vàlàm tăng khả năng ly trích dịch quả Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tượngthẫm màu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ Khi

sử dụng chế phẩm A niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính cellulase

và pectinase cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt quả cà phê được bóc

vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt không dùng chế phẩm enzyme và hiệusuất bóc vỏ khá cao

1.8.6.3 Trong sản xuất các loại nước quả

Việc sản xuất nước ép trái cây và nước ép rau quả đã trở thành thương mạihóa khi mà lợi ích từ các sản phẩm nước ép trái cây, rau quả đã được công nhận đốivới sức khỏe của con người Việc sản xuất nước ép rau quả đòi hỏi sự ổn địnhtrong thành phần dinh dưỡng cũng như chất lượng của sản phẩm Trong đầu nhữngnăn 1930, khi ngành công nghiệp trái cây bắt đầu sản xuất nước trái cây tuy nhiênviệc sản xuất chỉ với sản lượng thấp và gặp phải nhiều khó khăn trong việc lọcnước trái cây (Uhlig, 1998) Sau đó, các nghiên cứu về pectinase, cellulase và

hecmicellulase từ vi sinh vật (Aspergillus niger and Trichoderma sp.) cùng với việc

tăng kiến thức về thành phần dinh dưỡng trong trái cây giúp khắc phục những khókhăn trên (Grassin C, 1996) (Grassin và Fauquembergue, 1996)

Trong sản xuất các loại nước quả không cồn, cellulase được thêm vào dịchhóa, hemiccellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho nồng độ hóa củanước quả có thịt tốt hơn Dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tếbào thịt quả và các chất xơ có bản chất polysacharide làm cho dịch có độ nhớt cao

và có màu đục Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phâncác polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình táchchiết và làm trong.

1.8.7 Trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa

Cellulase được ứng dụng trong bột giặt và chất tẩy rửa chủ yếu nhằm mụcđích làm mềm vải cotton Ngoài ra, khi bổ sung kết hợp cellulase và một sốenzyme khác như protease, lipase, amylase v.v sẽ làm bột giặt và các chất tẩy rửa

có thể tẩy sạch một số các vết bẩn khó giặt như vết mực, dầu mỡ, vết bẩn có nguồngốc protein v.v

1.8.8 Trong sản xuất nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học (bioful) là loại nhiên liệu có thể phục hồi được, được tạo

ra từ sản phẩm của ngành nông nghiệp, thực phẩm hay quá trình tái chế các sảnphẩm dầu ăn hoặc dầu thực vật Nhiên liệu sinh học có thể được sử dụng trong cácthiết bị thông thường hay động cơ diesel Nhiên liệu sinh học sử dụng đơn giản,không độc và không chứa lưu huỳnh hay các chất thơm Ngoài ra, nhiên liệu sinhhọc có thể pha trộn với xăng dầu để tạo ra hỗn hợp chứa nhiên liệu sinh học

Bioethanol và biodiesel là hai loại nhiên liệu sinh học được sử dụng rộng rãinhất cho ngành giao thông vận tải; trong đó, bioethanol được sản xuất nhờ enzymecellulase thủy phân sinh khối cellulose còn biodiesel là một ester của acid béo vàankyl, được tạo ra từ dầu mỡ thực vật, mỡ động vật hay mỡ tái chế

Việc sản xuất enzyme được kiểm soát chặt chẽ với các dòng vi sinh vật vàcác điều kiện nuôi cấy chúng Khả năng sinh cellulase phụ thuộc vào một quan hệrất phức tạp liên quan đến nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, chất cảm ứng, chất phụthêm vào môi trường, sự khuấy, thời gian nuôi cấy v.v (Immanuel et al., 2006) Do

đó, việc tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase mạnh và

nghiên cứu sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợpcellulase của các dòng vi khuẩn đó sẽ giúp ích cho việc sản xuất enzyme cellulasetốt hơn cũng như trong việc cải tiến các sản phẩm vi sinh, đặc biệt là trong các chếphẩm hỗ trợ và xử lý phế phẩm nông nghiệp sau thu hoạch – nơi mà thành phầncellulose chiếm tỷ lệ khá cao (hơn 50%).

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bã nấm được thu thập tại trungtâm nấm Văn Giang-Hưng Yên, Đồng Văn –Hà Nam

Bảng 2.1: Mẫu bã nấm thu thập

cưa

Văn Giang-Hưng Yên

2.2 Hóa chất và môi trường

Hóa chất: Hoá chất dùng trong đề tài từ nhiều nguồn khác nhau được thống

kê trong bảng 2 dưới đây:

Bảng 2.3: Hóa chất

Methanol Trung Quốc

Môi trường nuôi cấy và khảo sát được sử dụng trong đề tài bao gồm:

- Môi trường LB (Luria and Bertani):

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn

Công nghệ vi sinh – Khoa CNSH – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu : Từ ngày 15/07/2014 đến ngày 31/12/2014.

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Sau 1-2 ngày, mỗi tế bào riêng biệt sẽ sinh sản và phát triển thành một khuẩnlạc riêng rẽ trên bề mặt môi trường Các khuẩn lạc này được cấy chuyển sang môitrường mới, quan sát và ghi lại đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào

2.4.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase (phương pháp định tính).

2.4.2.1 Phương pháp nuôi cấy chấm điểm có bổ sung cơ chất.

Xác định hoạt tính cellulose ngoại bào của vi khuẩn bằng phương pháp nuôicấy chấm điểm có bổ sung cơ chất (Pratima Gupta, 2012) Chủng vi khuẩn được nuôicấy chấm điểm trên môi trường LB có bổ sung cơ chất là CMC 1% Sau 24h nuôi cấy

ở nhiệt độ nghiên cứu là 50˚C, mẫu nuôi cấy chấm điểm được nhuộm bằng dung dịchlugol để quan sát vòng sáng quanh khuẩn lạc Vi khuẩn có khả năng sinh cellulosephân giải cơ chất CMC sẽ tạo thành vòng sáng quanh khuẩn lạc đơn Vòng sángquanh khuẩn lạc càng to, sáng chứng tỏ hoạt tính cellulase của vi khẩn càng mạnh

Hoạt tính cellulase được xác định bằng công thức: r = D – d

Trong đó: r (mm): Hoạt tính cellulase

D (mm): Đường kính vòng sáng

d (mm): Đường kính khuẩn lạc đơn

2.4.2.2 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch.

Xác định hoạt tính cellulose ngoại bào của vi khuẩn bằng phương pháp khuếchtán đĩa thạch (Laurent, 2000) Chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng,lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ nghiên cứu là 50˚C; sau 24h thu dịch nuôi sinh khối vikhuẩn đem ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch bên trên, nhỏ 50-100µl dịch này vào giếng đĩa thạch trên môi trường có bổ sung cơ chất CMC 1%được pha trong dung dịch đệm để ổn định pH của phản ứng enzyme cơ chất, ủ ở37˚C; sau 12h, đĩa thạch được nhuộm bằng dung dịch lugol 1X (1g iodine/100 ml) đểquan sát vòng sáng quanh giếng thạch Vi khuẩn có khả năng sinh cellulose phân giải

cơ chất CMC sẽ tạo thành vòng sáng quanh giếng thạch Vòng sáng quanh giếngthạch càng to, sáng chứng tỏ hoạt tính cellulase của vi khẩn càng mạnh

Hoạt tính cellulase được xác định bằng công thức: r = D – d

Trong đó: r (mm): Hoạt tính cellulase

D (mm): Đường kính vòng sáng

d (mm): Đường kính giếng thạch

2.4.3 Phương pháp giữ giống

Các chủng vi khuẩn đã được làm thuần, được giữ giống trên môi trườngthạch nghiêng bằng cách cấy theo kiểu zic zac trong ống nghiệm (Lương ĐứcPhẩm, 1998) rồi đem nuôi ở 50ºC trong 2-3 ngày Sau đó, các ống giống được bảoquản ở 4oC Các chủng vi khuẩn được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóatrước khi nhân giống

Giữ giống trong glycerol: Dịch vi khuẩn nuôi lỏng đến đầu pha ổn định được

bổ sung khoảng 20% glycerol (v/v) làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng và giữ ở âm80ºC Việc giữ giống theo cách này có thể giúp bảo quản vi khuẩn trong vài năm và

vi khuẩn cần được hoạt hoá trước khi nhân giống (Lương Đức Phẩm, 1998)

2.4.4.Phương pháp định danh sơ bộ

2.4.4.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào

Các chủng vi khuẩn được cấy ria hoặc cấy trên môi trường thạch LB sau đóquan sát và mô tả đặc điểm màu sắc, cấu trúc của khuẩn lạc

Sau 2-3 ngày nuôi, hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn được quan sát dướikính hiển vi bằng phương pháp nhuộm Gram

- Đổ lugol đi rồi khử màu bằng ethanol 95% (0,5-1 phút), thay cồn vài lần (đểnghiêng lam kính tạo dòng chảy)

- Dùng nước cất vô trùng rửa tiêu bản Nhuộm bổ sung fuchsin trong 1-2 phút

và rửa lại bằng nước

- Quan sát tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính dầu 100X

2.4.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính catalase.

Phương pháp này nhằm xác định hệ enzyme catalase có trong vi khuẩn Các visinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa chuỗi chuyền điện tử có cytochrome đều cóenzyme catalase, có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp vớioxy tạo ra H2O2 Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân

tử có độc tính cao này trong tế bào Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghinhận qua hiện tượng sủi bọt khí Hóa chất sử dụng trong phương pháp này bao gồmdung dịch H2O2 10% được giữ trong tủ lạnh với chai màu nâu, tránh ánh sáng và dungdịch đệm phosphate pH 7,0

Tiến hành thí nghiệm trên phiến kính: dùng que cấy lấy một ít sinh khối từkhuẩn lạc thuần đặt trên một phiến kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 10% lên sinh khốicủa vi khuẩn trên phiến kính Ghi nhận sự sủi bọt nếu có Hoặc có thể chuyển một ítsinh khối của vi khuẩn lên phiến kính, nhỏ một giọt H2O2 10% rồi đậy lại bằng lá kính(lam men) Ghi nhận nếu có sự xuất hiện bọt khí bị giữ lại giữa phiến kính và lá kính.Nếu vi khuẩn có hệ enzyme catalase sẽ có hiện tượng sủi bọt khí sau nhỏ dung dịch

H2O2

2.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ và độ bền của

enzyme.

2.4.5.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme.

Các chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng, lắc 180 vòng/phút ởnhiệt độ nghiên cứu là 50˚C Sau 24h thu dịch nuôi sinh khối vi khuẩn đem ly tâm vớitốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch bên trên, nhỏ 50-100µl dịch này vàogiếng đĩa thạch trên môi trường có bổ sung cơ chất CMC 1% được pha trong dungdịch đệm có các mức pH lần lượt là 4,5; 7,0 và 10; ủ ở 37˚C Đĩa thạch được nhuộmbằng dung dịch lugol 1X sau 12h để quan sát và đo vòng sáng quanh giếng thạch Xử

lý số liệu và lập đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase

2.4.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền enzyme.

Các chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng, lắc 180 vòng/phút ởnhiệt độ nghiên cứu là 50˚C Sau 24h thu dịch nuôi sinh khối vi khuẩn đem ly tâm vớitốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch bên trên Dịch enzyme thô được xử lý ởcác mức nhiệt độ khác nhau 30˚C, 45˚C, 60˚C, 75˚C và 90˚C Nhỏ 50-100µl dịchenzyme thô đã được xử lý tại các mức nhiệt độ khác nhau vào giếng đĩa thạch trênmôi trường có bổ sung cơ chất CMC 1% được pha trong dung dịch đệm để ổn định

pH của phản ứng enzyme cơ chất, ủ ở 37˚C; sau 12h, đĩa thạch được nhuộm bằngdung dịch lugol 1X để quan sát vòng sáng quanh giếng thạch Sau 12h, đĩa thạchđược nhuộm bằng dung dịch lugol 1X để quan sát và đo vòng sáng quanh giếngthạch Xử lý số liệu và lập đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tínhenzyme cellulase

2.4.6 Xác định hoạt độ bằng phương pháp DNS (phương pháp định lượng) (Miller, 1959)

Nguyên lý:

Dựa trên khản năng hydro hóa cơ chất CMC của cellulase để biến đổi thànhđường khử, phản ứng tạo phức màu đỏ sậm với thuốc thử DNS (2 – hydroxy – 3,5 –dinitrobenzoic acid) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độđường trong dung dịch.

Sản sau phản ứng được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bướcsóng 540 nm Hàm lượng đường sau phản ứng được xác định thông qua đồ thị đườngchuẩn glucose

Cách tiến hành:

Các hóa chất chuẩn bị:

- Dung dịch cơ chất CMC 1% Cân chính xác 1gram CMC, hòa tan trong

80 ml dung dịch đệm Natri acetate 20 mM, pH 5,8 chuyển vào bình địnhmức 100 ml, thêm dung dịch đệm đến vạch rồi lắc đều

- Dung dịch enzyme: pha loãng dung dịch enzyme với dung dịch đệmNatri acetate 20 mM, pH 5,8 đến độ pha loãng thích hợp

- Dung dịch DNS 1%: 1g DNS; 200mg phenol tinh thể; 50 mg sodiumsulphite; 6 g Rochelle salt; 1g NaOH trong 100 ml H2O

- Dựng đường chuẩn glucose

- Hòa tan 100 mg glucose với 80 ml nước cất và chuyển vào bình địnhmức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều, ta được dung dịchglucose nồng độ 1 mg/ml

- Thực hiện một loạt ống nghiệm theo bảng sau:

DNS (µl)

Nước cất

(ml)

- Lắc đều các ống nghiệm, đun sôi cách thủy trong 15 phút

- Làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng trong 1 chậu nước mát So màu trên máyquang phổ ở bước sóng 540 nm

- Dựa vào sự tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và nồng độ hấp phụ OD540

dựng đường biểu diễn sự biến thiên của OD và nồng độ glucose chuẩn bằngphần mềm Excel

- Tiến hành phản ứng

- Hút 150 µl dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm thử thật (ống thí nghiệm)

- Thay 150 µl dung dịch đệm Natri acetate 20mM, pH 5,8 đối với ống đối chứng(ĐC)

- Đặt vào bể ổn nhiệt trong vòng 5 phút ở ngưỡng nhiệt độ nghiên cứu Đồngthời ta cũng có để bình chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 40˚C trong

5 phút

- Sau đó, thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắcđều Để phản ứng ở nhiệt độ nghiên cứu chính xác 30 phút

- Thêm 900 µl dung dịch DNS, lắc đều để dừng phản ứng enzyme

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong mộtchậu nước

- So màu ở bước sóng 540nm, dựa theo đường chuẩn glucose, xác định nồng độđường khử trong dung dịch

Hoạt độ (U/ml) = (CTN – CDG) x D x 1000

T x VTrong đó:

CTN: số đọc từ đường chuẩn glucose của ống thí nghiệm, µmol/l