“Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.) đối kháng nấm Fusarium oxysporum”

Một nhóm bệnh hại cây trồng nguy hiểm trong sản xuất là nhóm nấm có nguồn gốc trong đất như: Fusarium, Phytophthora, Rhizoctonia, Phythium…. Nhóm nấm này có phổ ký chủ rộng, gậy hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: Đậu đỗ, cây họ cà, họ bầu bí, ….Chúng gây ra nhiều triệu chứng khác nhau như: Lở cổ rễ, héo rũ gốc mốc trắng, thối thân khi bệnh nặng. Đặc biệt là nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng làm chết cây rất nhanh. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây trồng. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI “Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.) đối kháng nấm Fusarium oxysporum” Sinh viên thực Ngành : Lê Thị Hiền : Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Giang “ Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội phần yêu cầu trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học” HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Bộ môn Công nghệ Vi sinh, quan tâm, giúp đỡ dìu dắt tận tình thầy cô giáo, cán phòng thí nghiệm Bộ môn, cố gắng nỗ lực thân, hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học truyền đạt cho kiến thức vô quan trọng quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Giang Ths Trần Thị Đào tận tình hướng dẫn dạy dỗ suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Hà Viết Cường, TS Đặng Xuân Nghiêm, TS Nguyễn Xuân Cảnh, KS.Đỗ Hải Quỳnh, KS Nguyễn Khắc Hải, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập Qua xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Phòng, Ban khoa Công nghệ sinh học toàn thể bạn bè giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập thực tập tốt nghiệp Và cuối cùng, với tất lòng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn tới Bố, Mẹ, Ông, Bà người thân nuôi nấng, động viên tạo động lực cho suốt trình học tập, nghiên cứu TÔI XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN! Sinh viên Lê Thị Hiền MỤC LỤC XK VSV HSCC HSKS HTKS HTKN ISP NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN : Xạ Khuẩn : Vi sinh vật : Hệ sợi chất : Hệ sợi khí sinh : Hoạt tính kháng sinh : Hoạt tính kháng nấm : International Streptomyces Project DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang 31 Bảng 4.1: Các chủng phân lập Bảng 4.2: đặc điểm hình thái chủng XK môi trường Gause –I (sau -10 ngày theo dõi) 32 Bảng 4.3: Số lượng phân bố xạ khuẩn theo nhóm màu 33 Bảng 4.4: Hoạt tính kháng nấm chủng XK phân bố theo nhóm màu 36 Bảng 4.5: Hoạt tính kháng nấm Fusarium Oxysporum 17 chủng xạ khuẩn Bảng 4.6: Đặc điểm nuôi cấy chủng HN6 sau thời gian nuôi cấy 38 Bảng 4.7: Đặc điểm nuôi cấy chủng NA1 sau thời gian nuôi cấy 41 Bảng 4.8: Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn HN6 NA1 43 Bảng 4.9: Nhiệt độ thích hợp chủng xạ khuẩn HN6 NA1 43 41 Bảng 4.10: pH thích hợp chủng xạ khuẩn HN6 NA1 44 Bảng 4.11: Khả chịu muối chủng HN6 NA1 45 Bảng 4.12: Hoạt tính enzyne chủng xạ khuẩn HN6 NA1 47 Bảng 4.13: So sánh đặc điểm phân loại chủng HN6 loài chuẩn theo Morais and D Maia, 1961; Gause 1983 48 Bảng 4.14: So sánh đặc điểm phân loại chủng NA1 loài chuẩn theo Thirumalachar and Bhatt 1960; Gause 1983 48 DANH MỤC HÌNH/ ĐỒ THỊ Tên hình/ đồ thị Hình 4.1: Tỷ lệ chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu Trang 36 Hình 4.2: Một số chủng xạ khuẩn khiết 37 Hình 4.3: Tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39 Hình 4.4: Hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn HN6 NA1 40 Hình 4.5: Hoạt tính kháng nấm chủng XK theo phương pháp đồng nuôi cấy 40 Hình 4.6: Hệ sợi khí sinh chất chủng HN6 41 Hình 4.7: Hệ sợi khí sinh chất chủng NA1 41 Hình 4.8: Khả hình thành sắc tố melanin chủng 43 Hình 4.9 : Khả thích ứng pH chủng HN6 45 Hinh 4.10 :Khả thích ứng pH chủng NA1 46 Hình 4.11: Khả chịu muối chủng NA1 47 Hình 4.12: Khả chịu muối chủng HN6 47 Hình 4.13 : Hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn HN6 NA1 48 Hình 4.14: Hoạt tính protease chủng HN6 NA1 49 TÓM TẮT Với mục đích tuyển chọn chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.) có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Fusarium oxysporum Chúng tiến hành phân lập, làm đánh giá đặc tính chủng xạ khuẩn phân lập Dựa vào điều kiện cho phép phòng thí nghiệm, tiến hành phân lập xạ khuẩn theo phương pháp Vinogradski, kết phân lập thu 44 chủng xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn sau phân lập, làm môi trường Gause - I (Ghighi cộng 2004; Zhang, 2011; Jeffrey,2008,v.v), sau tiến hành định danh sơ dựa đặc điểm hình thái, giữ giống thạch nghiêng tủ âm -80 oC Bằng phương pháp đồng nuôi cấy khuếch tán đĩa thạch, tuyển chọn chủng xạ khuẩn HN6 NA1 có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Fusarium oxysporum Chúng tiến hành nghiên cứu đăc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng xạ khuẩn HN6 NA1 Kết cho thấy màu sắc khuẩn ty đa dạng có thay đổi môi trường khác chủng sinh trưởng tốt nhiệt độ 30ºC, pH -8 Chủng HN6 có khả sinh trưởng 45ºC, có khả phát triển nồng độ muối 5%, sinh enzyme ngoại bào thủy phân CMC, tinh bột casein, có khả đồng hóa nguồn đường D – Glucose; Saccarose; D – Xylose; Rhamnose; Raffinose Kết so sánh với đặc điểm phân loại xạ khuẩn Gause, 1983 cho thấy HN6 có khả chủng S Roseosporus Chủng NA1 có khả sinh trưởng 40ºC, có khả phát triển môi trường có nồng độ muối lên tơi 7%, có khả sinh enzyme ngoại bào thủy phân tinh bột CMC, có khả sử dụng nguồn đường cacbon D – Glucose; Saccarose; I – Inositol; Mannitol; Raffinose; Lactose Kết so sánh cho thấy chủng NA1có khả chủng S Albofaciens PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Trong xu phát triển nông nghiệp giới, Việt Nam năm gần nông nghiệp đạt nhiều thành tựu to lớn Sản xuất gạo đáp ứng đủ nhu cầu nước mà xuất đến nước lớn trến giới Mỹ Ngoài lương thực, công nghiệp, thực phẩm phát triển mạnh mẽ sản xuất Song sản nông nghiệp gặp khó khăn thời tiết bất lợi, dịch hại sâu bệnh, cỏ dại, chuột…, giảm suất phẩm chất nông sản Theo thống kê FAO (1984) hàng năm bệnh hại trồng làm giảm suất, phẩm chất trồng mà làm tăng chi phí sản xuất Bời để bảo vệ sản xuất, phải áp dụng hàng loạt biện pháp canh tác, giới vật lý…, đặc biệt biện pháp dùng phổ biến sản xuất nông nghiệp biện pháp hóa học gây hàng loạt vấn đề ảnh hưởng đến môi trường ô nhiễm nguồn nước, đất, dư lượng vượt ngưỡng cho phép Vì việc tìm kiếm biện pháp phòng trừ bệnh hại tối ưu hướng đắn cần thiết cho nông nghiệp bền vững Một số thực phẩm trồng cạn cà chua, đậu tương, khoai tây… có giá trị dinh dưỡng cao, đem lại hiệu kinh tế Nhưng hàng năm thực phẩm thường bị nhiều loại bệnh hại làm tổn thất nặng nề sản xuất việc tìm biện pháp phòng trừ hiệu cần thiết Một nhóm bệnh hại trồng nguy hiểm sản xuất nhóm nấm có nguồn gốc đất như: Fusarium, Phytophthora, Rhizoctonia, Phythium… Nhóm nấm có phổ ký chủ rộng, gậy hại nhiều loại trồng khác như: Đậu đỗ, họ cà, họ bầu bí, ….Chúng gây nhiều triệu chứng khác như: Lở cổ rễ, héo rũ gốc mốc trắng, thối thân bệnh nặng Đặc biệt nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng làm chết nhanh Chính vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương FAO năm 1992 khẳng định đấu tranh sinh học tảng trương trình IPM (quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế phát triển quần thể vi sinh vật gây bệnh Trong số tác nhân sinh học thường sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn nhóm có nhiều tiền tỷ lệ loài có khả sinh chất kháng sinh cao, có nhiều chất kháng sinh chống nấm mạnh Xạ khuẩn, đặc biệt loài Streptomyces, xem nguồn sản xuất chất kháng sinh nhiều (Intra cộng sự, 2011) Đây đặc tính quan trọng xạ khuẩn Cho tới nay, có khoảng 8000 chất kháng sinh biết giới có tới 80% xạ khuẩn sinh (Dhanasekaran cộng sự, 2012) Nhiều nhóm hợp chất hoạt động sinh học khác macrolide, benzoquinones, aminoglycosides, polyenes, nucleoside antibiotics sử dụng nông nghiệp chất chuyển hóa sản xuất từ Streptomyces (Qin cộng sự, 1994; Smith cộng sự,1990; Hwang cộng sự, 1994 ) Vì việc tìm kiếm chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật (đặc biệt nấm Fusarium oxysporum) có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật xây dựng nông nghiệp an toàn bền vững Xuất phát từ lý trên, từ xu hướng nghiên cứu giới góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô phong phú nước ta Chúng thực đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.) đối kháng nấm Fusarium oxysporum” 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trồng Nghiên cứu số đặc điểm sinh học số chủng xạ khuẩn có hoạt  - tính kháng nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng 1.3 Đối tượng nội dung nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất vùng nước như: Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Đà Nẵng Nấm Fusarium oxysporum cung cấp Trung tâm Bệnh Nhiệt đới – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nôi Nội dung nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ mẫu đất khác Tìm 1-2 chủng có khả đối kháng mạnh; nghiên cứu mô tả sơ đặc  điểm sinh học đặc điểm phân loại số chủng có hoạt tính chống nấm mạnh Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả sinh phát triển chủng xạ khuẩn PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan xạ khuẩn 2.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Chúng có đất, nước, rác, bùn, phân chuồng, chí chất mà vi khuẩn nấm mốc không phát triển Trong đất xạ khuẩn chiếm khoảng 20 – 40% tổng số vi sinh vật đất, tập trung nhiều lớp đất bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm) Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật Ngoài ra, phân bố xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào pH môi trường, chúng có nhiều đất trung tính kiềm yếu đất chua Nhiệt độ thích hợp cho phát triển xạ khuẩn thường khoảng 25-45 oC, (Mitra cộng sự, 2008; Proudyogiki, 2012; Dhanasekaran cộng sự, 2012) Theo Waksman thi gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.00 mầm xạ khuẩn, chiếm khoảng – 45% tổng số vi sinh vật (Waksman, S.A 1961) 2.1.2 Vị trí phân loại xạ khuẩn Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi 1000 loài Hiện nay, 478 loài công bố thuộc chi Streptomyces 500 loài thuộc tất chi lại xếp vào nhóm xạ khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo, 2006) Xạ khuẩn nhóm vi sinh vật đa dạng đa số sinh trưởng hiếu khí tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự nấm Ban đầu xạ khuẩn coi vi nấm chúng sinh trưởng giống với nấm Mạng lưới phân nhánh thể sợi thường phát triển cà bề mặt chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên (tạo thành hệ sợi chất) (Ashutosh K, 2008) Đây đặc điểm để phân loại xạ khuẩn Xạ khuẩn nhóm đa dạng nhiều loài vi khuẩn hiếu khí, gram dương, cấu tạo dạng sợi, DNA giàu G+C với tỷ lệ G-C cao (>55%) (Istianto cộng sự, 2012) Trước đây, vị trí phân loại xạ khuẩn câu hỏi gây nhiều tranh luận nhà vi sinh vật học, có đặc điểm vừa giống vi khuẩn vừa giống nấm Tuy nhiên, đến nay, xạ khuẩn chứng minh vi khuẩn với chứng sau (Nguyễn Lân Dũng, 2006): Một số xạ khuẩn loài thuộc chi Actinomyces Nocardia giống với loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillusvà Corynebacterium 10 Cả chủng xạ khuẩn nghiên cứu có khả đồng hóa tốt nguồn cacbon khác Chủng HN6 đồng hóa tốt nguồn cacbon là: D – Glucose; Saccarose; D – Xylose; Rhamnose; Raffinose, sinh trưởng yếu môi trường có chứa nguồn cacbon: L – Arabinose; I – Inositol; Mannitol; Cellulose; Lactose Chủng NA1 có khả đồng hóa tốt nguồn cacbon D – Glucose; Saccarose; I – Inositol; Mannitol; Raffinose; Lactose, sinh trưởng yếu môi trường có chứa L – Arabinose; D – Xylose khả đồng hóa nguồn đường Rhamnose Cellulose  Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp (giải) Chủng HN6 NA1 nuôi môi trường Gause – I thang nhiệt độ khác Khả sinh trưởng chủng thể bảng 4.9 Bảng 4.9: Nhiệt độ thích hợp chủng xạ khuẩn HN6 NA1 Nhiệt độ 25˚ 30˚ 35˚ 40˚ Chủng HN6 ++ +++ ++ + NA1 ++ +++ ++ + Ghi chú: +++: Sinh trường tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; 45˚ 50˚ + - - +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng Trong dải nhiệt độ nghiên cứu 25 - 50ºC, nhận thấy hai chủng phát triển tốt nhiệt độ 30ºC biểu qua phát triển HSKS môi trường (ghi rõ phát triển) Tuy nhiên chủng HN6 có khả chịu nhiệt lên tới 45ºC cao so với chủng NA1 Hình ảnh phần phụ lục  pH sinh trưởng thích hợp Chủng NH6 NA1 nuôi cấy trên môi trường Gause – I với khoảng pH từ – 13 Khả sinh trưởng chủng thể bảng 4.10 Bảng 4.10: pH thích hợp chủng xạ khuẩn HN6 NA1 41 pH 10 Chủng HN6 + ++ ++ +++ +++ ++ ++ NA1 + ++ ++ +++ +++ ++ ++ Ghi chú: +++: Sinh trường tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; 11 12 13 ++ ++ ++ + + - +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng Kết cho thấy chủng phát triển được môi trường có dải pH rộng, phát triển tốt pH – Kết qảu hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu công bố xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật phát triển tốt môi trường trung tính kiềm Hình 4.9 : Khả thích ứng pH chủng HN6 42 Hinh 4.10 :Khả thích ứng pH chủng NA1  Khả chịu muối Hai chủng HN6 NA1 nuôi cấy môi trường ISP – I có bổ sung NaCl nồng độ 0,5; 3; 5; 7; 9; 11% 0% làm đối chứng Kết thu bảng 4.11 Bảng 4.11: Khả chịu muối chủng HN6 NA1 Nồng độ 0,5 NaCl(%) Chủng HN6 ++ ++ ++ + NA1 ++ +++ + + + Ghi chú: +++: Sinh trường tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; 11 - - +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả sinh trưởng xạ khuẩn Kết trình bày bảng 4.11cho thấy: chủng NA1 có khả chịu nồng độ muối tới 7% cao so với chủng HN6 Chủng NA1 có phát triển tốt nồng độ muối 0,5%, nồng độ có tác dụng kích thích sinh trưởng 43 Hình 4.11: Khả chịu muối chủng NA1 Hình 4.12: Khả chịu muối chủng HN6  Khả sinh enzyme ngoại bào 44 Trong trình sống, để phân giải hợp chất hữu phức tạp thành chất hữu đơn giản hấp thụ Xạ khuẩn có khả tiết vào môi trường enzyme ngoại bào Chúng tiến hành kiểm tra khả chủng xạ khuẩn nghiên cứu Hoạt độ tương đối enzyme xác định qua hệ số phân giải: D – d(cm) Trong đó: D đường kính vòng phân giải (cm), d đường kính lỗ thạch đường kính khuẩn lạc Kết thể bảng 4.12 hình 4.10 Bảng 4.12: Hoạt tính enzyne chủng xạ khuẩn HN6 NA1 Ký hiệu chủng HN6 NA1 Hoạt tính enzyme (D – d, mm) Amylase Cellulase 12 25 36 (-): vòng phân giải Protease 20 - Kết cho thấy, chủng HN6 có khả sinh loại enzyme mạnh enzyme protease Chủng NA1 sinh enzyme thủy phân mạnh tinh bột CMC không sinh enzyme protease thủy phân casein CMC Tinh bột Hình 4.13 : Hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn HN6 NA1 45 Chủng HN6 Chủng NA1 Hình 4.14: Hoạt tính protease chủng HN6 NA1 4.2.4 Vị trí phân loại hai chủng xạ khuẩn HN6 NA1  Phân loại chủng HN6 Đặc điểm phân loại chủng HN6 thể bảng 4.14 cho thấy: chủng HN6 có cuống sinh bào tử có dạng móc câu Khi nuôi cấy cấy môi trường Gause – I, màu sắc KTCC từ màu vàng sang màu hồng xám, màu sắc KTKS có màu hồng Trên môi trường Gause – II, ISP – I, ISP – II, ISP – IV, màu sắc KTKS từ màu trắng hồng sang màu hồng Chủng HN6 khả hình thành sắc tố melanin Đối chiếu khóa phân loại Gause, 1983, nhận thấy chủng HN6 có nhiều đăc điểm giống với loài S Roseosporus đặc điểm hình thái, cuống sinh bào tử, khả hình thành sắc tố melanin đặc điểm nuôi cấy Như vậy, chủng HN6 thuộc loài S Roseosporus Chủng Morais and D Maia mô tả năm 1961 Bảng 4.13: So sánh đặc điểm phân loại chủng HN6 loài chuẩn theo Morais and D Maia, 1961; Gause 1983 Các đặc điểm phân loại Màu sắc KTKS Màu sắc KTCC Hình dạng cuống sinh bào tử Nhóm đỏ Streptomyces HN6 S Roseosporus Hồng, trắng hồng Hồng, trắng hồng Hồng,hồng trắng, hồng Trắng, hồng xám xám Chuỗi bào tử có móc Chuỗi bào tử có móc câu 46 Sắc tố tan Sự tạo thành melanin Khả sử dụng đường: D – Glucose L – Arabinose I – Inositol Mannitol Raffinose Rhamnose D – Xylose Không có Không có - - + + ± ± + + ± + + + + Ghi chú: (+): có khả năng; (-): khả năng; (±): không  Phân loại chủng NA1 Bảng 4.13: So sánh đặc điểm phân loại chủng NA1 loài chuẩn theo Thirumalachar and Bhatt 1960; Gause 1983 Các đặc điểm phân loại Màu sắc KTKS Màu sắc KTCC Hình dạng cuống sinh bào tử Nhóm trắng Streptomyces NA1 S albofaciens Trắng, trắng xám Trắng, trắng xám Trắng, vàng Trắng, vàng Chuỗi bào tử có xoắn ốc Chuỗi bào tử có xoắn ốc Hình dạng bề mặt bào tử Hình ovan bề mặt nhẵn Hình ovan bề mặt nhẵn Sắc tố tan Không có Không có Sự tạo thành melanin Khả sử dụng đường: D – Glucose + + L – Arabinose + + I – Inositol + + Mannitol + + Raffinose + + Rhamnose D – Xylose ± ± Saccarose + ± Ghi chú: (+): có khả năng; (-): khả năng; (±): không Đối chiếu khóa phân loại xạ khuẩn Gause, 1983 Chúng nhận thấy chủng NA1 có nhiều đặc điểm giống loài S Albofaciens Kết so sánh đặc điểm chủng NA1 với loài S Albofaciens trình bày bảng 4.13 Chủng NA1 có cuống sinh bảo tử dạng xoắn, bề mặt bào tử nhẵn Khi nuôi cấy môi trường có chứa sắt chủng khả sinh sắc tố melanin 47 Khi so sánh đặc điểm chủng NA1 với loài chuẩn S Albofaciens khóa phân loại Gause, 1983 Chúng nhận thấy chủng NA1 có nhiều đặc điểm giống với loài hình thái, cuống sinh bào tử, đặc điểm nuôi cấy, khả hình thành sắc tố melanin Như vậy, chủng NA1 thuộc loài S Albofaciens Chủng Thirumalachar and Bhatt mô ta vào năm 1960 V.KẾT LUẬN 5.1 Kết luận  Từ mẫu đất khác nhau, phân lập làm 44 chủng xạ khuẩn, số có 17 chủng có khả sinh chất kháng sinh chống nấm Fusarium oxysporum mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 38,6%, phân thành nhóm: nhóm màu trắng chiếm 35,3%; xám – 23,5%; nâu – 23,5%; vàng – 5,9%; hồng – 5,9%; tím - 5,9 %  Đã tuyển chọn chủng xạ khuẩn HN6 NA1 có hoạt tính kháng nấm mạnh 17 chủng có hoạt tính kháng nấm Khả đối kháng nấm chủng HN6 trì 17 ngày, chủng NA1 20 ngày  Bước đầu xác định chủng HN6 thuộc loài Streptomyces roseosporus., chủng NA1 thuộc loài Streptomyces albofaciens 5.2 Kiến nghị - Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp sinh xạ khuẩn cho hoạt tính kháng nấm cao - Tiếp tục nghiên cứu khả tổng hợp kháng sinh hai chủng HN6 NA1 - Tách chiết xác định chất hóa học chất kháng sinh 48 - Giải trình tự 16S chủng xạ khuẩn HN6 NA1 để biết xác vị trí phân loại chủng xạ khuẩn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bùi Thị Hà, “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên” Luận văn thạc sĩ sinh học,2008 Bùi Thị Việt Hà, “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Đặn Văn Tiến, Nguyễn Đình Tuấn, Vi Thị Đoan Chính, Ngô Đình Bính, “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng vi khuẩn Xanthomonasoryzae gây bệnh bạc lúa” Báo cáo khoa học hội nghị CNSH toàn quố, 2009 Lê Gia Hy (1994), “ Nghiên cứu Xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam”, Luận án Tiến sĩ, Hà Nội Lê Mai Hương (1993), “ Nghiên cứu Xạ khuẩn sinh kháng chất kháng sinh phân lập Hà Nội vùng phụ cận”, Luận án Tiến sĩ, Hà nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietscience, 2006 Nguyễn Khang, Kháng sinh học ứng dụng, NXB Y học, Hà Nội, 2005 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 1972 10 Nguyễn Thành Đạt (2000), Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục 11 Vi Thị Đoan Chính, “Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện”, Báo cáo tổng kết dề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Mã số B2009 – TN07 – 02 49 12 Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998) Giáo trình bệnh nông nghiệp NXB Nông nghiệp Tài liệu tiếng anh Ashutosh K, Pharmaceutical Microbiology, New Age International (P) Ltd, pp 89 – 101, 2008 Berdy J, 1974, “Recent development in antibiotic research and classification of antibiotic according to the chemical structure”, Adv Appl.Microbiol, 18 309 – 406 Dhanasekaran D., Thajuddin N and Panneerselvam A 2012 Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine Fungicides for Plant and Animal Diseases: 1-27 E B Shirling and D Gottlieb, Methods for characterization of Streptomyces species, 1966, pp 313 – 340 Isolation of soil Streptomyces as source antibiotics active against antibioticresistant bacteria (EurAsian Journal of BioSciences EurAsia J BioSci 2, 73-82 (2008)) Hopwood D.A and MJ Merrick, (1997), “Genetics of antibiotic production” , J Bacteriol, pp 596 – 636 Newman D.J, Cragg G.M, Snader K.M, (2003), Natural products as ourees of new drugs over the period”, J Nat Prod, 66, 1022 – 1037 Plant pathology, Georgen Agrios, 1997 Thirumalachar M J And V.V Bhatt 1960 Some Streptomyces species producing oxytetracycline Hindustan Antiobiot Bull 3: 61-63 10 The fusarium laboratory Manual _John F Leslie, Brett A Summerell illustrated by Suzanne Bullock 11 Trerner, H.D, Buckus E.J (1963), “System of color wheels for Streptomyces taxonomy” Appl Microbiol, 11, 335 – 338 12 Robert D Nolan, Thomas C (1988), “Isolation and Screeming of Actinomycetes” In Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press, London 13 Shirling E.B, Gotilieb D (1966), “Methods for characterization of Streptomyces spectes”, International Journal of Systematic Bacterriology, Vol 16, No 3, 313 – 340 50 14 Shirling E.B, Gotilieb D 1968 Cooperative description of type cultures of Streptomyces II Species descriptions from first study Int J Syst Bacteriol 18:69- 189 15 Shirling E.B, Gotilieb D 1968 Cooperative description of type cultures of Streptomyces III Additional species descriptions from first and second studies Int J Syst Bacteriol 18:279-392 16 Shirling E.B, Gotilieb D 1968 Cooperative description of type cultures of Streptomyces IV Species descriptions from second, third, and fourth studies Int J Syst Bacteriol 18:391-512 17 Waksman, S A (1961) The Actinomycetes Classification identification and description of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkin Co., Baltimore, USA 18 Williams and Wilkin, Bergey’s maunual of systematic Bacteriology, Vol 4, 1989, pp 2451 – 2492 19 Werner Braun (1976), Di truyền học vi khuẩn (Người dịch Lê Đình Lương), NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội PHỤ LỤC Hình thái khuẩn lạc KTKS số chủng xạ khuẩn phân lập Chủng DN1 51 Chủng HN5 Chủng NA3 Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp chủng xạ khuẩn HN6 NA1 Hình 2.1: Hai chủng XK HN6 NA1 nuôi 25ºC 52 Hình 2.1: Hai chủng XK HN6 NA1 nuôi 30ºC Hình 2.1: Hai chủng XK HN6 NA1 nuôi 35ºC Hình 2.1: Hai chủng XK HN6 NA1 nuôi 40ºC 53 Hình 2.1: Hai chủng XK HN6 NA1 nuôi 45ºC Hình 2.1: Hai chủng XK HN6 NA1 nuôi 50ºC 54 55 ... tài: “Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.) đối kháng nấm Fusarium oxysporum” 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả đối kháng với nấm. .. (1963)) 3.2.1.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng 24 • Đồng nuôi cấy: Nấm mốc xạ khuẩn môi trường PDA Nấm mốc cấy trung tâm đĩa Petri, chủng xạ khuẩn cấy cách xa góc bao quanh nấm mốc Sau... cấy, xạ khuẩn có khả đối kháng nấm mốc làm nấm mốc khả xâm lấn khu vực môi trường xung quanh xạ khuẩn Nếu xạ khuẩn khả kháng, nấm mốc xâm chiếm toàn khu vực xung quanh xạ khuẩn mọc đè lên xạ khuẩn