“Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.) đối kháng nấm Fusarium oxysporum”

Một nhóm bệnh hại cây trồng nguy hiểm trong sản xuất là nhóm nấm có nguồn gốc trong đất như: Fusarium, Phytophthora, Rhizoctonia, Phythium…. Nhóm nấm này có phổ ký chủ rộng, gậy hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: Đậu đỗ, cây họ cà, họ bầu bí, ….Chúng gây ra nhiều triệu chứng khác nhau như: Lở cổ rễ, héo rũ gốc mốc trắng, thối thân khi bệnh nặng. Đặc biệt là nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng làm chết cây rất nhanh. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây trồng. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Giang

“ Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học”.

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn Công nghệ Vi sinh, được sự quan tâm, giúp

đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong và ngoài khoa Công nghệ sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức vô cùng quan trọng và quý báu trong suốt thời gian học tập, rèn luyện tại trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Giang và Ths Trần Thị Đào đã tận tình hướng dẫn và dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Hà Viết Cường, TS Đặng Xuân Nghiêm, TS Nguyễn Xuân Cảnh, KS.Đỗ Hải Quỳnh, KS Nguyễn Khắc Hải, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập.

Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Phòng, Ban của khoa Công nghệ sinh học và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp.

Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Bố, Mẹ, Ông, Bà và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.

TÔI XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!

Sinh viên

Lê Thị Hiền

MỤC LỤC

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.2: đặc điểm hình thái của các chủng XK trên môi trường Gause –I

(sau 7 -10 ngày theo dõi)

32Bảng 4.3: Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 33Bảng 4.4: Hoạt tính kháng nấm của các chủng XK phân bố theo nhóm màu 36

Bảng 4.5: Hoạt tính kháng nấm Fusarium Oxysporum của 17 chủng xạ

khuẩn

38Bảng 4.6: Đặc điểm nuôi cấy của chủng HN6 sau các thời gian nuôi cấy 41Bảng 4.7: Đặc điểm nuôi cấy của chủng NA1 sau các thời gian nuôi cấy 41

Bảng 4.8: Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn HN6

Bảng 4.9: Nhiệt độ thích hợp của 2 chủng xạ khuẩn HN6 và NA1 43Bảng 4.10: pH thích hợp của 2 chủng xạ khuẩn HN6 và NA1 44Bảng 4.11: Khả năng chịu muối của 2 chủng HN6 và NA1 45Bảng 4.12: Hoạt tính enzyne của 2 chủng xạ khuẩn HN6 và NA1 47

Bảng 4.13: So sánh đặc điểm phân loại của chủng HN6 và loài của chuẩn

theo Morais and D Maia, 1961; Gause 1983

48

Bảng 4.14: So sánh đặc điểm phân loại của chủng NA1 và loài của chuẩn

theo Thirumalachar and Bhatt 1960; Gause 1983

48

DANH MỤC HÌNH/ ĐỒ THỊ

Hình 4.1: Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu 36

Hình 4.3: Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm

màu

39

Hình 4.4: Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn HN6 và NA1 40

Hình 4.5: Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng XK theo phương pháp đồng

Hình 4.6: Hệ sợi khí sinh và cơ chất của chủng HN6 41Hình 4.7: Hệ sợi khí sinh và cơ chất của chủng NA1 41Hình 4.8: Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng 43Hình 4.9 : Khả năng thích ứng pH của chủng HN6 45Hinh 4.10 :Khả năng thích ứng pH của chủng NA1 46

Hình 4.13 : Hoạt tính enzyme của 2 chủng xạ khuẩn HN6 và NA1 48Hình 4.14: Hoạt tính protease của 2 chủng HN6 và NA1 49

hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Fusarium oxysporum

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đăc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy và đặc điểmsinh lý sinh hóa của 2 chủng xạ khuẩn HN6 và NA1 Kết quả cho thấy màu sắc của khuẩn

ty rất đa dạng có thay đổi trên các môi trường khác nhau 2 chủng sinh trưởng tốt ở nhiệt

độ 30ºC, pH 7 -8 Chủng HN6 có khả năng sinh trưởng ở 45ºC, có khả năng phát triển ởnồng độ muối 5%, có thể sinh enzyme ngoại bào thủy phân CMC, tinh bột và casein, cókhả năng đồng hóa các nguồn đường D – Glucose; Saccarose; D – Xylose; Rhamnose;Raffinose Kết quả so sánh với đặc điểm phân loại xạ khuẩn của Gause, 1983 cho thấy

HN6 có khả năng là chủng S Roseosporus

Chủng NA1 có khả năng sinh trưởng ở 40ºC, có khả năng phát triển trong môitrường có nồng độ muối lên tơi 7%, có khả năng sinh enzyme ngoại bào thủy phân tinhbột và CMC, có khả năng sử dụng các nguồn đường cacbon D – Glucose; Saccarose; I –Inositol; Mannitol; Raffinose; Lactose Kết quả so sánh cho thấy chủng NA1có khả năng

là chủng S Albofaciens.

PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU

1 1 Đặt vấn đề

Trong xu thế phát triển của nền nông nghiệp thế giới, Việt Nam trong những nămgần đây nền nông nghiệp cũng đạt được nhiều thành tựu to lớn Sản xuất gạo khôngnhững đáp ứng đủ nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu đến các nước lớn trến thế giớinhư Mỹ Ngoài cây lương thực, cây công nghiệp, các cây thực phẩm cũng phát triểnmạnh mẽ trong sản xuất Song trong sản nông nghiệp cũng gặp không ít những khó khănnhư thời tiết bất lợi, dịch hại do sâu bệnh, cỏ dại, chuột…, đã là giảm năng suất và phẩmchất nông sản Theo thống kê của FAO (1984) hàng năm bệnh hại cây trồng không nhữnglàm giảm năng suất, phẩm chất cây trồng mà còn làm tăng chi phí sản xuất Bời vậy đểbảo vệ sản xuất, chúng ta phải áp dụng hàng loạt các biện pháp như canh tác, cơ giới vậtlý…, đặc biệt biện pháp đang được dùng phổ biến trong sản xuất nông nghiệp là biệnpháp hóa học đã gây ra hàng loạt vấn đề ảnh hưởng đến môi trường như ô nhiễm nguồnnước, đất, dư lượng vượt quá ngưỡng cho phép Vì vậy việc tìm kiếm biện pháp phòngtrừ bệnh hại tối ưu là một trong những hướng đi đúng đắn và cần thiết cho một nền nôngnghiệp sạch và bền vững

Một số cây thực phẩm trồng trên cạn như cà chua, đậu tương, khoai tây… lànhững cây có giá trị dinh dưỡng cao, đem lại hiệu quả kinh tế Nhưng hàng năm cây thựcphẩm thường bị nhiều loại bệnh hại làm tổn thất khá nặng nề trong sản xuất do vậy việctìm ra các biện pháp phòng trừ hiệu quả là rất cần thiết

Một nhóm bệnh hại cây trồng nguy hiểm trong sản xuất là nhóm nấm có nguồn

gốc trong đất như: Fusarium, Phytophthora, Rhizoctonia, Phythium… Nhóm nấm này có

phổ ký chủ rộng, gậy hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: Đậu đỗ, cây họ cà, họbầu bí, ….Chúng gây ra nhiều triệu chứng khác nhau như: Lở cổ rễ, héo rũ gốc mốc

trắng, thối thân khi bệnh nặng Đặc biệt là nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng

làm chết cây rất nhanh

Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương FAO năm 1992 đãkhẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của trương trình IPM (quản lý dịch hại tổng

hợp) với chiến lược là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của cácquần thể vi sinh vật gây bệnh Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ứcchế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiền năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năngsinh chất kháng sinh cao, trong đó có nhiều chất kháng sinh chống nấm mạnh Xạ khuẩn,

đặc biệt là các loài Streptomyces, được xem là nguồn sản xuất chất kháng sinh nhiềunhất(Intra và cộng sự, 2011) Đây là đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn Cho tới nay,

có khoảng hơn 8000 chất kháng sinh được biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩnsinh ra (Dhanasekaran và cộng sự, 2012) Nhiều nhóm hợp chất hoạt động sinh học khácnhau như macrolide, benzoquinones, aminoglycosides, polyenes, nucleoside antibiotics

sử dụng trong nông nghiệp như các chất chuyển hóa được sản xuất từ Streptomyces (Qin

và cộng sự, 1994; Smith và cộng sự,1990; Hwang và cộng sự, 1994 ) Vì vậy việc tìm

kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật

(đặc biệt nấm Fusarium oxysporum) có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác

bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững

Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu thế giới hiện nay cũng nhưgóp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của nước ta Chúng tôi thực

hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.) đối kháng

1.3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

 Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ở các vùng trong nước như: Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Đà Nẵng

- Nấm Fusarium oxysporum được cung cấp bởi Trung tâm Bệnh cây Nhiệt

đới – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nôi.

 Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ

các mẫu đất khác nhau.

2 Tìm ra 1-2 chủng có khả năng đối kháng mạnh; nghiên cứu mô tả sơ bộ được đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng có hoạt tính chống nấm mạnh.

3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh và phát triển của các chủng xạ khuẩn trên.

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về xạ khuẩn

2.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãitrong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, bùn, phân chuồng, thậm chí cả trong cơchất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Trong đất xạ khuẩn chiếm khoảng

20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung nhiều ở lớp đất bề mặt (sâu xuốngkhoảng 40cm) Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độcanh tác và thảm thực vật Ngoài ra, sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào

pH môi trường, chúng có nhiều trong các đất trung tính và kiềm yếu hơn là trong đấtchua Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn thường trong khoảng 25-45oC,(Mitra và cộng sự, 2008; Proudyogiki, 2012; Dhanasekaran và cộng sự, 2012)

Theo Waksman thi trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.00 mầm xạkhuẩn, chiếm khoảng 9 – 45% tổng số vi sinh vật (Waksman, S.A 1961)

2.1.2 Vị trí phân loại của xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ,

35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi Streptomyces

và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm(Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo, 2006)

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí

và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm Ban đầu xạ khuẩn được coi là vi nấm vìchúng sinh trưởng giống với nấm Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở

cà bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hệ sợi cơ chất)(Ashutosh K, 2008) Đây là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm đa dạng nhiều loài vi khuẩn hiếu khí, gram dương, cấu tạodạng sợi, trong DNA giàu G+C với tỷ lệ G-C cao (>55%) (Istianto và cộng sự, 2012).Trước đây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà

vi sinh vật học, do nó có những đặc điểm vừa giống vi khuẩn vừa giống nấm Tuy nhiên,

đến nay, xạ khuẩn đã được chứng minh là vi khuẩn với những bằng chứng sau đây(Nguyễn Lân Dũng, 2006):

1 Một số xạ khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillusvà Corynebacterium.

2 Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắcchất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào

3 Khuẩn ty xạ khuẩn thường không có vách ngăn, đường kính khuẩn ty và hìnhthái bào tử giống với vi khuẩn

4 Xạ khuẩn là kí chủ của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn, trong khi đó,nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể

5 Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng khuẩn, nhưng lại thường không bịảnh hưởng bởi những chất kháng nấm như các polyen

6 Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều loàinấm, mà không có ở vi khuẩn Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn khôngchứa cellulose

7 Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng acid của môi trường,đặc điểm này không có ở nấm

8 Các đặc điểm về sợi và nang bào tử kín (sporangium) của chi Actinoplanes cho

thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp

2 1 3 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

2.1.3.1 Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không

có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơncủa nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1 µm đến 2- 3 µm, chiều dài cóthể đạt tới một vài cm (Nguyễn Lân Dũng, 2002; Lê Xuân Phương, 2001) Kích thướccủa hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn vàkhuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn dễ quan sát bằngmắt thường còn xạ khuẩn thì không

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơhay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu,xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Kích thước và hình dạng củakhuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môitrường, nhiệt độ, độ ẩm…

Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp,lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau.Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin,axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra bên ngoài môitrường

2.1.3.2 Hệ sợi

Trên môi trường cơ chất đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loạicắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất) với chức năng chủ yếu làdinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khísinh) với chức năng chủ yếu là sinh sản Hệ sợi của xạ khuẩn có thể mang túi bào tử có

chứa nhiều bào tử (Frankia) hoặc không chứa bào tử (Intrasporangium) ( Bergey’s

Manual of determinative bacteriology , 2000)

Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại chỉ có hệ sợi khí sinh, khi đó

hệ sợi khí sinh vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng (Nguyễn LânDũng, Phạm Thị Kim Châu, 1978)

Sự phân hóa của khuẩn ty khí sinh bắt đầu từ những mấu lồi xuất hiện trên bề mặtsợi khuẩn ty sau đó mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển thành sợi, cuối cùng tạothành hệ sợi dày đặc Đường kính mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm (R.E Buchanan,1998)

2.1.3.3 Bào tử

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinhgọi là cuống sinh bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Hình tháicuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn hình thành bào tử theo nhiều dạng khác nhau, có thể là bào tử đơn, cặpbào tử, chuỗi bào tử ngắn hay chuỗi dài bào tử (Bergey’s Manual of determinativebacteriology, 2000).

Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF- retus –flexibilis), dạng xoắn lò xo (S- spira), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản

có hình móc câu (RA- retinaculiaperti) Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dàicủa cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan,cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông (NguyễnLân Dũng và cộng sự, 1977)

Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độdày khoảng 300-400 Ao chia thành 3 lớp Các lớp này, bảo vệ bào tử khỏi những tác độngbất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH… Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử

và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọngdùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có nhữngthay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau (Nguyễn ThànhĐạt và Poltorac V.A., 1974)

2.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn

Cấu trúc hiển vi của xạ khuẩn tương tự các vi khuẩn Gram dương: thành tế bào,màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập Thành tế bào của xạkhuẩn có kết cấu dạng lưới, dày khoảng 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng củakhuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60 – 120 Å,khi già có thể đạt tới 150 – 200 Å, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50 Å, lớp trong dàykhoảng 50 Å Thành tế bào cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – axetylglucozamine liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucoside Khi xử lýbằng lyzozyme, các liên kết 1,4 - glucoside bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thànhprotoplast Cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este, chloroform vàcác dung môi hoà tan lipid khác Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếubằng lipit (thành hệ sợi khí sinh có nhiều lipit hơn so với hệ sợi cơ chất) khác với nấm .Trên thành tế bào xạ khuẩn còn có nhiều lỗ cho phép các hợp chất có khối lượng phân tử

lớn đi qua (Fang, 1995; Jongsik Chun, 1999; Miyadoh, 2001; Robert 1988) Căn cứ vàothành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính dựa theo thànhphần chủ yếu của thành tế bào (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1972):

Nhóm I: L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) acid và glycine Chi Streptomyces

thuộc nhóm này

Nhóm II: Meso - 2,6 - diaminopimelic acid (m - ADP) và glycine

Nhóm III: Meso - 2,6 – diaminopimelic acid

Nhóm IV: Meso - 2,6 – diaminopimelic acid, arabinose và galactose

Thành tế bào xạ khuẩn có thể cho phép các chất kháng sinh, axit amin, enzyme, vànhiều hợp chất đi qua một cách dễ dàng, đồng thời các chất dinh dưỡng từ môi trườngbên ngoài cũng được thẩm thấu một cách chọn lọc

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm Chúng có vai trò đặcbiệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn.Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezosome và các thể ẩn nhập (các hạtpolyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Sudan III và các hạt polysaccharidebắt màu với dung dịch Lugol) Do chất nhân chưa có màng bao bọc nên một trong nhữngđiểm đáng chú ý của xạ khuẩn là chúng không ổn định về mặt di truyền và thường xuyênxảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA Điều này tạo nên tính đa dạng về hình thái vàtính kháng thuốc Điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗchúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ

lệ này chỉ là 25 – 45% (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1977)

Trong genome của xạ khuẩn, bên cạnh các yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể, xạkhuẩn còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể có thể tự nhân lên mà đượcLederberg gọi là plasmid Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính như có thêm khảnăng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với cáckháng sinh, chuyển gene, sản xuất các hợp chất hoạt động sinh học và trong môi trườngtuyển chọn Xạ khuẩn có tính dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh

bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác, nguồn nitơ hữu cơ là protein, peptone, cao ngô, caonấm men Nguồn nitơ vô cơ là các muối nitrat, muối amoni… (Nguyễn Văn Cách, 2004).

2.1.5 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại

Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học… nênviệc định tên một chungr xạ khuẩn được tiến hành tường đối nhanh chóng và chính xácvới nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh… Songngười ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa,miễn dịch học và sinh học phân tử

2.1.5.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng

để phân loại xạ khuẩn Để định danh loại các chủng xạ khuẩn cần thường xuyên nuôi cấychúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhấtđịnh Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh va fghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấycủa xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bảo tử

Theo Pridham và cộng sự, cuống sinh bào tử chia làm 3 nhóm: RF cho nhữngcuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ vàngắn S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn

Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu

cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên như ta đã biết xạ khuẩn rất không bềnvững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA Trongcùng một loại có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thểgiống nhau về mặt hình thái Vì vậy để phân loại xạ khuẩn được chính xác, ngày nayngười ta phải dùng them các chỉ tiểu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa,miễn dịch học hay sinh học phân tử (Werner Braun, 1976)

1.2.5.2 Đặc điểm phân hóa phân loại (Chemotaxonomy)

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm trởlại đây Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và đinhlượng thành phần hóa học của tê bào vi sinh vật

Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptit vàđường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào

- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc củamạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của PG

- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi nocardia,Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter Đây là đặc điểm phân loại cơ bản cho cácchi đó

- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại axit béo bão hòa mạch thẳng vàkhông bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử cacbonthứ 10 Sự có mặt của axit 10 – metylloctade canoit (Axit tubereulostearinoic) là đặcđiểm để phân loại đến chi (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, 2006)

- Photpholipit có 5 typ photpholipit (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có

ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn

Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất Khimuốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thểkhông thể nào không xác định thành tế bào

1.2.5.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

Để phân loại xạ khuẩn đến loài , người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý,sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kíchthích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme Nhu cầu

về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môitrường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đốikháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sảnphẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

Hopwood (1975) khẳng đinh rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùngđặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về bề mặt phân loại Do tính không

ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặcđiểm sinh lý – sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng thay đổi (Hopwood, Merrick, 1997)

1.2.5.4 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici đặt tên

năm 1943 (Waksman, 1961) Đây là một chi có số lượng loài được mô ta lớn nhất Cácđại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩnkhoảng 1- 10µm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạcthường được phủ bới KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử Trên đầu sợi khí sinh

hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bảo tử có những hình dạngkhác nhau tùy loài: thẳng , lượn sóng, xoắn, có móc…

Bào tử hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp nhân đoạn và cắtkhúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng1,5 µm Màng bào tử có thể nhẵn, gai khối u, nấp nhăn… tùy thuộc vào loại xạ khuẩn vàmôi trường nuôi cấy

Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử biểu hiện cácđặc điểm rất rõ Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theonhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khácnhau Tại hội nghị “vi sinh vật thế giới lần X” (được tổ chức tại Mexico vào năm 1970)

ủy ban Quốc tế chọn khóa phân loại của E.B.Shirling & Gottlieb làm khóa phân loại chiStreptomyces và đặt tên quốc tế là “International Streptomyces Project” (ISP) và đã nêu

ra môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV này

Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram dương,hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 30˚C, pH tối ưu 6,5 –8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưu nhiệt và

ưu lạnh)

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế

vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật Cho đến nay để xác

định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các

điều kiện và khóa phân loại khác nhau

2.2 Tổng quan về nấm Fusarium oxysporum

2.2.1 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium oxysporum

Nấm Fusarium sp là một trong những loại nấm gậy thiệt hại về kinh tế quan trọng nhất Nấm Fusarium sp thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản hữu tính là Gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes) Fusarium gồm nhiều loài

khác nhau, có khả năng gây nhiều bệnh trên cây trồng khác nhau Có nhiều loài sinh sản

ra độc tố có độc tính cao, có ảnh hưởng đến động vật sống hoang dã, thú nuôi và con

người (Marasas và ctv, 1984) Tuy nhiên, có nhiều loài nấm Fusarium là nấm hoại sinh sống phổ biến trong đất (Burgess và ctv, 1994) Một số loài nấm Fusarium: Fusarium chlamydosporum, Fusarium compactum, F equiseti, F.oxysporum, F.pallidoroseum, F.proliferatum, F.sacchari var subglutinans, F.solani, F.verticillioides.

Nấm Fusarium oxysporum có dạng bào tử lớn trong suốt, có nhiều vách ngăn, bào

tử có hình trăng khuyết, một đầu thắt lại hình bàn chân Dạng bào tử nhỏ, đơn hoặc đa

bào hình cầu hoặc hình bầu dục Một số loài Fusarium oxysporum có bào tử nhỏ, bào tử

hậu và quả thể hoặc không có bào tử hậu C.Booth năm 1977 – 1979 đã chú ý vào bảnchất tế bào phân sinh mà tử đó sinh ra bào tử nhỏ, là trong những chỉ tiêu đầu tiên để

phân loại nấm trên cơ sở đó ông cho rằng nấm Fusarium oxysporum có số lượng 90 loài Gần đây Burgess và công sự (1993) đã đưa ra cơ sở phân loại nấm Fusarium oxysporum

gồm 7 chỉ tiểu như sau: Hình thành bảo tử lớn; hình thành bảo tử nhỏ; hình dạng và kiểubảo tử nhỏ; kích thước của bào tử nhỏ; sựu có mặt hay không có mặt của bào tử hậu trênmôi trường PGA; đường kính tản nấm trên môi trường PGA; hình thái tản nấm

Nấm Fusarium oxysporum ban đầu gồm hơn 100 loài được mô tả dựa trên kiểm

nghiệm về cấu trúc của ổ sinh bào tử lớn là thực vật Theo phân loại của WellenneperReikinh (1935), số loài sống còn 65 loài, 55 giống và 22 dạng Bằng phương pháp cấytruyền đơn bào tử dùng trong hệ thống phân loại của Snyder và Hanser đã bổ sung về sự

giống và khác nhau giữa các loài Fusarium oxysporum, Snyder và Hanser đã đề nghị

giảm số lượng xuống còn 9 loài

Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium oxysporum rất rõ rệt, sợi nấm phát triển

mạnh, màu sắc biển đổi từ màu trắng đến màu tím violet, tán nấm thường sinh sắc tố màuhồng đến màu tím đậm trên môi trường PDA Bào tử lớn hình thành trên môi trườngPDA có kích thước ngắn trung bình hoặc dài, phần lớn có 3 vách ngăn mỏng, một đầunhọn hoặc thon nhọn, một đầu hình bàn chân, bào tử nhỏ hình thành trên cành bào tửphân sinh đơn nhánh ngắn thường không có ngăn ngang, đôi khi có một ngăn Hình dạngbào tử thay đổi từ hình ovan, hình elip hoặc hình quả thận Hậu bào tử thường hình thànhhầu hết trên mẫu phân lập sau 3 - 6 tuần nuôi cấy trên bề mặt thạch của môi trường PGA(Burgess, Sazanne, Bullock, Gott, Backhouse, 1994)

2.2.2 Sự phân bố và phân loại

Nấm phân bố khắp nới trên thế giới, một vài loài phân bố khắp nơi trong khinhững loài khác có xu hướng xuất hiện chủ yếu ở vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới hay ônđới

Các yếu tố khách quan làm tăng sự phát triển của nấm Fusarium sp là: bón phân

đạm quá nhiều, các yếu tố về hệ VSV có trong đất, ẩm độ của đất, nhiệt độ tối ưu cho

nấm Fusarium sp phát triển là 27 – 30 ˚C, tối đa là 36 - 40˚C và tối thiểu là 7 – 8˚C,

nhưng nhiệt độ thích hợp cho sự xâm nhiễm là 35˚C (Ou, 1985)

Nấm Fusarium sp gây nhiều bệnh trên cây trồng: bệnh nghẽn mạch (héo), thối rễ, thối thân, thối hạt và thối trái Nấm Fusarium sp sống phổ biến trong đất lưu tồn dưới

dạng bào tử áo hoặc khuẩn ty sống trên xác bã thực vật dư thừa hay những chất hữu cơ

Nấm Fusarium sp tấn công chủ yếu vào bộ rễ (Agrios, 1997) Đặc biệt, bệnh gây hại

nặng nề trong điều kiện stress nước, dùng phân bón quá nhiều hay rễ cây bị tổn thương(Olsen và ctv, 2000)

2.2.3 Ký chủ của nấm Fusarium sp.

Nấm Fusarium oxysporum có phạm vi ký chủ rất rộng lớn và tồn tại nhiều dạng

khác nhau trong đất Mặt khác, thành phần và sự phân bố của nấm trong đất có liên quanchặt chẽ với sự xuất hiện và mức độ gây hại trên cây ở mỗi vùng sinh thái khác nhau

Nấm Fusarium sp gây hại ở nhiều loại cây họ đậu, họ cam quýt, khoai tây, cà

chua Nấm Fusarium sp gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây, nhưng chủyếu là thời kỳ cây con (Porter và ctv, 1984; Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

Fusarium sp là tác nhân gây bệnh thối rễ nguy hiểm nhất trên trên diện rộng ở đậu và cà

chua (Nelson và ctv, 1981) Loài này gồm nhiều dòng khác nhau và gây bệnh nghiêmtrọng: gây héo mạch dẫn (Beckman, 1987), gây thối rạp cây con (Nelson, 1981), gây thối

rễ (Jarvis và Shoemmaker, 1978) Loài này có hơn 100 dòng khác nhau và bệnh héo làmột vấn đề quan trọng

Nấm Fusarium oxysporum là tác nhân gây bệnh héo và thối rễ, thân và mầm cây.

Cây bị bệnh sẽ chết nhanh hơn và thiệt hại nhanh hơn khi cùng bị tuyến trùng

(Meloidogin incognita) xâm nhập vì tuyến trùng đã làm giảm khả năng chống bệnh của

cây gây ra bệnh thối rễ và lở cổ rễ (Binder và Hutchison, 1959) Ở vùng nhiệt đới loài

nấm Fusarium oxysporum còn gây bệnh hại trên nhiều ký chủ khác nhau như thuốc lá, cà

chua, khoai lang, chuối… Đây là những bệnh có tác hại kinh tế lớn trong sản xuất (R.H.Stover)

Theo Kavachich, sợi nấm và hậu bào tử chỉ xuất hiện trong bó mawch xylem màkhông hình thành ngoài bó mạch, sau khi xâm nhiễm gây bệnh nấm làm cho bó mạch bịchuyển sang màu nâu xám hoặc nâu đen, lá cây bị héo do độc tố nấm tiết ra làm tắc bómạch, dẫn đến mất chức năng quang hợp và cây sẽ bị chết (Bachy, 1981)

Nấm Fusarium oxysporum là loài nấm tồn tại chủ yếu trong đất, xâm nhiễm gây

bệnh vào bên trong bó mạch, chủ yếu thông qua bộ rễ làm nhiệm vụ hút nước và chấtdinh dưỡng nên nấm cũng theo con đường đó mà xâm nhập vào cây cho nên rất khó khăncho việc phòng trừ bằng thuốc hóa học

2.2.4 Biện pháp phòng trừ

Không giống như những loại ký sinh khác, ký sinh gây hại vùng rễ cây trồngthường rất khó phát hiện và phòng trị kịp thời, lý do là khi chúng ta phát hiện triệu chứngthể hiện trên cây (héo, vàng lá, ) thì ký sinh đã tấn công và hủy hoại một phần mô cây ký

chủ nằm phía dưới mặt đất, do đó việc phòng trị bệnh thường tốn kém nhưng khôngmang lại hiệu quả cao Vì vậy cần thiết kết hợp nhiều biện pháp phòng trị để mang lạihiệu quả kịp thời (Phạm Văn Kim và ctv, 2000).

Biện pháp canh tácĐất là nơi lưu tồn của nhiều mầm bệnh khác nhau Do đó, đất trở thành nguồn dự trữ, tíchlũy và lây truyền bệnh Khi cày bừa đất, chúng ta đã làm thay đổi điều kiện sống và pháttriển của mầm bệnh trong đất Khi cày bừa đất, chúng ta đã làm thay đổi lý tính, cấu trúc,

ẩm độ và nhiệt độ của đất từ đó làm thay đổi điều kiện sống và phát triển của mầm bệnhtrong đất Khi cày đất, chúng ta vùi mầm bệnh xuống sâu dưới đất làm cho chúng chếthoặc khó khăn trong hoạt động gây hại cho cây Việc cày ải phơi đất trong một thời giannhất định trong năm có ảnh hưởng khá quan trọng đối với bệnh cây (Phạm Văn Kim vàctv, 2000)

Vệ sinh đồng ruộng, chú ý diệt cỏ dại Trồng cây với mật độ cây thích hợp cho từnggiống và từng mùa vụ, nên trồng thưa vào đầu mùa mưa

Luân canhLuân canh giúp chúng ta cắt đứt nguồn lương thực của một số ký chủ chuyên tính, nhờ đólàm giảm bớt sự nhân mật số mầm bệnh Luân canh còn giúp những cây trồng lạ tiết ranhững chất ức chế mầm bệnh của cây trồng trước đó, ngoài ra các chất tiết từ rễ cũng cóthể giúp kích thích sự phát triển của các vi sinh vật đối kháng trong đất (Phạm Văn Kim

và ctv, 2000)

Xen canhViệc trồng cây xen canh dẫn đến giảm mật độ ký chủ trên đơn vị diện tích, giảm bớt sựutiếp xúc của các rễ cây lẫn nhau của cây này với các cây lân cận trên cùng một loại cây.Giảm bớt sự lây lan của mầm bệnh ở rễ và các mầm bệnh trong đất, thường được phân bốkhông đồng đều và thường dưới dạng lưu tồn, khi chúng chuyển sang dạng hoạt động sẽgây hại cho cây trồng do sự tiếp xúc với rễ của ký chủ, hoặc do các chất từ rễ ký chủ tiết

ra kích thích Do đó, khi xen canh sẽ làm giảm đáng kể tình trạng kích thích này, mầmbệnh chỉ ở dưới dạng lưu tồn chứ không gây hại (Phạm Văn Kim và ctv, 2000)

Sử dụng giống kháng

Nhiều công trình nghiên cứu về giống kháng đối với bệnh nhưng chưa có kết quả khảthi Ví dụ, công trình nghiên cứu về giống kháng đối với bệnh khô vằn ở nhiều nước trênthế giới Kết quả của các giống lúa đều nằm trong phạm vi từ nhiễm nặng tới tương đốichống chịu (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998).

Biện pháp hóa học

Có thể phòng trị vùng rễ với một số loại thuốc hóa học Tuy nhiên việc tồn dư lượng chấtđộc trong đất đòi hỏi việc sử lý đất rất tốn kém và lâu dài có ảnh hưởng đến sự cân bằngsinh thái

Biện pháp sinh họcTrong tự nhiên tồn tại nhiều sinh vật đối kháng với nấm Phòng trừ sinh học là một biệnpháp thay thế biện pháp hóa học trong phòng trừ bệnh cây khi sử dụng biện pháp hóa họckhông hiệu quả hay không kinh tế Tiềm năng sử dụng VSV vùng rễ để thay thế hoặc bổsung vào hóa chất diệt nấm đã được nhiều tác giả đề cập đến

PHẦN III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nguyên liệu và hóa chất

Các loại đường chuẩn: Glucose, saccarose, lactose, manitol, xylose…

Các loại muối: K2HPO4, KI, MgSO4 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4 7H2O, …

Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone…

Các loại hóa chất khác: Agar, tinh bột tan, casein…

Các dung môi: etanol, methanol…

3.1.2.3 Các công thức môi trường

Môi trường giữ giống nấm và thử khả năng đối kháng

+ Môi trường khoai tây (PDA – Potato Dextrose Agar) (g/l)

Khoai tây miếng 200g; đường 20g; NaCl 20g; Agar 20g; H2O 1 lít; pH – 7,4Môi trường thử hoạt tính enzyme

+ Môi trường Mineral salf agar: (NH4)2SO4 4g; NaCl 6g; K2HPO4 1g; MgSO40,1g; CaCl2 0,1g; cơ chất (CMC, tinh bột) 10g; Agar 20g; H2O 1 lít, pH – 7

Môi trường phân lập và giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn

+ Môi trường Gause – I (g/l): Tinh bột tan 20g; K2HPO4 0.5g; MgSO4.7H2O0,5g; NaCl 0,5g; KNO3 0.5g; FeSO4 0.01g; Agar 20g; nước 1 lít; pH 7 – 7,4

+ Môi trường Gause – II (g/l): Nước chiết thịt 30ml; Pepton 5g; NaCl 5g;Glucoza 10g; Agar 20g; H2O 1 lít

Các môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trường ISP1 đến ISP9):

Dung dịch muối vi lượng của ISP: FeSO4,7H2O 0,01g; MnCl2,4 H2O 0,1g; ZnSO4,7H2O 0,1g; nước cất vừa đủ 100ml; pH=7,0-7,2

+ Môi trường ISP – 1 (g/l): Tryptone 5g; cao nấm men 3g; Agar 20g; nước cất 1lít; pH=7,0-7,2

+ Môi trường ISP – 2 (g/l): Cao nấm men 4g; dịch chiết Malt 10g; glucoza 4g;Agar 20g; nước cất 1 lít; pH=7,3

+ Môi trường ISP – 3 (g/l): Bột yến mạch 20g; Agar 20g; dung dịch muối vi lượng1,0 ml; nước cất 1 lít; pH=7,0-7,4

+ Môi trường ISP – 4 (g/l): Tinh bột 10g; K2HPO4 1g; MgSO4,7H2O 1g; NaCl 1g;(NH4)2SO4 2g; CaCO3 2g; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; Agar 20g; nước cất 1 lít;pH=7,0-7,4

+ Môi trường ISP – 5 (g/l): L-asparagin 1g; glyxerin 10g; K2HPO4 1g; dung dịchmuối vi lượng 1,0 ml; Agar 20g; nước cất 1 lít; pH=7,0-7,4

+ Môi trường ISP – 6 (g/l): Peptone 10g; cao nấm men 1g; xitrat sắt 0,5g; Agar20g; nước cất 1 lít; pH=7,0-7,2

+ Môi trường ISP – 7 (g/l): Glycerin 15g; L-Tyrosin 0,5g; L- asparagin 1g;K2HPO4 0,5g; MgSO4, 7H2O 0,5g; NaCl 0,5g; FeSO4,7H2O 0,01g; dung dịch muối vilượng 1,0 ml; Agar 20g; nước cất 1 lít; pH=7,0-7,4

+ Môi trường ISP – 9 (g/l): (NH4)2SO4 2,64g; KH2PO4 2,38g; K2HPO4 3H2O5,65g; MgSO4 7H2O 1g; dung dịch B 1,0 ml; nguồn cacbon 10g; Agar 20g; nước cất 1lít; pH=6,8-7,0

Dung dịch muối B (%): CuSO4 5H2O 0,64g; FeSO4 7H2O 0,11g; MnCl2 4H2O0,79g; ZnSO4 7H2O; nước cất 100 ml

Các nguồn cacbon :D – Glucose; L – Arabinose; Saccarose; D – Xylose; I –Inositol; Mannitol; Rhamnose; Raffinose; Cellulose; Lactose.

3.2 Phương pháp ngiên cứu

3.2.1 Phương pháp phhân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

3.2.1.1 Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski

Cân 1g đất cho vào bình nón 50ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30phút Dùng pipet vô trùng hút 0,5ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5ml nước vôtrùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3,… 10-6 Từ mỗi nồng độ pha loãng ở các nồng

độ 10-3 đến 10-6, nhỏ 0.1ml sang đĩa peptri chứa môi trường Gause – I Dùng qua cấy vôtrùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 – 7 ngày Trên môi mẫu đất, khuẩnlạc của xạ khuẩn được cấy chuyển sang các đĩa peptri chứa môi trường Gause – I để làmsạch Từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trườngGause – I, tiếp tục nuôi trong 10 – 14 ngày sau đó cho vào tủ lạnh (Nguyễn Thành Đạt,2000)

Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng xạ khuẩn được chia thành 8nhóm màu: White (W) nhóm trắng Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y)nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím,

và nhóm không xác định (X) (Lê Gia Hy, 1994; Trerner, Buckus (1963))

3.2.1.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng

Đồng nuôi cấy: Nấm mốc và xạ khuẩn trên môi trường PDA Nấm mốc đượccấy ở trung tâm đĩa Petri, các chủng xạ khuẩn được cấy cách xa ở 4 góc bao quanh nấmmốc Sau 4-7 ngày nuôi cấy, nếu xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm mốc sẽ làm nấmmốc không có khả năng xâm lấn khu vực môi trường xung quanh xạ khuẩn Nếu xạkhuẩn không có khả năng kháng, nấm mốc sẽ xâm chiếm toàn bộ khu vực xung quanh xạkhuẩn hoặc mọc đè lên xạ khuẩn (Dhanasekaran và cộng sự, 2012)

Giếng thạch: Xạ khuẩn được nuôi lắc lỏng ( 200 vòng/phút, 30oC) trongmôi trường Gause (môi trường lỏng), sau 7 ngày thu dịch nuôi Dịch nuôi xạ khuẩn sauthu được chia làm 2 loại, 1 loại không xử lý ly tâm, 1 loại ly tâm trong 30 phút với tốc độ

8000 vòng/phút, 4oC

Nấm hoạt hóa, cấy thuần trên môi trường PDA Dùng que cấy lấy sợi nấmcho vào ống eppendorf chứa 500µl nước cất vô trùng, vortex để bào tử nấm phát tán đềutrong nước Hút 50-70µl dịch cấy trang trên môi trường đĩa thạch PDA Sau cấy nấm,dùng đầu côn vô trùng đục thành các giếng trên đĩa thạch (Dhanasekaran và cộng sự,2012; Intra và cộng sự, 2011; Aghighi và cộng sự, 2004;…).

Dịch xạ khuẩn (dịch không ly tâm, ly tâm) được bơm vào các giếng vớilượng 50-100µl Ủ các pêtri trên trong tủ nuôi 30oC trong 1-2 tuần và quan sát khả năngđối kháng của dịch nuôi xạ khuẩn với nấm

Nếu xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm sẽ tạo thành các vòng trong suốt-vòng

vô nấm quanh giếng bơm dịch nuôi xạ khuẩn

Khối thạch: Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường Gause trên đĩa peptri sau 7ngày dùng khoan nút trai khoan các thỏi thạch đặt vào đĩa peptri đã cấy nấm Sau đó đểvào tủ lạnh 4 – 5h sau đó để vào tủ ấm ở 28 – 30 ˚C, đọc kết quả sau vài ngày (NguyễnLân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978))

3.2.1.3 Bảo quản giống

Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn được cấy trên môi trường thạch nghiêng Gause –

I trong tủ nuôi Sau 10 – 14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt các ống giống được bảo quảntrong tủ lạnh ở 4 - 6˚C Sau 2 – 3 tháng cấy truyền lại một lần

Để bảo quản giống được lưu giữ trong ống cát, trong paraffin lỏng vô trùng, giữlạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được 6 tháng đến 2 năm

3.2.2 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn

3.2.2.1 Đặc điểm hình thái

Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh

Dựa theo tài liệu ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của hệ sợi khísinh dự vào bảng màu của Tresner và Backus Căn cứ vào màu sắc hệ sợi khí sinh của cácchủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự : White (W)nhóm trắng Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green(Gn) nhóm xanh…

Quan sát hệ sợi cơ chất Quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theothang màu chuẩn của Bondarsew (1953) Tresner và cộng sự (1961).

Quan sát cuống sinh bào tử

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường Gause – I có găm lamen nghiêng 45˚ trên bềmặt môi trường Sau 7 -9 ngày nuôi trong tủ nuôi lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinhbào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng haylượn sóng ký hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn

ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales) (Newman,Cragg, Snader (2003); Robert, Thomas (1988))

3.2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường: Gause-I, Gause-II, 1, 2, 3,

ISP-4, ISP-5, ISP-6, ISP-7 ở nhiệt độ phòng Sau 7, 1ISP-4, 21 ngày lấy ra qun sát màu sắcKTKS, KTCC và sắc tố tiết ra môi trường (Newman, Cragg, Snader (2003); Shirling,Gotilieb (1966))

Sự hình thành sắc tố melanin

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP – 6 trong tủ nuôi Bắt đầu quan sát màucủa môi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14 Nếu sinh melanin, màu môi trường sẽchuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm cho đến màu đen (Newman, Cragg, Snader,2003)

3.2.2.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

Khả năng sinh enzyme ngoại bàoPhương pháp 1: Chiết dịch enzyme

Xạ khuẩn sau khi được nuôi trên môi trường Gause – II dịch thể sẽ được lọc bỏsinh khối hoặc ly tâm lạnh ở 5000 vòng/ phút trong 15 phút, chiết dịch trong thu enzymethô Xác định hoặt tính enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch vớimột trong các nguồn cơ chất sau:

- Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza)

- Cazein (xác định hoạt tính proteaza)

- CMC (xác định hoạt tính cellulaza).

Chuẩn bị môi trường cơ chất – thạch gồm: 20g Agar + 1g cơ chất, pha môi trườngtrong 1 lít, đem hấp khử trùng môi trường sau đó đem đỗ môi trường vào các đĩa Petri.Dùng khoan nút chai đục lỗ trên lớp thạch Nhỏ 0,1 ml dung dịch emzyme thu được vàogiếng, 0,1 ml nước làm đối chứng, để ở tủ lạnh 4˚C khoảng 4 giờ, sau đó đặt vào tủ nuôi30˚C trong 24 giờ (Berdy, 1974)

Hoạt tính enzyme được xác định bằng giá trị D – d (mm) Sau khi nhuộm thuốcthử Lugol (cơ chất tinh bột, CMC), thuốc nhuộm amido black 0,1% (cơ chất casein).Vùng cơ chất bị phân giải không bắt màu ở xung quanh giếng thạch

Phương pháp 2: Cấy xạ khuẩn trên môi trường có bổ sung cơ chất

Xạ khuẩn được cấy chấm điểm trên môi trường đĩa thạch Mineral salf agar với 1%

cơ chất (tinh bột, CMC), sau 7 ngày nuôi, đĩa pêtri mọc khuẩn lạc được đem nhuộm bằngthuốc nhuộm lugol 1% và đo đường kính vòng phân giải (Gulve và Deshmukh, 2011).Nếu xạ khuẩn có hoạt tính cellulase và amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh khuẩn lạc

Khả năng chịu muốiCấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng ISP – 1 có bổ sung them NaCl vớicác nồng độ 0; 0,5; 3; 5; 7; 9;11 (%) Sau 7 – 10 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng

Khả năng sử dụng nguồn cacbon

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP – 9 có bổ sung 1 % các nguồn đường:Glucose, mannitol, lactose, sacscarose…

Cách làm: Cân 1 g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung vào 100ml môitrường ISP – 9 còn nóng Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa Petri và nuôi cấy xạ khuẩn ởnhiệt độ 28 – 30 ˚C, sau 7 – 10 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng và so sánh vớiđối chứng (Newman, Cragg, Snader (2003))

Trong đó môi trường có glucoza được coi là đối chứng dương (+) và môi trườngkhông có đường được coi là đối chứng âm (-)

 Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dương mộtít: có khả năng sử dụng nguồn đường đó, Ký hiệu là (+)

 Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, ký hiệu là (++)