Lai phân t : lai pha r n Phát hi n đ nh danh b ng k thu t SHPT PGS.TS Tr n Cát ông Nhu c u thay đ i Lai phân t : lai pha l ng Các PP truy n th ng có t th i Pasteur, Koch C y phân l p môi tr ng ch n l c, phân bi t Quan sát khóm, hi n vi, ph n ng sinh hóa u m R ti n, n gi n Ít đòi h i kinh nghi m, k thu t cao c ch p nh n tiêu chu n hóa Nh ích-đo n dò phát hi n ích-đo n dò đích-đo n dò phát hi n Lai thay th đo n (strand displacement) ánh b t thu n ngh ch (reversible target capture) Que nhúng Nhanh h n, nh ng c n có b c tách tr c phát hi n Hydroxyapatite g n v i ADN s i đôi Sepharose-Methidium B o v acrydinium ester chemiluminescent c m M t th i gian T n lao đ ng Không t đ ng hóa đ c Que nhúng Các ph ng pháp m i: Phát hi n Khu ch đ i tín hi u lai Lai acid nucleic Khu ch đ i acid nucleic Ph ng pháp Nhi t đ PCR Chu k DNA pol LCR Chu k DNA ligase RT, RNA pol RNaseH TMA S đo n m i ng nhi t Enzyme SDA ng nhi t DNA pol, RE QRA ng nhi t Q replicase CPR ng nhi t RNaseH Lai phân t o n dò ADN, ARN s i đ n ng n (20 nu) ánh d u Phóng x Enzyme Biotin Ch t nhu m Acid nucleic đích: L a ch n theo đ đ c hi u mong mu n Th ng vùng b o t n ARN vs ADN Khu ch đ i tín hi u lai Chi t tách ADN vi khu n G n ADN vào màng ADN đích Màng Lai v i đo n dò đánh d u b ng biotin B B o n dò đ c đánh d u biotin B B B B Streptavidin AP B AP AP Alkaline phosphatase biotinyl hóa B AP B B AP B AP B B AP B B AP AP B B C ch t Alkaline phosphatase Phát quang AP B AP B B AP B AP B B Ph n ng chu i polymerase (PCR) Phát hi n s n ph m PCR - Lai T ng h p ADN m i nh polymerase Nguy c : Ngo i nhi m Không đ c hi u M t nhi u công Bi n th - C i ti n Reverse (RT) Nested Multiplex Lo i b ngo i nhi m Phát hi n s n ph m - ELISA M i xuôi-Biotin Tách riêng khâu x lý phân tích S d ng UV S d ng UNG S d ng isopsoralen ADN khuôn m u B B D D S n ph m khu ch đ i đ c đánh d u hai đ u M i ng Khu ch đ i gen c-Digoxin B D ánh b t gi ng ph streptavidin D B G n kháng th antiDigoxin có đánh d u Gi ng ph Streptavidin AP D B Có màu Gi ng ph Streptavidin AP Thêm c ch t D B Gi ng ph Streptavidin Máy so màu Phát hi n s n ph m khu ch đ i Realtime PCR Phát hi n s n ph m ng ph n ng di n Cho phép phát hi n s n ph m ma không m ng Cho phép đ nh l ng Nhu m ADN Ch m, không t đ ng hóa ch i T ng nguy c nhi m chéo K thu t lai S n ph m khu ch đ i đ c lai v i đo n dò đ c hi u Phát hi n xác nh n s n ph m Phân h y đo n dò SYBR Green I Lai hóa đo n dò G n m i / đo n dò c tín hi u Pha kéo dài Pha kéo dài PCR dùng primer hu nh quang o n m i đ c hi u đ c đánh d u hu nh quang (th ng dùng fluorescein cho màu l c hay rhodamin cho màu đ ) M i th a sau ph n ng đ c lo i b b ng s c ký S hi n di n c a s n ph m PCR có hu nh quang s đ c phát hi n nh d u hi u d ng tính nh y r t cao, d d ng tính gi K t thúc chu k PCR c tín hi u c tín hi u ELISA Phát hi n s n ph m - Nhu m Nguyên lý TaqMan S n ph m đ c n di Nhu m b ng ethidim bromid c k t qu d i UV So sánh v i ch ng hay chu n C Phân t phát Phân t d p Bi n tính M Tín hi u b d p G n m i PCR đo n dò TaqMan Tín hi u đ c gi i phóng Kéo dài phân h y TaqMan Ph n Khu ch đ i nh Q replicase (QRA) ng chu i ligase (LCR) QRA: Q Replicase Amplification Midivariant-1 RNA (MDV-1) đ c chép r t hi u qu nh Q Replicase MDV-1 tái t h p có ch a trình t b sung v i DNA đích LCR: Ligase Chain Reaction S d ng c p m i b t b sung li n DNA đích S d ng ligase ch u nhi t n i m i thành s n ph m gap-LCR (PCR-LCR) k t h p PCR LCR LCR Gi m tín hi u n n cho QRA Bi n tính G nm i Bi n tính Bi n tính N i T4 ligase Khu ch đ i d a s phiên mã (TMA) TMA: Transcription-Mediated Amplification: 3SR, NASBA Khu ch đ i th i s i (SDA) SDA: Strand Displacement Amplification m i SDA ch a v trí nh n di n c a HincII (downstream probe) m i kéo dài (extend probe) 2’-deoxyadenosine 5’-O-(1thiophosphate) dùng thay cho dATP RNase III có v trí nh n di n RNA s i đôi MDV-1 tái t h p lai đ c v i DNA đích làm m t v trí nh n di n c a RNase III không b phân h y MDV-1 tái t h p không lai đ c v i DNA đích s b phân h y b i RNase III Ph n ng phân h y m i (CPR) CPR: Cycling Probe Reaction So sánh ph Ph ng pháp Hãng LCR Abbott PCR ng pháp Th i gian (gi ) S m u t i đa Thao tác T ng LCx 40 1-1,5 5,5 - 6,25 Roche Amplicor 92 - 3,75 6,75 - SDA B&D ProbeTec 46 - 1,25 3,1 - 3,8 TMA Gen-Probe Aptima 98 2,5 5,2 Kit ... u qu nh Q Replicase MDV-1 tái t h p có ch a trình t b sung v i DNA đích LCR: Ligase Chain Reaction S d ng c p m i b t b sung li n DNA đích S d ng ligase ch u nhi t n i m i thành s n ph m gap-LCR... n di n RNA s i đôi MDV-1 tái t h p lai đ c v i DNA đích làm m t v trí nh n di n c a RNase III không b phân h y MDV-1 tái t h p không lai đ c v i DNA đích s b phân h y b i RNase III Ph n ng phân