TẠO DÒNG PHÂN tử và PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG của ENZYME BERGAPTOL o METHYLTRANSFERASE từ cây BẠCH CHỈ (ANGELICA DAHURICA) và ỨNG DỤNG TRONG sản XUẤT một CÁCH HIỆU QUẢ CHẤT BERGAPTEN TRONG e COLI (shu chin LO, pei en chung và co sh

TẠO DÒNG PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG CỦA ENZYME BERGAPTOL-O-METHYLTRANSFERASE TỪ CÂY BẠCH CHỈ (ANGELICA DAHURICA) VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT MỘT CÁCH HIỆU QUẢ CHẤT BERGAPTEN TRONG E.COLI (Shu-chin LO, pei-en Chung Co-shine Wang) Shu-Chin LO1,2,Pei-En CHUNG2, vàCo-Shine WANG1,* Học việnCông nghệ sinh học, Đạihọcquốc gia ChungHsing, Taichung40.227, Đài Loan SởPhòngHóa họcNông nghiệp, Việnnghiên cứu nông nghiệpĐàiLoan, Taichung41.362, Đài Loan TÓM TẮT.Bạch từ lâu sử dụng làm kem dưỡng trắng da, có chứa hợp chất 8-hydroxybergapten, sản phẩm hydroxylate từ chất bergapten nhờ enzyme 5-omethyltransferase (BMT) phân cắt chất bergaptol bạch DNA bổ sung mã hoá BMT dòng hoá từ rễ cặp mồi thoái biến vùng chứa mã bảo tồn cao O-methyltransferase từ khác phân tích RT-PCR mảnh đơn DNA phù hợp cho trình tự AdBMT thu đoạn liên tục 5’ 3’ nhanh chóng khuếch đại tạo cDNA thông qua phương pháp PCR sử dụng để thu đựơc đoạn cDNA đầy đủ cDNA AdBMT chứa ORF dài 1080bp mã hóa cho polypêptide 359aa khối lượng 39kDa, pI 5.9 phương pháp gióng trình tự tiết lộ tương đồng AdBMT so với OMTs loài khác Đoạn AdBMT chứa vùng bảo tồn I-V tương tự OMTs loài khác Liên kết His-AdBMT biểu hịên E.coli làm cách tủa ammonium sulfate Đoạn tái tổ hợp AdBMT hầu hết hoạt động môi trường có chứa đệm kali phosphate pH 7.5 iử 35độC enzyme không cần ion cofactor hoá trị để hoạt động, mặt khác, nồng độ ion Cu2+, Ni2+, Co2+ dù thấp (0.1mM) đủ gây ức chế hoàn toàn enzyme Cách sản xuất bergapten đơn giản hiệu biểu vượt mức AdBMT nuôi cấy vi khuẩn E.coli lượng bergapten thu cao gấp 13 lần lượng hợp chất thu từ sản phẩm làm mảnh vỡ ammoni sulfate Bằng cách bổ sung bergaptol môi trường nuôi cấy E.coli hứa hẹn phương pháp đầy tiềm việc sử dụng bioreactor để sản xiất bergapten (tìm hình bạch chỉ) Từ khóa:Bạch chỉ; Bergapten; Bergaptol5-O-methyltransferase, nhân cDNA, hoạt động củaenzyme Viết tắt:BMT,bergaptol5-O-methyltransferase, cDNA, DNA bổ sung; EDTA,axitethylenedi-aminetetraacetic; IPTG, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside; NTA, axitnitrilotriacetic; OMT,O-methyltransferases; PAGE,điện dipolyacrylamide; RT-PCR, phản ứng chuỗipolymerasesao chép ngược, RACE, khuếch đạinhanh chóngcủa điểm kết thúccDNA; SAM,S-adenosyl-L-methionine, SDS-PAGE, sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, UPLC, siêusắc ký lỏnghiệunăng GIỚI THIỆU Sự Methyl hoá hợp chất tự nhiên S-adenosyl-L-methionine (SAM) phụ thuộc O-methyltransferases (OMTs) cách chuyển đổi phổ biến phản ứng tổng hợp tự nhiên Trong thực vật, O-methyl hoá cần thiết cho tổng hợp furanocoumarin mạch thẳng furanocoumarin tổng hợp từ đường phenylpropanoid xem phytoalexin phòng thủ chống lại vi sinh vật công ((Tietjen et al, 1983;Kueteet al, 2007; Alexandervà cộng sự, 2008) hợp chất mạch thẳng phong phú furanocoumarin kể đến psolaren, bergapten, xanthotoxin isopimpinellin, tất chất chất có hoạt tính sinh học đường tổng hợp hợp chất furanocoumarin phát hoạ bởi… nghiên cứu trình tự mã hoá cho trình hydroxyl hoá O-methyl hoá psoralen để tạo thành chất isopimpinellin chưa phát bergaptol BMT chuyển thành bergapten, tương tự với biến đổi OMTs cách xử lý với elicitor tế bào Ammi majus, gần với tb nuôi cấy Glehnia littoralis Vì BMT biểu chủ yếu tế bào nuôi cấy G.littoralis, người ta cho tế bào nuôi cấy sử dụng bioreactor đầy tiềm để sản xuất bergapten cách cung cấp psolaren Bergapten đựơc chuyển thành 8-hydroxybergapten ức chế tyrosinase nấm, sức chế mạnh kojic acid arbutin – hai chất ức chế tyrosinase sử dụng rộng rãi mỹ phẩm trắng da (Piao etal, 2004) OMT phân loại thành nhóm lớn (…) - Nhóm I: gồm loại OMT có trọng lượng phân tử thấp (13-27kDa), hoạt động phụ thuộc Mg2+ Nhóm II: gồm loại OMT có trọng lượng cao (38-43 kDa) họat động không cần Mg2+ Hầu hết OMT thuộc nhóm bao gồm acid caffeic, flavonoid, coumarin alkaloid OMT (Kutchan, 1999; Donget al, 2003), enzyme BMT thuộc OMT nhóm II Một số gene OMT thực vật mã hoá cho toàn thể cấu trúc OMT chứa vùng bảo tồn, vùng (I IV) cho có liên quan đến liên kết với ion kim loại SAM tương ứng (tìm hình - Rễ khô Angelica dahurica (Umbeliferae) tên bạch vị thúôc quan trọng trung y, nhiều coumarin chiết từ rễ bạch thể tính kháng vi sinh vật (Kwon etal, 1997) Chất 8-hydroxybergapten có chất furanocoumarin có tiềm ức chế tyrosinase từ nấm (Piao etal, 2004) rễ dử dụng để chữa chứng bệnh rối loạn sắc tố thể đựơc ứng dụng nhiều vào ngành công nghiệp mỹ phẩm chất 8hydroxybergapten có tác dụng làm trắng da nên nghiên cứu tập trung định dạng enz BMT từ bạch để sản suất chất tiền phản ứng bergapten để tạo chất 8hdxbgt làm trắng da Việc nghiên cứu E.coli làm bioreactor để sản xuất bergapten cách nuôi cấy tuyệt vời nghiên cứu nhiều Vật liệu phương pháp Nguyên liệu thực vật Vật liệu: bạch Angelica dahurica (Fish.) BENTH Et HOOK đuợc trồng ruộng rễ thu đựơc bảo quản lạnh nitơ lỏng tất phần vật liệu sử dụng phải cất trữ -80oC Hình Con đường sinh tổng hợpcủabergaptenvà8-hydroxybergapten Nhân cDNA Tổng số RNA phân lập từrễ 3tháng tuổicủaA.Dahurica Những đoạncDNAđược tạo bởiphản ứngphiên mã ngược chuỗipolymerase (RT-PCR) khuếch đạibằngcáchsửdụngmột cặpmồithoái hóađược thiết kế từhai trình tựbảo tồn caocủaOMTsthực vật Mồi5'-(5'-gtg/tgatgttggc/tggtggg/a/cactgga/t-3') nằm trongvùng bảo vệtrongkhimồi3' – primer (5'-ggg/atgcatcg/t/cc/tca/gac/tg/a/cacgtga/ggg-3') trongvùng bảo vệIInhư ratrong hình 2.Những đoạncDNAtạo rađượcnhân vô tínhởpGEM-T Easyvector (Promega, Madison, WI, Mỹ) vàđược xếp theo trình tựđể xác nhậndanh tính chúng Sự khuếch đại nhanh chóng mạch song song5'và 3'- điểm kết thúc cDNA (RACE) thôngquaphản ứng chuỗi polymerase(PCR)đã thực hiệntheohướng dẫn sử dụngbộkhuếch đạiRACESMARTTMcDNA(các phòng thí nghiệmCLONTECH,Inc, Mountain View,CA, USA) Trình tự DNAhoàn chỉnh đượcxác định từcả hai sợichènnhânbảnvớimộtmáy phân tíchABI3730XLDNA(FosterCity, CA, USA)bởi Sứ mệnhCông ty TNHHMission Biotech(Đài Bắc, Đài Loan) Sự liên kếtchuỗiđượcđạt cách sử dụngVectorNTISuite 8chương trình (InforMax, Inc, Bethesda, MD, USA) vàtìm kiếmtương đồngđã thực hiệnvới chương trìnhBLAST(Altschul etal, 1997) Biểu vượt mức AdBMT động chuyển hoá từ bergaptol thành bergapten E.coli Đoạn cDNAAdBMTmã hóakích thước đầy đủbao gồm mẫuvàmột cặpmồi đặc hiệu chogenAdBMT-over-f (5 GTCGACCATATGGCAGAAATGAAAACTAG-3)có chứamộtvị tríSalI, vàAdBMT-over-r (5-GCGGCCGCCTTCGAAAATTCCATAATC-3’) cóchứamột vị tríNotIđãđượcsử dụng đểkhuyếch đạiPCR MảnhAdBMT1,077bpdo đóđã đượctạo dòngbằng trình tự cắt giới hạnSalI/NotIvào vectorbiểu hiệnpET32a(Novagen, Madison, WI, USA) Saukhixử lývớiNdeI, mảnh6,5kb tinh lọcvàtự nối lạiđể tạo plasmid biểu pET32a-AdBMT chứa gene AdBMTvới His-tag tạiđầu C-terminus PET32a-AdBMTa chuyểnvàoE coliBL21 Saukhibiến nạp,các tế bàovikhuẩnđược nuôi cấytrong môi trườngLB(1% Bactotryptone, 0,5%chiết xuất từnấm menBacto, 170mMNaCl, pH 7.0) có chứaampicillin (50 µg/ml)ở 37°Ccho đến khiOD600đạt từ0,6-0,8.Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) sau đượcthêm vào để chonồng độ cuối cùng1mMvà tế bàosau đượcủ ởđiều kiện nhiệt độkhácnhaucho thêm 16 h.các tế bàothu đượcbằng cách ly tâmvà dùng để tách chiết proteinvà tinh chếenzymehoặchuyền phù trong25mlmôi trườngLBcó chứaampicillin(50mg/ml) và100µMbergaptolvàủthêm24 giờở 25°C.Sau khily tâm, phần nổiđượcsửdụngđể trích xuấtbergaptencho đo bằngphương pháp sắc kýlỏngsiêuhiệu suất (UPLC).Bergaptenthu đượcchuẩn hóatrên sởcủacácphần nhaucủa tế bàovi khuẩn E coli(trọng lượng ướt) Chỉ cóE colimang gene biểu vựơt mức AdBMT phát triểnở nhiệt độcảm ứngtối ưuđã thực hiệnđể phân tíchđộng học Thời gianủbệnhkéodàitừ24đến48h (tìm hình vector ET32a,) Hình 2.Nucleotide chuỗi amino acid dự đoáncủacDNA AdBMT xác định từ A.dahurica.(A)Số lượng chuỗinucleotidevàchuỗi axit aminđượcchỉ raở bên phải.Cácchữ in đậm trongchuỗinucleotidechothấycác codonmở đầu kết thúc Haimồithoái hóađược địnhbằng mũi tên Các tín hiệupolyadenylationđượcgiả địnhbởi gạch chân đôi.Điểm kết thúcdịchmã đánh dấu bằngdấu hoa thị(B)RT-PCRđược thực trêntổng số RNAđượcphânlậptừrễA.dahurica Trình tựcủaAdBMTđượckhuếch đạibằng cách sử dụng mộtcặpmồi thoái hóa định sắc ký lỏngsiêu giới hạn (tìm hình hệ thống này) Sau ly tâm, mldịch thu nhậnvàtrộnlẫnvới etyl axetat(1 ml)vàly tâm ở16.000vòng phút Sau khidư lượngđượchòa tan trongmethanol(0,3 ml), đem dịch bay chân không thu lấy chất rắn Bergaptolvàbergaptensau đượcđotrongcáckhoảng thời gianchỉ địnhbởiUPLC Sản phẩm phản ứng đượcphântíchbằnghệ thốngWatersACQUITYTMUPLC(WatersCrop,Milford,MA,USA)chứa mộtcực góp tự độnglàm mát, cột chứa thiết bị làm nóngchophépkiểm soát nhiệt độcủa cộtphântíchvàmột đầu dò mẫuphotodiode Mỗi lần tiêm5μlsản phẩmđược hoà tan methanol nạpvàomột cộtBEH(2,1mm ×18 cm, 1,7 μm)C18vàgiải hấp vớimột hỗn hợpnước/axetonitril(70/30) máy bơmUPLCở tốc độ dòng chảylà 0,25ml/ phút.Cộtđược trì trongmột lò ở40ºC.Phát hiệnởbước sóng 254 nm Sản phẩm phản ứngđược xác địnhvàđếm số lượngthành Bergaptoltinh khiết (Xác thực) (ChromaDex, Inc, Irvine, CA,USA)vàbergapten(Sigma-Aldrich Chemical Co, St Louis,MO,USA)đãđượcsử dụng lànhững hóa chất tiêu chuẩn Dữ liệu đượcthuthậpvà xử lý bởiphần mềmsắc kýMassLynx(Waters trồng, Milford,MA,USA) SDS-PAGE phương pháp miễn dịchthấm Đối vớiphân đoạnprotein, tếbàođượcthuthậptừ16°C đượccố địnhtrong200mMđệmkali photphat(pH7,5)cóchứa10mMaxitethylenediaminetetraacetic(EDTA), phá màng sóng âmvàly tâm16.000vòng 5phút ở4ºC.Tổngproteintrongnổiđã trộn lẫnvới đệmmẫu2x[2% (w/v)sodiumdodecylsulfate (PAGE) 4% (v/v) 2mercaptoethanol] vàphân đoạn[12%(w/v)SDS-polyacrylamide gel(PAGE) Sau điện di, gel đượcnhuộm màu với0,25%xanh CoomassieR-250, 10%acetic acid, và5%ethanoltrong giờ, khử màuvới axit axetic10% và20%ethanolhoặcelectroblottedlênnitrocellulose(0,45 μm,SartoriusStedim, Biotech, Goettingen, Germany) Màng tế bàobị chặnở 37°Ctrong giờtrongmột dung dịch chứa10 mMTris-HCl, pH7,5, 0,05%Tween-20, 150 mM NaClvà5%sữa bộtkhông có chất béo.Màng đượcủ vớikháng thể khángHis-tag với pha loãng1:1,000trong hở 4°Csau đómàngđượcrửa sạch, ủ với kháng thểthứ cấpphosphataseliên hợpkiềmtrong1 h ở4°C.Các điểm củaphức hợpkháng nguyên-kháng thể màu lên phân tách bởialkaline phosphatasevới chấtphosphate5-bromo4-chloro-3 indolylvà nitrobluetetrazoliumtrong đệmcarbonate(100mMNaHCO3, mMMgCl 2, pH9,8) Nồng độ proteinđượcxácđịnhtheoBradford(1976)vớitiêu chuẩn albuminhuyết bò (chả biết làm chi??) Tinh chế enzyme vàthử hoạt tính Để tinh enzyme, tế bào thu thập từ 16°C cố định 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) có chứa 10 mM axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA), phá màng sóng âm ly tâm 16.000 vòng trong5 phút 4°C cột Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) không thích hợp cho tinh chế BMT (Hehmann et al, 2004) nên tổng số protein dịch phân đoạn tủa ammonium sulfate mà từ phầnprotein thu thập độ bão hòa 40-50% Protein phân đoạn hòa tan 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) khử muối qua cột PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) Protein phân đoạn ammonium sulfate tiếp tục cô đặc centricon-30 (Millipore, Billerica, MA, USA) nồng độ xác định Mỗi phần nhỏ phải chịu thử nghiệm tính enzyme Khảo nghiệm hoạt tính củaBMT (EC 2.1.1.69) báo cáo trước (Hehmann et al, 2004) với số sửa đổi Một cách ngắn gọn, hoạt tính củaBMT ống nghiệm đo thường xuyên 35oC thể tích 200 μl đệm có chứa mM 200 phosphate kali, pH 7,5, 1,25 mM bergaptol chất (Indofine Chemical Co, Somerville, NJ, USA), 9,6 μg protein tinh khiết tương ứng với hoạt động 2,0 nkat BMT (hoạt động cụ thể 0,21 kat/kg) Phản ứng bắt đầu với việc bổ sung SAM (5 mM) chấm dứt sau 90 phút ủ cách thêm 30 μl HCl 1N Hỗn hợp phản ứng chiết xuất với etyl axetat (0,5 ml) ly tâm 16.000 vòng phút Lớp hữu thu thập bốc chân không sau đó, dư lượng hòa tan methanol (0,3 ml) Sản phẩm phản ứng (bergapten) sau xác định đếm số lượng sử dụng UPLC Các chiết xuất tế bào với vector trống sử dụng điều khiển thụ động pH nhiệt độ tối ưu yêu cầu kim loại AdBMT Độ pH tối ưu cho hoạt động enzyme xác định ủ 35°C 90 phút hệ đệm khác (200 mM), 4,0 10,0 (acetate, pH 4,0-5,5; phosphate, pH 5,5-9,0; Tris-HCl, pH 7,0 -8,5; cacbonat, pH 8,5-10,0) Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzyme xác định từ 16°C 42°Ctrong 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) 90 phút Ảnh hưởng ion kim loại khác nồng độ 0,1 1,5 mMlên hoạt động enzyme xác định 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) 35°C 90 phút Việc bổ sung 5.4 mM EDTA đệm sử dụng điều khiển Ba thí nghiệm độc lập thực để phân tích trường hợp Phản ứng khảo nghiệm điều kiện sản phẩm hình thành tuyến tính cho thời gian (15-120 phút) nồng độ protein tinh khiết (1,8-16 μg) Rõ ràng giá trị Km Vmax xác định lô Lineweaver-Burk cách sử dụng khoảng 9,6 μg chiết xuất protein khử muối điều chỉnh trình pha loãng nối tiếp chất bergaptol (0,625 ~ mM) SAM (1,25 mM ~ 7,5 mM) phản ứng enzyme mô tả Các kết Tạo dòng đặc tính củacDNABMTtừ Bạch Để có cDNABMTtừ Bạch chỉ, RNA tổng sốđượcphânlậptừrễđược sử dụnglàm khuôn Một cặpmồithoái hóaoligonucleotideđược thiết kếtừ vùngbảo tồn caocủa chuỗiBMTthực vật khácnhư đãtrình bàytrongHình2A Sửdụngkhuyếch đại RT-PCR, dảiduy củađoạn DNA107bptương ứng vớitrình tựAdBMTthu được(Hình2B) Bởi vìkích thướccDNAchỉ làmột phần,phương pháp5’ - và3’-RACE PCRđược sử dụngđể có đượctoàn chiều dài1.259bpcDNAAdBMT(accession no JN585954) ngoại trừđuôipoly(A) cDNAAdBMTchứamộtkhung đọcmở 1080bpmã hóa mộtpolypeptide359axit amin(Hình2A) vớimột khối lượng phân tử đượctính toánlà 39kDavàpIlà 5,9.Đánh giáhồ sơthủy liệu phápcủanó(Kyte vàDoolittle, 1982) chothấyrằngpolypeptideAdBMTkhông cómột vùngkỵ nướcmạnhmẽgầnđầu N-terminus, rasự vắng mặt củamột tín hiệupeptide(dữ liệukhông hiển thị) Trongvùng 3’ không dịch, mộtbiến thể AATAACvà2 môtiftương đồng giả địnhAATAAAcủapolyadenylationđược đặttại vùng thượng nguồn130, 113, và102bptừvị trí củapolyadenylation Chuỗi axit amin dự đoán củaAdBMTđãđượcsử dụng đểtìmkiếmcơ sở liệuprotein Chuỗiliên kếttiếtlộrằngpolypeptideAdBMT,trong tất cảnăm vùngđược bảo tồnIV(Ibrahim etal, 1998) tìm thấy, chiasẻ28%-91% tương đồngvớiOMTsthựcvật xác địnhít đối vớiOMTcủa người(13%) (Hình 3) AdBMTthể hiệnsự tương đồng vềtrìnhtựcao vớiGlBMT(91%giống nhau)vàAmBMT(84%giống nhau) Vùng I vàIVđãđược chứng minhbởinhiễu xạ tia Xđểđược tham gia vàoSAMvàliên kết kim loạitương ứng (Vidgren etal, 1994) Ngoàiký tựphổbiếncủa vùngbảo tồncao(vùng IV)đặctrưngchoSAM-phụthuộcvàoOMTs, motifA Bđược xem xét đểchi phối cácđặc trưngchất (Joshi vàChiangnăm 1998; Schröder etal, 2002) Hình 3.Liênkết amino acid chuỗiproteinAdBMTvớicácBMTskhácvà proteinliên quan đếnOMT Một dấu gạch ngangtrong chuỗichỉramột khoảng trốngđượcđưa rađể trìsự liên kếttốt Năm vùngbảo tồn cao(vùng I-V)được kí hiệu bằngmột khung Các motif A Bđược ký hiệu bằngmột gạch Hai BMTslàGlBMT(AB363638), bergaptolO-methyltransferase Glehnialittoralis, AmBMT(AY443006), bergaptolO-methyltransferase MajusAmmi.Các protein liên quan đếnOMTbaogồmAtOMT(NM_124796), quercetin3-O-methyltransferase Arabidopsis thaliana, ObOMT(AB530137), chavicolO-methyltransferase củaOcimumbasilicumvàHsOMT(Z26491), mộtcatecholO-methyltransferase Homo sapiens Biểu vượt mức AdBMTtrong E Colitái tổ hợp Trình tự khung đọc mởcủaAdBMTđượcbiến nạpvào mộtvector biểu hiện,pET32a,và biểu vượt mứctrong E coli Để xác địnhcác điều kiện chosự biểu hiệnAdBMT chức cao, nhân bảnthông quabiến nạpđã tạo ratrong 16 giờở nhiệt độkhácnhautrongsự diệncủa1mMIPTG Các tế bàoE coliđã thu hoạchbằng cách ly tâmvàcố địnhtrong môi trườngLBủ24 giờvới100μMbergaptol, hình thànhcủa sản phẩm(bergapten) đượcđịnh lượng bằngUPLCnhưlàmột thử nghiệmchuyển đổi sinh họccho hoạt độngAdBMTtrong tế bào Biểu mức AdBMTtrong tế bàocó thể chuyển đổitừ bergaptolthànhbergapten, mà đượcxácđịnhvàquantitatedbởiUPLC Sự sản xuấtbergaptentăng đáng kểkhinhiệt độcảm ứnggiảm(Hình 4) Số lượngtốiđacủabergaptenđượctạo rakhiủở 16°C, cho thấy thiết lậpphù hợp nhấtchohoạt độngAdBMTcao nhấttrongsốcác nhiệt độđã thửnghiệm Vì vậy, 16ºCđã lựa chọnđể điều tra thêm Kiểmsoátvới mộtvectorrỗngđã tiến hànhmột cáchsongsongtạimỗi nhiệt độủbệnh; bergaptenkhôngđược phát trongbấtkỳcác thí nghiệmkiểm soát(Hình 4) Hình 4.Ước tínhcủaAdBMTchứcnăngbiểu mứcởE coli 50mlnuôi cấy tế bàobiểu hiệnAdBMTvà vecto rỗngđược tạo ratrongsự diện của1mMIPTGở nhiệt độchỉ địnhtrong 16 giờ.Các tế bào từmỗisự chuẩn bịđượcthuhoạchbằng cách ly tâm, cô đặctrong25 mlLBvà ủở 25 ° Ctrong 24 giờvới việc bổ sungcủabergaptolđể đạt mộtnồng độ cuối cùngcủa 100μΜ.Các sản phẩm (bergapten) môi trường phản ứngđượcướctínhbởiUPLC Bergaptenđược chuẩn hóatrêncơ sởmột số lượng E colitế bào.Ba thí nghiệmđộclập tiến hành lầnđã thực hiệncho phân tích Các protein từmỗisự chuẩn bịđượcngăn cách bởiSDS-PAGE (hình5A) Mộtprotein39kDa quan sát thấytrong tế bàochứa pET32a-BMT (các tuyếnA2), ngược lại không đượcpháthiệntrong tế bàochứa pET32atrống(tuyếnA1), cho thấy rằngAdBMTtái tổ hợp(với His-tag) biểu thành côngởE coli.ProteinAdBMTđượcpháthiệnmiễn dịchbằngcáchsửdụngkháng thể kháng His-tag, rabởi mũi tên(Hình 5B, tuyến2) Các kích thướccủa proteinđược phát hiệntất đềuđồng thuận tuyệt vờivớikích thước dự kiến 39kDađược dự đoántừ trình tựAdBMT Băng17,5kDađược sản xuấtbởi vectorpET32ađã sử dụngnhư điều khiển(Hình 5, tuyến1) Hình Sự biểu mức AdBMTtrong E coli Các tế bào chứa khoảng trốngpET32a(1) hoặcpET32a-BMT (2)plasmidđược biểu hiệntrongsự diện của1mMIPTGtrong16 giờở 16°C Protein tổng số chiết xuấttừ khâu chuẩn bị Một khối lượng bằngnhaucủaproteinđược tách rabởiSDS-PAGE vàhoặcnhuộm với xanh Coomassie(A) hoặcelectroblottedlênnitrocellulosevàphát hiệnmiễn dịchbằngcáchsửdụngkháng thểchốngHis-tag(B) Mcho thấyproteinmarker(70, 53,41,30,22,và 14kDa) Cácmũi tên chỉAdBMTbiểu mức Đặc tính AdBMT Bởi Hehmannetal.(2004)báo cáo rằngcác hoạt độngBMTcủa A Majustrong chất chiết xuất từvikhuẩnlàrấtkhông ổn địnhvà không thểkíchhoạttínhnăngtinh chếrộngrãi, chiết xuấtAdBMTphânlậptừ tế bàovi khuẩn E colicũng vậy, phân đoạnammonium sulfate(40% -50 %bão hòa)vàsau đókhử muốivàcô đặcchocác đặc tínhsinh hóa Hình 6.Sản xuất bergapten tuyếntính cho hainồngđộchỉ định proteintinh khiếtvàkhoảng thời giancủa phản ứng Bergapten ước tínhtrong thể tích200μlở 35°C(A)trong 90 phútvớiviệc bổ sung cáclượngkhác củaproteintinh khiếthoặc(B) chocác khoảng thời giankhácnhauchỉ địnhvới9.6μgproteintinh khiết(hoạt động cụ thể0,21kat/kg) phân lập từ tế bàovi khuẩn E coli biểu mứcAdBMT Bergapten chuẩn hóatrên sởcủamột số lượng sốtếbàovi khuẩn E coli Như thể tronghình 6, bergaptenhình thànhtuyến tính trongcả thời gianchỉ định(15120 phút)và nồng độ cácproteintinh chế (1,8-16 μg) Vì vậy,9,6μgprotein tinh khiết(hoạt động cụ thể0,21kat/kg) thời gian phản ứng90 phút ở35ºCđãđượcthực đểđo độ pHtối ưu cáchoạt độngAdBMT Cần lưu ýrằng việc sản xuấtbergaptenđạt đến mộtmức tối đa(36μg) sau 2h ủ bệnh(Hình6B) Hoạt động đáng kểcủacácAdBMTtái tổ hợpđã quan sát thấytừpH6,5-9,0với pHtối ưu khoảng 7,5trong hệ đệm phosphatekalihoặc hệ đệm Tris-HCl(Hình7A) Ở pH7.5, hoạt động AdBMTtrong hệ đệmphosphatekalilà hoạt độngtrên mộtnhiệtđộrộngtừ16đến42°Cvới nhiệt độtối ưu củakhoảng 35°C(Hình7B) Cần lưu ýrằng không cósự bổ sung củaSAM(5mM), bergaptenkhôngđược quan sát thấytronghỗn hợp phản ứng Phân tíchđộng họccho thấyrằng giá trịKmcủaAdBMTvớibergaptollà0,56mMtrongkhigiá trịKmcủaAdBMTvớiSAMlà10,68mM Hình Ảnh hưởng pH,nhiệt độ,vàion kim loạivàohoạtđộng AdBMTtái tổ hợp Xấp xỉ 9.6μgproteinamonisulfatphân đoạnđã thêm vào(A) 200 mMcác hệ đệmchỉ định khácnhautrong bao gồmmộtphạmvipH rộngpH từ4,0đến 10,0, (B)vào200mMđệmphosphatekali (pH 7,5)vàủ nhiệt độchỉ định từ16đến42°C,hoặc (C)vào200mMđệmphosphatekali (pH 7,5), tất chứacác ion kim loạikhácnhauở nồng độ 0,1và 1,5mM, ủở 35°C tương ứng EDTA, mộtchelatorkim loại,đã bổ sungvào hệ đệmnhư kiểm soát.Bergapten chuẩn hóatrên sởcủamột số lượng sốtếbàovi khuẩn E coli Ba thí nghiệm độclập2 lầnđã thực hiệncho phân tích Dấu hoa thị chothấytầm quan trọng củasự khác biệtcủa giá trịđiềukhiểnđượcxácđịnhbằng Student’s t-test (* P