Tạo dòng phân tử và phân tích chức năng của enzyme bergaptol o methyltransferase (BMT) từ cây bạch chỉ (angelica dahurica) và ứng dụng trong sản xuất một cách có hiệu quả chất bergapten trong e coli

SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Nhóm Xin chào thầy bạn! Chiêu Hào Cam 0918040 Đàm Huỳnh Khang 0915215 Phạm Triều Nghi 0915326 L/O/G/O Tạo dòng phân tử phân tích chức enzyme bergaptol-O-methyltransferase (BMT) từ bạch (Angelica dahurica) ứng dụng sản xuất cách có hiệu chất bergapten E coli (Shu-chin LO, pei-en Chung Co-shine Wang) L/O/G/O Nội dung Tổng quan Vật liệu phương pháp Kết Thảo luận Tổng quan • Bạch từ lâu sử dụng làm kem dưỡng trắng da, có chứa hợp chất 8-hydroxy bergapten, sản phẩm hydroxylate từ chất bergapten nhờ enzyme 5-O-methyltransferase (BMT) phân cắt chất bergaptol bạch • Đoạn AdBMT chứa vùng bảo tồn I-V tương tự OMTs (O-methyltransferase) loài khác • Liên kết His-AdBMT biểu E coli làm cách tủa ammonium sulfate • Cách sản xuất bergapten đơn giản hiệu biểu vượt mức AdBMT nuôi cấy vi khuẩn E coli Lượng bergapten thu cao gấp 13 lần lượng hợp chất thu từ sản phẩm làm phân đoạn ammonium sulfate Bạch (Bai Zhi) Giới: Plantae Ngành: Angiosperms Lớp: Eudicots Bộ: Apiales Họ: Apiaceae Chi: Angelica Lồi: Angelica dahurica (Fish.) BENTH et HOOK • Sự methyl hoá hợp chất tự nhiên S-adenosyl-L-methionine (SAM) phụ thuộc Omethyltransferases (OMTs) cách chuyển đổi phổ biến phản ứng tổng hợp tự nhiên • Trong thực vật, O-methyl hoá cần thiết cho tổng hợp furanocoumarin mạch thẳng • Các hợp chất mạch thẳng phong phú furanocoumarin kể đến psolaren, bergapten, xanthotoxin isopimpinellin • Bergaptol BMT chuyển thành bergapten • Bergapten chuyển thành 8-hydroxybergapten ức chế tyrosinase nấm, sức chế mạnh kojic acid arbutin – hai chất ức chế tyrosinase sử dụng rộng rãi mỹ phẩm trắng da (Piao et al, 2004) OMT http://www.neurology.org/content/57/3/410/F2.expansion.html Vật liệu phương pháp Vật liệu Cây bạch Angelica dahurica (Fish.) BENTH Et HOOK trồng ruộng Rễ thu đựơc bảo o quản lạnh nitơ lỏng tất phần vật liệu sử dụng phải cất trữ -80 C • Bởi kích thước cDNA phần, phương pháp 5’ – 3’-RACE PCR sử dụng để có tồn chiều dài 1.259 bp cDNA AdBMT (accession no JN585954) ngoại trừ đuôi poly (A) • Chuỗi acid amin liên kết AdBMT cho thấy polypeptide AdBMT có tất vùng bảo tồn, IV (Ibrahim et al, 1998) tìm thấy, chia sẻ 28%-91% tương đồng với OMTs thực vật xác định OMT người (13%) Biểu vượt mức AdBMT E coli tái tổ hợp Đặc tính AdBMT Hiệu sản xuất bergapten nuôi cấy biểu mức AdBMT • Sau thời gian phản ứng ngắn khoảng giờ, việc sản xuất bergapten đạt 180µg, tương ứng 60% so với mức tối đa quan sát sau 24 (nếu mức tối đa bergapten sản xuất 24 tính 100%) Thảo luận • Piao et al (2004) báo cáo chiết xuất ethyl acetate A dahurica có tiềm hoạt động ức chế chống lại tyrosinase nấm Xét chất tyrosinase ức chế ngăn chặn hình thành hắc tố melanin, chúng dẫn đến giảm độ tối da • Một báo cáo trước BMT khơng ổn định đó, phương pháp phân đoạn ammonium sulfate áp dụng cho tinh chế enzyme (Hehmann et al, 2004) Việc sản xuất bergapten in vivo có số lợi lớn: • Đầu tiên, với số lượng tế bào vi khuẩn E coli, số lượng lớn bergapten sản xuất chất lỏng Quan trọng hơn, việc ủ mơi trường tiếp tục mở rộng đến 24 để đạt sản xuất bergapten tối đa, cao 13 lần so với sản xuất phần AdBMT tinh khiết ammonium sulfate • Thứ hai, SAM khơng cần thiết để thêm vào phản ứng in vitro vi khuẩn E coli tự cung cấp cofactor cho q trình methyl hóa đó, làm giảm đáng kể chi phí sản xuất • Thứ ba, tinh chế BMT từ tế bào khơng cần thiết E coli sử dụng bergaptol bổ sung chuyển đổi thành bergapten, lập tinh bergapten đơn giản nhiều • AdBMT phân loại thành viên OMTs loại II hoạt động enzyme độc lập với Mg 2+ Tuy nhiên, việc bổ sung Cu 2+ , Ni 2+ , CO 2+ nồng độ chí thấp 0,1 mM ức chế nghiêm trọng hoạt động enzyme • Kết luận, cDNA BMT xác định từ Bạch biểu mức E coli Các điều kiện tối ưu AdBMT xác định hệ đệm kali photphat, người ta nhận thấy enzyme không yêu cầu Mg • 2+ cho hoạt động xúc tác Với việc cung cấp bergaptol môi trường, tế bào vi khuẩn E coli sử dụng lò phản ứng sinh học tiềm để sản xuất bergapten Tài liệu tham khảo      Shu-Chin LO, Molecular cloning and functional analysis of bergaptol-O-methyltransferase from Angelica dahurica (Bai Zhi) and using it to efficiently produce bergapten in E coli, 2012 Michael E Swartz, Ph.D., Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC): An Introduction, 2005 http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html http://www.biovisualtech.com/bvplasmid/pET-32_a_b_c%28+%29.htm http://www.comsol.com/stories/waters_corp_hplc_systems/full/ Cảm ơn thầy bạn lắng nghe! L/O/G/O .. .T o dòng phân tử phân tích chức enzyme bergaptol- O- methyltransferase (BMT) từ bạch (Angelica dahurica) ứng dụng sản xuất cách có hiệu chất bergapten E coli (Shu-chin LO, pei-en Chung Co-shine... nhờ enzyme 5 -O- methyltransferase (BMT) phân cắt chất bergaptol bạch • o n AdBMT chứa vùng b o tồn I-V tương tự OMTs (O- methyltransferase) loài khác • Liên kết His-AdBMT biểu E coli làm cách. .. chất mạch thẳng phong phú furanocoumarin kể đến psolaren, bergapten, xanthotoxin isopimpinellin • Bergaptol BMT chuyển thành bergapten • Bergapten chuyển thành 8-hydroxybergapten ức chế tyrosinase