các enzyme sử dụng trong sinh học phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PH ẨM TP.HCM KHOA CNSH & KTMT CÁC ENZYME SỬ DỤNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: Th.S Trần Quỳnh Hoa NHÓM Enzim Giới Hạn (Restriction enzyme) Lịch sử phát O RE phát lần Werner Arber(Thụy Điển) O Ông cho rằng: Có enzyme đặc biệt, hoạt động tế bào vi khuẩn, chúng phân biệt DNA DNA lạ phage O Những enzyme hạn chế khả sinh sản phage tế bào vi khuẩn cách cắt DNA phage thành đoạn nhỏ Định nghĩa Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) O Là enzyme thuộc enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu O Phân huỷ liên kết phosphodieste khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases O Cắt AND đoạn xác định thành đoạn ngắn Thí nghiệm mô tả sau: Cho phage xâm nhiễm vào hai chủng vi khuẩn A B, vi khuẩn nuôi cấy môi trường thích hợp Sau thu hồi phân tích DNA phage  Ở chủng vi khuẩn A: xuất nhiều AND phage nguyên vẹn tế bào vi khuẩn bị phá vỡ (do nhân lên phage tế bào vi khuẩn)  Ở chủng B: Tế bào vi khuẩn không bị phá vỡ AND phage bị cắt thành đoạn có kích thước xác định (Trong trường hợp này, AND phage bị hệ thống bảo vệ vi khuẩn tiêu diệt vừa xâm nhập vào vi khuẩn) => Phần lớn loài vi khuẩn có hệ thống chuyên biệt hạn chế biến đổi để bảo vệ tế bào khỏi xâm nhập AND lạ Phân loại RE chia thành loại: O Loại I: Khi Enzime nhận biết trình tự, di chuyển phân tử DNA, dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotid O Loại II: Enzime nhận biết trình tự cắt vị trí O Loại III: Enzime nhận biết trình tự cắt DNA vị trí cách khoảng 20 nucleotid Các loại RE nhóm II a)Trình tự nhận biết RE Mỗi enzim nhận đoạn nucleotid khác gọi trình tự nhận biết,đoạn đọc ngược xuôi Chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palinromic), hai mạch hoàn toàn giống chúng đọc theo chiều từ 5’ đến 3’ở sợi đơn  Ví dụ: Restriction endonuclease EcoR I (từ Ecoli) có trình tự nhận biết: … G A A T T C… ….G… …A A T T C… … C T T A A G… …C T T A A… …G… Các kiểu cắt Cắt có đầu bằng: RE cắt mạch DNA điểm => đoạn DNA có đầu (blunt ends) khả kết hộ trở lại, nối đoạn DNA enzyme T4 ligase Ví dụ, enzyme Sma I nhận biết đoạn đặc hiệu có cặp nucleotid, cắt giai đoạn nhận biết tạo đầu bằng: MỘT SỐ QUY TẮC CẦN LƯU Ý KHI THIẾT LẬP MỘT PHẢN ỨNG THỦY GIẢI BỞI RE O Mỗi RE hoạt động tối ưu dung dịch đệm, khác nồng độ NaCl O Nếu chúng hoạt động tốt dung dịch đệm sử dung đồng thời RE giữ hoạt tính 50% Glycerol,bảo quản ở-20oC.Khi tiến hành thủy giải lấy RE vào phút chót sau cho đủ thành phần khác  Thể tích nhỏ tạo thuận lợi cho tiếp xúc Enzim- chất Ứng dụng enzim giới hạn công nghệ gen O Cho phép cắt bỏ BNST khổng lồ thao tác gen dễ dàng O Tạo số lượng lớn trình tự DNA xác định CÁC ENZYME THÔNG DỤNG KHÁC  Các polymerase  Các ligase  Các nuclease I CÁC POLYMERASE: - Là các enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A,T,G,C vào mạch DNA mới hợp • - DNA polymease I (DNA pol I) Có vai trò chế sữa sai chép vi khuẩn, tổng hợp theo chiều 3’-5’ • T4 DNA polymerase: - Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm vi khuẩn • - Taq polymerase: Là một enzyme được tách chiết từ một vi khuẩn từ suối nước nóng Không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng • Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase) - Do retrovirus sản sinh nhằm chép bộ gen RNA của chúng tế bào kí chủ - Tổng hợp nên một mạch DNA bổ sung(cDNA) từ khuôn RNA theo chiều 5’- 3’ có mặt mồi • Terminal transferase - Được trích ly từ tuyến ức của bê - Phản ứng xúc tác gắn các deocxynucleotidevafo đầu 3’OH tự của phân tử DNA • Các RNA polymerase - Xúc tác tổng hợp RNA từ một mạch của một DNA mạch đôi theo chiều 5’-3’.Tổng hợp không cần mồi khuôn DNA phải mang promoter đặc trưng II CÁC LIGASE Các enzym xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) Được sử dụng kết hợp hai enzym khác là T4 polynucleotide kinase và Alkaline phosphatase • E.coli DNA ligase - Emzym được trích ly từ E.coli và xúc tác phản ứng nối trình tự DNA có đầu so le • T4 DNA ligase Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli Ngoài chức với ligase trích từ E coli còn có khả nối hai trình tự DNA đầu • T4 RNA ligase Được trích từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, xúc tác sự nối trình tự RNA liên kết phosphodiester Sử dụng để đánh dấu phóng xạ đầu 3’ của các phân tử RNA dùng làm mẫu dò phân tử • T4 Polynucleotide kinase • Alkaline phosphate Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli Enzym này xúc tác cho sự chuyển nhóm γ- phosphate của ATP cho đầu 5’ của DNA hay RNA Được ly trích từ E.coli hay ruột bê, enzym xúc tác sự loại bỏ nhóm 5’ phosphate của DNA, RNA và các nucleotide tự III.CÁC NUCLEASE Đây nhóm enzyme phân cắt DNA (Dnase) RNA (RNase) • DNase - Enzyme có nguồn gốc từ tụy tạng bò, có vai trò xúc tác phản ứng thủy giải liên kết nằm sau pyrimidine chuỗi DNA mạch đơn hay mạch đôi • nuclease s1 - Enzyme trích ly từ Aspergillus oryzae, có khả phân hủy DNA mạch đơn DNA mạch đôi, phân tử lai DNA : RNA không bị enzyme phân cắt, trừ đoạn mạch đơn phân tử • Exonuclease iii - Là enzyme tách chiết từ E.coli, xúc tác phản ứng thủy giải nucleotide từ đầu 3’OH tự DNA, theo chiều 3’ → 5’  hình thành nên vòng mạch đơn dài DNA mạch đôi • rnase a - Là loại enzyme có hoạt tính cao, diện nơi bền vững Enzyme thương mại trích li từ tụy bò RNase A cắt cách đặc trưng liên kết phosphodiester nằm sau pyrimidine RNA mạch đơn • rnase h - Có khả loại bỏ RNA phân tử lai RNA : DNA thường dùng để loại bỏ RNA sau phản ứng phiên mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ cDNA hình thành DNA mạch đôi THE END ƠN CÔ V ... nuclease s1 - Enzyme trích ly từ Aspergillus oryzae, có khả phân hủy DNA mạch đơn DNA mạch đôi, phân tử lai DNA : RNA không bị enzyme phân cắt, trừ đoạn mạch đơn phân tử • Exonuclease iii - Là enzyme. .. Ứng dụng enzim giới hạn công nghệ gen O Cho phép cắt bỏ BNST khổng lồ thao tác gen dễ dàng O Tạo số lượng lớn trình tự DNA xác định CÁC ENZYME THÔNG DỤNG KHÁC  Các polymerase  Các ligase  Các. .. (Restriction enzyme) Lịch sử phát O RE phát lần Werner Arber(Thụy Điển) O Ông cho rằng: Có enzyme đặc biệt, hoạt động tế bào vi khuẩn, chúng phân biệt DNA DNA lạ phage O Những enzyme hạn chế khả sinh